CN105198871A

CN105198871A - 一类喹喔啉酮类化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN105198871A
Application number: CN201510759801.0A
Authority: CN
Inventors: 周金培; 徐斌; 杨一飞; 张惠斌; 赵雷磊; 张兵; 韩丽
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2015-12-30

Abstract

喹喔啉酮类化合物及其制备方法和应用，本发明涉及通式(I)化合物及其盐，这类类化合物可以有效地结合具有Bromodomain结构域的蛋白，进而调节下游的信号通路，发挥特定作用，部分化合物活性高于(+)-JQ1，并且具有较好的细胞活性，本发明还涉及该类化合物的制备方法及含有它们的药物制剂。本发明合成了一系列通式(I)化合物及其药学上可接受的盐。

Description

一类喹喔啉酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新的喹喔啉酮类化合物、其制备方法以及该类化合物作为Brd4抑制剂具有抗肿瘤的用途。

背景技术

表观遗传学是指不涉及DNA序列改变的情况下，基因功能发生了可遗传改变，最终导致表型的变化。染色质由DNA、组蛋白和非组蛋白构成。核小体是染色质的基本重复组成单位，由组蛋白H3、H4、H2A、H2B构成的八聚体以及位于核小体外部的组蛋白H1和缠绕在其外的含146个碱基对的DNA构成。染色质的状态对于调控基因转录具有重要作用。表观遗传学涉及到DNA甲基化、组蛋白修饰。染色体重塑和非编码RNA调控等，其中组蛋白修饰包括组蛋白的乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化及ADP核糖基化等，这些多样化的修饰以及它们在时间和空间上的组合与生物学功能的关系又可作为一种重要的表观标志或语言，因而被称为“组蛋白密码”。

Bromodomain结构域是一进化上高度保守的110个氨基酸的蛋白质功能结构域，可特异性识别组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点，通过染色质的组装和乙酰化而参与信号依赖性、非基础性的基因转录调控；Bromodomain亦可通过对转录因子等非组蛋白的乙酰化修饰而广泛参与细胞周期调控、细胞分化、信号转导等过程。如含Bromodomain结构域的BET家族包括四个蛋白(Brd2，Brd3，Brd4和BRDT)，每个蛋白都包含两个独立的Bromodomain结构域用来识别组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点。

癌基因c-myc广泛参与多种肿瘤发生发展过程，并且与肿瘤药物治疗反应性紧密相关。研究表明，c-myc在人类多种肿瘤中异常表达，通过调控细胞周期进程、细胞的生长代谢、遗传不稳定性、促进血管生成、细胞噁性转化、分化及凋亡对肿瘤噁性演进发挥重要推动作用；抑制c-myc的活性能够显著抑制肿瘤的增值生长。这些发现表明c-myc是一个潜在的抗肿瘤靶点。

C-myc作为一个转录因子，很难从其自身结构中找到合适的结构域进行小分子设计，破坏其余DNA的相互作用。最近研究表明，c-myc基因转录启动前，其启动子区域需要进行表观遗传学修饰。该区域组蛋白赖氨酸残基被乙酰化修饰，从而募集具有Bromodomain结构域的蛋白Brd4，后者通过和转录延伸因子P-TEFb相互作用，调控c-myc转录复合物的形成。因此，如果设计小分子干扰Brd4与乙酰化组蛋白的结合，将有可能抑制c-myc的转录。研究证明，影响Brd4和乙酰化组蛋白结合的小分子抑制剂JQ1，可以显著下调c-myc和其相关靶基因的转录。采用3种肿瘤研究模型证实，JQ1均可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，提示针对Brd4的靶向抑制剂很有希望成为c-myc高表达肿瘤的有效治疗药物。

目前公开了一系列Brd4抑制剂的专利申请，其中包括WO2013184878，WO2014076237，WO2014128655，WO2014134232，WO2014154762，WO2014128070，WO2011054553，WO2011054846，WO2011054848等。

