CN105189746B

CN105189746B - 用于使用耐热的错配内切核酸酶的方法

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Publication number: CN105189746B
Application number: CN201480026443.6A
Authority: CN
Inventors: 松村清之; 高津成彰; 上森隆司; 向井博之
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: JP6216416B2; CN105189746A; KR102126744B1; US20160017300A1; US10196618B1; JP6009649B2; US10280412B2; WO2014142261A1; KR20150131146A; US10131890B2; US20190100736A1; US20190085307A1; JP2016168061A; JPWO2014142261A1; US20190017037A1; KR20200053661A; KR102213886B1; EP2975124B1; EP2975124A4; EP2975124A1

Abstract

提供了使用新颖耐热的错配核酸酶的错配特异性切割反应，用于使用错配核酸酶去除核酸扩增反应中的误差的方法，用于抑制核酸扩增反应过程中扩增具有特定碱基序列的核酸的方法，和用于使用该抑制方法检测具有单碱基多态突变的核酸的方法。

Description

用于使用耐热的错配内切核酸酶的方法

技术领域

本发明涉及识别和切割双链核酸中的错配碱基对的耐热的错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，和使用所述错配内切核酸酶的方法。

背景技术

近年来，已经显著开发了生物技术。具体地，在伴随基因组分析技术的进步的大规模基因组分析的结果中，已经积累了大量基因组序列信息。此外，基于上述信息与各种生理功能的分析的组合，已经发现了许多功能性基因突变。这些突变的分析已经用于人类的基因诊断，以及农作物的改良和有用微生物的分离或生成，因此已经大大促进一般生活。

通过基因组序列的直接分析或通过使用识别错配的碱基对的酶进行突变分析。突变分析方法包括用能够特异性结合至由突变型DNA和野生型DNA形成的错配碱基对的因子进行检测。突变分析方法的代表性实例包括通过使用来自大肠杆菌的MutS、MutT和MutL复合物检测突变位点(专利文献1)。

包括使用特异性切割错配位点的错配内切核酸酶的突变分析方法也是已知的。在该方法中，错配内切核酸酶用于切割错配碱基对附近的DNA，且分析因此获得的DNA片段以检测突变的存在或不存在和位置。作为代表性实例，包括使用来自芹菜的Cel1基因产物的方法是已知的(专利文献2)，且该方法实际用于碱基突变的分析。然而，该酶是不耐热的，因此无法用于涉及高温反应过程诸如PCR的技术中。因此，为了检测碱基突变，该方法需要扩增、形成错配、切割错配和检测的四个步骤。

除了突变分析以外，具有大量影响力的生物技术的实例还包括核酸扩增技术。

核酸扩增技术的代表性实例是聚合酶链式反应(PCR)。PCR是用于容易地体外扩增核酸的期望片段的技术。PCR是在广泛领域包括生物学、医学和农业以及关于基因的研究的领域中是必要的实验技术。PCR也被应用于检测突变基因和分析DNA的甲基化。

等温核酸扩增方法，诸如LAMP方法和ICAN方法，不需要特殊设备，因此，它们被用作检测核酸的更便宜的方法。

对于近年来已经进行的全基因组的结构分析，全基因组扩增方法是重要的技术，特别是用于分析稀有样品。

在这些核酸扩增方法中，不正确碱基的掺入以恒定概率发生。该概率已经通过改进聚合酶等而降低。然而，不正确碱基的掺入仍然干扰精确的分析。

核酸扩增技术不仅用于扩增具有特定核苷酸序列的DNA，而且用于扩增在两端具有共同核苷酸序列区域的DNA的混合物。此类核酸扩增技术的具体实例包括基因组文库或cDNA文库的构建。然而，在构建此类文库中，优先扩增具有更高含量的DNA分子，其可以干扰各种类型的DNA的分析或筛选。

为了解决上述问题，具有较高含量的DNA的比例通过利用自我杂交的标准化而降低(非专利文献1)。还使用组合PCR和自我杂交的SSH-PCR(非专利文献2)。然而，使用这些方法，还可以去除与具有较高含量的DNA同源的DNA。

在通过核酸扩增方法检测DNA中，目标DNA和非目标DNA可以竞争扩增。换言之，当与扩增目标DNA的同时扩增非目标DNA时，难以检测目标DNA。上述问题可以通过使用实时PCR来解决，在所述实时PCR中，探针诸如循环探针或TaqMan探针用于仅检测目标DNA。然而，在其中非目标DNA以相对于目标DNA过度大量存在的情况下，因为具有许多类似DNA的假阳性反应，难以检测目标DNA。

此类问题可以在以下中发生：在正常等位基因存在的情况下检测少量突变等位基因(例如，检测循环肿瘤基因)，通过表观遗传测定检测少量甲基化或非甲基化的等位基因，检测在母体血液中循环的少量胎儿DNA序列等。

为了解决上述问题，已经开发了被称为限制性内切核酸酶介导的选择性聚合酶链式反应的方法(PCR REMS)(非专利文献3)。此方法涉及使用耐热的限制性酶。在该方法中，使用引物选择性检测具有突变核苷酸序列的DNA，设计所述引物，例如，使得仅当模板具有正常的核苷酸序列时限制性酶的切割才发生。然而，根据待检测的目标DNA，不存在具有适合于通过REMS PCR检测的识别序列的耐热限制性酶。

引用列表

专利文献

专利文献1：US 5922539 B

专利文献2：WO 01/062974

非专利文献

非专利文献1："Nucleic Acids Research", 2004 February, vol. 32, No. 3,e37

非专利文献2："Methods in Molecular Biology", 2009, vol. 496, No. 2,pp. 223-243

非专利文献3："American Journal of Pathology", 1998 August, vol.153,No.2, pp. 373-379。

发明概述

技术问题

本发明的目的包括提供耐热的错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，和使用所述错配内切核酸酶的方法。

问题的解决方案

作为在上述情况下的大量努力的结果，本发明人已经发现，已被认为是复制机制中的因子的来自古细菌的蛋白具有耐热的错配内切核酸酶活性。

本发明人还已经发现，在错配内切核酸酶和被设计以便当寡脱氧核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时生成一个或多个错配的寡脱氧核苷酸存在的情况下的核酸扩增反应中，具有特定核苷酸序列的DNA的扩增受到抑制。

此外，本发明人已经成功地生成具有增加特异性的耐热的错配内切核酸酶的突变体。已经发现，当使用突变错配内切核酸酶时，除了特定错配碱基对以外的碱基对的切割受到抑制，允许扩增的更特异性抑制。因此，已经完成了本发明。

具体地，本发明的第一个方面提供：

[1]切割双链核酸的方法，所述方法包括：

用至少一种选自以下(i)至(iii)的多肽处理具有错配的碱基对的双链核酸，以便在所述错配的碱基的位置处切割所述双链核酸的两条链，

(i) 具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基而不同于SEQ IDNO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和

(iii) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

[2]根据[1]的方法，其中所述错配的碱基对包含通常在所述双链核酸上配对的两个碱基对之间存在的连续的1至8个错配的碱基对；

[3]组合物，其包含以下(a)至(c)：

(a) DNA聚合酶；

(b) 至少一对寡核苷酸引物；和

(c) 至少一种选自以下(i)至(iii)的多肽：

(i) 具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

[4]扩增核酸的方法，所述方法包括以下步骤(a)和(b)：

(a) 制备包含根据权利要求3的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和

(b) 使通过步骤(a)获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增；

[5]根据[4]的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)方法、等温核酸扩增方法或多重置换扩增(MDA)方法进行所述核酸扩增；

[6]多肽，其选自以下(A)至(C)：

(A) 具有通过用另一种氨基酸残基取代位置77的色氨酸而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(B) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的氨基酸以外的1至10个氨基酸残基而不同于(A)的多肽的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和

(C) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置77的色氨酸的氨基酸残基用另一种氨基酸残基取代；

[7]根据[6]的多肽，其选自以下(A)至(C)：

(A) 具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；

(B) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的苯丙氨酸以外的1至10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和

(C) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置77的色氨酸的氨基酸残基用苯丙氨酸取代；

[8]抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括在以下(a)至(d)存在的情况下进行核酸扩增反应的步骤：

(a) 寡脱氧核苷酸，所述寡脱氧核苷酸被设计以便当所述寡脱氧核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸或其互补链杂交时生成一个至几个错配；

(b) DNA聚合酶；

(c) 至少一对寡核苷酸引物；和

(d) 具有错配内切核酸酶活性的多肽；

[9]根据[8]的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)方法或等温核酸扩增方法；

[10] 根据[8]的方法，其中所述具有错配内切核酸酶活性的多肽是至少一种选自以下(i)至(vi)的多肽：

(i) 具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基而不同于SEQ IDNO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(iv) 具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；

(v) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的苯丙氨酸以外的1至10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和

(vi) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置77的色氨酸的氨基酸残基用苯丙氨酸取代；

[11] 优先扩增目标DNA的方法，所述方法包括通过根据[8]的方法抑制具有在一个至几个核苷酸中与目标DNA的核苷酸序列不同的核苷酸序列的DNA的扩增：

[12] 根据[11]的方法，其用于扩增具有野生型核苷酸序列的DNA或含有单核苷酸多态性突变的DNA，其中野生型DNA的扩增和含有单核苷酸多态性突变的DNA的扩增彼此区分；

[13] 根据[12]的方法，其中所述单核苷酸多态性突变与癌变或用于治疗癌症的药剂的治疗效果相关联；

[14] 根据[11]的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)方法或等温核酸扩增方法进行所述DNA扩增反应。

