CN105112302A - 一株对老挝拟棘天牛具有致病力的绿僵菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株对老挝拟棘天牛具有高致病力的绿僵菌菌株及其应用。本发明所提供的绿僵菌菌株命名为金龟子绿僵菌（FJMa200902，已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC？No.10642。该菌株生长速度快、产孢能力强，具良好的生产性状，同时对老挝拟棘天牛幼虫的致病力高，以10⁷孢子/mL的孢子悬浮液接种后对老挝拟棘天牛幼虫的LT₅₀（致死中时）为3.6天，感染率达100%。利用该菌株生产的真菌制剂，对老挝拟棘天牛的防治效果好，能有效降低天牛幼虫虫口密度，是一株在老挝拟棘天牛的防治上具有应用价值的生防菌株。

Description

一株对老挝拟棘天牛具有致病力的绿僵菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，涉及一种绿僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一株对老挝拟棘天牛具有高致病力的绿僵菌及其应用。

背景技术

老挝拟棘天牛Neacanistalaosensis(Breuning,1965)comb.nov.，曾命名为短长角天牛ParacanthocinuslaosensisBreuning，2015年Huang等将其归到拟棘天牛属Neacanista，命名为老挝拟棘天牛。该虫是壳斗科植物罗浮栲、甜楮等上的一种重要蛀干害虫，发生严重的一株树有上百头幼虫群聚蛀食树干边材，在树干或韧皮部来回蛀害，造成大量的水分和营养物质输送中断，且其可与红腹柄天牛Aphredisinmfaldermanniirufiventris共同发生，寄主植物一旦遭受危害，轻者会引起风折，严重的将造成整株死亡。由于该天牛生活的隐蔽性，在危害初期，不易被发现，加大了监测和防治难度，一旦出现明显的被害状，已失去有利的防治时机，树木再难恢复生机。目前该虫在福建德化戴云山自然保护区等地已造成严重危害。而在自然保护区等特殊生态区位，为避免环境污染，保护生物多样性，不宜采取过多的化学防治。因此，探寻适宜的无公害防治手段显得十分必要与迫切。

绿僵菌是目前应用最为广泛的杀虫真菌之一，因其具有寄主范围广、致病力强，效果好，对人、畜、作物无毒害，在农林害虫的防治上应用十分广泛。然而，绿僵菌寄主范围虽广，但研究发现不同地理、寄主来源的菌株对靶标害虫的致病力差异十分显著，不同菌株对靶标害虫的致死中时（LT₅₀）可相差数倍，甚至数十倍，因此，针对不同害虫筛选出致病力强的菌株是利用绿僵菌生物防治害虫的基础。因此，本发明提供了一株对老挝拟棘天牛幼虫具有高致病力的绿僵菌菌株，并进行了林间应用。

发明内容

本发明的目的是提供一株对老挝拟棘天牛幼虫具有高致病力的绿僵菌菌株及其应用。

一株绿僵菌，为金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902菌株，已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCCNo.10642。

该金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902具有以下特征：

该菌株从福建省泉州市鲤城区松林中采集的天牛僵虫体上分离得到。保存方式为低温斜面保存。在PPDA培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径32mm，15天达64mm。菌落初期为白色，质地绒毛状或棉絮状，逐渐扩大；孢子深绿色粉末状，呈环形分布；孢子分布较均匀，菌落边缘孢子呈绿色。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.8~6.8μm×1.9-2.9μm。最佳生长温度范围为24~28℃。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供用于防治老挝拟棘天牛幼虫的菌剂。

本发明所提供的菌剂具体为分生孢子悬浮液，其浓度为10⁷孢子/ml。

本发明所提供菌剂的有效成分是上述金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902的分生孢子。

本发明所提供的菌剂中的分生孢子来源于以上述金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902菌株为菌种经固体发酵培养得到。

本发明所提供的或所述菌剂可用于防治老挝拟棘天牛幼虫。

本发明提供的金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902具有如下有益效果：

生产性状好，产孢能力强，同时对老挝拟棘天牛幼虫的致病力强，采用浓度为10⁷孢子/ml的孢子悬浮液浸渍法接种8天后，幼虫死亡率达100%，致死中时（LT₅₀）为3.6天，感染率为100%；使用该菌株为菌种，经液体发酵，接种于麦麸、谷壳和米粉组成的固体培养基进行固体发酵8~10天，产孢量可达8×10⁹孢子/g发酵产物，配制成孢子悬浮液喷洒在寄主植物树干上，能显著降低老挝拟棘天牛幼虫种群数量，虫口减退率达80%以上。适合在老挝拟棘天牛发生林分中应用。

