CN105092480B - 一种用于oird检测方法的生物芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于斜入射光反射差检测方法的生物芯片，包括：衬底；所述衬底上的透明缓冲层；固定到所述透明缓冲层上的生物样品，其中，所述缓冲层的厚度被设置为：i)同时获取所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号和倍频信号；或ii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号的强度等于其负极大值或其正极大值；或iii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的倍频信号的强度等于其负极大值或其正极大值。

Description

一种用于OIRD检测方法的生物芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物芯片及其检测方法，尤其涉及一种用于斜入射光反射差(oblique-incidence reflectivity difference，OIRD)检测方法的生物芯片及其检测方法。

背景技术

生命科学是一个复杂的体系，如蛋白、核酸、糖类等每一类都包含了上万种不同的生物分子，其小分子更是不计其数。因此生物分子的检测及其相互作用研究对生命科学中的基础研究、医学研究、新型药物研发以及临床等领域都是十分重要和有意义的，已发展成为生命科学中最为活跃的前沿领域之一。

为了研究众多生物分子的特性和分子间的相互作用，在20世纪九十年代出现了生物芯片技术，生物芯片一次可平行的同时检测上万个生物样品点的相互作用，被称之为20世纪具有划时代意义的微量分析技术之一。但到目前为止，在检测生物芯片方面，还是以荧光为代表的标记方法占统治地位。标记法不仅过程复杂、费时费力成本高，尤其是标记分子的引入，可能影响或改变被检测生物分子的结构和活性。因此生命科学领域急需无标记、高通量的检测技术和方法。

近年来发展了OIRD检测方法，可无标记、高通量地检测和研究生物分子及其相互作用。OIRD检测方法的基本原理是，使一束在p偏振和s偏振之间周期性变化的调制光斜入射到被检测物质(例如生物芯片上的生物样品)表面，并测量反射光的s和p两个偏振分量的差值，从而检测和研究物质表面在微纳尺度上的变化和特性。图1示出了一个OIRD检测装置的基本原理图。如图1所示，OIRD检测装置主要包括：He-Ne激光器11，用于输出p偏振光；光弹调制器12，用于把He-Ne激光器11输出的p偏振光调制为频率(Ω)为50kHz，在p偏振和s偏振之间周期性变化的调制光；相移器13，可在调制光的p偏振和s偏振分量之间引入一个固定的位相差，用于基频信号调节；第一透镜14，使调制光聚焦后，斜入射到被检测的生物样品16的表面；透镜(18)，用于聚焦被生物样品16表面反射的反射光；检偏器19，通过调节其光轴与偏振光方向之间的夹角，对倍频信号进行调节；光电二极管探测器120，用于检测经过偏振分析器19的反射光，并将光信号转变为电信号；第一、第二锁相放大器121、122，分别检测反射光差值的基频和倍频信号，其生成的数据由计算机采集和处理。对于不同的生物样品、或同一样品的不同浓度、或生物分子之间的相互作用，OIRD检测装置得到的基频和倍频信号会有所不同，从而可获得生物分子或生物分子之间相互作用的信息。

关于OIRD检测生物芯片方法的进一步具体细节，例如可参考文献1：Xu Wang,etal.,J Appl Phys,2010,107,063109，文献2：S.Liu et al.,Appl.Phys.Lett.,2004,104,163701，文献3：He Liping,et al.Sci China Phys Mech Astron,2014,57,615，中国发明专利ZL201010128589.5、ZL200810057538.4、ZL200810101699.5等。

已有的研究结果表明，OIRD检测方法是目前无标记、高通量地检测生物芯片的最好方法之一。但是目前的OIRD检测方法的检测灵敏度和分辨率尚需要进一步提高。

发明内容

因此，本发明的目的在于，提供一种用于OIRD检测方法的生物芯片，可使其检测灵敏度和分辨率达到最佳值。

本发明提供了一种用于斜入射光反射差检测方法的生物芯片，包括：

衬底；

所述衬底上的透明缓冲层；

固定到所述透明缓冲层上的生物样品，

其中，所述缓冲层的厚度被设置为：

i)同时获取所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号和倍频信号；或

ii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号的强度等于其负极大值或其正极大值；或

iii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的倍频信号的强度等于其负极大值或其正极大值。

根据本发明提供的生物芯片，其中所述缓冲层的厚度被选择为使所述基频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50％，同时使所述倍频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50％。