本发明涉及一种新的喹喔啉酮类化合物，其作为Brd4抑制剂具有抗肿瘤的用途。因此所述通式(I)化合物以及其药用盐潜在的用于抗肿瘤以及相关疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新型具有Brd4抑制作用的新型抗肿瘤分子。该类化合物具有喹喔啉酮结构，可干扰具有Bromodomain结构域的Brd4与乙酰化组蛋白的结合，进而下调癌基因c-myc和其相关靶基因的转录，因此可以成为肿瘤的有效治疗药物。

本发明的目的还在于提供一类喹喔啉酮类Brd4抑制剂的制备方法。

详细发明内容如下：

本发明合成了一系列通式(I)化合物及其药学上可接受的盐：

其中R₁选自环烷基、芳杂环基、取代或未取代的芳香基、取代或未取代的苄基；

其中R₂代表H、烷基、烷氧基、取代或未取代的芳香基、取代或未取代的苄基、环烷基或羟基；

其中R₃代表H、甲基或乙基；

本发明的优选化合物包括，但不限于：

(R)-4-苄基-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(R)-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-4-(4-甲氧苄基)-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(R)-4-(4-甲氧苄基)-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(R)-4-环戊基-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(R)-4-环己基-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(S)-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-4-(4-甲氧苄基)-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(S)-4-环戊基-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

1’-苄基-7’-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1’，4’-二氢-3’H-螺[环戊烷-1，2’-喹喔啉]-3’-酮；

4-(4-氯苄基)-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(R)-3，4-二苄基-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

(R)-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-4-(4-甲氧苄基)-1，3-二甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮；

4-(5-苄基-4-亚甲基-4，5-二氢四氮唑[1，5-a]喹喔啉-7-基)-3，5-二甲基异噁唑。

化合物的结构为：

通式(I)所示的化合物可以含有不对称或手性中心，因此可以以不同立体异构形式存在。本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体。对映异构体和阻转异构体以及它们的混合物(如外消旋混合物)，均包括在本发明的范围内。

通式(I)所示的化合物还可以以不同互变异构形式存在，所有这些形式均包括在本发明范围内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。

根据本发明，药学上可接受的盐包括与下列酸形成的加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、琥珀酸以及类似的已知可以接受的酸成的盐。

本发明喹喔啉酮类化合物制备方法如下：

步骤a：化合物A与相应的氨基酸反应得到化合物B；

步骤b、c：化合物B在连二亚硫酸钠水溶液中反应得到化合物C；

步骤d：化合物C与碘甲烷反应得到化合物D；

步骤e：化合物D与相应的苯甲醛或环烷酮反应得到化合物E；

步骤f：化合物E与3，5-二甲基异噁唑-4-硼酸频哪醇酯反应得到通式(I)表示的化合物；

其中，在步骤a中，化合物A与相应的氨基酸回流过夜得到化合物B，可以使用的溶剂为乙醇、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺以及水等；

在步骤b，c中，化合物B与连二亚硫酸钠在室温下搅拌过夜得到化合物C，可以使用的溶剂为水；

在步骤d中，化合物C与碘甲烷在冰浴下反应4小时得到化合物D，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；

在步骤e中，化合物D与相应的苯甲醛或环烷酮室温下反应得到化合物E，反应溶剂为四氢呋喃；

在步骤f中，化合物E与3，5-二甲基异噁唑-4-硼酸频哪醇酯在氮气保护下回流过夜得到通式(I)表示的化合物，溶剂选择水、乙醇、甲苯混合溶剂。

以下是本发明部分化合物的药理学实验数据：

喹喔啉酮类化合物的Brd4(BD1)酶水平活性测定

化合物与BRD4蛋白bromodomain结构域(以下称作BRD4(BD1))的结合活性测试采用的是AlphaScreen检测技术。化合物初筛抑制率浓度为1μM，测试部分初筛活性较好的化合物的IC₅₀。

