CN105101998A - 用于肺癌的诊断和免疫治疗的组合物和方法 - Google Patents
用于肺癌的诊断和免疫治疗的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明包括用于肺癌的诊断和治疗的组合物和方法，所述组合物和方法具有负载重组肿瘤相关抗原的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞针对由一种或多种肺癌细胞表达的SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种产生细胞毒性T淋巴细胞特异性免疫应答。
Description
发明的技术领域
本发明的一个实施方案一般地涉及肺癌的检测及其免疫治疗的领域，具体地涉及用于诊断和治疗肺癌的方法和组合物。
光盘上存档的材料的援引并入
本申请包括已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且据此将其全部内容引入作为参考。于___________生成的所述ASCII副本被命名为_____________并且大小为__千字节。
背景技术
在不限制本发明的范围的情况下，描述了其与用于肺癌的诊断和治疗的方法和组合物有关的背景。
在世界范围内，肺癌是癌症相关死亡的主要原因。预期在2012年在美国有约226,160例新病例和160,340例死亡(1)。世界卫生组织将肺癌分为四种主要组织学类型：(1)鳞状细胞癌(SCC)，(2)腺癌，(3)大细胞癌，和(4)小细胞肺癌(SCLC)。术语非小细胞肺癌(NSCLC)包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。
虽然乳腺癌的发生在美国略微更常见，但肺癌对于男性来说位居第二，仅次于前列腺癌，对于女性来说位居第三，仅次于乳腺癌和结肠直肠癌。然而，肺癌是癌症死亡的最常见病因。通常，使用X-射线和痰细胞学的组合诊断肺癌。不幸的是，到患者由于其症状而寻求医疗帮助的时候，癌症已经处于如此晚期的状态，以至于其通常是不能治愈的。
大多数(85％)的肺癌病例为非小细胞肺癌(NSCLC)类型，并且估计所有诊断患有NSCLC的患者的5年生存率低于20％。对NSCLC的标准治疗包括化学治疗、放射治疗、手术或这些治疗的组合。不幸的是，这些治疗干预与明显的副作用相关(2)，并且一般向患者提供的益处有限(3)。尽管近期在我们的医疗设备中增加了分子靶向治疗，但是针对NSCLC在医疗设备中更近期添加的是靶向治疗。不幸的是，尽管由这些药剂如基于单克隆抗体贝伐单抗的那些提供治疗优点，但是其仅可以用于16.5％的化学治疗接受者(1，4)。NSLC仍然是世界上癌症相关死亡的主要原因。因此，急需开发对患有该致命性疾病的患者更有效的治疗。
名称为“肺癌标记物”的第5,773,579号美国专利公开了对人类肺癌细胞具有特异性的新型蛋白的分离和纯化的核酸序列和相应的氨基酸序列。该基因在这些细胞中以比在正常肺细胞、其他正常组织和测试的其他肿瘤细胞系中高得多的水平表达。还公开了该基因和蛋白的三种另外的重组形式，在前两种情况下去除了跨膜区，在第三种情况下，通过体外突变改变氨基酸。
名称为“肺癌诊断”的第2012/0100558号美国公开专利申请涉及在症状发作之前受试者中的肺癌的诊断，其中该方法包括针对其中自身抗体的存在来筛选来自受试者的生物流体，所述自身抗体对一种或多种预诊断肺癌指示蛋白具有特异性，所述预诊断肺癌指示蛋白包括LAMR1，以及任选地另外或供选择地包括膜联蛋白I和/或14-3-3-θ和/或目前公开的其他预诊断肺癌指示蛋白作为决定性抗原。
名称为“癌症-睾丸抗原”的第2011/0177079号美国公开专利申请公开了癌症-睾丸抗原和编码其的核酸分子。该发明还涉及核酸分子、多肽及其片段在用于诊断和治疗疾病如癌症的方法和组合物中的用途。更具体地，该发明涉及新型癌症-睾丸(CT)抗原的发现。
名称为“用于治疗肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)的组合物”的第2010/0291156号美国公开专利申请涉及活性(免疫刺激性)组合物，所述组合物具有编码至少两种(优选不同的)能够引发哺乳动物中的(适应性)免疫应答的抗原的至少一种RNA，优选为mRNA。据称该发明还教导了包含所述活性(免疫刺激性)组合物的疫苗，以及所述活性(免疫刺激性)组合物(用于制备疫苗)的用途和/或所述疫苗用于引发(适应性)免疫应答以治疗肺癌，特别是治疗非小细胞肺癌(NSCLC)，优选地选自三种主要亚型的鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌或治疗其相关病症的用途。
发明内容
在一个实施方案中，本发明包括用于治疗肺癌的组合物，所述组合物包含：分离的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞已被负载以呈递SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种，并且所述抗原呈递细胞分别针对由一种或多种肺癌细胞表达的SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种产生细胞毒性T淋巴细胞特异性免疫应答。一方面，抗原呈递细胞为树突细胞。另一方面，抗原呈递细胞为自体树突细胞。另一方面，组合物还包含NYESO-1、XAGE-1、ADAM29和MAGEC1抗原中的至少一种。另一方面，组合物包含编码重组SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明包括用于确定疑似患有肺癌或至少有患上肺癌的风险的人受试者的方法，其包括以下步骤：获得来自受试者的样品；和确定样品中对抗-SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种具有特异性的特异性免疫球蛋白的存在或不存在，其中样品中抗-SP17、AKAP-4或PTTG1特异性免疫球蛋白中的至少一种的存在表明受试者患有肺癌或至少有患上肺癌的风险。