发明效果

根据本发明，提供了在生物技术中具有巨大实用性的耐热的错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，和使用所述错配内切核酸酶的方法。

附图简述

图1显示实施例2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。

图2显示基于实施例2中的荧光强度的增加的蛋白PF0012的错配切割活性。

图3显示基于实施例3中的荧光强度的增加的PF0012同源蛋白的错配切割活性。

图4显示基于实施例5中的荧光强度的增加的突变PF0012同源蛋白的错配切割活性。

图5显示实施例6中通过实时PCR技术对具有特定核苷酸序列的DNA的扩增的抑制。

图6显示通过HRM分析方法对单一核苷酸突变的基因的检测。

实施方案的描述

在本发明中，词语“错配”是指双链核酸中存在的不同于Watson-Crick碱基对的碱基配对，换言之，除了G (鸟嘌呤碱基) - C (胞嘧啶碱基)和A (腺嘌呤碱基) - T (胸腺嘧啶碱基)或U (尿嘧啶碱基)的碱基配对以外的组合的碱基的结合。

如本文所使用，具有错配内切核酸酶活性的多肽(有时称为错配内切核酸酶)是指具有切割双链核酸中存在的错配位点的活性的核酸酶。错配内切核酸酶活性包括切割邻近于形成错配的碱基对的核苷酸的磷酸二酯键的活性，和切割邻近位于远离错配的碱基对1至5个、优选1至3个碱基对的核苷酸的磷酸二酯键的活性。在本发明中，错配内切核酸酶可以是具有特异性识别双链核酸中的特定错配的碱基对以切割双链核酸的活性的核酸酶(例如，特异性识别GT错配的核酸酶，或者特异性识别GT错配和GG错配的核酸酶)。在本发明中，除了切割双链核酸中存在的错配位点的活性以外，所述耐热的错配内切核酸酶还可以具有，识别单链DNA、单链核酸和双链核酸之间的连接部分、双瓣结构(double flapstructure)、复制叉结构、D-环结构和/或具有缺口的Holiday连接结构以切割核酸的活性。如本文所使用，耐热的错配内切核酸酶意指表现出在50℃或更高的温度切割双链核酸中的错配位点的活性的核酸酶。在本发明中，优选使用耐热的错配内切核酸酶。

本发明中使用的耐热的错配内切核酸酶的实例包括，但不限于，来自古细菌的具有耐热的错配内切核酸酶活性的多肽。本发明人已经发现，迄今已经被视为是复制机制中的因子的来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的多肽PF0012 (RefSeq ID:NP_577741,SEQ ID NO:1)是耐热的错配内切核酸酶。此外，本发明人已经发现，作为PF0012的同源物的来自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的多肽MJ_0225 (RefSeq ID:NP_247194, SEQ ID NO:8)和来自Thermococcus barophilus的多肽TERMP_01877 (RefSeqID:YP_004072075, SEQ ID NO:7)也是耐热的错配内切核酸酶。MJ_0225和TERMP_01877分别与SEQ ID NO:1具有57％和73％序列同一性。本发明中使用的耐热的错配内切核酸酶的优选实例包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽；和具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明中使用的耐热的错配内切核酸酶的优选实例还包括具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽；具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽；和具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明中使用的耐热的错配内切核酸酶的优选实例还包括具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽；具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽；和具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。

此外，本发明人已经发现，具有通过用另一种氨基酸残基、优选苯丙氨酸取代位置77的色氨酸而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽是特异性识别错配G(鸟嘌呤碱基) - G(鸟嘌呤碱)的耐热的错配内切核酸酶。作为测量的结果，所述错配内切核酸酶对由鸟嘌呤碱基形成的错配的碱基对的切割活性是对其它错配的碱基对的切割活性的10倍或更多倍。因此，本发明的一个方面包括因此生成的具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽及其同源物。具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽及其同源物的实例包括具有通过用另一种氨基酸残基取代位置77的色氨酸而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的氨基酸以外的1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于上述多肽的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和具有与SEQID NO:1的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置77的色氨酸的氨基酸残基是除了色氨酸以外的氨基酸残基。此类错配内切核酸酶适于如后面提到的各种用途，例如，包括去除含有特定DNA序列的DNA且扩增和检测其它DNA的方法。

可以通过使用含有错配的碱基对的双链核酸作为底物测量错配内切核酸酶活性。具体地，制备含有错配的碱基对的双链核酸之后，双链核酸与错配内切核酸酶反应，其中双链核酸的量相对于错配内切核酸酶的量是过量的，然后，测量每单位时间切割的核酸的量。切割的双链核酸可以与未切割的核酸分开定量，例如，通过电泳。可以使用用荧光物质和猝灭剂物质双标记的双链核酸，使得仅当切割双链核酸时才可以检测荧光强度的增加。使用此类用荧光物质和猝灭剂物质双标记的双链核酸，可以通过以合适的时间间隔测量反应混合物中的荧光强度而容易地测定错配内切核酸酶活性。可以通过改变用作底物的双链核酸中存在的形成错配的碱基对的碱基来测定对特定错配的碱基对的切割活性。

切割本发明的双链核酸的方法包括用具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或其同源物处理具有错配的碱基对的双链核酸。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的同源物的实例包括，但不限于，具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％氨基酸序列同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性且具有错配内切核酸酶活性的氨基酸序列的多肽；和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽及其同源物。衍生出本发明的双链核酸切割方法中使用的多肽的生物体的实例包括古细菌，优选地耐热的古细菌，更优选地激烈热球菌、Thermococcus barophilus和詹氏甲烷球菌。在本发明的双链核酸切割方法中，还可以使用作为PF0012的同源物或MJ_0225的同源物的来自詹氏甲烷球菌的多肽MJ_0225(RefSeq ID:NP_247194, SEQ ID NO:8)，或作为PF0012的同源物或TERMP_01877的同源物的来自Thermococcus barophilus的多肽TERMP_01877 (RefSeq ID:YP_004072075, SEQID NO:7)。具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的同源物的实例包括，但不限于，具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽。具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽的同源物的实例包括，但不限于，具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽。

本发明的双链核酸切割方法中的错配的碱基对存在于双链核酸内(正常碱基配对的两个碱基对之间)。错配的碱基对不限于双链核酸内存在的一个错配的碱基对。错配的碱基对还包括双链核酸内以间隔存在的多个错配的碱基对，和双链核酸内存在的两个或更多个连续的错配的碱基对。本发明的双链核酸切割方法中的错配的碱基对的实例包括优选双链核酸内存在的1至8个连续的错配的碱基对，更优选双链核酸内存在的1至4个连续的错配的碱基对，且又更优选双链核酸内存在的2个连续的错配的碱基对或一个错配的碱基对。在本发明的双链核酸切割方法中，当双链核酸内存在多个错配的碱基对时，所述多个错配的碱基对可以是相同种类或不同种类的错配的碱基对。

具有错配的碱基对的双链核酸的实例包括来自生物体样品的核酸，例如，PCR产物、基因组DNA、或其片段和合成的核酸。具有错配的碱基对的双链核酸也可以是通过熔解和再退火多个生物体样品的混合物而获得的核酸混合物，或来自生物体样品的核酸和合成的核酸的混合物。例如，当混合、熔解和再退火含有突变和野生型核酸的核酸时，形成错配的碱基对且错配内切核酸酶的切割发生在错配的碱基对的位置处。通过错配内切核酸酶切割之后，观察因此切割的核酸片段的大小，以测定突变的存在或不存在和位置。本发明的错配内切核酸酶的使用允许通过一步反应分析突变，其中仅仅将错配内切核酸酶添加至反应混合物用于核酸扩增方法诸如PCR。已知，当增加PCR中的循环的数目以超过特定数目时，在扩增中没有获得任何效果。主要原因是耗竭添加至反应混合物的核酸，或引物和反应产物之间对于退火的竞争。此时，反应产物之间的退火发生。如果含有突变和野生型模板的模板共存，则使从这些扩增的反应产物互相退火以便在突变位点生成错配的碱基对。因此，可以在比通常更多的循环中在本发明的错配内切核酸酶存在的情况下进行PCR来简单地完成突变分析。具体地，本发明提供了突变分析方法，其包括用具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或其同源物处理双链核酸。本发明进一步提供了突变分析方法，其包括用具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的多肽或其同源物处理双链核酸。本发明进一步提供了突变分析方法，其包括用具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽或其同源物处理双链核酸。

在核酸扩增反应的方法中，可以进行本发明的双链核酸切割方法。通过将错配内切核酸酶添加至用于核酸扩增的反应混合物，切割具有通过在扩增方法过程中引入不正确的碱基生成的错配碱基对的双链核酸。作为结果，在反应引发之前具有与模板核酸的序列不同的序列的核酸的扩增受到抑制。因此，得到具有降低误差率的核酸扩增。具体地，本发明提供了核酸扩增方法，其包括通过使用具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或其同源物切割具有错配的碱基对的双链核酸的步骤。本发明进一步提供了核酸扩增方法，其包括通过使用具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽或其同源物切割具有错配的碱基对的双链核酸的步骤。本发明进一步提供了核酸扩增方法，其包括通过使用具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽或其同源物切割具有错配的碱基对的双链核酸的步骤。切割具有错配的碱基对的双链核酸的步骤可以与核酸扩增的步骤同时进行。本发明的一个方面还包括包含以下的组合物：(a) DNA聚合酶；(b) 至少一对寡核苷酸引物；和(c) 至少一种选自以下的多肽：(i) 具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和(iii) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽。作为本发明的另一个方面，提供了包含以下的组合物：(a) DNA聚合酶；(b) 至少一对寡核苷酸引物；和(c) 至少一种选自以下的多肽：(i) 具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽；(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和(iii) 具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽。作为本发明的另一个方面，还提供了包含以下的组合物：(a) DNA聚合酶；(b) 至少一对寡核苷酸引物；和(c) 至少一种选自以下的多肽：(i) 具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽；(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和(iii) 具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽。本发明的一个方面还包括核酸扩增方法，其包括制备包含如上述用于核酸扩增的组合物和作为模板的核酸分子的组合物的步骤，和在适合条件下使因此获得的组合物反应以进行核酸扩增的步骤。