根据本发明提供的生物芯片，其中所述透明缓冲层的材料为SiO2、SrTiO3LaAlO3或聚合物。

根据本发明提供的生物芯片，其中所述生物样品通过活化层固定到所述缓冲层上。

根据本发明提供的生物芯片，其中所述缓冲层由适于固定所述生物样品的活化材料构成。

根据本发明提供的生物芯片，还包括流体腔，覆盖在所述衬底上，用于容纳与所述生物样品反应的反应液。

本发明还提供一种检测上述生物芯片的斜入射光反射差检测方法，包括：

将背底信号的值设置为一预定值，该预定值使得斜入射光反射差检测方法的信号的强度至少达到该信号强度能够达到的最大强度的30％；

对所述生物芯片进行斜入射光反射差法检测。

本发明还提供一种用于制造上述生物芯片的方法，包括：

在衬底上形成透明缓冲层；

在所述透明缓冲层上形成生物样品；

其中所述缓冲层的厚度被设置为：

i)同时获取所述斜入射光反射差检测方法的信号中的所述基频信号和所述倍频信号；或

ii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号的强度等于其负极大值或其正极大值；或

iii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的倍频信号的强度等于其负极大值或其正极大值。。

本发明提供的生物芯片中，通过设置一缓冲层，合理地选择缓冲层的厚度，可使OIRD的基频/或倍频信号达到最大值，还可使OIRD检测同时获取基频和倍频两路信号，并使两路信号强度较大，从而提高OIRD检测方法的检测灵敏度和分辨率。

另外，本发明提供的无需背底调零的OIRD检测方法，可进一步提高OIRD信号的灵敏度和分辨率。

附图说明

以下参照附图对本发明实施例作进一步说明，其中：

图1为现有技术中的OIRD检测装置的结构示意图；

图2为现有技术中的OIRD检测方法所使用的生物芯片的结构示意图；

图3为根据本发明的一个实施例的生物芯片的结构示意图；

图4a和图4b示出了在进行OIRD检测时根据本发明的一个实施例的生物芯片中的光路图；

图5a和图5b示出了一个OIRD基频和倍频信号强度随缓冲层厚度变化的关系。

图6a示出了实施例2提供的生物芯片和对应于人IgG抗体反应的OIRD的倍频信号二维扫描图；

图6b示出了实施例2提供的生物芯片和对应于兔的IgG抗体反应的OIRD的倍频信号二维扫描图；

图7a是实施例3提供的生物芯片和兔IgG抗体反应的OIRD倍频信号的二维扫描图；

图7b是反应过程中用OIRD倍频信号实时监测实施例3提供的生物芯片上不同浓度蛋白与兔IgG抗体反应的动态曲线。

具体实施方式

到目前为止，还没有OIRD检测方法专用的生物芯片，因此目前OIRD检测方法使用的生物芯片均采用荧光标记法等所使用的生物芯片的结构。图2示出了目前的OIRD检测方法所使用的生物芯片的结构，包括：载玻片17；附着在载玻片17上的活化层161；多个生物样品16，以矩阵状、单分子层的形式被固定在活化层161上；流体腔15，覆盖在载玻片17上，如果流体腔15中是空气/或缓冲液体，可直接检测生物芯片表面的生物样品。如果流体腔的液体是反应液，可检测生物芯片上生物样品和反应液的反应动态过程及其反应结果。

由于载玻片17表面对生物样品16的附着性通常很差，因此通常需要在载玻片17表面上设置一层活化层161，以结合生物样品16。一般而言，活化层161的厚度很薄，因此在用OIRD检测方法检测生物样品时，可忽略活化层161对检测结果的影响。因此现有的OIRD检测方法中，只考虑生物芯片中的载玻片17、生物样品16和流体腔15这三层的作用，所以这种生物芯片也被称作是基于“三层模型”的生物芯片。