本发明的另一个实施方案包括用于测定患有癌症的个体的肿瘤标志物谱的方法，包括：获得来自个体的体液样品；使来自个体的体液样品与SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种接触；和确定结合于存在于体液样品中的一种或多种自身抗体的SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种的复合物的存在或不存在，其中所述一种或多种自身抗体对SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种具有免疫特异性；其中复合物的存在提供个体的肿瘤标志物谱，以及其中肿瘤标志物谱确定为病程的指征。一方面，复合物的存在表明检测到癌症。另一方面，所述癌症是肺癌。
本发明的又一个实施方案包括用于治疗癌症的免疫治疗组合物，其包含SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种，所述SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原能够产生对一种或多种肺癌细胞具有特异性的SP17、AKAP-4或PTTG1特异性细胞毒性T淋巴细胞。一方面，组合物还包含至少一种抗原呈递细胞。一方面，抗原呈递细胞为树突细胞。另一方面，至少一种抗原呈递细胞是致敏的或负载编码SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原的肽或表达构建体。另一方面，SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种是从非小细胞肺癌中分离的。
本发明的另一个实施方案包括用于检测受试者中的肺癌的方法，其包括以下步骤：获得来自受试者的样品；和确定样品中SP17、AKAP-4或PTTG1的存在或不存在，其中样品中SP17、AKAP-4或PTTG1的存在表明受试者患有肺癌或至少有患上肺癌的风险。一方面，所述样品为血液样品。
本发明的另一个实施方案包括组合物，其包含表达免疫刺激抗原的核酸载体，其中所述抗原包含编码SP17、AKAP-4或PTTG1肺癌相关抗原中的至少一种的核苷酸序列。另一方面，所述抗原为肽抗原。
本发明的又一个实施方案包括用于治疗癌症的方法，其包括以下步骤：给予需要其的哺乳动物除了稀释剂、溶媒、赋形剂或非活性成分中的至少一种以外的协同的治疗有效量的肺癌抗原；由肺癌抗原产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；和使用特异性细胞毒性T淋巴细胞靶向一种或多种肿瘤细胞。一方面，所述肺癌抗原为SP17、AKAP-4或PTTG1。
附图说明
为了更加彻底地理解本发明的特征和优点，现在参照本发明的详细描述以及附图，其中：
图1A-1C是显示癌症/睾丸抗原(CTA)表达的RT-PCR分析的图像。
图2显示使用显示的抗体和相应的同种型对照孵育的细胞的流式细胞术分析。
图3显示了对NSCLC细胞系，CRL-5928，CRL-5922，对正常支气管上皮来源的细胞CRL-2503和一例代表性患者进行的免疫荧光。
图4A-4C是用于检测循环CTA-特异性IgG的酶联免疫吸附测定(ELISA)数据的图表。
图5A-5F是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性和特异性的分析的图表。
图6A-6F是分析显示的细胞因子的水平的ELISA和与自体肿瘤细胞共培养的患者的CTL的IFN-γ表达的ELISPOT分析。
发明描述
虽然本发明的各种实施方案的形成和使用在下文详细讨论，但应理解的是，本发明提供可以在多处具体的上下文中体现的许多可适用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅说明形成和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，下文定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the)”不意在仅指代单数实体，而是包括可以用具体实例来说明的一大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其使用不限制本发明，除了在权利要求中指出。
如本文所使用的术语“抗原”和术语“表位”是指能够刺激免疫应答的分子或物质。在一个实例中，表位包括但不限于多肽和编码多肽的核酸，其中当多肽被加工并呈递到主要组织相容性复合体(MHC)分子上时，核酸表达为多肽能够刺激免疫应答。一般地，表位包括呈递在非共价结合于I类或II类MHC的结合小沟的细胞表面上的肽，以使其可以与T细胞受体和各自的T细胞辅助分子相互作用。然而，当讨论抗体的抗原结合部分时，抗原和表位也是适用的，其中所述抗体结合于抗原的特异性结构。
抗原的蛋白酶解加工。由抗原呈递细胞上的MHC展示的表位是更大的肽或蛋白抗原前体的切割肽或产物。对于MHCI表位，蛋白抗原通常由驻留在细胞中的蛋白酶体消化。细胞内蛋白酶体消化产生长度为约3至23个氨基酸的肽片段，所述片段随后负载到MHC蛋白上。细胞内或细胞外环境中的另外的蛋白酶解活性可以进一步修剪和加工这些片段。II类MHC的表位的加工一般地通过来自溶酶体/内涵体小室的细胞内蛋白酶发生。在一个实施方案中，本发明包括连接于抗-CD40抗体(或其片段)的预加工的肽，所述抗-CD40抗体(或其片段)直接将肽引导到抗原呈递细胞，针对所述肽可以寻求提高的免疫应答。
为了确定作为免疫原性化合物潜在有效的表位，单独对MHC结合的预测是有用的但通常是不足的。本发明包括用于特异性确定抗原内的表位的方法，所述表位最可能引起寻找抗原呈递细胞和效应性T细胞(responderTcell)的具体来源的免疫应答。
本发明能够快速和容易的测定，用于使用患者自身的抗原呈递细胞和T细胞库确定最可能产生希望的免疫应答的那些表位。本发明的组合物和方法可适用于任何蛋白序列，使使用者能够确定能够结合于MHC并且正确地呈递到将应答抗原的T细胞的表位。因此，本发明不限于任何特定的靶标或医疗状况，而是包括来自任何有用的来源的MHC表位(或多个表位)。
在过去的数年中，免疫治疗作为针对数种类型的癌症的有希望的疗法出现，所述癌症包括黑色素瘤、肾细胞癌以及最近的肺癌(5)。针对特异性肿瘤相关抗原的抗肿瘤免疫应答的产生具有促进赘生性细胞死亡的潜力，而具有对正常组织极少的有害作用和最小的毒性(5)。癌症/睾丸抗原(CTA)是具有睾丸限制性表达的蛋白家族，在正常组织中的表达可忽略。有趣的是，CTA在许多肿瘤中在mRNA和蛋白水平上频繁表达(6-10)。最近，CTANY-ESO-1和MAGE-A2/3/4/6已在非小细胞肺癌(NSCLC)原发肿瘤中检测到，并且其免疫原性表明其为用于潜在有效的肺癌疫苗的有希望的目标(11-14)。发明人先前已证实CTAsSP17、AKAP4、Ropporin和PTTG1作为卵巢癌、多发性骨髓瘤和前列腺癌中的潜在的免疫治疗靶标(6，15-17)。在确定可以开发为用于肺癌免疫治疗的潜在靶标的新型抗原的努力过程中，发明人通过测量肺癌患者的血清中的CTA特异性抗体(Ab)的存在，在本文中展示了来自NSCLC患者的NSCLC细胞系和原发肿瘤样品中的SP17、AKAP4和PTTG1的RNA和蛋白表达谱以及其免疫原性，以及在本文中展示了使用自体外周血单核细胞(PBMC)在体外产生CTA-特异性细胞毒性抗肿瘤应答的可行性。
