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CN105209073A - 包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的组合疗法 - Google Patents

包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的组合疗法 Download PDF

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CN105209073A
CN105209073A CN201480026686.XA CN201480026686A CN105209073A CN 105209073 A CN105209073 A CN 105209073A CN 201480026686 A CN201480026686 A CN 201480026686A CN 105209073 A CN105209073 A CN 105209073A
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CN
China
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inhibitor
raf
patient
compound
formula
Prior art date
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Application number
CN201480026686.XA
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English (en)
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G·卡波尼格罗
D·斯图尔特
L·德帕塞瓦尔
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Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
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Abstract

通过以下方式逆转对用于治疗增生性疾病的B-Raf抑制剂的抗性：从患者获得肿瘤样品并测试其包括BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRAS？HRAS、PTEN、PIK3CA和P16的一组基因中的遗传变化，以及施用克服对所述B-Raf抑制剂的抗性的包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂基于所述肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择。

Description

包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的组合疗法
发明概要
本发明涉及B-Raf抑制剂与第二抑制剂组合用于治疗罹患特征为B-Raf中的突变的增生性疾病的患者的用途，其中第二抑制剂基于在肿瘤样品中所鉴定的遗传变化而选择。
发明背景
在了解与黑素瘤的产生相关联的分子变化方面已取得重要进步。B-RAF的致癌突变(RAF/MEK/ERK途径中的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)在黑素瘤中尤其常见，其中40至60％的黑素瘤携带B-Raf基因中的活化突变。氨基酸600处谷氨酸对缬氨酸的取代(V600E突变)代表超过95％的所报导的B-Raf突变。该突变组成型活化RAF/MEK/ERK途径中的B-Raf和下游信号转导，所述途径发出癌细胞增殖和存活的信号。除黑素瘤以外，已知在其它增生性疾病中也发生此类B-Raf突变，例如结直肠癌、甲状腺癌、尤其是乳头状甲状腺癌、星形细胞瘤、胰腺癌和神经纤维瘤。尽管已知在用B-Raf抑制剂治疗此类疾病时可产生显著的结果，但通常用B-Raf抑制剂治疗会产生抗性，其通常在极短时段内发生。
对用B-Raf抑制剂治疗产生抗性有多种途径。主要机理使得RAF/MEK/ERK信号传导途径在B-Raf抑制剂存在下再活化。该再活化可经由如下方式发生：经由基因扩增和过表达和/或配体产生而提高受体酪氨酸激酶(RTK)的活性、获得NRAS和MEK1基因中的突变、经由诸如COT和RAF-1(CRAF)激酶的过表达绕过BRAF、表达突变BRAF等位基因的拼接变体和由于例如基因扩增而提高突变BRAF等位基因的表达。另外，经由RTK(诸如PDGFR-β和IGF-1R)的活化或PTEN基因的缺失而不同于MAPK途径的存活途径(诸如PIK3Cα信号传导系统)的活化也可在抗性中起作用。其它机理(通过c-MET和RTK的FGFR家族)是在多发性黑素瘤中可促进对B-Raf抑制剂的抗性的潜在机理。
上述发现突显了实时鉴定抗性机理的重要性，以便在B-Raf抑制剂治疗时在复发后不久即开始合理的组合疗法。使用基于机理的方法且比较复发时与治疗前患者肿瘤中存在的遗传变化，应有可能鉴定可能的抗性机理。这将有助于为个体患者选择适当的药物组合疗法以更好地避开抗性。本发明涉及基于机理的组合治疗方法以在对B-Raf抑制剂产生抗性后扩展和改善具有极差预后的患有BRAF突变晚期或转移性黑素瘤的患者的治疗选择。
简述
本发明涉及用B-Raf抑制剂治疗罹患特征为B-Raf中的突变的增生性疾病的患者，其中通过如下方法降低对B-Raf抑制剂的抗性：
(a)确定取自患者的肿瘤样品中的遗传变化，
(b)对患者施用由B-Raf抑制剂和第二抑制剂组成的药物组合疗法，其中第二抑制剂基于肿瘤样品中所存在的遗传变化而选择。
附图简述
图1–示出如实施例4中所述的单一药剂和组合形式的式(I)化合物和化合物F对体内HT-29细胞系模型的生长的作用。
图2–示出如实施例4中所述的单一药剂和组合形式的式(I)化合物和化合物F对体内RKO细胞系模型的生长的作用。
图3–示出组合RAF抑制剂(式I化合物)和FGFR抑制剂化合物H对具有编码BRAFV600E的BRAF等位基因的两种黑素瘤衍生细胞系增殖的作用。示出了如实施例5中所讨论的如使用基于阻抗的xCELLigence细胞分析仪所测得的(上图A)COLO741和(下图B)SK-MEL-5细胞系的实时生长。其中指示的FGF2和化合物H分别以100ng/ml和1uM的浓度补充到培养基。在(A)中以500nM且在(B)中以100nM使用式(I)化合物。
图4-组合式(I)化合物与FGFR抑制剂化合物H和FGFR配体FGF2在体外对两种BRAFV600E突变黑素瘤衍生细胞系的信号传导的作用。示出了用式(I)化合物(100nM)、FGF2(100ng/ml)和化合物H(1uM)处理后从(A)COLO74和(B)SK-MEL-5细胞分离的磷酸化与总AKT、ERK1/2和MEK1/2蛋白的Western分析。如实施例5中所讨论，用单独和组合形式的药剂处理细胞2和24小时。
详细描述
本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变，尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病的患者的方法，其包括：
(a)从患者获得肿瘤样品并测试包括BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的一组基因中的遗传变化。
(b)施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂基于肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择。
在一个实施方案中，增生性疾病为癌症。术语“癌症”在本文中用于意指多种肿瘤，包括所有实体瘤和恶性血液病。此类肿瘤的实例包括但不限于以下的良性或恶性肿瘤：脑、肺(尤其是小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、鳞状细胞、膀胱、胃、胰腺、乳腺、头颈、肾脏、肾、输尿管、卵巢、前列腺、结直肠、食道、睾丸、妇科(例如子宫肉瘤，输卵管、子宫内膜、子宫颈、阴道或外阴的恶性肿瘤)、甲状腺、胰腺、骨、皮肤、黑素瘤、子宫、卵巢、直肠、肛门、结肠、睾丸、霍奇金氏病(Hodgkin’sdisease)、食道、小肠、内分泌系统(例如甲状腺、副甲状腺或肾上腺)、软组织、尿道、阴茎的肉瘤、白血病、淋巴瘤、中枢神经系统赘生物、肉瘤、骨髓瘤、胆、肝、神经纤维瘤、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)和卡波氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)。
在本发明的另一实施方案中，增生性疾病为黑素瘤、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌(CRC)、乳腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌(RCC))、肝癌、子宫内膜癌、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、甲状腺癌、尤其是乳头状甲状腺癌、胰腺癌、神经纤维瘤或肝细胞癌。
在本发明的另一实施方案中，增生性疾病为实体瘤。术语“实体瘤”尤其意指黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌，且一般为胃肠道、子宫颈癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌或卡波氏肉瘤。
更具体地讲，本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的V600突变(例如V600E突变)的增生性疾病的患者的方法。通常特征为这样的突变的增生性疾病包括黑素瘤、结直肠癌、甲状腺癌、尤其是乳头状甲状腺癌、星形细胞瘤、胰腺癌和神经纤维瘤。本发明尤其涉及这样的方法，其中增生性疾病是特征为B-Raf中的V600突变(例如V600E、V600K或V600G突变)的黑素瘤。
B-Raf抑制剂及其用于治疗增生性疾病的用途在本领域中是已知的。威罗菲尼(PLX4032)是一种BRAF抑制剂，其经FDA批准用于治疗患有黑素瘤的患者，其肿瘤表达BRAFV600E。索拉非尼和达拉非尼及CEP-32496为另外的已知B-Raf抑制剂。美国专利7,482,367中所公开的苯并咪唑基吡啶基醚是可用于本发明的组合的B-Raf抑制剂，尤其是RAF265，该专利的全部内容以引用的方式并入本文。WO2011/025927中所公开的吡唑嘧啶是可用于本发明的组合的另一类B-Raf抑制剂，该专利的全部内容以引用的方式并入本文。