在检测时，利用OIRD检测装置(例如如图1所示的OIRD检测装置)生成一束在p偏振和s偏振之间周期性变化、且在p偏振分量和s偏振分量之间具有一定位相差的调制光L，并将该调制光L聚焦后斜入射到生物芯片的生物样品16的表面，反射光经过OIRD检测装置(例如如图1所示的OIRD检测装置)中的偏振分析器19，光电二极管探测器120接收后，经第一、第二锁相放大器121、122放大，最终得到OIRD信号。

通过理论计算可知，在生物样品16的厚度d<<λ(调制光L的波长)和一级近似的情况下，经过化简后可得到如下三层模型的关系式：

其中Δ_p-Δ_s为s和p偏振光反射率相对变化的差值，d为生物样品16的厚度，为调制光L入射到生物芯片表面的入射角，ε_s、ε_dε₀分别表示载玻片17、生物样品16和流体腔15内部的介电常数。

OIRD信号的基频ΔI(Ω)和倍频ΔI(2Ω)信号分别正比于Δ_p-Δ_s的虚部和实部。对于不同的生物样品、或同一样品的不同浓度、或生物分子之间的反应，OIRD信号的基频和倍频信号都会有差异，从而能够在OIRD信号中获得生物分子或生物分子反应的信息。

如果生物样品16、流体腔15内的液体以及载玻片17都是透明的，或者说它们的介电常数ε_s、ε_dε₀都只有实数，则由公式(1)可知，Δ_p-Δ_s没有实部，因此OIRD信号将只有一路基频(虚部)信号。

根据本发明的一个方面，提供一种生物芯片，其中在载玻片与生物样品之间设置一缓冲层。缓冲层与载玻片之间形成第一界面，缓冲层与生物样品之间形成第二界面。通过理论计算可知，由于该第一界面和第二界面上的反射光引起的干涉作用，使OIRD信号中的基频和倍频信号的强度都随着缓冲层厚度的改变而发生周期性的变化。换句话说，随着缓冲层厚度的不同，OIRD基频和倍频信号的强度可以在正极大值和负极大值之间变化。因此，通过合理地设置缓冲层的厚度，可同时获取基频和倍频两路信号，还可以使OIRD信号的基频或倍频信号的强度获得最大值，从而提高OIRD检测方法的检测灵敏度和分辨率。

另外，由于采用本发明提供的生物芯片，可同时获取两路信号(基频和倍频)，而根据两路信号就可拟合出被检测生物样品的一些物理特性。这是目前基于“三层模型”的生物芯片(只能获取一路基频信号)所实现不了的。

根据本发明的一个实施例提供了一种生物芯片，其结构如图3所示，包括：

载玻片2；

载玻片2上的缓冲层5；

附着在缓冲层5上厚度为1nm的活化层3；

多个生物样品1，以矩阵状、单分子层的形式被固定在活化层3上；

流体腔4，覆盖在载玻片2上，流体腔4中提供有反应液，用于和多个生物样品1反应。

由于活化层3的厚度很薄，可忽略其对检测结果的影响，因此只需考虑生物芯片中的载玻片2、缓冲层5、生物样品1和流体腔4这四层的作用，因此本发明提供的生物芯片也可被称作是基于“四层模型”的生物芯片。

通过理论计算可知，本实施例提供的“四层模型”生物芯片所得到的OIRD信号中，基频和倍频信号的强度都随着缓冲层5的厚度的改变而发生周期性的变化。下文中将给出该理论计算的推导过程。

图4a和图4b示出了在进行OIRD检测时，四层模型生物芯片中的光路图(其中活化层3由于非常薄而被省略)。其中图4a为生物芯片表面没有结合生物样品1的区域(包括载玻片2、缓冲层5和流体腔3三层)的光路图，而图4b为生物芯片表面结合了生物样品1的区域(包括载玻片2、缓冲层5、生物样品1和流体腔4四层)的光路图。

根据OIRD的基本原理，在四层模型下，OIRD检测生物芯片的基频信号ΔI(Ω)和倍频信号ΔI(Ω)可以分别表示成：

ΔI(Ω)＝I₀[|r_4p||r_4s|sin(φ_4p-φ₀-φ_4s)-|r_3p||r_3s|sin(φ_3p-φ₀-φ_3s)]J₁(π)sin2α (2)

ΔI(2Ω)＝I₀[(|r_4p|²-|r_3p|²)cos²α-(|r_4s|²-|r_3s|²)sin²α]J₂(π) (3)