虽然历史上认为NSCLC由于低频率的肿瘤浸润T细胞而具有弱的免疫原性(21)，但是使用鼠NSCLC模型的研究已显示可以利用基于DC的方法活化有效的免疫应答(22，23)。此外，在患有NSCLC的患者中已检测到肿瘤抗原特异性T细胞应答(23)，表明确定特异性NSCLC-相关抗原并将其以最佳方式呈递到免疫系统可以产生在该疾病中通常不存在或无活性的肿瘤特异性效应T细胞(24)。免疫治疗在提高患者生存率和降低与标准治疗相关的死亡率中的潜在作用已通过最近的对患有NSCLC的患者的临床疫苗试验的荟萃分析证实(25)。当研究基于免疫治疗的抗癌策略时，疫苗靶向的抗原的选择是关键步骤(5)。理想的靶标应是在癌症细胞而不在正常细胞中选择性表达的高免疫原性的蛋白(5，10)。CTA由于其高度的肿瘤限制性表达谱及其免疫原性，特别适用于肿瘤免疫治疗的肿瘤相关抗原(7,9)。
本发明提供了三种CTA，即SP17、AKAP4和PTTG1在NSCLC的免疫治疗中的用途。发明人首次分析了3种CTA，即SP17、AKAP4和PTTG1在一组正常组织、三个NSCLC细胞系、一个正常支气管细胞系、来自17名NSCLC患者的原发肿瘤细胞和来自8名健康受试者的支气管上皮细胞中的差异表达。除了睾丸以外，非肿瘤组织均未表达RNA水平的选择的CTA(7,10)。NSCLC细胞系表达SP17、AKAP4和PTTG1转录物和蛋白，而正常支气管上皮细胞系仅显示微弱的SP17RNA表达。这与发明人之前的报导一致，该报导显示SP17在体细胞纤毛上皮细胞中表达，包括气道的体细胞纤毛上皮细胞(26)。有趣的是，独立的临床前研究强烈表明14种SP17-定向的免疫治疗未产生任何与纤毛细胞中SP17-表达相关的毒性(16,27,28)。源自患者的所有肺癌组织显示转录和翻译水平的SP17表达，而大多数样本也显示AKAP4和PTTG1表达。蛋白表达的结果独立地通过流式细胞术和免疫荧光证实，结果是一致的。来自17名NSCLC受试者中的16名的肿瘤显示研究的三种CTA中的至少两种的表达，表明其在该疾病中的潜在重要性。对于充当免疫治疗的靶标的蛋白，其应能够引发强烈且可测量的免疫应答，该性质称为免疫原性。本发明人发现大多数NSCLC患者的血清对至少两种CTA-特异性抗体是阳性的，仅有#5患者显示抗-SP17但无抗-AKAP4或抗-PTTG1IgG。虽然在肿瘤组织中的mRNA和蛋白表达数据之间完全一致，但体液抗肿瘤应答以血清中的抗-CTA抗体来测定，其导致更加异质。例如，三名NSCLC患者(#2,13,14)分类为抗-SP17阴性，但是其肿瘤表达SP17。有趣的是，所有AKAP4-或PTTG1-阳性患者在其血清中也显示相应的特异性自身抗体。ShanQ.等人的最近的研究(29)生成了含有72种CTA的低密度蛋白微阵列，并使用来自NSCLC患者和健康受试者的血清对其探测。这些研究者报导了在NSCLC患者的血清中的NYESO-1、XAGE-1、ADAM29和MAGEC1Ab的检测。这些发现表明抗-CTA抗体可以开发为NSCLC的诊断工具。
为了测定SP17、AKAP4和PTTG1免疫原性是否能够产生CTA/肿瘤特异性CTL应答，发明人检查了对CTA-负载的树突细胞(DC)的T细胞应答。DC的应用是广泛认可的用于刺激肿瘤抗原特异性T细胞应答的方法，并且本发明人之前已经在MM、宫颈癌和前列腺癌中使用该技术(6,15,30,31)。为了研究由PBMC产生CTA-特异性CTL的可行性，本发明人选择了经测试对肿瘤细胞中的SP17、AKAP4或PTTG1蛋白表达呈阳性的5名患者。使用CTA-呈递DC刺激的患者的PBMC显示显著的对自体肺癌细胞和NSCLC-来源细胞系的细胞溶解活性。观察到的细胞毒效应限于HLAI类阳性靶标，因为其被抗-HLAI类抗体阻断而不是被抗-HLAII类抗体阻断。对CTL细胞溶解活性的抗原特异性通过其不能产生针对CTA-阴性CRL-2503细胞的细胞毒性应答来证实或在暴露于未致敏DC或负载HPVE7抗原的DC之后证实。细胞因子表达分析显示发明人的基于DC的CTL产生方案在刺激的PBMC中诱导强的Th-1极化，如通过升高的IFN-γ和TNF-α以及降低的IL-4、IL-5和IL-10水平所证实的(6,16,19,31-33)。由于NSCLC患者显示异常的Th-2-型细胞因子谱(34)，所述异常的Th-2-型细胞因子谱负面影响对免疫治疗的显著应答(35)，因此可能的是(但不限制本发明)，CTA-负载的DC刺激T-辅助细胞Th-1谱的能力是临床相关的(36)。效应T淋巴细胞的活化进一步通过ELISPOT分析证实，其显示在CTA-负载的DC致敏(prime)并暴露于自体肿瘤细胞的PBMC中高频率的IFN-γ-表达细胞。该发现是有意义的，因为IFN-γ已显示在NSCLC生长中发挥显著的抑制作用(37)。体外产生活性CTA-特异性免疫应答的可行性表明由NSCLC细胞表达CTA可以具有治疗意义，并充当针对该疾病设计新型免疫治疗策略的基础。此外，在体外改造以有效将CTA呈递到效应T细胞的DC可以克服在NSCLC肿瘤微环境中见到的免疫抑制，实现针对该疾病的有效的疫苗接种策略的开发(38-40)。
本发明提供了CTA：SP17、AKAP-4和PTTG1，在NSCLC中选择性表达，并且其表达可以用于产生特异性CTL-介导的抗肿瘤应答。SP17、AKAP4和PTTG1在多发性骨髓瘤、卵巢癌和前列腺癌中的表达和免疫原性(6,16,17,19,31,32)，以及目前在NSCLC中的表达和免疫原性，表明使用CTA-驱动的疫苗接种策略靶向这些CTA表达肿瘤的用途。
NSCLC细胞系CRL-5928(鳞状细胞癌)、CRL-5922(腺癌)和永生化的非致瘤人支气管上皮细胞系CRL-2503(通过使用复制起点缺陷型SV40大T质粒转染而建立)来自美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(Manassas,VA,USA)并且在37℃和5％CO2下保持在补充10％V/VFBS(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的RPMI-1640培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。