上述组合物可以进一步含有选自反应缓冲剂、二价金属离子、脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸探针和嵌入染料中的至少一者。当上述组合物用于核酸扩增反应中时，所述组合物可以进一步含有作为用于核酸扩增反应的模板的核酸。反应缓冲剂意指具有降低氢离子浓度(pH)的变化的活性的化合物或混合物。弱酸及其盐或其弱碱及其盐的混合溶液广泛用作反应缓冲剂用于pH控制的目的，因为混合溶液具有强缓冲作用。本发明中使用的反应缓冲剂的实例包括Good氏缓冲剂诸如Tris-HCl和HEPES-KOH，和磷酸盐缓冲剂诸如磷酸钠缓冲剂。二价金属离子的实例包括镁离子、锰离子、锌离子和钴离子。二价金属离子可以提供为盐形式诸如氯化物、硫酸盐或乙酸盐。

用于核酸扩增的方法的实例包括，但不限于，扩增DNA的方法。扩增DNA的方法的实例包括聚合酶链式反应(PCR)法、多重置换扩增(MDA)方法，和等温核酸扩增方法诸如ICAN方法和LAMP方法。

适当地可以通过测定每种反应系统中的不抑制DNA扩增反应的浓度或有效切割错配的碱基对的浓度，来测定上述用于核酸扩增反应的组合物中的具有错配内切核酸酶活性的多肽的浓度。

作为上述用于核酸扩增反应的组合物中含有的至少一对引物，选择适合于每种核酸扩增方法的两种或更多种引物。这些引物可以是DNA引物、RNA引物或其中DNA分子的部分被替换为RNA的嵌合引物，只要实现期望的扩增。引物也可以是含有已知的核酸类似物的引物，和例如具有用于检测目的的荧光染料的标记引物。

本发明人已经进一步发现，可以通过使用错配内切核酸酶和合适设计的寡脱氧核苷酸抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸。因此，本发明的一个方面还包括在核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，其包括在以下存在的情况下进行核酸扩增反应的步骤：(a) 寡脱氧核苷酸，其被设计为当所述寡脱氧核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时生成一个至几个错配，(b) DNA聚合酶，(C)至少一对寡脱氧核苷酸引物，和(d) 具有错配内切酶活性的多肽。本发明的一个方面还包括优先扩增目标DNA的方法，其包括通过使用上述在核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，抑制具有在一个至几个核苷酸中与目标DNA的核苷酸序列不同的特定核苷酸序列的DNA的扩增。

上述(a)中的寡脱氧核苷酸没有特别限制，只要其是被设计为当其与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时生成一个至几个错配的寡脱氧核苷酸。寡脱氧核苷酸可以是所谓的嵌合寡脱氧核苷酸，其中DNA分子的部分被替换为RNA。可以修饰寡脱氧核苷酸的3'末端，以抑制通过DNA聚合酶从所述寡脱氧核苷酸的延伸反应，本发明没有特别限于此。修饰的实例包括氨基化。磷硫酰化(phosphorothioation)或其它修饰可以保护寡脱氧核苷酸免于被脱氧核糖核酸酶切割，只要寡脱氧核苷酸结合的核酸经受用具有错配内切核酸酶活性的多肽的切割。为了检测的目的，寡脱氧核苷酸可以用荧光染料或猝灭剂标记。

可以适当测定寡脱氧核苷酸的长度，使得寡脱氧核苷酸可以在进行反应的条件下与具有特定核苷酸序列的核酸杂交。当寡脱氧核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时生成的错配的位置优选远离寡脱氧核苷酸的5'末端和3'末端至少3个核苷酸。

对于本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法，可以使用具有特异性切割错配位点的活性的任何错配内切核酸酶。例如，当耐热的DNA聚合酶用于核酸扩增方法、包括高温下的反应诸如PCR方法时，优选使用耐热的错配内切核酸酶。在此类情况下，优选使用耐热的错配内切核酸酶，即，至少一种选自以下的多肽：(i) 具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和(iii) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽；(iv) 具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽；(v) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和(vi) 具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；(vii) 具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽；(viii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和(ix) 具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽，但本发明没有特别限于此。

对于本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法，优选使用具有仅特异性切割含有特定错配的碱基对的双链核酸的活性的错配内切核酸酶。在此类情况下，其扩增受到抑制的核苷酸序列可以限于一种核苷酸序列。例如，具有通过用另一种氨基酸残基取代位置77的色氨酸而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽特异性切割含有G (鸟嘌呤碱基) - G (鸟嘌呤碱基)错配的双链核酸。因此，当使用具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽时，其中在错配位点存在除了G(鸟嘌呤碱基)以外的碱基的双链核酸不被切割且不发生扩增的抑制。具体地，具有通过用另一种氨基酸残基取代位置77的色氨酸而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽及其同源物，优选用于抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法。

因此，本发明进一步提供了用于核酸扩增反应的组合物，其包含以下(a)至(d)：

(a) 寡脱氧核苷酸，所述寡脱氧核苷酸被设计以便当寡脱氧核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸或其互补链杂交时生成一个至几个错配；

(b) DNA聚合酶；

(c) 至少一对寡核苷酸引物；和

(d) 至少一种选自以下(i)至(xii)的多肽：

(i) 具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

(ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(iii) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(iv) 具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；

(v) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的苯丙氨酸以外的1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(vi) 具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽, 其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置77的色氨酸的氨基酸被另一种氨基酸残基取代；

(vii) 具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽；

(viii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(ix) 具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；

(x) 具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽；

(xi) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基而不同于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和

(xii) 具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性、优选至少80％氨基酸序列同一性、更优选至少85％氨基酸序列同一性、又更优选至少90％氨基酸序列同一性、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肽。上述组合物可以进一步含有选自反应缓冲剂、二价金属离子、脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸探针和嵌入染料中的至少一者。上述组合物可以进一步含有作为用于核酸扩增反应的模板的核酸。

可以通过任何核酸扩增方法进行本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法。优选使用扩增DNA的方法，但本发明不限于此。可以进行本发明，例如，通过PCR方法、MDA方法或等温核酸扩增方法，诸如LAMP方法或ICAN方法。

可以将本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法应用于扩增任何核酸。当DNA用作待扩增的目标时，DNA的实例包括人工制备的DNA混合物、来自环境的样品、生物体样品或从上述样品制备的DNA混合物中存在的DNA。生物体样品的实例包括，但不限于，来自哺乳动物诸如人的样品。DNA混合物的实例包括，但不限于，基因组DNA片段的混合物，通过逆转录反应从mRNA生成的cDNA的混合物，和多种PCR产物的混合物。经受扩增的抑制的具有特定核苷酸序列的DNA的实例包括不经分离且保持的来自rRNA的逆转录产物，和通过引物之间的配对生成的低分子量DNA。当扩增基因文库和随后功能筛选之后，可以通过抑制表现出阳性信号的具有已知基因的序列的DNA的扩增来制备能够有效地搜索未知基因的文库。

适当地可以通过检查每种反应系统中的不抑制DNA扩增反应的浓度或有效切割错配的碱基对的浓度，来测定本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法[8]的(d)中的具有错配内切核酸酶活性的多肽的浓度。(a)中的寡脱氧核苷酸的浓度可以通过优化使用浓度、同时考虑模板的量或目标DNA的扩增效率来测定。例如，寡脱氧核苷酸的浓度可以是用于扩增反应的引物的浓度的0.1至10倍。

优先扩增本发明的目标DNA的方法[11]可以进一步包括检测扩增的目标DNA的步骤。如本文所使用，本发明的该方面，有时被称为“本发明的检测方法”。例如，根据本发明的检测方法(其中，当不是待检测的目标的DNA(具有特定核苷酸序列的DNA)以相对于作为待检测的目标的DNA(目标DNA)以过度大量存在时，DNA被用作待检测的目标)，作为模板的非目标DNA的扩增，凭借本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核苷酸序列的核酸的方法[8]的(a)中的寡脱氧核苷酸和(d)中的具有错配内切核酸酶活性的多肽而抑制，因此可以检测待检测的目标DNA。

本发明的检测方法能够区别地检测例如对应于其中已知存在基因中的突变的基因的核酸的野生型和突变型。当使用具有野生型核苷酸序列的DNA作为具有特定核苷酸序列的核酸进行本发明的检测方法时，可以在过度大量的正常等位基因(即，具有野生型核苷酸序列的DNA)存在的情况下检测少量突变等位基因。例如，本发明的方法可用于检测循环肿瘤DNA，或检测母体血液中含有的少量胎儿DNA序列。突变的实例包括微缺失和点突变。由点突变生成的多态性被称为单核苷酸多态性(SNP)。如本文所使用，在SNP间具有突变核苷酸多态性的DNA有时被称为具有单核苷酸多态性突变的DNA。

