CN105123522B - 一种广西美登木的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种广西美登木的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取广西美登木带腋芽的茎段作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS诱导培养基中诱导发芽得到无菌试管苗；(3)将无菌试管苗置于MS增殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；(4)将丛生芽置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；(5)将完整的带根苗进行炼苗后移植于苗床生长一个月，再移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量广西美登木的优质种苗，有效解决了广西美登木的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种广西美登木的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
广西美登木(Maytenus guangxiensis C.Y.Cheng et W.L.Sha)，为卫矛科美登木属常绿灌木，是广西岩溶特有药用植物，分布于广西大新、崇左、凭祥、宁明等地的石灰岩山地灌丛中。广西美登木的根、茎、叶中含有抗癌活性成分美登木素(Maytansine)和美登布林(Maytanprrine)，对乳腺癌、消化道癌、淋巴肉癌、骨髓癌、慢性粒细胞白血病等恶性肿瘤有显著疗效。
广西美登木的生产主要靠野生资源，由于生存环境恶化及多年来产区群众乱采滥伐，野生资源蕴藏量越来越少，处于濒危状态，已被《中国南部和西南部石灰岩珍稀濒危植物名录》列为稀有濒危植物。在自然条件下，广西美登木主要依靠种子进行繁殖，但因其结实率低、且败育率高，果实提早脱落严重，种子来源十分困难，难以在生产上实现大面积栽培。
发明内容
本发明的目的是提供一种广西美登木的组织培养快速繁殖方法，能够快速繁殖出大量适合移栽大田的广西美登木优良种苗，有效快速地提高广西美登木的种苗质量和繁殖系数，实现广西美登木优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
本发明采用以下技术方案达到上述目的：一种广西美登木的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取带腋芽的茎段作为外植体，用质量百分数为0.05％洗洁精水溶液浸泡5min，再经流水冲洗15min；移置于超净工作台上，用添加了2-3滴吐温-20的质量百分数为0.1％升汞消毒8-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分，切成0.5-0.8cm带一个腋芽的茎段，获得无菌外植体；所述无菌水为经高压灭菌后的蒸馏水。
(2)无菌试管苗的获取：将步骤(1)得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养25d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；所述诱导培养基是以MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg·L-1激动素KT、0.2mg·L-1的萘乙酸NAA，培养基pH值为5.8；
(3)试管苗繁殖培养：将步骤(2)得到的无菌试管苗置于增殖培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养30d，得到大量不定芽；所述增殖培养基是以MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1g·L-1活性炭，1.0-2.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-1.5mg·L-1的灵发素LFS、0.3-0.5mg·L-1的吲哚丁酸IBA，培养基pH值为5.8；
(4)试管苗生根培养：将步骤(3)得到的不定芽切成带顶芽或叶芽的茎段，置于生根培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养30d，得到完整的带根苗；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1g·L-1活性炭，0.1-1.0mg·L-1的灵发素LFS、0.1-0.3mg·L-1的吲哚丁酸IBA、1.0-2.0mg·L-1的萘乙酸NAA，培养基pH值为5.8；
(5)试管苗炼苗移栽：将步骤(4)获得的完整的带根苗，在室温为23-25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗3-5d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土：细河沙＝3:1的基质中生长40d，再移栽至大田。
本发明的突出优点在于：
(1)采用生物技术对广西美登木进行组织培养快速繁殖，保持了原有品种的优良性状，在短时间内培育出大量可供大田栽培的广西美登木幼苗，显著提高了广西美登木的种苗质量和繁殖系数，适用于工厂化生产，从而满足生产上的需要。
(2)在诱导培养基中添加6-BA、KT和NAA，能够诱导不定芽萌发；在增殖培养基中添加6-BA、LFS和IBA可促进不定芽的分化和生长；在1/2MS生根培养基中添加LFS、IBA和NAA可获得完整的带根苗，经炼苗后可直接移栽至基质中。
(3)该法得到的单芽增殖系数达6-13倍，经过扩繁和生根培养，组培苗生根率高达95.79％，移栽基质后成活率为92.5％，有效地解决了广西美登木的规模化育苗问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
本发明所述的广西美登木组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取带腋芽的茎段作为外植体，放置烧杯中，用质量百分数为0.05％洗洁精水溶液浸泡5min，浸泡过程中用毛笔轻轻清洗外植体表面污垢，再经流水冲洗15min；移置到超净工作台上，用添加了2-3滴吐温-20的质量百分数为0.1％升汞消毒8-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分，切成0.5-0.8cm带一个腋芽的茎段，获得无菌外植体；所述无菌水为经高压灭菌后的蒸馏水。