配制HEPES缓冲液(50mMHEPES，100mMNaCl，0.1％BSA，0.05％CHAPS，pH7.5)用于制备BRD4(BD1)蛋白、Biotin标记的组蛋白H4、待测化合物(DMSO0.1％)、donorbeads和acceptorbeads溶液。取384孔板一块，按照布置，板上分待测化合物孔、空白对照孔(min，max)、阳性药对照孔。向待测化合物孔和阳性药孔分别加入不同浓度的化合物溶液5μL，空白加入缓冲液5μL(DMSO0.1％)。继续向除空白对照孔(min)外的各孔加入BRD4(BD1)蛋白溶液5μL，向空白对照孔(min)加入缓冲液5μL。室温下孵育15分钟后，每孔加入Biotin标记的组蛋白H4溶液5μL，继续在室温下孵育1小时后，加入donorbeads和acceptorbeads溶液15μL，避光室温孵育1小时后用EnSpire检测仪的Alphamode(λ_ex＝680，λ_em＝570)读取荧光数值。

数值处理：抑制率＝(Max-Signal)/(Max-Min)×100％

其中：Max：Biotin标记的组蛋白H4与蛋白完全结合的值

Min：Biotin标记的组蛋白H4本底值

Signal：化合物相应浓度下的值

以化合物浓度和相应的抑制率做S曲线。得到相应化合物的IC₅₀。

表1为化合物药理实验生物活性结果

表1

注：“NT”表示没有测试IC₅₀。

表1所列的部分化合物初筛浓度为1μM下表现出与阳性对照(+)-JQ1相当的抑制率，部分化合物IC50优于(+)-JQ1，显示出较强的活性，表明本发明的化合物在酶水平可以有效结合具有bromodomian结构域的蛋白，因此本发明的化合物可以成为肿瘤的有效治疗药物。

MV-4-11细胞的抑制作用

选择实施例1化合物进行测定其对MV-4-11细胞的抑制作用，具体操作如下：

第1天：细胞铺板

细胞板胰蛋白酶化，并确定细胞密度。稀释细胞浆液得到最优密度所需的体积。取90μl/孔细胞浆液至测试板，37℃加湿条件下(5％CO₂)孵育24小时。

第2天：添加化合物

根据孔板(200×最终浓度)制备阳性对照物与测试化合物的DMSO溶液。将7μl化合物加至133μl完全培养基(最终浓度：10×)。将10μl化合物加至测试板(终浓度：1×)。37℃加湿条件下(5％CO₂)进行孵育。

第5天：细胞成像

将测试试剂在使用前解冻30分钟。添加30μl细胞滴度-Glo试剂至各孔中，晃动板10分钟以诱导细胞裂解。将板在室温下孵育2分钟，以稳定发光信号。使用Envision进行测量(时间间隔：0.5秒)。

使用XLfit进行数据处理。

％INH＝(最大信号-化合物信号)/(最大信号-最小信号)×100。

最大信号为DMSO溶液中测得。

最小信号为培养基中测得。

表2为对化合物1进行测定其对MV-4-11细胞的抑制作用。

表2

实验结果表明该化合物具有良好的细胞抑制作用。

以下通过实施例对本发明作进一步描述。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。需要说明的是，下述实施例仅用于说明，而并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的教导所做出的各种变化均应在本申请权利要求所要求的保护范围内。

原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。

化合物的结构通过核磁共振(¹H-NMR)或质谱(MS)来确定。NMR测定是用BrukerAV-300型核磁共振仪，测定溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-D6)或氘代氯仿(CDCl₃)，TMS为内标。

制备实施例：

实施例1：

合成路线为：

a)4-溴-2-氟-1-硝基苯(2.0g，9.1mmol)，D-2-氨基丁酸(1.03g，10.0mmol)和碳酸钾(1.38g，10.0mmol)溶于乙醇(10mL)和水(3mL)的混合溶液中，加热回流8小时。冷却至室温，1M盐酸调节pH至2～3。抽滤，石油醚冲洗析出固体，干燥，得R-2((5-溴-2-硝基苯基)-氨基)丁酸2.61g，棕黄色固体，产率94.7％。¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ8.44(d，J＝7.3Hz，1H)，8.02(d，J＝9.1Hz，1H)，7.25(d，J＝1.9Hz，1H)，6.88(dd，J＝9.1，2.0Hz，1H)，4.54(dd，J＝12.5，5.3Hz，1H)，1.98-1.77(m，2H)，0.87(t，J＝7.4Hz，3H)。