具有特定核苷酸序列的核酸可以优选是含有至少一个选自用作肿瘤标志物的单核苷酸多态性、与用于治疗癌症的药剂的治疗效果相关的单核苷酸多态性和已知与细胞的癌变相关的单核苷酸多态性的单核苷酸多态性的核酸，但是本发明不具体限于此。SNP的实例包括肿瘤细胞中经常发现的那些，和已知与用于治疗癌症或癌症发生的药剂的治疗效果相关的那些。此类SNP的实例包括K-ras基因、B-raf基因和表皮生长因子受体(EGFR)基因的SNP。K-ras基因中的体细胞突变经常发现于结肠直肠癌、肺腺癌、甲状腺癌等中。B-raf基因中的体细胞突变经常发现于结肠直肠癌、恶性黑色素瘤、乳头状甲状腺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌等中。EGFR基因中的体细胞突变经常发现于各种实体瘤中。已知的是，当癌组织中的EGFR基因具有特异性单核苷酸多态性突变时，用EGFR抑制剂诸如吉非替尼或埃罗替尼治疗癌症可能是有效的。相反，已知的是，当癌组织中的K-ras基因具有单核苷酸多态性突变时，癌症可能对EGFR抑制剂是耐受的。

可以使用用亚硫酸氢盐处理从生物体样品提取的含有甲基化DNA的组合物之后获得的DNA作为材料，进行本发明的检测方法。根据本发明的检测方法，可以进行在过度大量的非甲基化等位基因存在的情况下检测少量甲基化等位基因，或在过度大量的甲基化等位基因存在的情况下检测少量非甲基化等位基因。

作为用亚硫酸氢盐处理，可以使用用于检测甲基化DNA的已知亚硫酸氢盐方法。通过处理，非甲基化胞嘧啶变为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不改变。当用亚硫酸氢盐处理的反应混合物通过PCR进行扩增时，尿嘧啶变为胸腺嘧啶且甲基化胞嘧啶变为胞嘧啶。换言之，在特定位点存在过度大量的非甲基化等位基因的情况下检测少量甲基化等位基因，和在过度大量的甲基化等位基因存在的情况下检测少量非甲基化等位基因分别对应于在过度大量的胸腺嘧啶存在的情况下检查胞嘧啶的存在，和在过度大量的胞嘧啶存在的情况下检查胸腺嘧啶的存在。当过度大量的含有胸腺嘧啶或胞嘧啶的DNA的扩增被抑制时，容易地检查少量的甲基化等位基因或非甲基化等位基因的存在。

对于本发明的检测方法中检测目标核酸的步骤，可以使用电泳、核苷酸序列分析或使用探针(如循环探针或TaqMan探针)的实时PCR。对于这些检测方法，可以直接使用常规技术。具体而言，高分辨率熔解(HRM)分析方法的使用允许通过一个步骤扩增和检测目标DNA，且因此达到目标DNA的快速和简单的检查。

实施例

本发明将借助实施例更具体地解释，本发明不限于所述实施例。

制备例1：基因组DNA的制备

遵循日本专利号3742659的实施例1中描述的方法制备激烈热球菌的基因组DNA。遵循WO02/22831的实施例8中描述的方法制备Thermococcus barophilus和詹氏甲烷球菌的基因组DNA，除了使用Thermococcus barophilus和詹氏甲烷球菌替代海滨热球菌(Thermococcus litoralis)作为微生物菌株。这些微生物菌株可得自德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）。

制备例2：蛋白PF0012的制备

(1) pET-PF12(用于表达PF0012的质粒)的制备

对于蛋白PF0012的功能性分析，构建用于在大肠杆菌(大肠杆菌)中的强制表达的系统。对于使用In-Fusion (注册商标) HD克隆试剂盒(由TAKARA BIO INC.制造)从Genbank Acc. NC_003413中显示的激烈热球菌克隆PF0012的蛋白编码区域(核苷酸编号11810-12610)，设计两个引物PF12F和PF12R。PF0012的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1。引物PF12F和PF12R的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。作为模板的来自激烈热球菌的基因组DNA、这些引物和PrimeSTAR (注册商标) HS DNA聚合酶(由TAKARA BIOINC.制造)用于扩增所述区域。扩增区域的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:5。使用In-Fusion(注册商标) HD克隆试剂盒将扩增的片段插入质粒pET15b (由Merck MilliporeCorporation制造)中的NdeI和BamHI切割位点之间。In-Fusion反应混合物用于转化大肠杆菌JM109。从表现出氨苄青霉素抗性的克隆分离用于表达PF0012的质粒pET-PF12。从保留该质粒的大肠杆菌的粗提取物，通过实施例2中描述的方法检测错配内切核酸酶活性。然而，该质粒非常不稳定，且频繁引起内部缺失。因此，所述质粒不适于产生蛋白。

(2) pET-optPF12(用于表达PF0012的优化质粒)的制备

由于使用pET-PF12表达蛋白PF0012不稳定，所以设计核苷酸序列以通过大肠杆菌类型密码子编码PF0012的氨基酸序列，且人工合成含有所述核苷酸序列的DNA。该DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:6。用限制酶NdeI和BamHI消化该DNA，然后纯化。使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix> (由TAKARA BIO INC.制造)将因此获得的DNA片段插入NdeI和BamHI限制性位点之间。连接反应混合物用于转化大肠杆菌JM109。选择表现出氨苄青霉素抗性的克隆。从所述克隆获得用于表达PF0012的优化质粒pET-optPF12。

(3) 蛋白PF0012的表达

用质粒pET-optPF12转化大肠杆菌BL21 DE3。分离表现出氨苄青霉素抗性的克隆。将因此获得的新鲜单一菌落在2 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(以下，称为LB-AP培养基)中在37℃培养过夜。向50ml LB-AP培养基添加500 μl过夜培养物，且然后在37℃培养3小时。然后，向培养溶液，以1mM的最终浓度添加IPTG，然后在37℃培养3小时。培养完成之后，将培养溶液以6000 x g离心10分钟，以便从培养溶液收获细菌细胞。

(4) 蛋白PF0012的纯化

将上述细菌细胞悬浮于3ml含有50mM Tris-HCl, pH 7.5和100 mM NaCl的溶液(以下，称为缓冲液A)中，且进行使用VP-5S Ultras.均化器(由TAITEC制造)的超声波破碎。持续30秒钟的超声波处理重复3次之后，悬浮液变得透明。

将超声波处理之后的悬浮液在95℃加热10分钟以变性热不稳定蛋白，然后以17000 x g离心10分钟。收集上清液。向因此获得的粗提取物，添加500 μl Ni-NTA琼脂糖(由QIAGEN制造)，随后在4℃轻轻搅拌2小时。将树脂填充至Econo-Pac(注册商标)柱(由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造)，且用20 ml含有5mM咪唑的缓冲液A洗涤。洗涤之后，1ml含有300mM咪唑的缓冲液用于洗脱蛋白PF0012。将洗脱物用缓冲液A在4℃透析两次，然后用含有50％甘油的缓冲液A在4℃透析过夜，以获得含有蛋白PF0012的溶液。

制备例3：PF0012同源蛋白的制备

(1) pET-TBA和pET-MJA(用于表达PF0012同源蛋白的质粒)的制备

为了从属于古细菌的两种菌株(Thermococcus barophilus和詹氏甲烷球菌)分离PF0012同源蛋白的目的，克隆编码所述蛋白的区域。来自这两种菌株的PF0012同源蛋白的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

从Genbank Acc. CP002372.1和Genbank Acc. NC_000909.1中显示的核苷酸序列信息，获得对应于PF0012同源蛋白的序列信息(TERMP_01877: 核苷酸编号1674836-1675591和MJ_0225: 核苷酸编号215449-216240)。设计和制备用于克隆对应基因的引物。对于TERMP_01877基因的克隆，使用引物TBA1877F和TBA1877R的对。对于MJ_0225基因的克隆，使用引物MJ255F和MJ255R的对。这些引物的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:9、10、11和12。

作为模板的来自Thermococcus barophilus或詹氏甲烷球菌的基因组DNA、上述引物对和PrimeSTAR (注册商标) HS DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)用于扩增所述区域。扩增的DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:13和14。以与制备上述pET-PF12相同的方式，将扩增的DNA各自插入质粒pET15b，以获得质粒pET-TBA和质粒pET-MJA。

(2) PF0012同源蛋白的表达

以与上述蛋白PF0012的表达相同的方式进行PF0012同源蛋白的表达和纯化，除了pET-TBA和pET-MJA用作质粒，且在细菌细胞的破裂之后，热不稳定的蛋白通过在75℃高温处理10分钟而沉淀。因此，获得PF0012同源蛋白，TERMP_01877和蛋白MJ_0225。

实施例1：突变PF0012蛋白的制备

(1) pET-optPF12-W77F(用于表达突变PF0012的质粒)的制备

制备编码蛋白PF0012的突变体的基因，其中蛋白PF0012(SEQ ID NO:1)中的位置77的氨基酸色氨酸(密码子TGG)被变为苯丙氨酸(密码子TTT)。根据蛋白PF0012的同源蛋白NucS的分析，PF0012中的位置77的色氨酸据信是ssDNA结合区域(The EMBO Journal,2009, vol. 28, p. 2479-2489)。PF0012蛋白的突变体(以下，称为突变体W77F)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2。