其中I₀是初始光强，|r_4p|、|r_4s|、|r_3p|和|r_3s|分别是r_4p和r_4s的幅值，φ_4p、φ_4s、φ_3p和φ_3s分别是r_4p、r_4s、r_3p和r_3s的相位(幅角)；φ₀是半波片引入的相位差；α是检偏器光轴的角度，J₁(π)和J₂(π)分别是一阶和二阶贝塞尔函数，其值分别为0.2846和0.4854。

下面参照图4a和图4b详细的说明上述公式(2)和(3)中各个物理量的定义、推导和参数选取。

如图4a和图4b所示，λ表示入射光，r_3p和r_3s表示生物芯片表面没有结合生物样品1的区域对P和s偏振光的反射率，r_4p和r_4s表示生物芯片表面结合有生物样品1的区域对P和s偏振光的反射率。其中ε_s、ε_p、ε_d和ε₀分别表示载玻片2、缓冲层5、生物样品1和流体腔4的介电常数，而 和分别表示在载玻片2、缓冲层5、生物样品1和流体腔4中的折射角。h为缓冲层5的厚度，d为生物样品1的厚度。

在生物芯片表面的没有结合生物样品1的区域中，p和s偏振光的反射率r_3p和r_3s分别表示为：

其中，和分别表示在载波片2和活化层3界面对p偏振光和s偏振光的反射率，和分别表示在活化层3和流体腔4界面对p偏振光和s偏振光的反射率。

在生物芯片表面的结合生物样品1的区域中，p和s偏振光的反射率r_4p、r_4s分别表示为：

其中

和分别表示在活化层3和生物样品层1界面对p偏振光和s偏振光的反射率，和分别表示在生物样品层1和流体腔4界面对p偏振光和s偏振光的反射率。

一般由介电常数为ε_a和ε_b的两种材料a和b构成的界面对p和s偏振光的反射率可以由下面的公式给出：

其中和分别为入射光在a、b两种介质中的折射角。

因此根据公式(8)和(9)，代入具体介质的介电常数就可以计算各个界面对p和s偏振态的反射率。换句话说，也就是可以用公式(8)和(9)得到：

我们将公式(4)-(7)代入到公式(2)和(3)，忽略初始光强I₀，并给定相应的参数，就能计算出OIRD基频和倍频信号强度随缓冲层5厚度的变化规律。

例如，在根据本发明的一个实施例中，探测激光的波长λ＝632.8nm，在玻片2内部的入射角＝31°，玻片2的折射率n_s＝1.5，流体腔4内的液体(反应溶液)的折射率近似等于水的折射率n₀＝1.33，缓冲层5的折射率n_p＝1.54，生物样品1的折射率为1.52。OIRD检测装置中相移器的相位差取φ₀＝φ_3p-φ_3s，检偏器的角度α＝45°。生物样品1的厚度d＝1nm。

将上述参数带入公式(2)和(3)中可知，当透明缓冲层5的厚度h从0到500nm时，OIRD信号中的基频信号强度和倍频信号强度的变化情况如图5a和图5b所示。根据缓冲层厚度的不同，OIRD的基频信号强度和倍频信号强度在负极大值和正极大值之间变化。

如图5a所示，若缓冲层5的厚度h为0，250和500nm时，则基频信号的强度到达负的极大值。若缓冲层5的厚度h为125和375nm时，基频信号的强度达到正的极大值。而当缓冲层5的厚度分别为40，210，280和400nm时，基频信号的强度为0。

如图5b所示，若缓冲层5的厚度h分别为60和310nm时，倍频信号的强度到达正的极大值。在缓冲层5的厚度h分别为185和435nm时，倍频信号的强度达到负的极大值。当缓冲层的5厚度h分别为0，125，250和500nm时，倍频信号的强度为0。

由此可见，本领域技术人员可以根据实际需要而选择合适的缓冲层5厚度h，以获得最大的倍频信号强度或最大的基频信号强度，从而提高OIRD检测的灵敏度和分辨率。或者可以通过选择合适的缓冲层5的厚度h，而同时获得强度均较大的倍频信号强度和基频信号强度，其中优选为,基频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50％，且倍频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50％。例如缓冲层5的厚度h为75nm或150nm等某些特殊的厚度，就可同时获得信号强度较为理想的基频和倍频两路信号，从而在提高OIRD检测的灵敏度和分辨率的同时，还能够根据两路信号拟合出被检测生物样品的一些物理特性。