本发明人评价了源自手术过程的17份NSCLC肿瘤样品和来自经历了支气管活检的健康受试者的8份样品。如前所述，在血常规检查时收集血清(6)。来自人受试者的材料是在当地伦理委员会的批准和患者知情同意的情况下获得的。切碎钻取活检物并将组织碎片以完全培养基(补充有10％FBS、20mMHEPES缓冲液、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基)铺成平板。将细胞保持在5％CO2和37℃下24小时，然后分析。正常组织组来自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。SP17：5′Sp17PCRSEQIDNO:1-5′-GGCAGTTCTTACCAAGAAGAT-3′；3′Sp17PCRSEQIDNO:2-5′-GGAGGTAAAACCAGTGTCCTC-3′；AKAP4：SEQIDNO:3-5′-GCGTACTCTGATACTACAATGATG-3′和SEQIDNO:4-5′-GGG6GTTTTGGGTAAAGTCA-3′；PTTG1:SEQIDNO:5-5'-GGTTTAAACCAGGAGTGCCGC-3'和SEQIDNO:6-5'-AATTCAACATCCAGGGTCGACAG-3'；β-肌动蛋白：SEQIDNO:7-5'-CGTCTTCCCCTCCATCG-3'和SEQIDNO:8-5'-CTCGTTAATGTCACGCAC-3'(35个循环，55℃退火温度)。在溴化乙锭琼脂糖凝胶上针对期望大小的DNA带对PCR产物可视化。所有结果在三个独立的RT-PCR实验中证实。
约400,000个细胞使用PBS1X洗涤并使用缓冲的多聚甲醛(4％W/V的PBS1X溶液，pH＝7.4)固定。然后在冰上使用透化缓冲液(0.3％V/V皂苷的PBS溶液)透化细胞5分钟，并使用特异性第一抗体：山羊抗-人SP17，山羊抗-人AKAP4(两者均来自antaCruzBiotechnology,Inc.SantaCruz,CA,USA)或兔抗-人PTTG1(NovusBiologicals,LLC,Littleton,CO,USA)孵育。阴性对照使用等量的匹配同种型抗体(NovusBiologicals,LLC,Littleton,CO,USA)孵育的细胞获得。在冰上孵育1小时后，在透化缓冲液中洗涤细胞三次，然后使用合适的FITC-缀合的第二抗体(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)在冰上孵育20分钟。使用FACS-Canto流式细胞仪(BD)测量荧光强度。
如前所述进行CTA表达的免疫荧光评价(15)。对20,000个细胞进行细胞离心涂片并使用SlideRite(Fisher)固定，并风干过夜。每种样品在4℃下在0.1％TritonX-100柠檬酸钠缓冲液中透化15分钟，然后在4℃下在湿室中使用在流式细胞法中描述的特异性第一抗体(用PBS/BSA0.1％1:100稀释)孵育细胞过夜，然后使用藻红蛋白缀合的兔IgG第二抗体(1:500稀释，7Abcam)孵育。通过倒置荧光显微镜(装备有激光的OlympusIX71倒置显微镜)分析结果，并在60X物镜放大倍数下拍摄图片。标准DAPI染色用于检测细胞核。
在23℃下，在温和搅拌下，使用在50μL碳酸盐包被缓冲液中的人重组蛋白(SP17、AKAP4或PTTG1，均来自NovusBiologicals,LLC,Littleton,CO,USA)包被聚苯乙烯96-孔板(10μg/孔)2小时。在使用100μLPBS洗涤两次后，在23℃下，使用1％W/VBSA的PBS溶液封闭非特异性结合位点1小时。然后，除去BSA并加入50μL血清(用PBS1:5稀释)。在34℃下孵育1小时后，使用100μL洗涤缓冲液(0.05％V/VTween-20的PBS溶液)洗涤板两次，并使用HRP-连接的小鼠抗-人IgG(Abcam，用PBS1:4,000稀释)孵育。在黑暗中在22℃下孵育1小时后，使用100μL洗涤缓冲液洗涤板两次，然后在黑暗中在22℃下使用HRP底物溶液(Kpl过氧化物酶底物体系)孵育5分钟。在405nm下读取吸光度(0.1s/孔)。从使用血清孵育的孔中获得的吸光度扣除阴性对照(使用市售抗体孵育的无抗原孔)的吸光度。
肝素化的血液以Ficoll-Hypaque密度梯度离心以分离来自5名患者的PBMC。将PBMC以8-10x106个细胞/孔接种至具有3mLRPMI-1640培养基和10％FBS的6-孔培养板。在37℃和5％CO2下2小时后，本发明人移除了非粘附细胞并在补充10％FBS、1000IU/mL白介素4(IL-4)和800IU/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子8(GM-CSF)的RPMI-1640中培养粘附细胞。培养1星期后，收获DC并如所述的使用人类重组SP17、AKAP4或PTTG1致敏(6,15)。
洗涤DC两次并放置在50mL聚丙烯管中。将重组蛋白与阳离子脂质DOTAP(Roche,Mannheim,Germany)在室温下混合20分钟，并在37℃下在偶尔搅拌下加入DC中3小时。
在37℃，5％CO2下，将抗原-致敏的DC与新鲜自体PBMC(6)以1:10的比例在具有10％自体血清、10IU/mLIL-2和5ng/mLIL-7的RPMI-1640中共培养。每周一次加入辐照的自体PBMC饲养细胞和重组CTA(50μg/mL)，并且每三天加入一次IL-2。重组CTA无内毒素，如通过ToxinSensorChromogenicLAL内毒素分析试剂盒(GenScriptUSAInc.,08854,NJ)进行的内毒素检测分析所证实的。
为了测试CTA-刺激的T细胞的细胞毒活性，本发明人使用EuTDA系统(PerkinElmer,USA)，根据制造商的指示进行了基于铕的细胞毒性分析。靶细胞包括自体DC(未使用肺癌不相关的HPV-E/抗原刺激或致敏)和自体肿瘤细胞(效应细胞-靶细胞比例为40:1、20:1或10:1)。针对HLAI类(W6/32)和HLAII类(L243)的抗体以25μg/mL的浓度加入以评价HLA限制性细胞毒性，效应细胞：靶细胞比例固定为20:1。