作为用于引入突变的引物，制备SEQ ID NO:15和16中显示的mutF1和mutR1。使用pET-optPF12作为模板、上述引物和PrimeSTAR (注册商标)诱变基础试剂盒(由TAKARA BIOINC.制造)进行PCR。因此获得的扩增反应混合物用于转化大肠杆菌JM109。从表现出氨苄青霉素抗性的克隆获得用于表达突变体W77F的质粒pET-optPF12-W77F。

(2) 突变体W77F的表达和纯化

以与上述野生型蛋白PF0012的那些相同的方式进行突变体W77F的表达和纯化，除了PET-optPF12-W77F用作质粒。

实施例2：蛋白PF0012的错配切割活性

(1) 用于测量切割活性的底物的制备 - 1

为了测定蛋白PF0012的错配切割活性，制备用于检测活性的底物。

将两种合成DNA(一种在其5’末端用FAM标记，且另一种在其5’末端用ROX标记)进行混合且退火以制备底物。合成四种ROX标记的DNA：ROX-探针-G、ROX-探针-A、ROX-探针-T和ROX-探针-C。四种ROX标记的DNA的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:17、18、19和20。ROX-探针-G、ROX-探针-A、ROX-探针-T和 ROX-探针-C的核苷酸序列是相同的，除了从5’末端起的第11个碱基，其中第11个碱基分别是G、A、T和C。合成四种FAM标记的DNA：FAM-探针-G、FAM-探针-A、FAM-探针-T和FAM-探针-C。四种FAM标记的DNA的核苷酸序列分别显示于SEQID NO:21、22、23和24。FAM-探针-G、FAM-探针-A、FAM-探针-T和FAM-探针-C的核苷酸序列是相同的，除了从5’末端起的第15个碱基(分别是G、A、T和C)。从这些，选择一种ROX标记的DNA和一种FAM标记的DNA，混合且杂交以制备用于检测错配切割活性的底物。所述底物是在除了从用ROX标记的碱基起第11个碱基以外的位置形成碱基对且在第11个碱基的位置具有一个错配碱基对的双链DNA。

(2) 通过蛋白PF0012的错配切割反应(通过PAGE检测)

制备反应混合物，所述反应混合物含有1 μl 5 μM的一种ROX标记的DNA、1 μl 5 μM的一种FAM标记的DNA、1 μl 10 X Ex taq缓冲液[随附TaKaRa Ex Taq(注册商标)，由TAKARA BIO INC.制造]、蛋白PF0012和H₂O。添加蛋白PF0012和H₂O，使得反应混合物的总量变为10 μl。将反应混合物在60℃孵育1小时之后，停止反应。反应混合物在10％聚丙烯酰胺变性凝胶上进行电泳。电泳之后，通过FMBIO (注册商标) (由Hitachi Solutions, Ltd.制造)检测凝胶中的荧光信号。

图1 a)显示ROX信号的检测。图1b)显示来自与用于检测ROX信号的凝胶相同的电泳凝胶的FAM信号的检测。在图的上部部分，指向ROX的左侧的字母显示使用的ROX标记的DNA的种类，且具体地，G、A、T和C显示分别使用ROX-探针-G、ROX-探针-A、ROX-探针-T和ROX-探针-C。指向FAM的左侧的字母显示使用的FAM标记的DNA的种类，具体地，G、A、T和C显示分别使用FAM-探针-G、FAM-探针-A、FAM-探针-T和FAM-探针-C。空白显示不使用FAM标记的DNA，且仅使用ROX标记的DNA用于反应。

在两种系统中，仅当使用具有G-G、G-T、T-G或T-T错配的底物时，才在低分子量区域中观察到可能对应于切割片段的DNA的荧光信号。该事实显示，蛋白PF0012识别G-G、G-T、T-G和T-T的位置，且具有切割错配的附近的DNA的两条链的能力。

由于来自切割片段的信号没有显示模糊模式，蛋白PF0012可能不具有外切核酸酶活性。此外，当使用单一荧光标记的DNA时，在低分子量区域中没有观察到荧光信号。因此，发现蛋白PF0012几乎没有切割单链DNA的活性。

发现蛋白PF0012具有对于所述蛋白可以切割的错配碱基的选择性、对于错配的高特异性和与形成正常碱基对的双链DNA和单链DNA的低反应性。当将蛋白PF0012添加至核酸扩增反应时，该蛋白对于错配的高特异性是有利的，因为该蛋白不太可能凭借对于错配的高特异性抑制反应。

(3) 用于测量切割活性的底物的制备 - 2

为了相继观察PF0012的错配切割活性，制备能够通过被切割而生成荧光信号的底物。

合成SEQ ID NO:25、26、27、28中显示的核苷酸序列的DNA，其中猝灭剂eclipse结合至5'末端且FAM结合至3’末端：DD-探针-G、DD-探针-A、DD-探针-T和DD-探针-C。作为用于互补链的模板DNA，制备SEQ ID NO:29和30中显示的模板-G和模板-T。混合荧光标记的DNA和模板DNA，以制备在从5’末端起第5个碱基的位置具有错配碱基对的双链DNA底物。

(4) 通过蛋白PF0012的错配切割反应的相继观察

制备反应混合物，所述反应混合物含有1.5 μl 5 μM荧光标记的DNA (DD-探针-G、DD-探针-A、DD-探针-T和DD-探针-C中的任一种)、1 μl 25 μM模板-G、2.5 μl 10 X Ex Taq缓冲液、蛋白PF0012和H₂O。添加蛋白PF0012和H₂O，使得反应混合物的总量变为25 μl。将反应混合物在55℃孵育1小时，同时每分钟一次观察荧光强度的变化。通过使用ThermalCycler Dice(注册商标)实时系统测量(由TAKARA BIO INC.制造)测量反应和荧光强度。

图2显示逐分钟(minute by minute)的荧光强度。在未切割的底物中，通过eclipse猝灭来自FAM的荧光。当蛋白PF0012切割底物时，FAM和eclipse之间的距离增加，因此观察到来自FAM的荧光。

事实上，仅当使用含有G-G或G-T错配的底物时，观察到荧光强度的增加。当使用含有G-A错配或G-C碱基配对的底物时，没有观察到荧光强度的增加。该实验显示蛋白PF0012具有切割由G或T构成的错配的活性。对各错配的碱基对的切割活性表示为在反应开始时的初始速率，即从维持线性的阶段中且通过各底物的荧光强度校正的斜率计算的值。当比较从图2中显示的曲线计算的反应初始速率时，发现蛋白PF0012对G-G错配的切割活性比对G-T错配的切割活性高2倍。

实施例3：PF0012同源蛋白的错配切割活性

(1) PF0012同源蛋白的错配切割反应

检查来自Thermococcus barophilus和詹氏甲烷球菌的PF0012同源蛋白的错配切割活性和碱基特异性。以与蛋白PF0012的错配切割反应的相继观察相同的方式，除了PF0012同源蛋白(蛋白TERMP_01877或蛋白MJ_0225)用作酶蛋白，基于作为指标的荧光强度的增加观察错配切割活性。

作为结果，如图3中显示，发现来自Thermococcus barophilus和詹氏甲烷球菌的蛋白具有切割由G或T构成的错配位置的活性。

(4) 通过添加蛋白PF0012减少PCR基因扩增中的误差率

蛋白PF0012可以识别双链核酸中的错配的碱基对且切割双链核酸的两条链。该蛋白是耐热的，因此可以直接添加至高温反应系统诸如PCR。该蛋白特异性切割PCR过程中生成的含有错配的碱基对的双链核酸，且由此预期扩增反应过程中误差的发生率受到抑制。

(1) 添加蛋白PF0012的PCR

将蛋白PF0012添加至用于PCR的反应混合物。反应混合物连同作为模板的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的基因组DNA和四对引物进行PCR。使用的引物对是Tth1F(SEQ ID NO:31)和Tth1R (SEQ ID NO:32)；Tth2F (SEQ ID NO:33)和Tth2R (SEQ ID NO:34)；Tth3F (SEQ ID NO:35)和Tth3R (SEQ ID NO:36)；以及Tth4F (SEQ ID NO:37)和Tth4R (SEQ ID NO:38)。添加嗜热栖热菌HB8基因组DNA溶液(由TAKARA BIO INC.制造)作为模板、上述引物对和蛋白PF0012。在98℃持续10秒、55℃持续30秒和72℃持续1分钟的30个循环中，使用TaKaRa Taq (注册商标) Hot Start Version (由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR。

(2) PCR中的误差率的计算

通过使用NucleoSpin (注册商标)凝胶和PCR Clean-up (由TAKARA BIO INC.制造)纯化如上所述扩增的DNA片段。DNA片段进行TA克隆到pMD19(简单)质粒(由TAKARA BIOINC.制造)中。然后，每种扩增的DNA片段的96个质粒克隆(总共384个克隆)进行扩增区域的核苷酸测序。

去除不含有目标DNA的序列信息和假设为用于核苷酸测序分析的程序过程中生成的误差的序列信息之后，将扩增区域的核苷酸序列与原始基因组DNA序列进行比较，以计算不同碱基的数目。不同碱基的数目除以分析碱基的总数目以获得误差率。

在通过没有蛋白PF0012的PCR扩增的DNA中，128826 bp中的71 bp是误差且误差率是0.055％。当在添加蛋白PF0012的情况下进行PCR时，97112 bp中的28 bp是误差且误差率是0.029%。

