CN105199978A - 一种用于畜禽养殖的凝结芽孢杆菌制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于畜禽养殖的微生物制剂-凝结芽孢杆菌及其制备方法，属于畜禽养殖添加剂的技术领域。该制剂按重量可溶性淀粉2-5％，酵母膏0.5-1％，蛋白胨0.5-1.5％，豆粕1.0-1.5％，水补足至100％配制成发酵培养基；以保藏编号为CCTCC？No:M？2011422的凝结芽孢杆菌(Bacillus？coagulans)BFS-2菌株为菌种，经各级发酵后制备而成。该制剂价格低廉，菌数含量高，保质期一年半以上，应用后能有效抑制养殖动物肠道中有害菌的生长，改良养殖动物的肠道微生态环境，降低腹泻发生率；同时能有效地促进饲料的利用，降低养殖成本，提高养殖效益；可在畜禽养殖场推广使用。<!-- 2 -->

Description

一种用于畜禽养殖的凝结芽孢杆菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及畜禽养殖添加剂领域，尤其涉及一种用于畜禽养殖的微生物制剂-凝结芽孢杆菌及其制备方法。

背景技术

近年来，随着养殖业集约化、规模化的迅猛发展，养殖动物病害爆发越来越频繁，危害也越来越大，养殖动物病害已经成为限制养殖业发展的瓶颈。

抗生素等化学药剂在养殖业中的应用已有几十年的历史，对预防动物疾病，提高养殖业的产量和质量起到了积极的作用。但随着认识的不断深入，人们发现长期使用抗生素会破坏畜禽消化道内的微生物区系，使动物机体对抗生素产生抗药性，以及抗生素在畜禽产品中的残留等，已经直接影响到人类的健康和生态环境的安全。因此寻找能够克服上述弊端的抗生素替代物，开发新型安全的绿色饲料添加剂，已成为国内外学者关注和研究的热点。

微生态添加剂是一种采用营养缓释技术、生物发酵技术和特殊生产工艺培养而成的一种多功能微生物制剂，它既不会产生抗药性，又无药物残留等问题，被认为是取代抗生素最具潜力的饲料添加剂，得到了越来越多的重视。目前乳酸菌、芽孢杆菌是应用最为广泛的微生态制剂。乳酸菌能为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素，有直接促进生长的作用。芽孢杆菌能产生蛋白酶、脂肪酶、可溶性淀粉酶等活性物质，还能分泌抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，对促进动物体内乳酸菌、双歧杆菌等有益厌氧微生物的生长，维持微生态平衡起到重要作用。因此，集中两者优点的产乳酸芽孢杆菌的研究在近年来成为了益生菌菌株研发的热点。在发达国家已得到较多应用的凝结芽孢杆菌是饲用产乳酸芽孢杆菌中最重要的一种，它不仅具有乳酸菌的所有特点，由于能产生芽孢，它还具有芽孢杆菌所有的独特性，是当前较好的动物保健品种之一。早在1989年，美国FDA就公布了41种可用于饲料的安全菌株，1992年再次批准42种，其中凝结芽孢杆菌排在第一位。我国对凝结芽孢杆菌的研究开发起步较晚，近年来国内对凝结芽孢杆菌的研究多集中在医学方面，并已取得了很好的疗效。用于治疗肠道菌群紊乱引起的肠炎、腹泻、便秘、消化不良等，效果显著。因此，开发出功能强，成本低、针对性强的畜禽养殖用微生态制剂已成为国内外研究的重点。

发明内容

本发明目的在于，利用从自然环境中筛选的高效菌种，运用统计学方法和现代生物发酵工程技术与手段，进行低成本、高密度产业化生产和先进的后处理加工工艺，作为抗生素的替代物应用于养殖业，对促进畜牧业增产、增效及健康持续发展，具有显著的经济效益和开发前景。本发明的另一目的是提供一种该微生物制剂的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种用于畜禽养殖的凝结芽孢杆菌制剂,其中，该制剂包括保藏在在中国武汉，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株。

种凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)BFS-2菌株：

我们从断奶仔猪肠道、菜园土壤、泡菜等不同来源中分离具有较高产酸能力的微生物菌株，并结合细菌的形态特征、生理生化指标，16SrRNA分子鉴定等方式对获得的高效菌株进行鉴定；并在此基础上，对获得的凝结芽孢杆菌的抑菌活性进行初步分析。结果表明，从上述各种不同来源中总共分离得到产酸菌株43株，在经过产酸试验和耐酸、耐胆盐试验初步筛选后，确定了3株微生物菌株。经过后续生理生化和分子鉴定，这3株均为凝结芽孢杆菌。抑菌结果表明，这3株凝结芽孢杆菌对芽孢类杆菌的抑制效果较差，对大肠杆菌等肠道条件致病菌的抑制情况较好，其中综合效果最好的菌株为BFS-2，该菌株取样分离自浙江杭州的一个菜园。