用于治疗患者的待与B-Raf抑制剂组合的适当的第二抑制剂根据表1基于肿瘤样品中所存在的遗传变化而选择。遗传变化可由基因扩增、基因突变或基因活性缺失而产生。
关于表1中所鉴定的基因的信息、其序列和相关蛋白是本领域技术人员已知的且见于公众可得的数据库，例如以下所提供的数据库：NationalCenterforBiotechnologyInformation,U.S.NationalLibraryofMedicine8600RockvillePike,BethesdaMD,20894USA，诸如GENE(URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)或OfficeofBiologicalandEnvironmentalResearchoftheU.S.DepartmentofEnergyOfficeofScience，HumanGenomeProjectInformation(URL:http://genomics.energy.gov/)。
药物组合疗法涉及以一定的量施用组合疗法中的每种药物，该量足以相较于用该组合治疗的障碍的临床可观察的基线体征和症状提供可观察的改善。这些药物可以其优选的时间间隔单独给予(以时间交错的方式，尤其是特定次序的方式)以使得在患者中显示出(优选协同)相互作用(联合治疗作用)，尤其是其中对用B-Raf抑制剂治疗的抗性在患者中克服或降低。
术语治疗剂的组合的“药学有效量”或“临床有效量”或“治疗有效量”为相较于用该组合治疗的障碍的临床可观察的基线体征和症状足以提供可观察的改善的量。
除非另外明确说明，否则本文所用的一般术语通过如下含义而定义：
除非另外说明，否则术语“包含”和“包括”在本文中以其开放且非限制性意义使用。
除非本文中另外指明或上下文明显矛盾，否则在描述发明的上下文中(尤其是在如下权利要求书的上下文中)，术语“一”和“一个/一种”与“该/所述”及类似的提及内容应被视为涵盖单数与复数两者。若将复数形式用于化合物、盐等，则其也用于意指单一化合物、盐等。
如本文所用，术语“组合”、“治疗性组合”、“组合疗法”或“药物组合”定义一个单位剂型中的固定组合或用于组合施用的多个部分或说明的药盒，其中B-Raf抑制剂和第二抑制剂可同时独立地施用或在使组合搭配物显示协作(例如协同)作用的时间间隔内单独施用。
本文将术语“药物组合物”定义为指含有至少一种待施用于受试者(例如哺乳动物或人)以便预防或治疗影响该哺乳动物的特定疾病或病症的治疗剂的混合物或溶液。
本文将术语“药学上可接受”定义为指如下那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在正确医学判断的范围内适于与受试者(例如哺乳动物或人)的组织接触而无过度毒性、刺激过敏反应和其它问题并发症，与合理的效/险比相称。
除非另外指明，否则如本文所用的“药学上可接受的盐”包括可存在于本发明化合物中的酸性和碱性基团的盐。性质上为碱性的本发明的化合物能够与各种无机和有机酸形成多种盐。可用于制备本发明的此类碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸为形成如下无毒酸加成盐的那些酸，即含有药学上可接受的阴离子的盐，诸如乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、氯化物、柠檬酸盐、延胡索酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、硝酸盐、草酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐。除非另外规定，否则本发明方法中所用的治疗剂以游离形式或以药学盐形式施用。
术语“组合制剂”在本文中按如下意义定义为尤其指“多个部分的药盒”：如上所定义的组合搭配物(a)和(b)可独立地或通过使用不同的固定组合(具有区别量的组合搭配物(a)和(b))给药，即同时地或在不同的时间点给药。多个部分的药盒的各部分可随后例如同时地或按时间交错施用，即对于多个部分的药盒的任何部分在不同的时间点且以相等或不同的时间间隔施用。待在组合制剂中施用的组合搭配物(a)与组合搭配物(b)的总量的比率可以变化，例如以便满足待进行治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要。
如本文所用的术语“共施用”、“组合疗法”或“组合施用”定义为涵盖对单个患者施用所选的治疗剂且意欲包括如下治疗方案，其中这些药剂未必通过相同的施用途径或同时施用。
如本文所用的术语“治疗”包括缓解、减轻或缓和受试者中的至少一种症状或实现疾病进展的延迟的治疗。例如，治疗可去除障碍的一种或多种症状或完全根除障碍，诸如癌症。在本发明的含义中，术语“治疗”还表示阻止、延迟疾病的发作(即疾病的临床表现前的时间段)和/或降低发生疾病或疾病恶化的风险。术语“保护”在本文中用于意指预防、延迟或治疗或视需要预防、延迟且治疗受试者中疾病的发生或持续或加剧。
如本文所用的术语“受试者”或“患者”尤其是指人，例如罹患增生性疾病、处于罹患增生性疾病的风险中或可能罹患增生性疾病的人。然而，不旨在排除治疗哺乳动物，例如狗、牛、马、猪、羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。
术语“约”或“大约”应具有在给定值或范围的10％以内、更优选地5％以内的含义。
因此，本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)从患者获得肿瘤样品并测试选自BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的基因中的遗传变化。
(b)施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂根据表1基于肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择，尤其是其中，
(i)当肿瘤样品具有BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中的遗传变化时，第二抑制剂为Mek1/2抑制剂，或
(ii)当肿瘤样品具有CCND1、CDK4或P16中的遗传变化时，第二抑制剂为CDK4抑制剂，或
(iii)当肿瘤样品具有HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的遗传变化时，第二抑制剂为PI3激酶抑制剂，或
(iv)当肿瘤样品具有cMET中的遗传变化时，第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂，
(v)当肿瘤样品具有FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化时，第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
因此，本发明进一步涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)从患者获得肿瘤样品并检测选自BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR的基因中的遗传变化。
(b)对患者施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂为Mek1/2抑制剂。
本发明还涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(b)从患者获得肿瘤样品并检测选自CCND1、CDK4或P16的基因中的遗传变化。
(d)对患者施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂为CDK4抑制剂。
本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)在疾病进展后从患者获得肿瘤样品并检测选自HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA的基因中的遗传变化，
(b)对患者施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂为PI3激酶抑制剂。
本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)获得肿瘤样品并检测选自cMET的基因中的遗传变化，
(b)对患者施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂。
本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)从患者获得肿瘤样品并检测选自FGFR1、FGFR2或FGFR3的基因中的遗传变化，
(b)对患者施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
在本发明的一个重要实施方案中，患者之前已用B-Raf抑制剂单一疗法治疗。具体地讲，用B-Raf抑制剂单一疗法治疗患者直至疾病进展，然后使用根据表1所确定的药物组合疗法。
在一个优选的实施方案中，连续施用B-Raf抑制剂作为单一疗法直至疾病进展或开始药物组合疗法，且在用药物组合疗法治疗期间继续该连续施用。
在另一个实施方案中，以间歇给药计划施用B-Raf抑制剂，其意指施用B-Raf抑制剂一段时间，然后是停止用B-Raf抑制剂进行治疗的一段时间。例如，每天施用Raf抑制剂持续3或4周的时间段，然后是1或2周不治疗的时间段，并重复该周期。
通过适当的临床标准(诸如RECIST标准)评估疾病进展。RECIST(实体瘤的反应评估标准)是定义癌症患者在治疗期间改善(“反应”)、保持不变(“稳定”)或恶化(“进展”)的时间的一套已发布的规则。原始标准由包括EuropeanOrganizationforResearchandTreatmentofCancer(EORTC)、NationalCancerInstitute(NCI)oftheUnitedStates和theNationalCancerInstituteofCanadaClinicalTrialsGroup的国际合作发布于2000年2月，。发布于2009年1月的RECIST1.1为原始标准的更新。参见Eur.J.Cancer,45,(2009)228-247。