因此，通过核酸扩增生成的误差可以通过仅将蛋白PF0012添加至PCR反应混合物而减少。

实施例5：突变体W77F的错配切割活性

蛋白PF0012初始具有对于由G或T构成的错配的碱基对的选择性。我们通过将突变引入蛋白而制备识别进一步限制的错配的碱基对的酶蛋白。

(1) 通过突变体W77F的错配切割反应的相继观察

通过使用上述荧光DNA底物观察到实施例1中制备的突变体W77F的错配切割活性和碱基特异性。在该实验中，使用突变体W77F替代蛋白PF0012，且组合DD-探针-G、DD-探针-T和模板-G、模板-T。其它反应条件与实施例2(4)中描述的相继错配切割活性的测量中的那些相同。

如图4中显示，突变体W77F充分切割G-G错配，而对G-T错配的切割活性等于或小于对G-G错配的切割活性的1/20，且没有切割T-T错配。野生型蛋白PF0012对G-T错配的活性是对G-G错配的活性的约1/2，如图2中显示。因此，突变体W77F具有对G-G错配的更特异性的切割活性。

实施例6：通过添加突变体W77F特异性扩增非常少量的污染性突变基因

(1) 模板质粒的制备

对于突变基因扩增测试，制备作为模板的质粒。

从Genbank Acc. NG_017013中显示的人TP53基因区域的序列信息，设计和合成SEQ ID NO:39和40中显示的两个引物：TP53CloneF和TP53CloneR。使用上述引物、作为模板的人基因组DNA(由Clontech Laboratories, Inc.制造)和PrimeSTAR(注册商标)HS DNA聚合酶扩增该区域。扩增区域的核苷酸序列信息显示于SEQ ID NO:41。扩增的DNA片段进行TA克隆到质粒pMD19(简单)(由TAKARA BIO INC.制造)中。因此获得的质粒被称为pTP53(G)。为了使用pTP53(G)作为模板将TP53基因的扩增区域中的第99个碱基G改变为A，设计和制备SEQ ID NO:42和43中显示的TP53AF和TP53AR作为用于引入突变的引物。作为模板的质粒pTP53(G)、用于引入突变的引物对和PrimeSTAR(注册商标)诱变基础试剂盒用于制备突变质粒pTP53(A)，其中将期望位置的G改变为A。

(2) 用于特异性突变基因切割的探针的设计和制备

设计用于特异性突变基因切割的寡核苷酸以具有与从向其中引入突变的pTP53(G)的位置以5'方向延伸8个碱基且以3'方向延伸7个碱基的区域互补的序列，且在对应于pTP53(G)上的突变位置的位置含有C至G的突变。当寡核苷酸与pTP53(G)杂交时，生成G-G错配。为了防止从寡核苷酸的延伸反应，用氨基替换寡核苷酸的3'末端的羟基。寡核苷酸被称为用于特异性SNP切割的寡核苷酸TP53deg。TP53deg的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:44。

(3) 抑制特异性突变基因的扩增的PCR

单独的质粒pTP53(G)，单独的质粒pTP53(A)，或作为模板的这些质粒的混合物，突变体W77F，和TP53deg用于进行PCR。质粒相对于100 ng pTP53(G)的混合比为，100 ng (1/1)、10 ng (1/10)、1 ng (1/100)、100 pg (1/1000)和10 pg (1/10000)的pTP53(A)。根据LightCycler (注册商标) 480 High Resolution Melting Master (由RocheDiagnostics制造)制备反应混合物。反应混合物含有3 μM的最终浓度的作为扩增引物的SEQ ID NO:45和46中分别显示的引物TP53AmpF和TP53AmpR，3 μM的最终浓度的作为用于特异性突变基因切割的寡核苷酸的TP53deg，和突变体W77F。添加突变体W77F，使得反应混合物的总体积变为20 μl。通过使用LC480(由Roche制造)进行PCR和荧光检测。用于PCR的反应条件包括在95℃预热5分钟，由95℃持续10秒、95℃持续20秒和72℃持续20秒组成的3步反应的40个循环，最后作为解离反应95℃持续1分钟，40℃持续1分钟，然后将温度从50℃相继增加至95℃，同时观察在各温度的荧光强度。使用不添加突变体W77F的反应混合物进行相同的测量。

(4) 非常少量的污染性突变基因的检测

图5显示PCR中的扩增曲线。表1显示从测量结果计算的Ct值。当反应混合物不含有突变体W77F时，观察到根据模板的混合比的Ct值的较少变化。相反，当在添加突变体W77F的情况下进行PCR时，使用单独的质粒pTP53(G)作为模板的反应受到抑制，且Ct值增加10倍或更多倍。该事实显示，突变体W77F使从质粒的DNA扩增抑制1000倍或更多倍。在使用单独的质粒pTP53(A)作为模板的扩增的情况下，突变体W77F的添加几乎不改变Ct值，且添加突变体W77F几乎不抑制扩增。当质粒的混合物用作模板时，观察到根据pTP53(A)的量的扩增。该事实显示，尽管突变体W77F切割由PCR反应混合物中的pTP53(G)和TP53deg形成的含有G-G错配的碱基对的双链核酸，但突变体W77F表现出对由pTP53(A)和TP53deg形成的G-A错配的碱基对的较少切割活性。此外，发现突变体W77F不显示对不含有错配的核酸的扩增抑制作用。当反应混合物含有1/10000拷贝的pTP53(A)/pTP53(G)，Ct值比单独的pTP53(G)更小。这表明，凭借突变体W77F从1/10000的混合比的反应混合物中存在的模板特异性扩增突变型(A)的基因区域。

测量每种扩增产物的荧光强度，同时将温度从50℃增加至95℃以进行熔解曲线分析。图6显示在各温度的荧光强度的一阶导数(first derivation)的图。如图6 a)中显示，当在不添加突变体W77F的情况下进行PCR时，在使用单独的pTP53(G)作为模板的扩增产物的熔解曲线分析中，峰出现在90.2℃。当单独的pTP53(A)用作模板时，峰出现在89.6℃。在其中两种质粒以1:1的比率存在的杂双链的情况下，除了在单独的每种质粒的情况下出现的峰以外，宽峰出现在约88.5℃。熔解曲线的一阶导数中的峰的此类差异可以用于区分含有野生型(G)的模板和含有突变型(A)的模板。

在添加突变体W77F的PCR中，如图6 b)中显示，当质粒pTP53(A)的混合比为1/100或更高时，波形与在使用单独的pTP53(A)作为模板的情况下发现的波形几乎相同。该事实显示，仅进行使用pTP53(A)作为模板的扩增。当质粒pTP53(A)的混合比为1/1000或1/10000时，观察到可能来自pTP53(A)的89.6℃的峰，并且进一步，还观察到可能来自杂双链的在约88.5℃的宽峰。该事实显示，以这些混合比，优先扩增来自pTP53(A)的片段。

在本实施例中，发现添加蛋白PF0012的突变体和生成与期望基因区域的核苷酸序列的错配的寡脱氧核苷酸导致具有所述核苷酸序列的基因的扩增的抑制，且因此导致具有少量SNP的基因的特异性扩增。

产业实用性

本发明可用于广阔领域(包括生物技术、生物学、医药和农业领域)中。

序列表自由文本

SEQ ID NO:1；来自激烈热球菌的PF0012的氨基酸序列

SEQ ID NO:2；PF0012 Y77F突变体的氨基酸序列

SEQ ID NO:3-4；设计的用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO:5；用于克隆PF0012基因的环状双链DNA中的插入DNA的核酸序列。

SEQ ID NO:6；用于克隆从PF0012氨基酸序列推导的设计序列的环状双链DNA中的插入DNA的核酸序列。

SEQ ID NO:7；来自Thermococcus barophilus的TERMP_01877的氨基酸序列

SEQ ID NO:8；来自詹氏甲烷球菌的MJ_0225的氨基酸序列

SEQ ID NO:9-12；设计的用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO:13；用于克隆TERMP_01877基因的环状双链DNA中的插入DNA的核酸序列。

SEQ ID NO:14；用于克隆MJ_0225基因的环状双链DNA中的插入DNA的核酸序列。

SEQ ID NO:15-16；设计的用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO:17-30；设计的用于测定错配核酸酶活性的寡核苷酸DNA。

SEQ ID NO:31-40；设计的用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO:41；用于克隆部分TP53基因的环状双链DNA中的插入DNA的核酸序列。

SEQ ID NO:42-43；设计的用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO:44；设计的用于抑制特定TP53片段的扩增的寡核苷酸DNA

SEQ ID NO:45-46；设计的用于PCR的寡核苷酸引物

序列表

<110> TAKARA BIO INC.