保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征：

凝结芽孢杆菌BFS-2菌株：属芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)；革兰氏阳性菌，在MRS液体培养基中生长良好，细胞杆状，有芽孢；在MRS琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整齐，规则，灰白色，表面有光泽。

该BFS-2菌株已于2011年11月25日，在中国武汉，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNo:M2011422。

另一方面，本发明提供一种制备用于畜禽养殖的微生物制剂-凝结芽孢杆菌制剂，

该制剂可按以下方法获得：以马铃薯葡萄糖固体培养基为斜面培养基；以马铃薯葡萄糖液体培养基为摇瓶菌种培养基；按重量可溶性淀粉2—5％，酵母膏0.5—1％，蛋白胨0.5—1.5％，豆粕1.0—1.5％，水补足至100％配制成种子罐和发酵罐发酵培养基；以保藏编号为CCTCCNo:M2011422的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)BFS-2菌株为菌种，经各级发酵后制备而成活菌数为1X10⁸CFU/g的凝结芽孢杆菌。

用于畜禽养殖微生物制剂-凝结芽孢杆菌制剂的制备方法，按以下步骤进行：

(1)各级培养基的配制，其中：

a)斜面培养基：马铃薯葡萄糖固体培养基，备用；

b)摇瓶菌种培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基，备用；

c)种子罐发酵培养基：按重量可溶性淀粉2—5％，酵母膏0.5—1％，蛋白胨0.5—1.5％，豆粕1.0—1.5％，水补足至100％；

d)发酵罐培养基：按重量可溶性淀粉2—5％，酵母膏0.5—1％，蛋白胨0.5—1.5％，豆粕1.0—1.5％，水补足至100％；

(2)斜面菌种的培养：将保藏菌种：CGMCCNo.2288凝结芽孢杆菌BFS-2菌株接种于步骤(1)斜面培养基上，在28—37℃的培养箱中培养18—24小时，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；

(3)摇瓶菌种扩增：在无菌操作下，取一环斜面菌种接入60ml步骤(1)摇瓶菌种培养基中，于28—37℃，110—220转/分的摇床中，培养18—24小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；

(4)种子罐发酵：将步骤(1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐内温度121℃保持30分钟后，保压至0.1MPa，进行蒸汽高温灭菌后冷却至28—37℃；在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入步骤(3)摇瓶菌种，接种量为5—10％；开动搅拌机在转速110—220转/分，温度28—37℃，通气量4m³/h，罐压0.02—0.06MPa，pH自然，培养18—24小时,备用；

(5)批量产品的制备：将步骤(1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐内温度121℃，保压至0.1MPa，保持30分钟后把培养基冷却至28—37℃；通过移种管道向发酵罐内接入步骤(4)种子罐菌种，接种量为5—10％；开动搅拌机在转速110—220转/分，温度28—37℃，通气量20m³/h，罐压0.02—0.06MPa，pH自然，培养18—24小时,取样检验，根据产品质量标准进行后处理(产品形态根据客户需要生产成固体或者液体)，灌装，封口，即成用于畜禽养殖的微生物制剂，其中，凝结芽孢活菌数为1X10⁸CFU/g。

畜禽养殖微生物制剂-凝结芽孢杆菌的应用方法：每吨饲料中按质量百分比为0.005-0.1％的用量添加微生物制剂-凝结芽孢杆菌，搅拌均匀后直接饲喂，其中，该制剂包括保藏在在中国武汉，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株或该菌株的培养产物。这里的浓度可以为0.005％，0.05％，0.1％中的任何比值。

在一些优选的方式中，凝结芽孢杆菌的质量百分比为0.05％。

在一些优选的方式中，凝结芽孢活菌数为1X10⁸-5X10⁸CFU/g。

对于保藏细菌的生物学特性说明

该细菌菌株BFS-2保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号码为CCTCCNo:M2011422，地址：中国武汉，拉丁学名：Bacilluscoagulans，中文名称为：凝结芽孢杆菌，保藏日期：2011年11月25日。