对活化PBMC和自体肿瘤细胞4小时共培养物(20:1的效应细胞：靶细胞比)的上清液进行ELISA。根据制造商的说明，使用U-CyTech夹心ELISA试剂盒(U-CyTech,Utrecht,TheNetherlands)检测人IL-4、IL-5、IL-10、干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子α(TNF)-α。通过加入TMB微孔底物进行反应，通过加入2MH2SO4停止反应。在450nm下读取吸光度。数据显示为使用活化PBMC测量的OD除以使用在无抗原的情况下使用自体DC孵育的PBMC获得的OD(OD比)。
如本发明人在别处所述，根据制造商的说明，使用ELISPOT分析(UCyTech,Utrecht,TheNetherlands)评价患者的CTL的IFN-γ表达(20:1效应细胞：靶细胞比)(15)。使用AIDELISPOT读取系统(CellTechnology,Inc.,Columbia,MD)进行点计数。
图1A-1C是显示CTA表达的RT-PCR分析的图像。图1A是显示由正常组织组制备的cDNA的PCR的凝胶图像。图1B是显示来自NSCLC细胞系CRL-5928(1)、CRL-5922(2)或正常支气管上皮来源细胞CRL-2503(3)的cDNA的PCR的凝胶图像。图1C是显示来自NSCLC原发肿瘤的cDNA的PCR的凝胶图像。阳性对照为由睾丸制备的cDNA，而阴性对照为在没有先前逆转录(无RT)的情况下使用RNA进行的PCR，以及在没有模板的情况下(无模板)进行的PCR。β-肌动蛋白用于证实成功的逆转录。发现SP17/AKAP4/PTTG1RNA选择性地由NSCLC细胞系和原发肿瘤表达，而不在非肿瘤细胞系和组织中表达。如图1A中所见，使用来自一组正常组织的RNA，借助RT-PCR测定SP17、AKAP4和PTTG1的基因表达。三个细胞系(两个源自NSCLC，一个源自正常支气管上皮)显示在图1B中，且一群新近诊断患有NSCLC的17名患者显示在图1C。作为阳性对照，本发明人分析了在睾丸中的CTA表达(6、16、17)，而使用未经历逆转录的汇集RNA获得阴性对照(以排除污染的基因组DNA的可能的扩增)，并且其中在没有模板的情况下进行RT-PCR。虽然没有正常组织针对SP17、AKAP-4和PTTG1表达可检测的RNA水平(如图1A所见)，但是正常支气管细胞系CRL-2503显示SP17RNA的微弱表达(如图1B所示)。NSCLC细胞系CRL-5928和CRL-5922显示评价的三种CTA的显著的RNA表达(如图1B所见)。此外，来自所有17名NSCLC患者的肿瘤对于SP17是阳性的，而65％的肿瘤表达AKAP4(11/17)，59％表达PTTG1(10/17)(如图1C所见)。
图2显示使用指定抗体(有色直方图)或相应的同种型对照(黑色直方图)孵育的细胞的流式细胞术分析。使用FACS-Canto流式细胞仪(BD)在FL1通道中(对数级)对FSC/SSC-门控细胞(gatedcell)(10,000事件)测量荧光强度。图表按照在细胞系和原发患者样品中的SP17、AKAP4和PTTG1排列。SP17、AKAP4和PTTG1由NSCLC细胞系和原发患者样品在蛋白水平上表达，但不由正常支气管上皮表达。为了研究CTA组在蛋白水平上的表达，本发明人通过对透化细胞的CTA-特异性抗体染色进行流式细胞术分析。图2显示SP17、AKAP4和PTTG1由NSCLC来源细胞系而不是由正常支气管来源细胞系表达。应注意的是，即使SP17基因微弱地表达，非肿瘤CRL-2503细胞对SP17蛋白也是阴性的(图1B和2)。本发明人对源自患者的NSCLC肿瘤/组织进行了类似分析，其与RT-PCR数据完全一致。图2显示来自3名患者的代表性结果。CTA表达的特异性通过在源自评价的健康个体之一的组织中不存在SP17、AKAP4和PTTG1阳性染色来证实11(例如，代表性结果显示在图2中)。为了进一步评价选择的CTA在肿瘤和正常细胞中的表达，本发明人进行了离心涂片(cytospun)的NSCLC细胞系、正常支气管细胞系和源自原发肿瘤的细胞的免疫荧光分析。
图3显示了对NSCLC细胞系、CRL-5928、CRL-5922、对正常支气管上皮来源细胞CRL-2503和一名代表性患者进行的免疫荧光。代表性免疫荧光针对NSCLC细胞系、CRL-5928、CRL-5922、针对正常支气管上皮来源细胞CRL-2503和一名代表性患者(7号)进行。本发明人显示了在细胞质中，SP17、AKAP4和PTTG1的阳性染色(绿色信号)。在60X放大倍数下通过倒置荧光显微镜(OlympusIX71)拍摄图片。为了测量可能的针对SP17、AKAP4和PTTG1的体液应答，本发明人通过间接ELISA比较了来自NSCLC患者的血清中的循环CTA-特异性IgG自身抗体的水平与来自受试者的那些。如果ELISA信号比健康受试者的中值信号高至少3个标准偏差，则认为受试者是阳性的(20)。
图4A-4C是用于检测针对SP17、AKAP4和PTTG1的循环CTA-特异性IgG的ELISA数据的图表。图4A-4C是用于检测循环CTA-特异性IgG的ELISA。图表显示由一式三份进行的研究计算的平均OD值(正方形，NSCLC患者的血清；菱形，健康受试者的血清)。水平线表示阳性界限，计算为从健康对照组获得的中值的三倍。与来自RT-PCR、流式细胞术和免疫荧光的表达数据一致，图4A-4C显示大多数NSCLC患者显示CTA特异性循环自身抗体。
图5A-5F是CTL活性和特异性分析的图表。直方图显示在指定的不同条件下，通过基于非放射性铕的分析获得的特异性细胞溶解的百分比。左侧图显示在不同的效应细胞(E)：靶细胞22(T)比例下的CTL活性。条代表一式三份进行的实验的平均值，误差条表示标准偏差。右侧图显示CTL特异性的分析。条代表由对选择的5名患者进行的实验获得的平均值，而误差条表示标准偏差。以25μg/mL的浓度加入针对HLAI类(W6/32)和HLAII类(L243)的抗体以评价HLA限制性细胞毒性。CTL表示细胞毒性T淋巴细胞；DC，树突细胞；HLA，人白细胞抗原；E7，HPVE7抗原；PBMC，外周血单核细胞。本发明人成功地生成能够有效杀死来自5名患者的自体肿瘤细胞的CTL，如图5A-F左列所见。对于该分析，本发明人选择显示在其肿瘤细胞中在蛋白水平上特异性CTA表达的患者。细胞毒效应的特异性由自体肿瘤细胞和NSCLC来源细胞系的细胞溶解的高百分比(40％至高于80％)来支持，而非肿瘤细胞(DC，使用不相关的HPV-E7抗原致敏的DC，和正常支气管来源细胞系CRL-2503)的细胞溶解<10％(图5A-F，右侧)。HLAI类限制通过针对12单态HLAI类分子而不是HLAII类分子的抗体的细胞溶解抑制来显示，如图5A-F右列所见。