通过比较复发时例如与治疗前患者肿瘤中所存在的遗传变化来确定疾病进展的机理。遗传变化可由基因扩增、基因突变或基因活性缺失而产生。遗传变化通过本领域已知的方法，通常通过已知的测序方法来确定。在一个优选的实施方案中，比较复发时与治疗前所采集的肿瘤样品中选自B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的基因。
因此，本发明还涉及测试从罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者获得的肿瘤样品的包括B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的一组基因中的遗传变化以便确定用B-Raf抑制剂治疗后疾病进展的机理。
本发明还涉及一种用于选择待与B-Raf抑制剂组合的第二抑制剂的诊断方法，其中测试肿瘤样品的一种或多种选自B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的基因的遗传变化。第二抑制剂根据表1选择。优选地，选择第二抑制剂以克服对用B-Raf抑制剂治疗的抗性。
本发明还涉及可用于检测一或多种选自B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16或包含上述基因的全部或子集的基因中的遗传变化的基因芯片。该基因芯片可用于确定对用B-Raf抑制剂治疗的抗性的机理且可用于选择待用于克服该抗性的药物组合疗法中的第二抑制剂。
本发明的一个特定实施方案为一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)对患者施用治疗有效量的B-Raf抑制剂直至患者表现出疾病进展，
(b)在疾病进展后从患者获得肿瘤样品并测试一种或多种选自BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的基因中的遗传变化，和
(c)施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂基于肿瘤样品中所存在的遗传变化而选择，其中，
(i)当遗传变化在BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中时，第二抑制剂为Mek1/2抑制剂，或
(ii)当遗传变化在CCND1、CDK4或P16中时，第二抑制剂为CDK4抑制剂，或
(iii)当遗传变化在HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中时，第二抑制剂为PI3激酶抑制剂，或
(iv)当遗传变化在cMET中时，第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂，或
(v)当遗传变化在FGFR1、FGFR2或FGFR3中时，第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
可用于本发明的优选的B-Raf抑制剂为式(I)化合物
式(I)化合物及其作为B-Raf抑制剂的应用公开于WO2011/025927中。
因此，本发明更具体地涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)从患者获得肿瘤样品并测试一种或多种选自BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的基因中的遗传变化，和
(b)施用包含式(I)的B-Raf抑制剂
或其药学上可接受的盐和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂根据表1基于肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择，尤其是其中，
(i)当肿瘤样品具有BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中的遗传变化时或当步骤(b)中未发现遗传变化时，第二抑制剂为Mek1/2抑制剂，或
(ii)当肿瘤样品具有CCND1、CDK4或P16中的遗传变化时，第二抑制剂为CDK4抑制剂，或
(iii)当肿瘤样品具有HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的遗传变化时，第二抑制剂为PI3激酶抑制剂，或
(iv)当肿瘤样品具有cMET中的遗传变化时，第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂，或
(v)当肿瘤样品具有FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化时，第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
本发明的一个更具体的实施方案包括在药物组合疗法前用式(I)的B-Raf抑制剂提供单一疗法。因此，本发明进一步涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)对患者施用治疗有效量的式(I)的B-Raf抑制剂
或其药学上可接受的盐，直至患者表现出疾病进展，
(b)在疾病进展后从患者获得肿瘤样品并测试一种或多种选自B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的基因中的遗传变化，
(c)施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，该第二抑制剂根据表1基于肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择，尤其是其中，
(i)当疾病进展机理的特征为BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中的遗传变化时或当步骤(b)中未发现遗传变化时，第二抑制剂为Mek1/2抑制剂，或
(ii)当疾病进展机理的特征为CCND1、CDK4或P16中的遗传变化时，第二抑制剂为CDK4抑制剂，或
(iii)当疾病进展机理的特征为HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的遗传变化时，第二抑制剂为PI3激酶抑制剂，或
(iv)当疾病进展机理的特征为cMET中的遗传变化时，第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂，或
(v)当疾病进展机理的特征为FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化时，第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
在步骤(a)和(c)中，式(I)化合物可连续施用或以间歇给药计划施用。优选连续施用。
在上述方法的每一种中，优选的实施方案尤其包括如下那些实施方案，其中增生性疾病的特征为B-Raf中的V600突变，例如V600E突变。通常特征为这样的突变的增生性疾病包括黑素瘤、结直肠癌、甲状腺癌、尤其是乳头状甲状腺癌、星形细胞瘤、胰腺癌和神经纤维瘤。优选地，增生性疾病是特征为B-Raf中的V600突变(例如V600E、V600K或V600G突变)的黑素瘤或结直肠癌。本发明尤其涉及这样的方法，其中增生性疾病是特征为B-Raf中的V600突变(例如V600E、V600K或V600G突变)的黑素瘤。
用于本发明方法的适当的Mek1/2抑制剂为本领域已知的。可用于本发明的Mek1/2抑制剂包括PD325901、PD-181461、ARRY142886/AZD6244、ARRY-509、XL518、JTP-74057、AS-701255、AS-701173、AZD8330、ARRY162、ARRY300、RDEA436、E6201、RO4987655/R-7167、GSK1120212或AS703026。
在一个重要的实施方案中，Mek1/2抑制剂包括WO03/077914中所述的化合物，该专利的全部内容以引用的方式并入本文，尤其是式(II)或(III)化合物
或其药学上可接受的盐(下文分别称为化合物A和B)以及WO05/051906、WO05/023251、WO03/077855、US20050049419和US7235537中所述的化合物，这些专利的全部内容以引用的方式并入本文，其涵盖N3-烷基化苯并咪唑和其它类似的杂环衍生物作为治疗增生性疾病的Mek1/2抑制剂。
CDK4抑制剂为本领域已知的且包括夫拉平度、P1446A-05、LEE011、AT7519、BMS265246、LY2835219和PD-0332991。在本发明的一个具体实施方案中，CDK4抑制剂为WO2007/140222或WO20210/020675中所公开的化合物，这些专利的全部内容以引用的方式并入本文。在一个具体的实施方案中，CDK4抑制剂为式(IV)化合物
或其药学上可接受的盐，下文称为化合物C。
PI3激酶抑制剂为本领域已知的且包括哌立福辛、CAL-101、PX-866、BEZ235、SF1126、INK1117、GDC-0941、BKM120、XL147、XL765、Palomid529、GSK1059615、Zstk474、PTW33597、IC87114、TG100-115、CAL283、PI-103、BYL719、GNE-477、CUDC-907和AEZS-136。
WO2006/122806，其全部内容以引用的方式并入本文，描述了具有PI3-激酶抑制活性的咪唑并喹啉衍生物。本发明极优选的化合物为2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧-8-喹啉-3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈及其单甲苯磺酸盐(化合物D)。2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧-8-喹啉-3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈的合成例如作为实施例7和152-3描述于WO2006/122806。本发明另一个极优选的化合物为8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(化合物E)。8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮的合成例如作为实施例86描述于WO2006/122806。WO07/084786描述了具有PI3激酶抑制活性的嘧啶衍生物。本发明极优选的化合物为5-(2,6-二吗啉-4-基-嘧啶-4-基)-4-三氟甲基-吡啶-2-基胺(化合物F)。5-(2,6-二吗啉-4-基-嘧啶-4-基)-4-三氟甲基-吡啶-2-基胺的合成例如作为实施例10描述于WO07/084786。具有PI3-激酶抑制活性的另一个优选的化合物为(S)-吡咯烷-1,2-二甲酸2-酰胺1({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(化合物X)。