本发明的有益效果

1、本发明采用了液体发酵的发酵模式，以保藏的凝结芽孢杆菌BFS-2菌株为培养菌种，并通过对该菌的习性研究与各因素的影响试验，确定适合的C、N比，生长温度、接种量和培养基的配方，辅以最适宜的制备工艺与方法，所制菌剂产品能有效抑制养殖动物肠道中有害菌的生长，改良养殖动物的肠道微生态环境，降低腹泻发生率；同时能有效地促进饲料的利用，降低养殖成本，提高养殖效益；

2、在21日龄杜×长×大断奶仔猪中分别添加浓度为0.05％和0.1％的凝结芽孢杆菌，并不添加抗生素，进行为期52d的饲养试验。试验结果表明：与对照组相比，在日粮中添加凝结芽抱杆菌后，断奶仔猪的日增重、饲料转化率显著高于饲喂对照组仔猪，料肉比提高分别达到4.97％和4.48％；腹泻率显著降低，分别较对照组降低了54.95％和44.55％。

在70日龄杜×长×大三元杂交生长猪上进行试验，结果表明：添加凝结芽孢杆菌对生长猪的生长性能和血清生化指标没有显著影响；但可有效提高粪便中的乳酸杆菌数量。

3、本发明产品所用原料丰富，价格低廉，一吨产品价格在5000元上下，较进口产品便宜一半左右；产品的质量也较稳定，有效保质期一年半以上。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作更详细说明，但以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

对所涉材料的说明：

葡萄糖：市售；

蛋白胨：市售；

可溶性淀粉：市售；

酵母膏：市售；

豆粕：市售；

实施例1：(本发明产品的配方与制备方法1)

一种用于畜禽养殖的微生物制剂-凝结芽孢杆菌，按以下方法步骤制备：

(1)各级培养基的配制，其中：

a)PDA斜面固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖2g、琼脂2g、水1升，备用；

b)摇瓶液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖2g、水1升，备用；

c)种子罐发酵培养基：可溶性淀粉20克、酵母膏7克、蛋白胨10克、豆粕10克、水953克，备用；

d)发酵罐发酵培养基：可溶性淀粉20克、酵母膏7克、蛋白胨10克、豆粕10克、水953克，备用；

(2)斜面菌种的培养：将保藏编号：CCTCCNo:M2011422凝结芽孢杆菌BFS-2菌株接种于步骤(1)PDA斜面固体培养基上于28℃的培养箱中培养24小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；

(3)摇瓶液体菌种的制备：在无菌操作下，取一环芽孢杆菌菌株BFS-2斜面菌种接入60ml步骤(1)摇瓶液体菌种培养基中，于28℃，转速220转/分的摇床中，培养24小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；

(4)种子罐发酵：配制步骤(1)种子罐发酵培养基并放入种子罐中，通蒸汽使种子罐内温度升至121℃，并保压至0.1MPa，保持30分钟后停止，随后把培养基冷却到30℃；在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入经检验培养合格的步骤(3)摇瓶液体种子菌种，接种量为6％；开动搅拌机转速180转/分，温度保持在30℃，通气量4m³/h，罐压0.02MPa，pH自然，培养时间为24小时；

(5)批量产品的制备：配制步骤(1)发酵罐发酵培养基并放入发酵罐中，通蒸汽使发酵罐内温度升至121℃，并保压至0.1MPa，保持30分钟后停止，随后把培养基冷却到30℃；通过移种管道从种子罐内接入培养好的步骤(4)种子罐液体种子菌种，接种量为6％；开动搅拌机转速180转/分，温度保持在30℃，通气量20m³/h，罐压0.02MPa，pH自然，培养24小时后；检验合格即可灌装制成畜禽养殖用微生物制剂-凝结芽孢杆菌，活菌数为1X10⁸CFU/g。实施例2：(本发明产品的配方与制备方法2)

本实施例种子罐和发酵罐发酵培养基的配制：可溶性淀粉30克、酵母膏5克、蛋白胨5克、豆粕15克、水945克备用；其余制备方法均同于实施例1。活菌数为2X10⁸CFU/g。

实施例3：(本发明产品的配方与制备方法3)

本实施例种子罐和发酵罐发酵培养基的配制：可溶性淀粉28克、酵母膏5克、蛋白胨5克、豆粕12克、水950克备用。其余制备方法均同于实施例1。活菌数为5X10⁸CFU/g。

试验例4：(本发明产品在断奶仔猪养殖上的应用效果试验)

由于抗生素的大量滥用，其在动物中的耐药性和药物残留问题已日益突出。微生态制剂作为一种新型绿色饲料添加剂，以无残留、无污染和无毒副作用，并能增强动物抗病力、促进动物生长以及提高饲料利用率等优点而备受青睐。