b)(5-溴-2-硝基苯基)-D-2-氨基丁酸(1.20g，4.0mmol)和碳酸钾(1.09g，8.0mmol)加入水中(10mL)，室温搅拌至全部溶解。

c)反应瓶中分批加入连二亚硫酸钠(3.45g，19.8mmol)，室温搅拌10小时。抽滤，得(R)-6-溴-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮0.41g，白色固体，产率40.6％。¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ10.31(s，1H)，6.85(d，J＝2.1Hz，1H)，6.70(dd，J＝8.2，2.1Hz，1H)，6.61(d，J＝8.2Hz，1H)，6.29(s，1H)，3.76-3.66(m，1H)，1.72-1.52(m，2H)，0.91(t，J＝7.4Hz，3H)。

d)(R)-6-溴-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(0.85g，3.3mmol)，苯硅烷(1.08g，10.0mmol)，苯甲醛(1.06g，10.0mmol)和二丁基二氯化锡(1.11g，3.7mmol)溶于四氢呋喃(10mL)。室温搅拌10小时。减压旋去溶剂，硅胶柱纯化，使用石油醚/乙酸乙酯洗脱(V/V＝3/1)。得(R)-4-苄基-6-溴-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮0.93g，透明油状液体，产率80.9％。¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ10.56(s，1H)，7.35-7.25(m，5H)，6.77(ddd，J＝23.7，15.0，5.0Hz，3H)，4.69(d，J＝15.6Hz，1H)，4.36(d，J＝15.6Hz，1H)，3.78(dd，J＝7.4，5.4Hz，1H)，1.56(m，2H)，0.81(t，J＝7.5Hz，3H)。

e)(R)-4-苄基-6-溴-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(0.31g，0.9mmol)，3，5-二甲基异噁唑-4-硼酸频哪醇酯(0.20g，0.9mmol)，碳酸钠(0.26g，2.7mmol)和四三苯基膦钯(0.10g，0.1mmol)溶于水(3mL)，乙醇(1mL)，甲苯(3mL)的混合溶剂中，氮气保护，加热回流反应12小时。乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。减压旋干溶剂，硅胶柱纯化，使用石油醚/乙酸乙酯洗脱(V/V＝3/1)，得(R)-4-苄基-6-(3，5-二甲基异噁唑)-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮，淡黄色固体0.19g，产率58.5％。MS(ES)：m/z361.2[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ10.54(s，1H)，7.33(d，J＝4.3Hz，4H)，7.27-7.16(m，1H)，6.85(d，J＝7.9Hz，1H)，6.62(d，J＝7.9Hz，1H)，6.43(s，1H)，4.67(d，J＝15.7Hz，1H)，4.44(d，J＝15.7Hz，1H)，3.92-3.85(m，1H)，2.10(s，3H)，1.93(s，3H)，1.73-1.61(m，1H)，1.59-1.48(m，1H)，0.85(t，J＝7.5Hz，3H).

按照与制备实施例1相同的方法制备下9列化合物：

实施例11：

合成路线为：

参照制备实施例1的方法实施步骤a、b、c、e和f。步骤d的具体步骤为：在冰浴条件下分批加入氢化纳(0.3g，12.6mmol)至DMF(4mL)，搅拌5分钟。加入(R)-6-溴-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(1.52g，6.3mmol)，搅拌20分钟。滴加碘甲烷(1.34g，9，5mmol)，反应4小时。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。减压旋去溶剂，硅胶柱纯化，使用石油醚/乙酸乙酯洗脱(V/V＝3/1)，得(R)-6-溴-1，3-二甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮1.21g，浅黄色固体，产率75.2％。¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ6.89-6.86(m，2H)，6.36(s，1H)，3.85(q，J＝6.6Hz，1H)，3.21(s，3H)，1.25(d，J＝6.6Hz，3H).