图6A、6C和6E是分析指定细胞因子的水平的ELISA，并且图6B、6D和6F是与自体肿瘤细胞共培养的患者的CTL的IFN-γ表达的ELISPOT分析。图6A、6C和6E是来自自体肿瘤细胞的共培养物(效应细胞：靶细胞比为20:1)的上清液的ELISA，并且分析使用CTA致敏的或未改性的DC刺激的PBMC的指定的细胞因子的水平。所有测量均一式三份地进行。结果显示为使用活化PBMC测量的平均OD除以使用在没有抗原的情况下与自体DC孵育的PBMC获得的平均OD(OD450比)。图6B、6D和6F是与自体肿瘤细胞共培养的患者的CTL的IFN-γ表达的ELISPOT分析(效应细胞：靶细胞比为20:1)，使用如在材料和方法部分详细描述的ELISPOT分析进行评价。使用AIDELISPOT读取系统(CellTechnology,Inc.,Columbia,MD)进行点计数，并每106个PBMC归一化。结果代表一式三份进行的分析的平均值±标准偏差。基于ELISA的细胞因子表达的测量显示了朝向Th1效应细胞表型的T细胞活化和极化：在使用CTA-致敏的DC刺激并且与肿瘤细胞共培养后，IFN-γ和TNF-α的水平升高超过50倍，而IL-4、IL-5和IL-10基本未改变(如图6A、6C和6E所示)。IFN-γ的ELISPOT结果进一步证实了在使用与自体肿瘤细胞共培养的精子蛋白(ropporin)呈递DC活化的PBMC中，产生IFN-γ的细胞的升高的高发生率(图6A、6C和6E)。
SP17/AKAP4/PTTG1RNA选择性地由NSCLC细胞系和原发肿瘤表达，但不在非肿瘤细胞系和组织中表达。
使用来自一组正常组织(图1A)、三个细胞系(两个源自NSCLC，一个源自正常支气管上皮，图1B)和一群新近诊断患有NSCLC的17名患者(图1C)的RNA，使用RT-PCR测定SP17、AKAP4和PTTG1的基因表达。作为阳性对照，本发明人分析了在睾丸中的CTA表达(6、16、17)，而使用未经历逆转录的汇集RNA获得阴性对照(以排除污染的基因组DNA的可能的扩增)，并且其中在没有模板的情况下进行RT-PCR(图1A-C)。虽然没有正常组织针对SP17、AKAP-4和PTTG1表达可检测的RNA水平(图1A)，但是正常支气管细胞系CRL-2503显示SP17RNA的微弱表达(图1B)。NSCLC细胞系CRL-5928和CRL-5922显示评价的三种CTA的显著的RNA表达(图1B)。此外，来自所有17名NSCLC患者的肿瘤对于SP17是阳性的，而65％的肿瘤表达AKAP4(11/17)，59％表达PTTG1(10/17)(图1C)。
NSCLC细胞系和原发患者样品在蛋白水平上表达SP17/AKAP4/PTTG1，而正常支气管上皮不表达。
为了研究我们的CTA组在蛋白水平上的表达，本发明人通过透化细胞的CTA-特异性抗体染色进行流式细胞分析。图2显示SP17/AKAP4/PTTG1由NSCLC来源细胞系而不是由正常支气管来源细胞系表达。应注意的是，即使SP17基因微弱地表达，非肿瘤CRL-2503细胞对SP17蛋白也是阴性的(图1B和2)。本发明人随后对源自患者的NSCLC肿瘤/组织进行了类似分析，其与RT-PCR数据完全一致。图2显示来自3名患者的代表性结果。CTA表达的特异性通过在来自评价的健康个体之一的组织中不存在SP17/AKAP4/PTTG1阳性染色来证实(代表性结果显示在图2中)。为了进一步评价选择的CTA在肿瘤和正常细胞中的表达，本发明人进行了离心涂片的(cytospun)NSCLC细胞系、正常支气管细胞系和源自原发肿瘤的细胞的免疫荧光分析。图3显示肿瘤细胞中的SP17/AKAP4/PTTG1的胞质定位，但是根据来自流式细胞术的结果，在正常支气管细胞系CRL-2503中未显示或显示边界信号。
循环CTA-特异性自身抗体在NSCLC患者的血清中是可检测的。
为了测量可能的针对SP17/AKAP4/PTTG1的体液应答，本发明人通过间接ELISA比较了来自NSCLC患者的血清中的循环CTA-特异性IgG自身抗体的水平与来自受试者的那些。如果ELISA信号比健康受试者中发现的中值信号高至少3个标准偏差，则认为受试者是阳性的(20)。与来自RT-PCR、流式细胞术和免疫荧光的表达数据一致，图4A-4C显示大多数NSCLC患者显示CTA特异性循环自身抗体。
由患者的PBMC生成CTA-特异性CTL。
本发明人成功地生成能够有效杀死来自5名患者的自体肿瘤细胞的CTL(图5A-F，左侧)。对于该分析，本发明人选择显示在其肿瘤细胞中在蛋白水平上特异性CTA表达的患者。细胞毒效应的特异性由自体肿瘤细胞和NSCLC来源细胞系的细胞溶解的高百分比(40％至高于80％)来支持，而非肿瘤细胞(DC，使用不相关的HPV-E7抗原致敏的DC，和正常支气管来源细胞系CRL-2503)的细胞溶解<10％(图5A-F，右侧)。HLAI类限制通过针对单态HLAI类分子而不是HLAII类分子的抗体的细胞溶解抑制来显示(图5A-F，右侧)。通过基于ELISA的细胞因子表达的测量显示了朝向Th1效应细胞表型的T细胞活化和极化：在使用CTA-致敏的DC刺激并且与肿瘤细胞共培养后，IFN-γ和TNF-α的水平升高超过50倍，而IL-4、IL-5和IL-10基本未改变(图6A-F，左侧)。IFN-γ的ELISPOT结果进一步证实了在使用与自体肿瘤细胞共培养的精子蛋白(ropporin)呈递DC活化的PBMC中，产生IFN-γ的细胞的升高的高发生率(图6A-F，右侧)。
虽然历史上认为NSCLC由于低频率的肿瘤浸润T细胞而具有弱的免疫原性(21)，但是使用鼠NSCLC模型的研究已显示可以利用基于DC的方法活化有效的免疫应答(22，23)。此外，在患有NSCLC的患者中已检测到肿瘤抗原特异性T细胞应答(23)，表明确定特异性NSCLC-相关抗原并将其以最佳方式呈递到免疫系统可以产生在该疾病中通常不存在或无活性的肿瘤特异性效应T细胞(24)。免疫治疗在提高患者生存率和降低与标准治疗相关的死亡率的潜在作用已通过最近的对患有NSCLC的患者的12个临床疫苗试验的荟萃分析证实(25)。当研究基于免疫治疗的抗癌策略时，选择被疫苗靶向的抗原是关键步骤(5)。理想的靶标应是在癌症细胞而不在正常细胞中选择性表达的高免疫原性蛋白(5，10)。由于其高肿瘤限制性表达谱及其免疫原性，CTA特别适用于肿瘤免疫治疗的肿瘤相关抗原(7,9)。