(2)无菌试管苗的获取：将步骤(1)中得到的外植体接种到诱导培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养25d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；所述诱导培养基是以MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg·L-1激动素KT、0.2mg·L-1的萘乙酸NAA，培养基pH值为5.8；
(3)试管苗繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于增殖培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养30d，得到大量不定芽；所述增殖培养基是以MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1g·L-1活性炭，1.0-2.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-1.5mg·L-1的灵发素LFS、0.3-0.5mg·L-1的吲哚丁酸IBA，培养基pH值为5.8。数据分析发现，6-苄基腺嘌呤和吲哚丁酸对广西美登木丛生芽的增殖系数具有显著影响，根据芽增殖系数确定的最佳培养基激素浓度为1.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.1mg·L-1的灵发素和0.4mg·L-1的吲哚丁酸，此时芽增殖系数高达13.97，实施例4。
表1不同激素对广西美登木组织培养快速繁殖效果的影响
注：表1中K1/3为水平1的3次指标值的平均；K2/3为水平2的3次指标值的平均；K3/3为水平3的3次指标值的平均；
R表示6-苄基腺嘌呤6-BA，灵发素LFS和吲哚丁酸IBA在各自取值范围内的极差。
(4)试管苗生根培养：将步骤(3)中得到的不定芽切成带顶芽或叶芽的茎段，置于生根培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养30d，得到完整的带根苗；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1g·L-1活性炭，0.1-1.0mg·L-1的灵发素LFS、0.1-0.3mg·L-1的吲哚丁酸IBA、1.0-2.0mg·L-1的萘乙酸NAA，培养基pH值为5.8。观察发现，灵发素和萘乙酸对广西美登木组培苗的生根率具有显著影响，根据生根率确定的最佳培养基激素浓度为1.0mg·L-1的灵发素LFS、0.3mg·L-1的吲哚丁酸IBA和1.5mg·L-1的萘乙酸NAA，此时生根率高达95.79％，如实施例9所示。
表2不同激素对广西美登木组织培养快速繁殖效果的影响
注：表2中K1/3为水平1的3次指标值的平均；K2/3为水平2的3次指标值的平均；K3/3为水平3的3次指标值的平均；
R表示灵发素LFS、吲哚丁酸IBA和萘乙酸NAA在各自取值范围内的极差。
(5)试管苗炼苗移栽：步骤(4)获得完整的带根苗后，在室温为23-25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗3-5d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土：细河沙(3:1)的基质中生长40d，再移栽至大田，成活率为92.5％。
Claims (1)
1.一种广西美登木的组织培养快速繁殖方法，包括外植体的取材与消毒，无菌试管苗的获取，试管苗繁殖培养和试管苗炼苗移栽步骤，其特征在于，具体操作步骤和控制条件为：
(1)外植体的取材与消毒：取带腋芽的茎段作为外植体，用质量百分数为0.05％洗洁精水溶液浸泡5min，再经流水冲洗15min；移置于超净工作台上，用添加了2-3滴吐温-20的质量百分数为0.1％升汞消毒8-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分，切成0.5-0.8cm带一个腋芽的茎段，获得无菌外植体；所述无菌水为经高压灭菌后的蒸馏水，
(2)无菌试管苗的获取：将步骤(1)得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养25d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；所述诱导培养基是以MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg·L-1激动素KT、0.2mg·L-1的萘乙酸NAA，培养基pH值为5.8，在诱导培养基中添加6-BA、KT和NAA，能够诱导不定芽萌发；
(3)试管苗繁殖培养：将步骤(2)得到的无菌试管苗置于增殖培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养30d，得到大量不定芽；所述增殖培养基是以MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1g·L-1活性炭，1.0-2.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-1.5mg·L-1的灵发素LFS、0.3-0.5mg·L-1的吲哚丁酸IBA，培养基pH值为5.8，在增殖培养基中添加6-BA、LFS和IBA可促进不定芽的分化和生长；
(4)试管苗生根培养：将步骤(3)得到的不定芽切成带顶芽或叶芽的茎段，置于生根培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h·d-1的条件下培养30d，得到完整的带根苗；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加入30g·L-1蔗糖，3.5g·L-1琼脂，1g·L-1活性炭，0.1-1.0mg·L-1的灵发素LFS、0.1-0.3mg·L-1的吲哚丁酸IBA、1.0-2.0mg·L-1的萘乙酸NAA，培养基pH值为5.8；在1/2MS生根培养基中添加LFS、IBA和NAA可获得完整的带根苗，经炼苗后可直接移栽至基质中；
(5)试管苗炼苗移栽：将步骤(4)获得的完整的带根苗，在室温为23-25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗3-5d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土：细河沙＝3:1的基质中生长40d，再移栽至大田，
该繁殖方法得到的单芽增殖系数达6-13倍，经过扩繁和生根培养，组培苗生根率高达95.79％，移栽基质后成活率为92.5％，有效地解决了广西美登木的规模化育苗问题。
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