c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂为本领域已知的且包括克唑替尼、PHA-665752、SU11274、PF-04217903、福瑞替尼(foretinib)、SGX523、JNJ-38877605、GSK1363089、AMG208和INCB28060。在一个具体的实施方案中，c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂为式IV化合物
或其药学上可接受的盐(下文称为化合物G)。
根据本发明方法使用的FGFR激酶抑制剂优选地为选择性和ATP竞争性泛FGFR激酶抑制剂，包括AZD4547和BGJ398。在一个具体的实施方案中，FGFR激酶抑制剂为WO2006/000420中所公开的芳基-嘧啶基脲衍生物，尤其是式(V)化合物
或其药学上可接受的盐(下文称为化合物H)。
尤其优选的是这样的本发明方法的实施方案：其中Mek1/2抑制剂为化合物A或化合物B、尤其是化合物B，CDK4抑制剂为化合物C，PI3激酶抑制剂为化合物D、化合物E、化合物F或化合物X、尤其是化合物F，c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂为化合物G并且其中FGFR激酶抑制剂为化合物H或上述化合物的药学上可接受的盐。
式(I)的B-Raf抑制剂以每天150至600毫克、优选每天400至600毫克、尤其是450或600毫克/天的剂量施用。作为药物组合疗法的第二抑制剂，化合物B以15至60mg的剂量每天两次、优选45mg每天两次施用，化合物C以100至900毫克/天、优选200至900毫克/天(例如200、400、700或900毫克/天)的剂量施用，化合物F以30至100毫克/天、优选60至100毫克/天或60至80毫克/天的剂量施用，化合物G以50至300mg的剂量每天两次、优选100至300mg每天两次(例如100、150、200、250或300mg每天两次)施用，或化合物H以25至125毫克/天(例如75、100或125毫克/天)的剂量施用。
在上述方法的一个重要实施方案中，肿瘤样品中所发现的BRAF遗传变化不是V600突变。
本发明进一步涉及用于单独、同时或序贯施用的包含B-Raf抑制剂、优选式(I)的B-Raf抑制剂以及选自PI3激酶抑制剂、c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂和FGFR激酶抑制剂的第二抑制剂的治疗性组合。更具体地讲，该治疗性组合包含用于单独、同时或序贯施用的式(I)的B-Raf抑制剂和第二抑制剂，该第二抑制剂为选自化合物D、化合物E、化合物F和化合物X或其药学上可接受的盐的PI3激酶抑制剂；或该治疗性组合包含用于单独、同时或序贯施用的式(I)的B-Raf抑制剂和第二抑制剂，该第二抑制剂为选自化合物G或其药学上可接受的盐的c-Met抑制剂；或该治疗性组合包含用于单独、同时或序贯施用的式(I)的B-Raf抑制剂和第二抑制剂，该第二抑制剂为选自化合物H或其药学上可接受的盐的FGFR激酶抑制剂。在下文中，此类治疗性组合称为本发明的组合。
本发明进一步涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变的增生性疾病(例如特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤)的患者的方法，其包括对患者施用治疗有效量的组合，该组合包含B-Raf抑制剂、优选式(I)的B-Raf抑制剂和选自PI3激酶抑制剂、c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂和FGFR激酶抑制剂的第二抑制剂。更具体地讲，本发明涉及一种治疗罹患特征为B-Raf中的突变(诸如V600突变)的增生性疾病(例如特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤)的患者的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的组合。优选地，以治疗有效剂量施用这些抑制剂，它们在组合时提供有益的作用。施用可单独、同时或序贯进行。
本发明还关于用于制备治疗或预防有需要的患者中的增生性疾病、尤其是特征为B-Raf中的突变、特别是B-Raf中的V600突变的增生性疾病(例如特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤)的药物组合物或药物的本发明的组合。
本发明进一步提供一种市售包装，其包含作为治疗剂的本发明的组合以及用于同时、单独或序贯施用本发明组合以用于延迟增生性疾病的进展或治疗增生性疾病的说明。
相较于仅施用本发明组合中所用的药学治疗剂之一的单一疗法，施用本发明的组合不仅可以产生有益的作用，例如协同治疗作用，例如在缓和、延迟症状的进展或抑制症状方面，而且还可以产生另外惊人的有益作用，例如较少的副作用、更持久的反应、改善的生活质量或降低的发病率。
如下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例1
在研究的第一部分期间，用式(I)的B-Raf抑制剂以单一药剂形式以450毫克/天的推荐II期剂量治疗患者。经口施用调配成囊封固态分散体的式(I)的B-Raf抑制剂。
在研究的第二部分中，将用式(I)的B-Raf抑制剂与第二靶向剂的组合(即式(I)的B-Raf抑制剂+化合物B、式(I)的B-Raf抑制剂+化合物F、式(I)的B-Raf抑制剂+化合物H、式(I)的B-Raf抑制剂+化合物G或式(I)的B-Raf抑制剂+化合物C)治疗患者。各组合分支中的剂量递增将由贝氏逻辑回归模型(Bayesianlogisticregressionmodel,BLRM)指导以建立各组合的MTD/RP2D，除非其之前已在单独的组合试验中确定。使用BLRM的开放性剂量递增研究设计是估计癌症患者中的MTD和/或RP2D的公认方法。自适应BLRM将由控制剂量过量的递增设计(EWOC)原理指导以控制研究中未来患者的DLT风险。在第一个周期后未经历DLT的患者将允许进行患者自身(intra-patient)剂量递增。
患者自身剂量递增将由BLRM用反映个体患者耐受性的改良EWOC标准指导。将贝氏反应自适应模型用于小数据集已被EMEA接受且其发展和适当使用是FDA关键途径计划(CriticalPathInitiative)的一个方面。
组合药物选择的基本原理
临床前和临床研究的数据表明，通过用式(I)的B-Raf抑制剂和化合物B组合同时、双重、垂直途径抑制RAF/MEK/ERK信号传导途径可使临床功效提高且可使患有BRAFV600依赖性晚期黑素瘤的患者克服对任一单一药剂的早期抗性。此外，再活化MAPK信号传导或活化其它途径(诸如PI3K/AKT信号传导途径)的其它机理可在BRAF抑制剂的原发性抗性和/或获得性抗性中起作用。因此，除式(I)的B-Raf抑制剂+化合物B以外，还将评估式(I)的B-Raf抑制剂与分别靶向PI3K、c-met、FGFR和CDK4/6激酶的所选药剂化合物F、化合物H、化合物G和化合物C的组合的抗肿瘤活性。给予个体患者的式(I)的B-Raf抑制剂组合的选择将基于式(I)的B-Raf抑制剂进展后在该患者的肿瘤样品中所鉴定的遗传变化(参见表1)。
研究设计的描述
这是一项多中心、开放性、II期研究，其将使约100个患有BRAF突变局部晚期或转移性黑素瘤的患者加入且由两个治疗部分组成。
在第一部分(部分I)中，将用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂以450毫克/天的RP2D治疗未曾用过选择性BRAF抑制剂的患者直至疾病进展(如根据RECISTv1.1所定义)。在疾病进展时，将对肿瘤进行活检并分析所选组的基因(表1)。
在研究的部分I中，复发的患者在用于抗性活检的分子分析的预期周转时间期间，将继续接受式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂，直至可鉴定并开始适当的式(I)的B-Raf抑制剂的合理组合。
基于复发时从肿瘤活检所鉴定的遗传变化，多个患者队列将进入研究的第二部分(部分II)以进行式(I)的B-Raf抑制剂加上第二靶向剂的定制组合治疗。对应于所研究的5个组合治疗，有5个分支：式(I)的B-Raf抑制剂+化合物B、式(I)的B-Raf抑制剂+化合物F、式(I)的B-Raf抑制剂+化合物H、式(I)的B-Raf抑制剂+化合物G和式(I)的B-Raf抑制剂+化合物C。第二药剂的选择将按照表1标准来定义。预期所加入的超过一半的患者将在用式(I)的B-Raf抑制剂进展后接受式(I)的B-Raf抑制剂加上化合物B的组合治疗。
在前一研究(其中将患有BRAFV600突变黑素瘤的患者用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗)中复发的曾用过BRAF抑制剂治疗的患者可在用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂进展后加入到部分II中。对于这些患者，在之前试验的治疗访视结束时所收集的新鲜肿瘤活检样本的分析结果将用于部分II中的组合治疗分配。
在其它式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂研究(例如IIT)中复发的患者将在进展后从式(I)的B-Raf抑制剂治疗中断并将停止接受式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂，直至其可分配至研究部分II中的合理组合治疗。
那些患者的进行性疾病被认为由之前的研究确认，并且如果在进展时开展的CT之前与开始该研究内的研究治疗的时间间隔不超过28天，则将用作研究的部分II的基线肿瘤评估。
所有患者均将以所定义的双重组合MTD/RP2D开始合理组合，或者如果之前未确定双重组合MTD/RP2D，则使用450毫克/天的RP2D(或患者所耐受的最高末次剂量)的式(I)的B-Raf抑制剂与贝氏逻辑回归模型允许的起始剂量的第二药剂的组合。合理组合治疗部分将以第二药剂的可能上升剂量继续，直至已建立该组合的MTD/RP2D。在对于耐受给定剂量的组合至少一个周期的患者预先定义的条件下，将允许进行由BLRM指导的第二药剂的患者自身剂量递增。