在该研究中，本发明人示出了三种CTA，即SP17、AKAP4和PTTG1在NSCLC的免疫治疗中的用途。本发明人首次分析了3种CTA，即SP17、AKAP4和PTTG1在一组正常组织、三个NSCLC细胞系、一个正常支气管细胞系、来自17名NSCLC患者的原发肿瘤细胞和来自8名健康受试者的支气管上皮细胞中的差异表达。如预期的，除了睾丸以外，非肿瘤组织均未表达RNA水平的选择的CTA(7,10)。NSCLC细胞系表达SP17/AKAP4/PTTG1转录物和蛋白，而正常支气管上皮细胞系仅显示微弱的SP17RNA表达。这与我们之前的报导一致，该报导显示SP17在体细胞纤毛上皮细胞中表达，包括气道的体细胞纤毛上皮细胞(26)。有趣的是，独立的临床前研究强烈表明SP17-定向的免疫治疗未产生任何与纤毛细胞中SP17-表达相关的毒性(16,27,28)。源自患者的所有肺癌组织显示转录和翻译水平的SP17表达，而大多数样本也显示AKAP4和PTTG1表达。蛋白表达的结果独立地通过流式细胞术和免疫荧光证实，结果是一致的。来自17名NSCLC受试者中的16名的肿瘤显示研究的三种CTA中的至少两种的表达，表明其在该疾病中的潜在重要性。对于充当免疫治疗的靶标的蛋白，其应能够引发强烈且可测量的免疫应答，该性质称为免疫原性。本发明人发现大多数NSCLC患者的血清对至少两种CTA-特异性抗体是阳性的，仅有#5患者显示抗-SP17但无抗-AKAP4或抗-PTTG1IgG。虽然在肿瘤组织中的mRNA和蛋白表达数据之间完全一致，但体液抗肿瘤应答以血清中的抗-CTA抗体来测量，导致更加异质。例如，三名NSCLC患者(#2,13,14)分类为抗-SP17阴性，但是其肿瘤表达SP17。有趣的是，所有AKAP4-或PTTG1-阳性患者在其血清中也显示相应的特异性自身抗体。ShanQ.等人的最近的研究(29)生成了含有72种CTA的低密度蛋白微阵列，并使用来自NSCLC患者和健康受试者的血清对其探测。这些研究者报导了在NSCLC患者的血清中的NYESO-1、XAGE-1、ADAM29和MAGEC1Ab的检测。这些发现表明抗-CTA抗体可以开发为NSCLC的诊断工具。
为了测定SP17/AKAP4/PTTG1免疫原性是否能够产生CTA/肿瘤特异性CTL应答，发明人检查了对CTA-负载的树突细胞(DC)的T细胞应答。DC的应用是广泛认可的用于刺激肿瘤抗原特异性T细胞应答的方法，并且本发明人之前已经在MM、宫颈癌和前列腺癌中使用该技术(6,15,30,31)。为了研究由PBMC产生CTA-特异性CTL的可行性，本发明人选择了经测试对肿瘤细胞中的SP17、AKAP4或PTTG1蛋白表达显阳性的5名患者。如预期的，使用CTA-呈递DC刺激的患者的PBMC显示显著的对自体肺癌细胞和NSCLC-来源细胞系的细胞溶解活性。观察到的细胞毒效应限于HLAI类阳性靶标，因为其被抗-HLAI类抗体阻断而不是被抗-HLAII类抗体阻断。对CTL细胞溶解活性的抗原特异性通过其不能产生针对CTA-阴性CRL-2503细胞的细胞毒性应答来证实或在暴露于非致敏DC或负载HPVE7抗原的DC之后证实。细胞因子表达分析显示我们的基于DC的CTL产生方案在刺激的PBMC中诱导强的Th-1极化，如升高的IFN-γ和TNF-α以及降低的IL-4、IL-5和IL-10水平所证实的(6,16,19,31-33)。由于NSCLC患者显示异常的Th-2-型细胞因子谱(34)，所述异常的Th-2-型细胞因子谱负面影响对免疫治疗的显著应答(35)，因此可能的是(但不限制本发明)，CTA-负载的DC具有刺激T-辅助细胞Th-1谱的能力(36)。效应T淋巴细胞的活化进一步通过ELISPOT分析证实，其显示在使用CTA-负载的DC致敏(prime)并暴露于自体肿瘤细胞的PBMC中高频率的IFN-γ-表达细胞。该发现是有意义的，因为IFN-γ已显示在NSCLC生长中发挥显著的抑制作用(37)。
体外产生活性CTA-特异性免疫应答的可行性表明由NSCLC细胞表达CTA可以具有治疗意义，并充当针对该疾病设计新型免疫治疗策略的基础。此外，在体外改造以有效将CTA呈递到效应T细胞的DC可以克服在NSCLC肿瘤微环境中见到的免疫抑制，实现针对该疾病的有效的疫苗接种策略的开发(38-40)。可以针对NSCLC开发CTA-依赖性免疫治疗以确定是否能够在体外产生CTA-特异性CTL应答并克服在该疾病中观察到的免疫耐受(41-44)。总之，这些结果显示，CTASP17、AKAP-4和PTTG1，在NSCLC中选择性表达，并且其表达可以开发用于产生特异性CTL-介导的抗肿瘤应答。本发明人之前已确定SP17、AKAP4和PTTG1在多发性骨髓瘤、卵巢癌和前列腺癌中的表达和免疫原性(6,16,17,19,31,32)，以及目前在NSCLC中的表达和免疫原性的这一事实表明可以使用CTA-驱动的疫苗接种策略靶向CTA表达肿瘤。
预期的是在本说明书中讨论的任何实施方案可以以本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
要理解的是，本文描述的具体实施方案通过说明的方式显示，并不作为对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，可以在各种实施方案中采用本发明的主要特征。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文描述的具体过程的多种等价方式。认为这样的等价方式在本发明的范围内，并涵盖在权利要求中。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所涉及的领域中的技术人员的技术水平。将所有出版物和专利申请引入本文作为参考，其程度如同具体地和单独地表明将每个单独的出版物或专利申请引入作为参考。
单词“一个(a)”或“一个(an)”当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”联合使用时，可以指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中术语“或”的使用是指“和/或”，除非明确表明仅指代供选择的方案，或供选择的方案是互相排斥的，但是公开内容支持仅指代供选择的方案和“和/或”的定义。在本申请中，术语“约”用来指这样的值，其包括装置的误差、用于测定值的方法或在研究受试者中存在的变化的固有改变。
如在本说明书和权利要求(或多个权利要求)中所使用的，单词“包含(comprising)”(和包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，不排除另外的未列举的元素或方法步骤。