菌种名称：金龟子绿僵菌

拉丁学名：Metarhiziumanisopliae

菌株编号：FJMa200902

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年3月19日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10642。

附图说明

图1为金龟子绿僵菌FJMa200902菌株在PPDA培养基上25±1℃下培养15天的菌落形态图。

图2为老挝拟棘天牛幼虫和老挝拟棘天牛幼虫被绿僵菌FJMa200902感染症状。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中的PPDA培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写，其具体配方为每1000ml水中含有马铃薯200g（切块煮熟后过滤，取滤液），葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g。

实施例1

金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902的形态学

将分离纯化的绿僵菌菌株在直径为90mm的平板PPDA培养基上使用点接法接种后，于25±1℃条件下培养，4-5天后挑取菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征。该菌株菌落质地棉絮状，菌落初期为白色，逐渐扩大，其上产生暗绿色分生孢子并成轮环状、射线状分布。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.5~6.8μm×1.8-2.9μm。

金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册编号为CGMCCNo.10642。

实施例2

绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902的生物学特性

用点滴法将金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902接种于PPDA平板培养基中央，置于25±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个平板（重复），共观察15天。同时记录开始产孢时间，第15天（产孢基本结束）用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含30mL的0.3‰吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。每个平板测定3块菌碟，取其平均值作为1个重复的孢子数。

表1金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902生物学特性

由表1可见，金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902菌落生长较快，5天菌落直径为32mm，15天菌落直径达64mm，生长4天后菌落上开始出现绿色孢子，产孢量为1.4×10⁸孢子/cm²。

实施例3

金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902对老挝拟棘天牛幼虫的致病力测定

配制一定量的0.03%吐温-80溶液，然后高温灭菌，冷却后备用。从PPDA平板上刮取一定量金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902孢子置于上述溶液中，配制成10⁷孢子/mL的孢子悬浮液；将健康的老挝拟棘天牛幼虫在孢悬液中浸渍10s，然后重新放入养虫盒内以灭过菌的木屑喂食，接种30头老挝拟棘天牛幼虫，重复3次；以浸渍0.3‰吐温-80无菌水溶液处理作为空白对照，并以接种绿僵菌MaZPTR-01菌株（福建省林科院保存菌株，为公知菌株）作为对照，接种方法与浓度均同上。处理后将养虫盒放置于黑暗的25±1℃恒温培养箱中，每天观察记载天牛幼虫死亡情况，死虫保湿培养观察菌丝生长及产孢情况（虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子），并挑片在显微镜下观察是否为绿僵菌感染致死，统计死亡率及感染率（僵虫率）。

采用10⁷孢子/mL的金龟子绿僵菌FJMa200902孢子悬浮液接种老挝拟棘天牛幼虫8天后，天牛幼虫死亡率达100%，死亡高峰在3~5天。而接种绿僵菌MaZPTR-01菌株15天后，天牛幼虫死亡率为93.3%，死亡速度显著较接种绿僵菌FJMa200902菌株的要慢，空白对照组的天牛幼虫在试验期间未出现死亡。死亡的幼虫经保湿培养后发现，以绿僵菌FJMa200902接种的感染率为100%，而接种绿僵菌MaZPTR-01菌株的，天牛幼虫感染率为60%。采用死亡率-时间机率值分析法进行分析，即以时间（d）的对数值为x，将死亡率转换为机率值，并以机率值为y，计算出毒力回归方程和致死中时（LT₅₀），绿僵菌FJMa200902菌株接种老挝拟棘天牛幼虫后的致死中时为3.6天，而接种绿僵菌MaZPTR-01后对该天牛幼虫的致死中时为9.1天，比金龟子绿僵菌FJMa200902菌株致死中时长2.53倍。

表2老挝拟棘天牛幼虫接种金龟子绿僵菌FJMa200902和MaZPTR-01菌株后累计死亡率

表3绿僵菌FJMa200902和MaZPTR-01菌株对老挝拟棘天牛幼虫的致病力分析

实施例4

金龟子绿僵菌FJMa200902菌株的生产特性

1液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1菌种：金龟子绿僵菌FJMa200902菌株。

1.2斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面培养基在25℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PPDA培养基）。