最终制得化合物(R)-6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-4-(4-甲氧苄基)-1，3-二甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮，淡黄色固体，产率为68.8％。MS(ES)：m/z391.2[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz，DMSO)δ7.29(d，J＝8.3Hz，2H)，7.12(d，J＝8.1Hz，2H)，6.90(d，J＝8.3Hz，2H)，6.81(d，J＝7.4Hz，1H)，6.56(s，1H)，4.50(d，J＝14.7Hz，1H)，4.24(d，J＝14.7Hz，1H)，4.06-4.01(m，1H)，3.72(s，3H)，3.33(s，3H)，2.18(s，3H)，2.01(s，3H)，1.04(d，J＝7.0Hz，3H).

实施例12：

合成路线为：

参照制备实施例1的方法实施步骤a、b、c、d和g。步骤e、f的具体步骤为：

e)(R)-4-苄基-6-溴-3-甲基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(0.62g，1.9mmol)溶入三氯氧磷(3mL)，加热至50℃，反应4小时。加水，乙酸乙酯萃取，干燥。减压旋干溶剂，硅胶柱纯化，使用石油醚/乙酸乙酯洗脱(V/V＝40/1)，得1-苄基-7-溴-3-氯-2-亚甲基-1，2-二氢喹喔啉0.35g，黄色固体，产率53.8％。¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ7.37(t，J＝7.3Hz，2H)，7.32-7.23(m，2H)，7.19(d，J＝7.3Hz，2H)，7.14-7.02(m，2H)，5.00(s，2H)，4.77(d，J＝2.9Hz，1H)，4.28(d，J＝2.9Hz，1H)。

f)1-苄基-7-溴-3-氯-2-亚甲基-1，2-二氢喹喔啉(0.32g，0.9mmol)与叠氮钠(0.07g，1.1mmol)溶于乙酸(4mL)，加热回流8小时。饱和碳酸钠溶液调pH至中性，乙酸乙酯萃取，干燥。减压旋干溶剂，得5-苄基-7-溴-4-亚甲基-4，5-二氢四氮唑[1，5-a]喹喔啉0.14g，浅棕色固体，产率42.9％。¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ7.94(d，J＝8.3Hz，1H)，7.43-7.19(m，7H)，5.22(d，J＝2.4Hz，1H)，5.18(s，2H)，4.58(d，J＝2.4Hz，1H)。

最终制得化合物4-(5-苄基-4-亚甲基-4，5-二氢四氮唑[1，5-a]喹喔啉-7-基)-3，5-二甲基异噁唑，淡黄色固体，产率40.9％。MS(ES)：m/z370.2[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz，DMSO)δ8.08(d，J＝8.2Hz，1H)，7.36(d，J＝4.4Hz，4H)，7.31-7.23(m，1H)，7.13(dd，J＝8.2，1.5Hz，1H)，6.95(d，J＝1.4Hz，1H)，5.24(d，J＝2.4Hz，1H)，5.21(s，2H)，4.70(d，J＝2.4Hz，1H)，2.18(s，3H)，1.99(s，3H).

实施例13

含化合物1的片剂：

按常规方法将原辅料混合，制粒，干燥，压片。

Claims

1.权利要求通式(I)所示的化合物及其可药用盐：

其中R₁选自：环烷基、芳杂环基、取代或未取代的芳香基、取代或未取代的苄基；

其中R₂选自：H、烷基、烷氧基、取代或未取代的芳香基、取代或未取代的苄基、环烷基或羟基；

其中R₃选自：H、甲基或乙基。

2.权利要求1的化合物，可以是下列任一化合物或其可药用盐：

3.权利要求1-2的化合物的制备方法，由以下方法制备得到：

其中R₃选自：H、甲基或乙基。

4.权利要求1-2中任一项所述的通式(I)所示的喹喔啉酮类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与Bromodomain结构域蛋白相关疾病的药物中的用途。

5.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利1-2任意一项所述的通式(I)所示的喹喔啉酮类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。