将在21天周期中施用组合治疗直至疾病进展，其中组合治疗期间的肿瘤评定将与再计算的基线(即在部分I或之前研究中式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗时导致PD评定的肿瘤评估结果)进行比较。
分子预筛选
为进入研究的筛选期，患者必须具有BRAFV600突变的书面文件，其应在新鲜肿瘤活检时于当地获得(优选)或可使用最新归档的肿瘤样品。然而，在考虑加入到该研究中的时候分子状况未知且所具有的肿瘤未在当地实验室常规筛选BRAF突变并需要收集新鲜肿瘤的患者将签署分子预筛选知情同意书，以使得可收集新鲜肿瘤样品进行突变状况的当地评定。仅在已知或确定BRAFV600突变状况后，患者才允许签署主要研究知情同意书且开始筛选。
筛选
在已知或确定BRAFV600突变状况后，患者才允许签署主要研究知情同意书且开始筛选。所有筛选评估均要求在施用研究治疗前执行。
治疗期
将存在两个治疗部分：部分I和部分II：
部分I＝单一药剂治疗期且将在第1个周期第1天开始直至开始组合治疗。
部分II＝组合治疗，应在来自复发时收集的肿瘤活检样本的遗传变化已知后开始。
研究治疗将在21天周期期间施用且将持续直至疾病进展(在双重组合治疗时)、不可接受的毒性、撤回知情同意书或死亡。
患者群体
将在患有具有经确认的BRAFV600突变的局部晚期或转移性黑素瘤的成人患者中进行研究。
加入试验的第一部分(部分I)的患者必须未曾用过选择性BRAF抑制剂。
之前用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗的患者若在复发时收集肿瘤活检样本则可直接加入到部分II中。
加入到该研究中的患者不允许参与平行研究药物或装置研究。此外，完成该研究的患者不可再加入到第二疗程中。
研究者或被指定者必须确保在研究中仅向满足所有以下纳入标准且不满足任何排除标准的患者提供治疗。
纳入标准
患者未曾用过式(I)的B-Raf抑制剂(适于部分I)。
适于纳入该研究中的患者必须满足所有以下标准：
开始给药时年龄≥18岁
能够理解且自愿签署知情同意书，并能够遵守研究访视计划和其它方案要求。必须在筛选程序前获得书面的知情同意书
组织学上确诊不可切除的III期或转移性黑素瘤(根据美国癌症联合委员会[AJCC]的IIIC期至IV期)。
书面的BRAFV600突变文件，
在基线时进行新鲜肿瘤活检，且在非医学上不当时患者同意在复发时强制性活检。
如由RECISTv1.1所确定，可测量疾病的证据。
注意：先前的放射疗法或其它局部疗法(例如经皮消融)的区域中的病变不应认为是可测量的，除非从该疗法以来已记录到病变进展。
预期寿命≥3个月
世界卫生组织(WHO)体能状况≤2。
在所有可生育的女性中，第一剂研究治疗前72小时内血清妊娠测试阴性。
在式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗后复发时，必须可获得强制性新鲜活检。
式(I)的B-Raf抑制剂的其它单一药剂研究中记录到进行性疾病的患者可根据抗性概况结果加入部分II，这些抗性概况结果将决定治疗的组合分支分配。
那些患者的进行性疾病必须由进行肿瘤评估评定的之前研究确认。如果记录疾病进展的肿瘤评估与第一剂组合治疗之间的时间间隔大于4周(28天)，则应执行新的肿瘤评估。需要在之前研究的治疗访视结束时所执行的且经由全面基因组分析所表征的活检来分配组合治疗。
排除标准
适于该研究的患者不得满足任何以下标准：
加入到部分I(式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗)中：
之前用RAF-抑制剂治疗
有症状的或未治疗的软脑膜疾病
有症状的脑转移。对于在无皮质类固醇疗法下无症状的这些病症，之前接受了治疗或未治疗的患者将允许加入。通过成像证实脑转移必须稳定至少三个月(例如筛选时完成的脑MRI或CT展示无进行性脑转移的当前证据)。患者不允许接受酶诱导的抗癫痫药物。
已知急性或慢性胰腺炎
包括以下任一者的临床上显著的心脏病：
需要治疗的CHF(NYH等级≥2)，如通过MUGA扫描或ECHO确定LVEF<45％，或不受控的高血压(请参见WHO-ISH指导原则)
临床上显著的室性心律失常或心房纤颤史或存在临床上显著的室性心律失常或心房纤颤
临床上显著的静息性心动过缓
在开始研究药物前，不稳定型心绞痛≤3个月
在开始研究药物前，急性心肌梗塞(AMI)≤3个月
在筛选ECG时QTcF>480毫秒
在基线时具有任何以下实验值的患者：
嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)<1,500/mm3[1.5x109/L]
血小板<100,000/mm3[100x109/L]
血红蛋白<9.0g/dL
血清肌酐>1.5xULN
血清总胆红素>1.5xULN
AST/SGOT和ALT/SGPT>2.5xULN，或如果存在肝转移，则>5xULN
胃肠(GI)功能损伤或可显著改变口服介入药物的吸收的GI疾病(例如溃疡病、不受控的恶心、呕吐、腹泻、吸收不良综合征、小肠切除术)。
以前有或并发有恶性肿瘤。例外：经充分治疗的基底细胞或鳞状细胞皮肤癌；经有疗效地治疗且在进入研究前至少3年无复发证据的子宫颈原位癌；或经有疗效地治疗且在进入研究前至少3年无复发证据的其它实体瘤。
过去6个月内有血栓栓塞或脑血管事件史，包括短暂性缺血性发作、脑血管意外、深静脉血栓形成或肺栓塞。
开始研究药物前≤4周(对于亚硝基脲、丝裂霉素-C为6周)内接受了放射疗法(其包括>30％骨髓储量)、化学疗法、生物学疗法(例如抗体)，或在开始研究药物前在药剂的5个半衰期内(或在未知半衰期时≤4周内)用连续或间歇小分子治疗剂或试验药治疗，或尚未从这样的疗法的副作用(除脱发以外)中恢复的患者。
开始研究药物前最后2周内经历了任何重大外科手术或不能从之前的外科手术中完全恢复的患者。
已知人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
可增加与研究参与或研究药物施用有关的风险或可干扰研究结果的判读和在研究者判断下将使患者不适于该研究的其它严重、急性或慢性医学或精神病症或实验异常。
怀孕或哺乳(泌乳)妇女，其中怀孕定义为女性在受孕后直至妊娠结束的状态，其通过阳极hCG实验室测试(>5mIU/mL)确认。定义为生理上能够受孕的可生育妇女不允许参与该研究，除非其使用高度有效的方法在整个研究期间且在研究药物中断后10天避孕。
允许停经后妇女参与该研究。妇女在其12个月自然(自发)闭经且具有适当的临床概况(例如年龄适当、血管舒缩症状史)或六个月自发闭经且促卵泡激素(FSH)水平>40mIU/mL或在筛选前至少六周进行了外科双侧卵巢切除术(进行或不进行子宫切除术)或输卵管结扎时被认为是停经后且不能生育的。在仅进行卵巢切除术的情况下，仅当该妇女的生殖状况已由后续激素水平评定确认时才认为其是不可生育的。
性活跃男性在服用该药物时且在停止治疗后3个月内在性交期间必须使用安全套且不应在此期间孕育子女。还要求切除输精管男性使用安全套以防止经由精液传递药物。
研究治疗
待用于该研究的试验药物为式(I)的B-Raf抑制剂、化合物B、化合物F、化合物H、化合物G和化合物C。
这些研究治疗为：
部分I：式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂
部分II：双重组合
式(I)的B-Raf抑制剂(每天一次)和化合物B(每天两次)
式(I)的B-Raf抑制剂(每天一次)和化合物F(每天一次)
式(I)的B-Raf抑制剂(每天一次)和化合物H(每天一次)
式(I)的B-Raf抑制剂(每天一次)和化合物G(每天两次)
式(I)的B-Raf抑制剂(每天一次)和化合物C(每天一次)
给药方案
表2剂量和治疗计划
施用式(I)的B-Raf抑制剂+第二药剂的说明
式(I)的B-Raf抑制剂、化合物F、化合物H和化合物C将以每天一次计划(QD)以平稳固定剂量而非根据体重或体表面积经口施用。
每天一次给药：应指导患者每天在早晨用一大杯水(约250ml)服用式(I)的B-Raf抑制剂(和化合物F、化合物H或化合物C)胶囊。对于所有剂量施用，患者应在研究药物摄入之前和之后保持空腹2小时。若患者忘记在早晨服用剂量，则其应在错过的剂量后6小时内服用该剂量。若已经过去6小时以上，则应扣除该天的剂量且患者应继续用下一计划的剂量治疗。若出于任何原因未食用早餐，则患者仍应用一杯水服用计划的早晨剂量。若这种情况在完整PK取样之日发生，则应进行记录。
化合物B和化合物G将以每天两次计划(BID)以平稳固定剂量而非根据体重或体表面积经口施用。
BID给药：化合物B或化合物G的剂量应隔12±2小时服用。将指导患者每天在早晨和傍晚用一大杯水(约250ml)服用剂量。对于式(I)的B-Raf抑制剂和化合物G组合，对于所有剂量施用，患者应在研究药物摄入之前和之后保持空腹2小时。对于式(I)的B-Raf抑制剂和化合物B组合，在所有早晨剂量施用日，患者不应在研究药物摄入前2小时内食用任何食物且在式(I)的B-Raf抑制剂和化合物B摄入后禁止饮食2小时。对于所有傍晚药量施用，患者应在化合物B摄入之前和之后保持空腹1小时。注意，两种药物(式(I)的B-Raf抑制剂+化合物B或化合物G)应在早晨一起服用且仅BID施用的药物(化合物B或化合物G)应在傍晚服用。
在执行PK取样之日的施用说明：
应在即将摄入剂量之前收集给药前PK样品。
在每次访视时，负责的现场人员将确保施用适当剂量的各研究药物且将为患者提供研究药物的正确量以用于后续给药。将指导患者在每次访视时归还未使用的研究药物至研究中心(site)。
应指导患者将胶囊/片剂整个吞咽而非咀嚼或将其压碎。
任何遗漏剂量不应在下一计划的给药期间或在后一天替换或补足，适用于任一者。
在整个研究期间且优选在第一剂研究药物前7天，患者必须避免食用葡萄柚、石榴、杨桃、塞维利亚橙(Sevilleorange)或含有每一者的汁液的产品，因为CYP3A4可能与研究药物相互作用。允许食用橙汁。
若在治疗过程中发生呕吐和/或腹泻，则在下一计划的剂量前不允许向该患者再次给药。给药后4小时内的任何呕吐和/或腹泻(或大便频率增加)的发生和频率必须标注在eCRF的AE部分中。另外，在完整PK取样之日，在该日给药后前4小时内的任何呕吐事件的发作时间必须标注在相应的剂量施用记录PKeCRF中。
研究者或负责的研究中心人员应指导患者按照方案服用研究药物(提高顺应性)。研究期间所开具且分配至患者的所有剂量和所有剂量变化及所有错过的剂量均必须记录在剂量施用记录eCRF上。必须定期执行药物问责(drugaccountability)。将指导患者在各周期结束时归还未使用的研究药物至研究中心。在每次访视时，研究中心人员将确保施用适当剂量的各研究药物且为患者提供药物的正确量以用于后续给药。