试验主要研究凝结芽抱杆菌对断奶仔猪生长性能的影响，为生产中合理应用提供参考。

1材料与方法

1.1试验动物和分组

将90头8kg左右的杜×长白×大白原种猪随机分成3组，每组3个重复，每个重复10头。以猪场饲喂的常规日粮为基础日粮，对照组饲喂基础日粮，处理1为添加0.05％凝结芽抱杆菌+基础日粮组；处理2为0.1％凝结芽抱杆菌+基础日粮组。试验方案见表1。凝结芽抱杆菌BFS-2由本实验室筛选并按照实施例子1的方法而发酵制备。凝结芽抱杆菌制剂形态为粉状物，主要成分为凝结芽抱杆菌，活菌数为1X10⁸CFU/g。

表1基础日粮的配方和营养水平

1预混料为每千克饲粮提供Cu200mg，Fe180mg，Zn170mg，Mn50mg，Co1.0mg，Se0.4mg，I0.4mg，VA8330IU，VD31440IU，VE30IU，VB2.0mg，VB8.0mg，VB61.2mg，VB0.03mg，叶酸2.0mg，生物素0.2mg，烟酸40mg，泛酸20mg。

2营养水平均为计算值。

1.2饲养管理

按猪场常规管理进行。预试期5d，同时进行预防接种、驱虫。进入正试期后，各组分喂相应日粮。自由采食，自由饮水，按猪场正常程序进行免疫。试验期52d。

1.3生长性能测定指标

日增重：分别于试验开始的第1d和最后1d早上8:00空腹称重，根据初重和末重计算平均日增重。采食量和料重比：每周计算各组的采食量，日平均采食量，试验结束后计算料重比。

腹泻率：每天上午8:00点定时观察仔猪粪便情况。记录腹泻头数，计算腹泻率。

腹泻率(％)＝总腹泻次数/(总头数×试验天数)×100

1.4血清生化免疫指标测定

试验最后1d的20:00停止喂料，照常供水，于次日早上对空腹仔猪进行前腔静脉采血10mL，收集于离心管中，不加抗凝剂，室温静置2h，待血清析出，吸出血清置于-20℃保存。采用全自动生化分析仪测定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量和补体3(C3)、补体4(C4)水平，测定用试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司。

1.5肠道微生物检测

饲养结束前3d，于每次喂食后2h，采集新鲜粪便样品，立即采用生理盐水进行10被稀释后，分别取1mL稀释样品涂布MRS平板检测总乳酸菌、涂布大肠杆菌鉴定培养基平板检测大肠杆菌，涂布EC双歧杆菌鉴定培养基检测双歧杆菌数量。菌数以log(CFU/g)表示。

1.6数据统计

采用SPSS统计软件对数据进行方差分析和多重比较，多重比较采用Duncan法，以P<0.05为显著水平。

2结果与讨论

2.1凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响

在本试验中(表2)，添加浓度为0.05％和0.1％的凝结芽孢杆菌BFS-2后，与饲喂对照日粮的仔猪相比，日增重、末重均显著提高；饲料增重比显著降低，但对采食量的影响不显著。这可能是由于凝结芽孢杆菌进入肠道后迅速清理肠道内有害杂菌，从而促进厌氧有益菌如乳酸杆菌、双歧杆菌等的生长，降低肠道内pH值，抑制有害菌生长，达到促进仔猪生长的作用。这与前人文献报道的凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长表现的影响研究结果一致。

表2添加凝结芽孢杆菌BFS-2对断奶仔猪生长性能的影响

2.2凝结芽孢杆菌对断奶仔猪血清生化指标的影响

凝结芽孢杆菌对断奶仔猪血清生化指标的影响结果见表3。由表可知，饲料中添加浓度为0.05％的凝结芽孢杆菌可显著提高断奶仔猪血清中IgG的含量，但对IgA和IgM的影响不显著。添加浓度为0.1％的凝结芽孢杆菌对IgA、IgG和IgM的影响均不显著。同时，添加凝结芽孢杆菌均显著提高了补体C3和C4的水平。以上研究表明凝结芽抱杆菌能影响动物的免疫机能。研究表明，芽抱类微生物可有效吸附在小肠粘膜表面，通过生物拮抗和免疫作用使病原菌难以在动物肠道内定植，可提高肠道局部和全身益生菌免疫的功能。