<120> 用于使用耐热的错配内切核酸酶的方法

<130> 671898

<150> JP2013-52265

<151> 2013-03-14

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 激烈热球菌

<400> 1

Met Glu Met Thr Lys Ala Ile Val Lys Glu Asn Pro Arg Ile Glu Glu

1 5 10 15

Ile Lys Glu Leu Leu Glu Val Ala Glu Ser Arg Glu Gly Leu Leu Thr

20 25 30

Ile Phe Ala Arg Cys Thr Val Tyr Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Glu

35 40 45

Leu Gly Glu Gly Asp Arg Ile Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Leu Ile His Gln Lys Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Pro

65 70 75 80

Gly Ser Lys Val Lys Met Glu Gly Asn Ser Leu Ile Ser Ile Arg Arg

85 90 95

Asn Pro Lys Glu Thr Leu Lys Val Asp Ile Ile Glu Ala Tyr Ala Ala

100 105 110

Val Leu Phe Met Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Thr Leu Thr Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Glu Met Ala Glu Leu Ile Phe Gln Asn Pro Asn Val Ile Glu

130 135 140

Glu Gly Phe Lys Pro Met Phe Arg Glu Lys Pro Ile Lys His Gly Ile

145 150 155 160

Val Asp Val Leu Gly Val Asp Arg Glu Gly Asn Ile Val Val Leu Glu

165 170 175

Leu Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu His Ala Val Ser Gln Leu Lys Arg

180 185 190

Tyr Val Asp Ala Leu Lys Glu Glu His Gly Asn Lys Val Arg Gly Ile

195 200 205

Leu Val Ala Pro Ser Leu Thr Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys

210 215 220

Leu Gly Leu Glu Phe Arg Lys Leu Glu Pro Pro Lys Lys Gly Lys Lys

225 230 235 240

Lys Ser Ser Lys Gln Lys Thr Leu Asp Phe Leu Asn Asp Thr Val Arg

245 250 255

Ile Thr Gly Ala Ser Pro Pro Glu Ala Ile Gln

260 265

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> 激烈热球菌

<400> 2

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1 5 10 15

Ile Lys Glu Leu Leu Glu Val Ala Glu Ser Arg Glu Gly Leu Leu Thr

20 25 30

Ile Phe Ala Arg Cys Thr Val Tyr Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Glu

35 40 45

Leu Gly Glu Gly Asp Arg Ile Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Leu Ile His Gln Lys Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Phe Gln Pro Pro

65 70 75 80

Gly Ser Lys Val Lys Met Glu Gly Asn Ser Leu Ile Ser Ile Arg Arg

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100 105 110

Val Leu Phe Met Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Thr Leu Thr Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Glu Met Ala Glu Leu Ile Phe Gln Asn Pro Asn Val Ile Glu

130 135 140

Glu Gly Phe Lys Pro Met Phe Arg Glu Lys Pro Ile Lys His Gly Ile

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Val Asp Val Leu Gly Val Asp Arg Glu Gly Asn Ile Val Val Leu Glu

165 170 175

Leu Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu His Ala Val Ser Gln Leu Lys Arg

180 185 190

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195 200 205

Leu Val Ala Pro Ser Leu Thr Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys

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Leu Gly Leu Glu Phe Arg Lys Leu Glu Pro Pro Lys Lys Gly Lys Lys

225 230 235 240

Lys Ser Ser Lys Gln Lys Thr Leu Asp Phe Leu Asn Asp Thr Val Arg

245 250 255

Ile Thr Gly Ala Ser Pro Pro Glu Ala Ile Gln

260 265

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

cgcgcggcag ccatatggaa atgacgaaag caatag 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

gttagcagcc ggatccttac tgaatggctt caggag 36

<210> 5

<211> 834

<212> DNA

<213> 激烈热球菌

<400> 5

cgcgcggcag ccatatggaa atgacgaaag caatagtaaa agaaaatccc aggattgaag 60

agataaaaga gttattggaa gttgcagaga gtagggaagg gttacttaca atttttgcta 120

ggtgtaccgt ttattatgag ggaagggcca agagtgagct tggagaagga gacaggatta 180

taataataaa gcctgatgga agcttcctta tccaccagaa gaagaaaagg gagcctgtca 240

attggcaacc ccctgggagt aaagtaaaaa tggaaggaaa ctccttaatt agcattagaa 300

ggaacccaaa agaaacactc aaagttgata taattgaagc atatgcagca gttcttttca 360

tggcagagga ctatgaggag ctaaccctaa ctggaagtga agcagagatg gctgagctca 420

ttttccaaaa tcccaatgtt atcgaggaag gatttaaacc aatgtttaga gagaagccaa 480

taaagcatgg aatagttgat gtacttggcg tggacagaga gggaaatata gtagttctag 540

aactgaaaag gaggagggcc gatttacacg cggttagtca gttaaagagg tacgtagatg 600

cactaaaaga agaacatgga aataaagtaa gaggaatatt ggtggcacct tctctaacgg 660

aaggagctaa aaagctttta gagaaacttg ggctagagtt tagaaagtta gaacctccta 720

aaaaaggtaa aaagaaaagt tcaaagcaaa aaactctaga cttcctcaac gatactgtta 780

ggataactgg ggcatcacct cctgaagcca ttcagtaagg atccggctgc taac 834

<210> 6

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 从PF0012氨基酸序列推导的设计序列

<400> 6

catatggaaa tgaccaaagc gattgtgaaa gaaaacccgc gcattgaaga aattaaagaa 60

ctgctggaag tggcggaaag ccgcgaaggc ctgctgacca tttttgcgcg ctgcaccgtg 120

tattatgaag gccgcgcgaa aagcgaactg ggcgaaggcg atcgcattat tattattaaa 180

ccggatggca gctttctgat tcatcagaaa aagaaacgcg aaccggtgaa ctggcagccg 240

ccgggcagca aagtgaaaat ggaaggcaac agcctgatta gcattcgccg caacccgaaa 300

gaaaccctga aagtggatat tattgaagcg tatgcggcgg tgctgtttat ggcggaagat 360

tatgaagaac tgaccctgac cggcagcgaa gcggaaatgg cggaactgat ttttcagaac 420

ccgaacgtga ttgaagaagg ctttaaaccg atgtttcgcg aaaaaccgat taaacatggc 480

attgtggatg tgctgggcgt ggatcgcgaa ggcaacattg tggtgctgga actgaaacgc 540

cgccgcgcgg atctgcatgc ggtgagccag ctgaaacgct atgtggatgc gctgaaagaa 600

gaacatggca acaaagtgcg cggcattctg gtggcgccga gcctgaccga aggcgcgaaa 660

aaactgctgg aaaaactggg cctggaattt cgcaaactgg aaccgccgaa aaaaggcaaa 720

aagaaaagca gcaaacagaa aaccctggat tttctgaacg ataccgtgcg cattaccggc 780

gcgagcccgc cggaagcgat tcagtaagga tcc 813

<210> 7

<211> 251

<212> PRT

<213> Thermococcus barophilus

<400> 7

Met Glu Ala Lys Val Glu Pro Ser His Glu Glu Ile Ile Glu Ile Leu

1 5 10 15

Asp Lys Ala Leu Ser Val Glu Ala Ile Ile Thr Leu Phe Ala Tyr Cys

20 25 30

Arg Val Phe Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Glu Leu Gly Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Val Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ser Phe Leu Ile His Gln Lys

50 55 60

Asn Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Pro Gly Ser Val Val Ser

65 70 75 80

Ile Val Leu Glu Asp Gly Arg Ile Met Leu Arg Ser Val Arg Arg Lys

85 90 95

Pro Lys Glu Thr Leu Glu Val Glu Leu Ile Lys Thr Tyr Leu Val Ser

100 105 110

Tyr Phe Gln Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu

115 120 125

Ala Glu Met Ala Asp Leu Ile Phe Glu Asn Pro Ser Leu Ile Glu Glu

130 135 140

Gly Phe Lys Pro Leu Phe Lys Glu Lys Pro Ile Lys His Gly Ile Val

145 150 155 160

Asp Val Leu Gly Lys Asp Lys His Gly Asn Leu Val Val Leu Glu Leu

165 170 175

Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu His Ala Val Ser Gln Leu Lys Arg Tyr

180 185 190

Val Asp Ser Leu Arg Glu Glu His Lys Asn Val Arg Gly Ile Leu Val

195 200 205

Ala Pro Ser Leu Thr Ala Gly Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys Glu Gly

210 215 220

Leu Glu Phe Lys Lys Leu Asn Pro Pro Lys Arg Glu Lys Arg Lys Lys

225 230 235 240

Gly Lys Gln Lys Thr Leu Asp Phe Leu Ser Pro

245 250

<210> 8

<211> 263

<212> PRT

<213> 詹氏甲烷球菌

<400> 8

Met Met Arg Leu Glu Lys Val Phe Tyr Leu Thr Asn Pro Thr Thr Lys

1 5 10 15

Asp Leu Glu Asn Phe Ile Asp Met Tyr Val Phe Lys Tyr Ile Leu Ile

20 25 30

Leu Leu Ala Arg Cys Lys Val Phe Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Gln

35 40 45

Leu Glu Glu Gly Asp Arg Val Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ala Phe

50 55 60

Leu Ile His Lys Asp Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Ser

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ile Ile Trp Glu Val Glu Asp Asn Phe Phe Ile Leu Lys

85 90 95

Ser Ile Arg Arg Lys Pro Lys Glu Glu Leu Lys Val Val Ile Ser Glu

100 105 110

Val Tyr His Ala Cys Ala Phe Asn Cys Glu Asp Tyr Glu Glu Ile Asn

115 120 125

Leu Arg Gly Ser Glu Ser Glu Met Ala Glu Met Ile Phe Arg Asn Pro

130 135 140

Asp Leu Ile Glu Glu Gly Phe Lys Pro Ile Ser Arg Glu Tyr Gln Ile

145 150 155 160

Pro Thr Gly Ile Val Asp Ile Leu Gly Lys Asp Lys Glu Asn Lys Trp

165 170 175

Val Ile Leu Glu Leu Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu Gln Ala Val Ser