1.3液体培养基：配制马铃薯葡萄糖培养基（在PPDA培养基的基础上去除琼脂）2L，用500ml三角瓶中装入，每个装200ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成粘稠菌丝体后即可接入固体培养基，进行绿僵菌固体培养。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养基配方及制备：

绿僵菌固体培养基配方：按体积比麦麸﹕谷壳﹕米粉=3:3:1的比例进行配制，混合均匀后，按每500g培养基加入400ml水进行混匀。

制备方法：将固体培养基的各组分分别称量，加入水后搅拌均匀，装入聚乙烯袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。

2.2接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内进行，按15%的接种量，将液体菌种倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入预先进行过表面消毒的、可堆叠的PP塑料发酵箱中（底部有孔）培养基厚度5cm，随即放入发酵室培养。

2.3固体培养：将6个上述装有接种后固体培养基的塑料发酵箱堆叠放入22±1℃的发酵室中培养，4天后待固体培养基长满菌丝即可。第5天将发酵箱十字交叉堆叠，开放式培养，保持培养室内温度在25±2℃，湿度80%左右，4天后待固体培养基质内外长满墨绿色孢子即可，将发酵产物置于阴凉通风处晾干即成粗粉剂。

3培养结果：发酵周期为8天，自然干燥后随机称取粗粉剂5g，用0.03%吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果发酵产物平均含孢量为8×10⁹孢子/克粉剂。

实施例5金龟子绿僵菌FJMa200902菌株对老挝拟棘天牛幼虫林间防治效果

于11月在位于福建省德化县戴云山自然保护区的罗浮栲林中，对发现有老挝拟棘天牛危害的植株，进行树干喷菌处理，菌液配制方法：使用金龟子绿僵菌FJMa200902菌株固体发酵生产菌粉，将菌粉置于0.05%的吐温-80溶液中，稀释至10⁷孢子/ml的浓度，然后用双层纱布过滤，即配制成孢子悬浮液，用压力喷雾器喷至树干表面，以喷湿树干为准。共处理30株树，另找15株有天牛危害的，以喷0.05%的吐温-80溶液处理，作为对照。喷菌后，每隔5天选取10株树，在天牛危害部位进行剥皮检查，检查危害部位长度为50cm，统计天牛数量、死亡数量及感染数量，分析防治效果。

表4金龟子绿僵菌FJMa200902菌株林间防治老挝拟棘天牛幼虫效果

防治效果见表4，从表中可以看出，使用金龟子绿僵菌FJMa200902菌株的孢子悬浮液进行树干喷菌后，树干中的老挝拟棘天牛幼虫死亡率随时间逐渐增加，喷菌5天后，树干内天牛幼虫死亡率为62.1%，而到15天时，幼虫死亡率达89.3%，而对照组中幼虫死亡率极低，可见防治效果十分显著。同时，幼虫感染率也随着时间逐渐增加，但其增加速度较死亡率慢，主要是因为幼虫死亡后至虫体长出肉眼可见的菌丝或孢子，还需要一段时间。喷菌15天后，树干内的幼虫感染率超过70%。

实施例3、4、5结果表明，金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902菌株生产性能好、对老挝拟棘天牛幼虫具有较强的致病力，杀虫效果好，能有效降低林间老挝拟棘天牛虫口密度，减轻其带来的危害，是一株在老挝拟棘天牛的防治上具有应用价值的生防菌株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要说明的是，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一株对老挝拟棘天牛具有致病力的绿僵菌菌株，其特征在于：所述菌株为金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa200902，该菌株已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册编号为CGMCCNo.10642。

2.一种真菌杀虫剂，其特征在于：所述的真菌杀虫剂含有权利要求1所述的金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株FJMa200902。

3.根据权利要求2所述的真菌杀虫剂，其特征在于其剂型为分生孢子悬浮液。

4.根据权利要求3所述的真菌杀虫剂，其特征在于其有效成分为绿僵菌分生孢子，浓度为1×10⁷孢子/mL。

5.根据权利要求4所述的真菌杀虫剂，其特征在于：所述的绿僵菌分生孢子，是由以金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株FJMa200902为菌种经固体发酵得到，绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株FJMa200902经液体发酵后接种于麦麸、谷壳和米粉组成的固体培养基上固体发酵8~10天后，发酵产物产孢量为8×10⁹孢子/克发酵产物。

6.如权利要求1所述的绿僵菌菌株在防治老挝拟棘天牛幼虫中的应用。