表3芽孢杆菌BFS-2对断奶仔猪血清生化指标的影响

2.3凝结芽孢杆菌对断奶仔猪粪便中微生物菌群的影响

凝结芽孢杆菌对断奶仔猪血清生化指标的影响结果见表4。有表可知，添加0.05％和0.1％的凝结芽抱杆菌可增加粪便中乳酸菌和双歧杆菌的数量(P<0.05)，降低大肠杆菌数量(P<0.05)。试验结果与前人研究基本一致，日粮中添加0.05％凝结芽抱杆菌表现出较好的促生长和防治腹泻作用。试验发现，凝结芽抱杆菌添加量从0.05％增加到0.1％，以0.05％添加量对仔猪的肠道微生物数量的影响最为有利。说明凝结芽抱杆菌的作用效果可能与其使用剂量有关。有研究报道，凝结芽抱杆菌的作用机制主要可通过促进肠道内有益菌群(双歧杆菌、乳酸菌、粪杆菌等)的增殖和发育，防止病原菌及有害菌在肠道内的异常增殖来发挥作用。

表4芽孢杆菌BFS-2对断奶仔猪粪便中微生物数量的影响

3结论

同样，采用实施例子2和3的方法获得凝结芽抱杆菌试剂参照实施例子4的方法进行实验，除了活菌数不同外，也获得了类似的结果(具体实验略)。由此可见，断奶仔猪日粮中添加浓度为0.05％和0.1％的凝结芽抱杆菌可显著提高仔猪的平均日增重和饲料转化效率；同时改善粪便中有益微生物数量，降低有害菌群数量，提高断奶仔猪的免疫机能。

Claims (5)

1.一种用于畜禽养殖的凝结芽孢杆菌制剂,其中，该制剂包括保藏在在中国武汉，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株。

2.一种用于畜禽养殖的凝结芽孢杆菌制剂的制备方法，该方法按以下步骤获得：以马铃薯葡萄糖固体培养基为斜面培养基；以马铃薯葡萄糖液体培养基为摇瓶菌种培养基；按重量可溶性淀粉2—5％，酵母膏0.5—1％，蛋白胨0.5—1.5％，豆粕1.0—1.5％，水补足至100％配制成种子罐和发酵罐发酵培养基；其中采用的凝结芽孢杆菌菌种为保藏在在中国武汉，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株，并经各级发酵后制备而成，其中活菌数为1X10⁸-5X10⁸CFU/g的凝结芽孢杆菌。

3.一种制备权利要求2所述的方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)各级培养基的配制，其中：

a)斜面培养基：马铃薯葡萄糖固体培养基，备用；

b)摇瓶菌种培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基，备用；

c)种子罐发酵培养基：按重量可溶性淀粉2—5％，酵母膏0.5—1％，蛋白胨0.5—1.5％，豆粕1.0—1.5％，水补足至100％；

d)发酵罐培养基：按重量可溶性淀粉2—5％，酵母膏0.5—1％，蛋白胨0.5—1.5％，豆粕1.0—1.5％，水补足至100％；

(2)斜面菌种的培养：将保藏菌种：CGMCCNo.2288凝结芽孢杆菌BFS-2菌株接种于步骤(1)斜面培养基上，在28—37℃的培养箱中培养18—24小时，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；

(3)摇瓶菌种扩增：在无菌操作下，取一环斜面菌种接入60ml步骤(1)摇瓶菌种培养基中，于28—37℃，110—220转/分的摇床中，培养18—24小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，备用；

(4)种子罐发酵：将步骤(1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐内温度121℃保持30分钟后，保压至0.1MPa，进行蒸汽高温灭菌后冷却至28—37℃；在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入步骤(3)摇瓶菌种，接种量为5—10％；开动搅拌机在转速110—220转/分，温度28—37℃，通气量4m³/h，罐压0.02—0.06MPa，pH自然，培养18—24小时,备用；

(5)批量产品的制备：将步骤(1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐内温度121℃，保压至0.1MPa，保持30分钟后把培养基冷却至28—37℃；通过移种管道向发酵罐内接入步骤(4)种子罐菌种，接种量为5—10％；开动搅拌机在转速110—220转/分，温度28—37℃，通气量20m³/h，罐压0.02—0.06MPa，pH自然，培养18—24小时,取样检验，根据产品质量标准进行后处理(产品形态根据客户需要生产成固体或者液体)，灌装，封口，即成用于畜禽养殖的微生物制剂。

4.一种包括按照权利要求2或3制备的凝结芽孢杆菌制剂的饲料，其中每吨饲料中按质量百分比为0.005-0.1％的用量添加所述的凝结芽孢杆菌制剂，搅拌均匀后直接饲喂，其中，该制剂包括保藏在在中国武汉，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株或该菌株的培养产物，其中活菌数为1X10⁸-5X10⁸CFU/g的凝结芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的饲料，凝结芽孢杆菌的质量百分比为0.05％。