180 185 190

Gln Leu Lys Arg Tyr Val Glu Tyr Phe Lys Asn Lys Tyr Gly Glu Asp

195 200 205

Lys Val Arg Gly Ile Leu Val Ser Pro Ser Leu Thr Thr Gly Ala Glu

210 215 220

Lys Leu Leu Lys Glu Glu Asn Leu Glu Phe Lys Arg Leu Asn Pro Pro

225 230 235 240

Lys Gly Ser Lys Arg Asp Leu Lys His Asn Ile Lys Thr Lys Lys Thr

245 250 255

Thr Val Leu Asp Glu Trp Leu

260

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 9

cgcgcggcag ccatatggaa gctaaggttg aaccctc 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 10

gttagcagcc ggatccctat gggctgagaa aatcaag 37

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 11

cgcgcggcag ccatatgatg agattggaga aagttttc 38

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 12

gttagcagcc ggatccttat agccattcat ctaaaactg 39

<210> 13

<211> 786

<212> DNA

<213> Thermococcus barophilus

<400> 13

cgcgcggcag ccatatggaa gctaaggttg aaccctctca cgaagaaata attgaaattt 60

tggataaagc cctctctgtt gaggctatca taactctttt tgcttattgt agggtattct 120

atgaggggag agccaagagt gagcttggcc ccggagatag ggtcattata atcaagccag 180

atggctcttt tttaattcac cagaagaaca aaagagaacc tgttaactgg cagccgccgg 240

ggagtgttgt cagcatcgtt cttgaggatg ggagaataat gctgagaagt gttaggagaa 300

aaccgaaaga aacccttgaa gttgagctca ttaaaactta tcttgtgagt tatttccaag 360

cagaggatta tgaggagctg acattaactg gaagtgaagc agagatggct gatttgatct 420

ttgagaatcc ctcattaatt gaggaaggat ttaaaccgct ctttaaggaa aagccaatta 480

aacatggaat agttgatgtg cttggaaaag acaaacatgg caatttggtt gtccttgagc 540

ttaagcgcag gagagcagat ctgcatgcgg tcagtcaact taaaagatat gttgattctc 600

tgagggagga gcataaaaat gttcgtggga ttttggttgc cccttctctt acggctgggg 660

ctaaaaaatt acttgaaaaa gaagggctgg aatttaaaaa gctgaatcca ccaaagcgtg 720

aaaagaggaa aaaaggcaag cagaaaaccc ttgattttct cagcccatag ggatccggct 780

gctaac 786

<210> 14

<211> 822

<212> DNA

<213> 詹氏甲烷球菌

<400> 14

cgcgcggcag ccatatgatg agattggaga aagttttcta tctaaccaat cctactacca 60

aagatttaga aaattttatt gatatgtatg tgtttaaata tatattaata ttattagctc 120

gatgtaaagt tttttatgaa ggcagagcta aaagtcagtt agaagaggga gatagagtca 180

ttataataaa accagatgga gcctttttaa ttcataaaga taaaaaaaga gaacctgtaa 240

attggcaacc ttctggaagt agtataatat gggaagttga agataacttt ttcattttaa 300

aaagcattag aagaaagcca aaagaagagt taaaggttgt tatttcagaa gtttatcatg 360

catgtgcttt taactgtgaa gattatgaag agataaatct aaggggtagt gaatcagaga 420

tggcagagat gatttttaga aatccagatt tgattgaaga aggatttaag cccatatcaa 480

gagagtatca gattcccact ggaatcgttg atattttagg aaaagataaa gagaataaat 540

gggttatctt agagctaaag agaaggagag ctgatttaca ggcagtttct caactaaaaa 600

ggtatgtgga atattttaaa aacaaatatg gtgaggataa agttagagga attttggttt 660

ctccctcttt aactactggg gcggaaaaat tgctgaaaga ggagaactta gaatttaaaa 720

gacttaatcc accaaaagga agtaaaagag atttaaaaca taacataaaa actaaaaaaa 780

caacagtttt agatgaatgg ctataaggat ccggctgcta ac 822

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 15

gtgaactttc agccgccggg cagcaaag 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 16

cggctgaaag ttcaccggtt cgcgtttc 28

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 17

ctaaacttgg gtctcctcag ggttc 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 18

ctaaacttgg atctcctcag ggttc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 19

ctaaacttgg ttctcctcag ggttc 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 20

ctaaacttgg ctctcctcag ggttc 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 21

gaaccctgag gagagccaag tttag 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 22

gaaccctgag gagaaccaag tttag 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 23

gaaccctgag gagatccaag tttag 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 24

gaaccctgag gagacccaag tttag 25

<210> 25

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 25

atgcctagcg ga 12

<210> 26

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 26

atgcctatcg ga 12

<210> 27

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 27

atgcctaacg ga 12

<210> 28

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 28

atgcctaccg ga 12

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 29

aatatccggt aggcattgaa gca 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡聚序列

<400> 30

aatatccgtt aggcattgaa gca 23

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 31

gagccttccc tggtccttta cggcg 25

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 32

gttgcggagg aggtcgtcca ggag 24

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 33

gagcggaacc acgagaacac cctgg 25

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 34

ctccaggtcc gcctcttccc gctt 24

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 35

cggccctacc gctttagcct ggagg 25

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 36

ccacggcacc tccaagaagg cctc 24

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 37

gtagaggaag tggttcttcc cggcg 25

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌

<400> 38

gaagctcccc ttcagggcct ccac 24

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人

<400> 39

cctggtaggt tttctgggaa gggac 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人

<400> 40

ctggtcctct gactgctctt ttcac 25

<210> 41

<211> 252

<212> DNA

<213> 智人

<400> 41

cctggtaggt tttctgggaa gggacagaag atgacagggg ccaggagggg gctggtgcag 60

gggccgccgg tgtaggagct gctggtgcag gggccacggg gggagcagcc tctggcattc 120

tgggagcttc atctggacct gggtcttcag tgaaccattg ttcaatatcg tccggggaca 180

gcatcaaatc atccattgct tgggacggca agggggactg tagatgggtg aaaagagcag 240

tcagaggacc ag 252

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 42

gctggtgcag gggccacgag gggagc 26

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 43

ggccacgagg ggagcagcct ctggca 26

<210> 44

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 44

tgctccccgc gtggcc 16

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 45

gcaatggatg atttgatgct 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 46

aacgacggcc agtgaattag 20

Claims

1.切割双链核酸的方法，所述方法包括：

用根据(i)或(ii)的至少一种多肽处理具有错配的碱基对的双链核酸，以便在所述错配的碱基对的位置处切割所述双链核酸的两条链，

(i) 由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽；

(ii) 从表达由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽的质粒表达的多肽。

2.组合物，其包含以下(a)至(c)：

(a) DNA聚合酶；

(b) 至少一对寡核苷酸引物；和

(c) 根据(i)或(ii)的至少一种多肽：

(i) 由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽；

3.扩增核酸的方法，所述方法包括以下步骤(a)和(b)：

(a) 制备包含根据权利要求2的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和

(b) 使通过步骤(a)获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增。

4.根据权利要求3的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)方法、等温核酸扩增方法或多重置换扩增(MDA)方法进行所述核酸扩增。

5.根据(A)或(B)的多肽：

(A) 由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽；

(B) 从表达由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽的质粒表达的多肽。

6.抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸扩增反应中扩增的方法，所述方法包括在以下(a)至(d)的存在下进行核酸扩增反应的步骤：

(a) 寡脱氧核苷酸，所述寡脱氧核苷酸被设计以便当所述寡脱氧核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸或其互补链杂交时，生成一个至几个错配；

(b) DNA聚合酶；

(c) 至少一对寡核苷酸引物；和

(d) 具有错配内切核酸酶活性的多肽，其为根据(i)或(ii)的至少一种多肽：

(i) 由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽；

7.根据权利要求6的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)方法或等温核酸扩增方法。

8.优先扩增目标DNA的方法，所述方法包括通过根据权利要求6的方法抑制具有在一个至几个核苷酸中与目标DNA的核苷酸序列不同的核苷酸序列的DNA的扩增。

9.根据权利要求8的方法，其用于扩增具有野生型核苷酸序列的DNA或含有单核苷酸多态性突变的DNA，其中野生型DNA的扩增和含有单核苷酸多态性突变的DNA的扩增彼此区分。

10.根据权利要求9的方法，其中所述单核苷酸多态性突变与癌变或用于治疗癌症的药剂的治疗效果相关。

11.根据权利要求8的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)方法或等温核酸扩增方法进行所述DNA扩增反应。

12.切割双链核酸的方法，所述方法包括：用由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽所具有的错配内切核酸酶活性处理具有错配的碱基对的双链核酸，以便在所述错配的碱基对的位置处切割所述双链核酸的两条链。

13.扩增核酸的方法，所述方法包括：在核酸扩增反应期间，用由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽所具有的错配内切核酸酶活性处理作为扩增产物的双链核酸，以便在错配的碱基对的位置处切割所述双链核酸的两条链。

14.抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸扩增反应中扩增的方法，所述方法包括：在核酸扩增反应期间，用由SEQ ID NO:1、2、7或8的氨基酸序列组成的多肽所具有的错配内切核酸酶活性处理作为扩增产物的双链核酸，以便在错配的碱基对的位置处切割所述双链核酸的两条链。

15.优先扩增目标DNA的方法，所述方法包括通过根据权利要求14的方法抑制具有在一个至几个核苷酸中与目标DNA的核苷酸序列不同的核苷酸序列的DNA的扩增。