仅针对式(I)的B-Raf抑制剂与化合物F的组合分支
在执行空腹血浆葡萄糖监测之日的施用说明：在空腹血浆葡萄糖监测之日，患者必须保持空腹过夜，保持血液采集之前空腹至少8小时。空腹血浆葡萄糖抽取后可食用清淡早餐/点心。式(I)的B-Raf抑制剂(和适用时化合物F)可在早餐后2小时施用。患者应在施用式(I)的B-Raf抑制剂(和适用时化合物F)后继续保持空腹2小时。
治疗持续时间
患者可用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂持续治疗直至经历不可接受的毒性，和/或在研究者判断下或在撤回同意时中断治疗。在疾病进展时，式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗后，患者将根据复发活检中所鉴定的遗传变化分配至组合治疗。患者可持续组合治疗直至经历不可接受的毒性、疾病进展和/或在研究者判断下或在撤回同意时中断治疗。
剂量递增指导原则
起始剂量基本原理。
式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂
对于加入该试验的第一部分中的患者，式(I)的B-Raf抑制剂的剂量设定在450mgQD，其对应于单一药剂RP2D。起始剂量的选择遵循用于选择在患有癌症的患者中所进行的首次用于人类的试验(first-in-humantrial)的起始剂量的ICHS9指导原则且示于表6-2中。
式(I)的B-Raf抑制剂与化合物B的组合：
式(I)的B-Raf抑制剂加上化合物B的起始剂量设定在600mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和45mgBID的化合物B，或经证明为安全的最高剂量组合。
式(I)的B-Raf抑制剂与第二药剂(化合物F、化合物H、化合物G或化合物C)的组合：
在该试验的第二部分中，式(I)的B-Raf抑制剂和第二药剂的起始剂量将分别为450mgQD(RP2D)、或式(I)的B-Raf抑制剂的可耐受最高末次剂量和BLRM所允许的第二药剂的最高剂量(参见表3)。
式(I)的B-Raf抑制剂的RP2D据宣布为450mgQD。
定性DDI评定预测出：式(I)的B-Raf抑制剂或化合物F共施用时对它们的暴露无显著影响。使用SimCYP模拟的定量分析确认了该评定。因此，该组合对的起始剂量经选择对于式(I)的B-Raf抑制剂为当前确立的RP2D且对于化合物F为75％MTD：450mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和75mg的化合物F。
使用Simcyp模拟的定量DDI评定预测出：在式(I)的B-Raf抑制剂与化合物H共施用时，式(I)的B-Raf抑制剂暴露的变化极小。在450mg的式(I)的B-Raf抑制剂剂量下，预期化合物H的暴露(Cmax和AUC))降低20-40％。因此，该组合对的起始剂量经选择对于式(I)的B-Raf抑制剂为当前确立的RP2D且对于化合物H为60％MTD：450mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和75mg的化合物H。
使用Simcyp模拟的定量DDI评定预测出：在共施用450mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和150mgBID的化合物G时，式(I)的B-Raf抑制剂的AUC和Cmax分别增加76％和43％，并且化合物G的AUC和Cmax分别降低54％和36％。在临床上，已以高达700mgQD的剂量测试了式(I)的B-Raf抑制剂并且所观察到的不良事件为可逆且可管理的，因此两个分子之间的可使得式(I)的B-Raf抑制剂浓度高于当前确立的RP2D的潜在DDI不会造成风险，因为不良事件可监测、可管理且可逆。该组合对的起始剂量经选择对于式(I)的B-Raf抑制剂为当前确立的RP2D且对于化合物G为50％MTD：450mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和150mg的化合物G。
使用Simcyp模拟的定量DDI评定预测出：在共施用450mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和300mg的化合物C时，式(I)的B-Raf抑制剂的AUC和Cmax分别增加43％和20％，并且化合物C的AUC和Cmax分别降低43％和37％。在临床上，已以高达700mgQD的剂量测试了式(I)的B-Raf抑制剂并且所观察到的不良事件为可逆且可管理的，因此两个分子之间的可使得式(I)的B-Raf抑制剂浓度高于当前确立的RP2D的潜在DDI不会造成风险，因为不良事件可监测、可管理且可逆。该组合对的起始剂量经选择对于式(I)的B-Raf抑制剂为当前确立的RP2D且对于化合物C为当前以900mgQD的剂量水平测试的剂量的约23％，因为其最大耐受剂量(MTD)尚未实现：450mgQD的式(I)的B-Raf抑制剂和200mg的化合物C。
在该研究中，将尽快在稳态下评估所有组合搭配物及其活性代谢物(适用时)的药代动力学且与相应单一疗法研究中所得的那些进行比较以评定潜在的药物-药物相互作用。
在给予第一个患者这些组合中的一个之前，将用得自进行中的单一药剂试验的最新数据更新该组合的贝氏模型，以确认式(I)的B-Raf抑制剂和第二药剂的所建议起始剂量仍适当(即满足EWOC标准)。如果所建议的起始剂量不满足该标准，则将使用满足EWOC标准的较低剂量组合。
临时剂量水平
表3描述可在该试验期间评估的组合的研究治疗的起始剂量和临时剂量水平。如果认为非当前规定的其它剂量水平的加入和其他患者以已测试的剂量水平加入为提供最佳安全性及耐受性、药代动力学和药效动力学数据所必需，则可进行这些变化。
表3临时剂量水平
*在研究过程中可添加其它和/或中间剂量水平，或可以低于MTD的任何剂量水平添加研究队列以充分了解安全性、PK或PD。
**剂量水平-1和-2还将用于需要从起始剂量水平减少剂量的患者。该研究不允许低于剂量水平-2的剂量减少。
剂量递增确定的实施
在该周期的前21天中在评估个体患者对双重组合的耐受性后将进行第二药剂的剂量递增的确定。
为实施剂量递增确定，将在剂量确定期间评估可获得的毒性信息(包括非DLT的不良事件和实验室异常)、BLRM的建议和可获得的PK及PD信息。直至研究者收到表明已评估前一剂量水平的结果且允许进行较高剂量水平的书面确认后才可以按下一较高剂量水平施用药物。如果确定递增至较高剂量水平，但以前一剂量水平治疗的一个或多个其他患者在第一治疗周期中经历DLT，则在任何其他患者以该较高剂量水平加入前将用该新信息更新BRLM。
剂量递增过程将逐步实施且用3个患者的队列进行。仅第二药剂、化合物F、化合物H、化合物G或化合物C将根据BLRM递增。
在用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂治疗的部分I内的任何时间均不允许进行患者自身的剂量递增。
在用组合治疗的第二部分期间，允许进行第二药剂的患者自身剂量递增，式(I)的B-Raf抑制剂+化合物B分支中的患者除外，其将以式(I)的B-Raf抑制剂和化合物B(45mgBID)的组合的所宣布的RP2D治疗。
为使患者以化合物F、化合物H、化合物G或化合物C的较高剂量治疗，其必须耐受较低剂量组合至少1个疗法周期(例如其不得在最初分配的一对较低剂量下经历CTCAE等级≥2的毒性，因为无法排除该毒性与研究药物的关系)。此外，待用来治疗患者的一对新的较高剂量必须满足用于患者自身递增的改良EWOC标准(添加参考章节)。
下一队列中新加入的患者将以末次剂量递增会议所确定的剂量开始治疗。随后将为下一队列更新贝氏逻辑回归模型(BLRM)和患者自身剂量界限。
治疗中断和治疗中止
如果患者需要对式(I)的B-Raf抑制剂、化合物B、化合物F、化合物H、化合物C或化合物G从下一计划剂量的预期日期起>连续21天的剂量延迟，则该患者应从该研究治疗中止。在例外情形下，如果患者明显受益于研究治疗(即稳定的疾病、部分反应、完全反应)且研究者认为不存在安全性担忧，则患者可以按基于安全性而调节的剂量水平保留在研究治疗中。
分子预筛选
分子预筛选知情同意书
必须在任何研究相关分子预筛选程序前签署分子预筛选知情同意书(在已评定BRAF的突变状况不属于该研究时不适用)。这仅适用于部分1患者。
新鲜或归档活检样本的BRAF突变状况
为进入研究的筛选期，患者必须具有BRAFV600突变的书面文件，其应在新鲜肿瘤活检时于当地获得(优选)或可使用最新归档的肿瘤样品。必须在任何研究相关分子预筛选程序前签署分子预筛选知情同意书(在已评定突变状况不属于该研究时不适用)。
通过指定的当地实验室确认BRAFV600密码子(例如V600E/K/D/R)的突变且由研究中心记录后，患者可开始筛选程序。
治疗期
治疗期分成两个部分：
部分I：将在21天(3个日历周)的周期中将式(I)的B-Raf抑制剂连续给予未曾用过BRAF抑制剂的患者，其在周期1的第1天开始。周期之间将无计划的间隔。患者将接受式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂，直至在发生疾病进展或不可接受的毒性(无论何者首先发生)后开始组合治疗为止。
部份II：接受式(I)的B-Raf抑制剂至少一个21天的周期且发生进展的患者将基于复发时肿瘤活检中所鉴定的遗传变化进入部分II中以接受式(I)的B-Raf抑制剂+第二药剂的治疗组合。
无固定的治疗持续时间；患者可用式(I)的B-Raf抑制剂单一药剂继续治疗，直至组合治疗为止，以及在第一疾病进展期间发生了妨碍任何进一步治疗的不可接受的毒性和/或在研究者判断下或因患者拒绝(撤回同意)而中断治疗为止。在第一疾病进展时，已知活检的分析结果后，患者可开始用式(I)的B-Raf抑制剂+第二抑制剂组合治疗，直至第二疾病进展、发生了妨碍任何进一步治疗的不可接受的毒性和/或在研究者判断下或因患者拒绝(撤回同意)而中断治疗为止。
尽管患者要求>21天的剂量中断，但因患者经历了临床获益的客观证据且研究者认为患者保留在研究中具有最佳利益，则患者保留在研究中。
贝氏逻辑回归模型
由EWOC原理指导的自适应BLRM将指导每种研究药物(化合物F、化合物H、化合物G或化合物C)与式(I)的B-Raf抑制剂的组合至其相应的MTD/RP2D的剂量递增。对于各组合，将对整个剂量递增期间所收集的周期1剂量限制毒性数据(即不存在或存在DLT)拟合组合治疗的5参数BLRM，以模拟与式(I)的B-Raf抑制剂组合给予的化合物F、化合物H、化合物G或化合物C的剂量-毒性关系。
附录1中提供BLRM的定义、模型参数的先验分布(以关于靶向剂当前可获得的信息为基础)和DLT率的相关先验分布。
剂量推荐