如本文所使用的术语“或其组合”是指在该术语前所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体上下文中的顺序是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是包含一种或多种项目或条目的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解通常对任意组合的项目或条目的数量没有限制，除非从上下文中明显得出。
根据本发明，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在不进行过度实验的情况下形成或实施。虽然以优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，变化可以适用于本文所描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序中。对本领域技术人员明显的是所有这些类似的替代和改变被视为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。
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Claims (20)
1.用于治疗肺癌的组合物，其包含：
分离的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞已被负载以呈递至少一种SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原，并且分别针对一种或多种肺癌细胞表达的SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种产生细胞毒性T淋巴细胞特异性免疫应答。
2.权利要求1的组合物，其中所述抗原呈递细胞为树突细胞。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗原呈递细胞为自体树突细胞。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含负载到抗原呈递细胞的NYESO-1、XAGE-1、ADAM29和MAGEC1抗原中的至少一种。
5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码重组SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原，并且重组的SP17、AKAP-4或PTTG1在抗原呈递细胞中表达。
6.用于确定疑似患有肺癌或至少有患上肺癌的风险的人受试者的方法，其包括以下步骤：
获得来自受试者的样品；和
确定样品中对抗-SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种具有特异性的特异性免疫球蛋白的存在或不存在，其中样品中抗-SP17、AKAP-4或PTTG1特异性免疫球蛋白中的至少一种的存在表明受试者患有肺癌或至少有患上肺癌的风险。
7.用于确定患有癌症的个体的肿瘤标志物谱的方法，包括：
获得来自个体的体液样品；
使来自个体的体液样品与SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种接触；
确定结合于存在于体液样品中的一种或多种自身抗体的SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种的复合物的存在或不存在，其中所述一种或多种自身抗体对SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种具有免疫特异性；其中复合物的存在提供个体的肿瘤标志物谱，以及其中肿瘤标志物谱被确定为病程的指征；和
向个体提供对SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种具有特异性的抗原呈递细胞或细胞毒性T细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述复合物的存在表明检测到癌症。
9.权利要求7的方法，其中所述癌症是肺癌。
10.用于治疗癌症的免疫治疗组合物，其包含SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种，所述SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原能够产生对一种或多种肺癌细胞具有特异性的SP17、AKAP-4或PTTG1特异性细胞毒性T淋巴细胞。
11.权利要求10的免疫治疗组合物，还包含至少一种抗原呈递细胞。
12.权利要求11的免疫治疗组合物，其中所述抗原呈递细胞为树突细胞。
13.根据权利要求10的免疫治疗组合物，其中所述至少一种抗原呈递细胞被编码SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原的肽或表达构建体致敏或负载。
14.根据权利要求10的免疫治疗组合物，其中所述SP17、AKAP-4或PTTG1肿瘤相关抗原中的至少一种是从非小细胞肺癌中分离的。
15.用于检测受试者中的肺癌的方法，其包括以下步骤：
获得来自受试者的样品；
确定样品中SP17、AKAP-4或PTTG1的存在或不存在，其中样品中SP17、AKAP-4或PTTG1的存在表明受试者患有肺癌或至少有患上肺癌的风险；和
向个体提供对SP17、AKAP-4或PTTG1中的至少一种具有特异性的抗原呈递细胞或细胞毒性T细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述样品为血液样品。
17.组合物，其包含表达免疫刺激抗原的核酸载体，其中所述抗原包含编码SP17、AKAP-4或PTTG1肺癌相关抗原中的至少一种的核苷酸序列。
18.权利要求17的组合物，其中所述抗原为肽抗原。
19.用于治疗癌症的方法，其包括以下步骤：
给予需要其的哺乳动物除了稀释剂、溶媒、赋形剂或非活性成分中的至少一种以外的协同的治疗有效量的肺癌抗原；
由肺癌抗原产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；和
使用特异性细胞毒性T淋巴细胞靶向一种或多种肿瘤细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述肺癌抗原为SP17、AKAP-4或PTTG1。
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