组合搭配物的剂量推荐受限于进入部分II的患者之间可能不同的式(I)的B-Raf抑制剂的剂量。该推荐将基于DLT率的后验概述，其包括平均值、中值、标准偏差、95％可信区间和各剂量组合的真实DLT率在以下种类之一中的概率：
[0％,16％]剂量不足
[16％,35％]靶向毒性
[35％,100％]过度毒性
按照EWOC的原理，在各患者队列后，推荐的剂量组合是这样的组合，其在满足以下超剂量标准的剂量之间的目标区间[16％,35％]中具有DLT的最高后验概率：存在低于25％几率的过度毒性。另外，两种研究药物的队列内最大组合剂量递增限于100％，其中100％是指各研究药物的相对递增的总和，即对于式(I)的B-Raf抑制剂(其剂量不能超过450mg)以及对于第二靶向剂(可用时其不能递增至超过其s.a.MTD/RP2D)分别为0％和100％。
组合搭配物的患者自身剂量递增将限于50％且将由BLRM根据反映个体患者耐受性的以下改良EWOC标准指导：患者的自身剂量将能够递增至存在低于40％几率的过度毒性的剂量。此外，如果在某一剂量水平下在2个或更多个患者中观察到CTCAE2级的治疗相关毒性或如果任何患者经历3级或更高的毒性，则组合搭配物的剂量增加将≤任何后续剂量增加的25％。
剂量递增会议上将使用可获得的毒性信息(包括非DLT的AE)、PK、PD和功效信息以及来自贝氏模型的建议的临床综合结果来确定下一队列的剂量组合。研究者和试验人员将参与决策。
如果队列中的前2个可评估患者在第3个患者加入前经历DLT，则将在任何其他患者加入该队列前再评估任何组合的模型。各组合的最终推荐MTD/RP2D将基于对来自BLRM的建议的考虑以及基于安全性的整体评定，该整体评定考虑到来自所测试的所有不同剂量组合的后续周期的耐受性数据。
实施例2
材料和方法
在DMSO中制备化合物储液，其最终浓度为10mM。在适当的细胞培养基中以3倍增量连续稀释工作储液以获得在2.7μM至1.2nM范围内的最终测定浓度。
细胞系、细胞培养物、细胞活力测量
A-375和WM-266-4细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将A-375细胞培养于DMEM培养基(ATCC)中，且将WM-266-4细胞培养于EMEM培养基(ATCC)中，这两种培养基均补充有10％胎牛血清(Gibco)，然后在37℃/5％CO2下温育。从Novartis-Emeryville获得经工程改造以表达常见的指示抗性的等位基因的细胞系。这些抗性模型包括表达突变型MEK1P124L、截短型p61-BRAFV600E或突变型NRASQ61K的A-375细胞，以及表达突变型MEK1C121S、截短型p61-BRAFV600E或突变型NRASQ61K的WM-266-4细胞。将这些细胞培养于具有选择标记物G418且存在5uMLFE158(MEK突变体)或LIH720(截短型p61-BRAFV600E)的适当的母培养基中。
板布局、细胞分配和化合物添加
对于筛选，使用具有8通道标准盒的MultiDropCombi(Thermo-Fisher)将细胞以每孔500(A-375)或750(WM-266-4)个的细胞密度接种于384孔板(ThermoScientific，目录号4332)中的80ul培养基中。为促使细胞在整个孔中均匀分布，将细胞在1000RPM下短暂离心并在室温下温育30分钟。在37℃、5％CO2下温育所有板24小时，随后添加化合物。在适当的培养基中新鲜制备化合物储液，并使用配有200nl针式工具的PAA机器人添加。在最少三个重复孔中，均通过经由CellTiterGlo(Promega)根据制造商的方案对细胞ATP水平定量以及通过显微成像来评定72小时后单一药剂和组合的作用。对于成像，将细胞固定于板并经由WellMate分配器以受控的分配速度用10％PFA、0.3％TX-100于PBS中的溶液透化。用Hoechst33342(H3570,Invitrogen)将细胞核染色，并通过BioTek洗涤器执行所有必需的洗涤步骤。
自动化图像分析
得自InCellAnalyzer2000(GEHealthcare,28-9534-63)的图像为TIFF格式且具有2048x2048像素的大小，从而捕获384孔板的所有孔。使用开放源代码中的定制脚本、统计编程语言R和BioConductor软件包EBImage的函数建立自动化图像分析流程。目标是作为细胞活力的近似值对每个孔的活(细胞)核的数量定量。该流程由七个步骤构成：(I.)使图像平滑以减少强度峰的数量，(II.)应用阈值函数分离前景(信号)与背景(噪声)，(III.)鉴定前景中作为细胞核的种子的局部最大值，(IV.)滤除极为贴近的局部最大值，(V.)从剩余局部最大值使细胞核繁殖，(VI.)以及从繁殖的细胞核提取目标特征(细胞核数量、尺寸特征和强度特征)。作为最后一步(VII.)，为排除对碎片(例如破裂的细胞核)进行计数，分别使用在DMSO和星形孢菌素(Staurosporin)处理的孔中所鉴定的目标来获得活的和破裂的细胞核的特征分布。使用这些分布来设定区分活细胞核与破裂细胞核的截止值。从所鉴定的目标的总数减去破裂细胞核的数量，并将结果报道为该孔的最终计数。
数据归一化
数据包含各处理(化合物)条件-DMSO处理孔的42个重复样和星形孢菌素处理孔的两个重复样的三个重复测量结果。将数据归一化至DMSO测量结果的中值，且通过计算三个重复测量的中值来概述。将数据导入Chalice中以计算化合物协同作用。
实施例3
在七个BRAF突变CRC衍生细胞系中RAF激酶抑制剂(式(I)化合物)和PIK3Cα激酶抑制剂(化合物X)的单一药剂和组合对增殖的作用。所有细胞系均表达BRAFV600E蛋白。在PI3Kα基因中具有已知或推定的活化突变的细胞用(*)标记，而PTEN缺失的细胞用(#)标记。在72小时celltitergloTM测定中测量了细胞增殖，且所提供的所有结果均为至少三次重复测量的结果。示出了式(I)化合物和化合物X的单一药剂IC50值。表6中针对各组合给出了50％作用水平下的协同作用评分(SS)测量结果以及组合指数(CI50)。当SS值≥2.0且CI值≤0.5时，认为相互作用为协同作用。当SS值≥2.0但CI值>0.5或SS值<2.0但CI值≤0.5时，认为相互作用为相加作用/协同作用。当SS值<2.0且CI值>0.5时，相互作用称为相加作用。协同作用的叫法在“作用描述”列中给出。
表6
在BRAFV600E突变CRC细胞系中式(I)化合物与化合物X的组合
实施例4
该实施例研究单一药剂形式和组合形式的式(I)化合物和化合物F在体内对HT-29和RKO细胞系模型的生长的作用。这些抑制剂的浓度和给药计划为每天一次50mg/kg(式(I)化合物)和每天一次32.7mg/kg(化合物F)。所有化合物均在其为单一药剂形式时组合给药。在HT-29模型中在第28天停止给药且在21天后在RKO模型中停止给药。结果分别在图1和图2中报道。
实施例5
所有细胞系均购自ATTC(SK-MEL-5、SK-MEL-24、UACC-62、COLO741、COLO-800、WM-266-4、Colo205、LS411N、SW1417)、ECACC(MDST8)、DSMZ(CL-34)和NCI(LOXIMVI)。根据供应商的建议，将细胞培养于补充有10％(或对于CL-34细胞为20％)FBS(GIBCO，目录号10099-141)的RPMI1640(ATCC，目录号30-2001)或DMEM(ATCC，目录号30-2002)中。将细胞系培养于37℃和5％CO2培养箱中且在T-75烧瓶中扩增。在所有情况下，均将细胞从冷冻储液解冻，经由≥1代使用1:3稀释度扩增，使用ViCell计数器(Beckman-Coulter)计数且评定活力，随后涂于96孔或6孔板中。为使细胞系分裂和扩增，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，目录号25200)从烧瓶取出细胞。如通过在IdexxRadil(Columbia,MO,USA)执行的PCR检测方法所测定，所有细胞系均确定为不含支原体污染，并通过检测一组SNP而正确鉴定。
将式(I)化合物和化合物H以10mM的浓度溶于100％DMSO(Cellgro，目录号25-290-CQC)中且储存在-20℃直至使用。将化合物排列于2ml深96孔板(Greinerbio-one，目录号780271)中，连续3倍稀释七次，得到22nM至16200nM的浓度范围。重组人碱性FGF购自R&Dsystem(目录号233-FB)且以50μg/ml在无菌PBS中复原。在所有实验中其均以固定浓度100ng/ml使用。
对于CellTiter-GloTM测定，将细胞分配于组织培养物处理的96孔板(Costar，目录号3904)中，培养基的最终体积为80μL且密度为每孔3000个细胞。涂布后12至24小时，将20μL各化合物连续稀释液转移至含有细胞的板，通过3倍稀释产生2700nM至3.7nM的化合物浓度范围且最终DMSO浓度为0.16％。各孔的总体积为120μL。温育板72小时并使用CellTiter-GloTM发光细胞活力测定(CTG,Promega)和VictorTMX4酶标仪(PerkinElmer)测定化合物对细胞增殖的作用。对于实时生长测定，将细胞以每孔4000个细胞的密度接种于xCELLigenceE-板(Roche目录号05232368001)中总共90μl的培养基中，且在涂布后24小时，向孔中添加11μl含有或不含化合物的培养基。除LGX818+FGF2处理的COLO741细胞(N＝1)外，对于所有细胞系和处理组，均涂布2-4个重复孔。其中化合物和生长因子的所示最终浓度对于化合物H为1uM，对于FGF2为100ng/ml且对于式(I)化合物为100nM(SK-MEL-5)或500nM(COLO741)。用xCELLigence基于阻抗的实时细胞分析仪每两个小时连续监测细胞持续七天。使用电极在E-板上测量阻抗，其中细胞的表面积覆盖率越高产生的电极阻抗越大。电极阻抗以细胞指数值呈现，且用作细胞活力和数量的指示。在所有情况下，均将细胞指数值归一化为添加化合物后所紧邻的时间点。
对于Western分析，将细胞以每孔5x105个细胞的密度涂布于6孔(Costar，目录号3506)板中的2.0ml完全培养基中。涂布后12至24小时，用各种化合物处理细胞，且在所有实验中，式(I)化合物、化合物H和FGF2均分别以100nM、1.0uM和100ng/ml的最终浓度使用。在新鲜制备的补充有磷酸酶(PhosStop，目录号04906845001)与蛋白酶抑制剂(Roche，目录号11697498001)的细胞裂解缓冲液(CellSignalingTechnology目录号9803)中添加化合物后2小时和24小时收获细胞。通过电泳经由NuPAGE4-12％Bis-Tismidi凝胶(Novex，目录号WG1402BX10)从细胞裂解物分离蛋白，转移至硝酸纤维膜，随后与得自CellSignalingTechnology(Danvers,MA,USA)的抗体一起温育，这些抗体识别p-AKT(S473，目录号4058)、总AKT(目录号2920)、p-ERK1/2(T202/Y204，目录号9101)、总ERK1/2(目录号9107)、p-MEK1/2(S217/221，目录号9121)和β-肌动蛋白(Ambion，目录号AM4302)。与IRDye680RD山羊抗兔IgG(Li-Cor，目录号926-68071)和IRDye800CW山羊抗小鼠IgG(Li-Cor，目录号926-32210)一起温育且用Odyssey红外线成像系统(Li-Cor,Lincoln,NE,USA)扫描后观察Western印迹。
为确定FGFR是否可援救用式(I)化合物处理的BRAFV600E突变黑素瘤细胞系的亚群，在十一个T1799突变BRAF细胞系中在FGFR活化的配体FGF2存在或不存在下检查其抗增殖作用。在FGF2不存在下，六个黑素瘤和五个CRC衍生细胞系中的IC50值分别在3.0至470nM和4.0至185nM的范围内(表7)。六个细胞系所测得的IC50值不受FGF2存在的影响，然而，对于剩余的五个细胞系，对式(I)化合物的反应大大削弱(例如CL-34)或完全消失(例如ls411N)。因此，FGF2的存在能够通过式(I)的B-Raf抑制剂的抗增殖作用援救BRAFV600E黑素瘤衍生细胞系的群。此外，在来源于CRC肿瘤的BRAFV600E突变细胞系中也观察到类似的作用。
表7
在一组BRAFT1799突变黑素瘤和CRC细胞系中存在或不存在100ng/mlFGF2下式(I)化合物的单一药剂IC50值。突变型(mut)和野生型(wt)状况由已发布的数据确定。除了在分别具有V600K和V600D的MDST8(mut*)和WM-266-4(mut**)的情况下，所有BRAF突变均导致V600E取代。PTENmut名称表示PTEN基因的基于突变、基因拷贝数和mRNA表达信息的简要叫法。
为确定FGF2对BRAFV600E黑素瘤细胞系的援救是否取决于FGFR信号传导，检查了选择性FGFR抑制剂化合物H是否可防止FGF2介导的援救。在化合物H存在或不存在下，将由FGF2不同程度援救的两个细胞系(COLO741和SK-MEL-5，表8-1)培养于含有式(I)化合物和FGF2的培养基中，且实时测量生长。
与早前的IC50数据一致，式(I)化合物抑制了两种细胞系的生长，且该生长抑制通过添加FGF2而消除(图3)。作为单一药剂，化合物H未影响任一细胞系(A组，对于SK-MEL-5未示出)的增殖且在FGF2不存在下与式(I)化合物组合时不会有助于其单一药剂活性。在FGF2存在下与式(I)化合物组合时，化合物H恢复抗增殖作用至在FGF2不存在下所观察到的水平。这些结果表明FGF2介导的援救可经由添加选择性FGFR抑制剂化合物H而阻止。
为研究恢复的MAPK或活化的PIK3C信号传导是否可支持FGF2介导的援救，经由磷酸化MEK1/2(MAP2K1/2)、ERK1/2(MAPK1/2)和AKT1/2/3的Western印迹分析来检查FGF2对MAPK和PIK3C信号传导的作用。如图4所示，将COLO741和SK-MEL-5细胞与式(I)化合物一起温育在化合物添加后2小时和24小时均导致MAPK信号传导的显著抑制，其可由磷酸化MEK和ERK两者的水平下降来判定。在COLO741细胞中，在2小时时，AKT的磷酸化水平不受影响，但在24小时时显示出适度下降。相比之下，FGF2和化合物H在以单一药剂形式添加时均不影响2小时或24小时的信号传导。当组合FGF2和式(I)化合物时，相对于单独的式(I)化合物，在处理后两小时观察到信号传导的微弱变化(但在SK-MEL-5细胞中观察到p-ERK的略微增加)，但到24小时，磷酸化MEK和ERK的水平已大体上但非完全恢复。最后，向式(I)化合物/FGF2组合添加化合物H完全消除了FGF2诱导的MAPK和PIK3C信号传导变化。这些数据强烈表明：FGF2对B-Raf抑制剂的抗增殖作用的抑制是由于MAPK信号传导的再活化，且指示化合物H能够完全抑制这些FGF2诱导的信号传导变化。
实施例6
目的：评估式(I)化合物和CDK4抑制剂化合物C的组合在HMEX1906原发性黑素瘤模型中的功效，该模型在5mg/kg式(I)化合物存在下生长且耐受5mg/kg式(I)化合物(HMEX1906-R5)
药物配制：在0.5％MC/0.5％Tween80中配制化合物C且在20％PEG300/3％ETPGS中配制式(I)化合物。
将肿瘤剁/切成细胞系样悬液(肿瘤均质化)。添加7mL基质胶和1.5mLHBSS。在手掌中温热悬液直至基质胶变稠，然后用18G针皮下植入雌性裸鼠右侧腹部。
植入后18天将小鼠分配至以下组中，其中平均肿瘤体积为266mm3且平均体重为25克。
组：10只小鼠/组，途径为经口，给药体积为0.2mL
组1：媒介物，0mg/kgbidx14
组2：化合物C，250mg/kgqdx21
组3：式(I)化合物，5mg/kgbidx21
组4：化合物C250mg/kgqdx21+式(I)化合物5mg/kgbidx21
结果：
*3只小鼠由于大肿瘤而被实施安乐死。

Claims (15)

1.一种用于治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括：
(a)从所述患者获得肿瘤样品并测试选自包括BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的组的基因中的遗传变化，
(b)施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂基于所述肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择，其中，
(i)当所述肿瘤样品具有BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中的遗传变化时，所述第二抑制剂为Mek1/2抑制剂，或
(ii)当所述肿瘤样品具有CCND1、CDK4或P16中的遗传变化时，所述第二抑制剂为CDK4抑制剂，或
(iii)当所述肿瘤样品具有HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的遗传变化时，所述第二抑制剂为PI3激酶抑制剂，或
(iv)当所述肿瘤样品具有cMET中的遗传变化时，所述第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂，
(v)当所述肿瘤样品具有FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化时，所述第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述B-Raf抑制剂为式(I)化合物式(I)化合物
3.根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括：
(a)从所述患者获得肿瘤样品并检测BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中的遗传变化，和
(b)向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂是为化合物B的Mek1/2抑制剂。
4.根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括：
(b)从所述患者获得肿瘤样品并检测CCND1、CDK4或P16中的遗传变化，和
(d)向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂为CDK4抑制剂。
5.根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括：
(a)在疾病进展后从所述患者获得肿瘤样品并检测HER2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的遗传变化，和
(b)向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂为PI3激酶抑制剂。
6.根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括：
(a)获得肿瘤样品并检测cMET中的遗传变化，和
(b)向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂为c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂。
7.根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括：
(a)从所述患者获得肿瘤样品并检测FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化，和
(b)向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂为FGFR激酶抑制剂。
8.一种治疗性组合，其包含式(I)的B-Raf抑制剂和为化合物F的第二抑制剂或其药学上可接受的盐，供单独、同时或序贯施用。
9.一种治疗性组合，其包含式(I)的B-Raf抑制剂和为化合物G的第二抑制剂或其药学上可接受的盐，供单独、同时或序贯施用。
10.一种治疗性组合，其包含式(I)的B-Raf抑制剂和为化合物H的第二抑制剂或其药学上可接受的盐，供单独、同时或序贯施用。
11.一种治疗罹患特征为B-Raf中的V600突变的增生性疾病的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求8、9或10中的任一项所述的组合。
12.根据权利要求8、9或10中的任一项所述的组合的用途，其用于制备用以治疗或预防增生性疾病的药物组合物或药物。
13.一种用于选择待与B-Raf抑制剂组合的第二抑制剂的诊断方法，其中测试肿瘤样品的包括B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的一组基因中的遗传变化。
14.一种诊断药盒，其用于检测包括B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16的一组基因中的遗传变化。
15.根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中所述增生性疾病是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤。
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