另外，本发明还提供了一种用于检测根据本发明的基于“四层模型”的生物芯片的OIRD检测方法。

现有技术中的OIRD检测方法中，检测前都必须对基频和倍频信号同时背底“调零”。然而，在使用本发明提供的生物芯片的情况下，在OIRD检测之前，不必要对基频和倍频信号同时调零。

在OIRD检测中，OIRD检测装置中的光电探测器所检测到的值为OIRD信号与背底信号的叠加。为了使检测结果更精确，当背底信号和OIRD信号均为正值或均为负值时，通常会通过背底调零，使背底信号的绝对值尽可能地小，从而提高信噪比。

然而，对于背底信号和OIRD信号为一正、一负时，背底信号的绝对值如果过小，会导致OIRD信号的幅度减小，反而对结果的精确度不利。这是因为，OIRD检测装置中的光电探测器只能够检测信号值的大小，而无法检测出信号为正值还是负值。因此，当背底信号与OIRD信号叠加后，由于正负抵消，OIRD信号的幅度会减小。例如当背底信号为0.6mV，OIRD信号为-1mV时，光电探测器所检测到的信号为二者叠加后的信号的绝对值，即0.6mV。此时光电探测器所检测到的值在0.6mV与0.4mV之间变化。而此时，如果将背底信号值增大至1mV，则光电探测器所检测到的值将变成0mV，即此时光电探测器所检测到的值在1mV与0mV之间变化，可见OIRD信号的幅度得到明显增大。

通常情况下，背底信号为正值，且现有的基于“三层模型”的生物芯片所得到的OIRD信号也通常为正值，因此现有技术中的OIRD检测方法中，检测对基频和倍频信号同时背底“调零”是有益的。

然而对于根据本发明的基于“四层模型”的生物芯片而言，如图5a和图5b所示，基频信号和倍频信号在相位上相差90度，也就是说，缓冲层5在一些厚度条件下，基频和倍频信号可能同时为正或负，而缓冲层5在另一些厚度条件下，基频和倍频信号可能是正和负反相的两路信号。无论是基频还是倍频，当其信号为负值时，不仅不需要“调零”，反而应将背地信号调到一定大的一个幅度，这样才能保证需要的信号不被抵消而减小。

在根据本发明提供的OIRD检测方法中，使用上述具有缓冲层5的生物芯片，在进行正式的OIRD检测之前，先对背底信号进行调试，当所获得的OIRD信号的强度达到最大值和/或信噪比最大时，其对应的背底信号的值即为背底信号的最佳值。将背底信号设置在该最佳值或至少接近该最佳值后，开始OIRD检测。OIRD检测的具体步骤可采用现有技术中的检测步骤继进行。

其中所述的“接近该最佳值”是指，背底信号被设置为，使得斜入射光反射差检测方法的信号的强度至少达到强度最大值的30％。

本发明还提供了一种上述基于“四层模型”的生物芯片的制造方法，包括：

在载玻片2上形成缓冲层5，其中缓冲层的厚度根据上述公式(2)和(3)的计算结果而设置，通过选择缓冲层的厚度，可同时获取基频和倍频两路信号，或者通过选择缓冲层的厚度，可使得OIRD信号的基频或倍频信号的强度获得最大值；

在缓冲层5上形成活化层3；

在活化层3上以矩阵状、单分子层的形式形成多个生物样品；

在载玻片2上覆盖流体腔4。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合几个具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1

本实施例提供一种生物芯片，其结构包括：

载玻片2；

载玻片2上生长的30nm厚的缓冲层5，由聚合物(聚乙烯)构成，该缓冲层5的材料(聚乙烯)也是一种活化层材料，可有效地对生物样品产生固定作用；

用点样仪点制的50×50个人IgG和兔IgG的生物样品1，以矩阵状、单分子层的形式被固定在聚合物活化材料表面；

流体腔4，覆盖在载玻片2上，并在流体腔4中分别加入人IgG和兔IgG抗体与芯片反应。

本实施例提供的生物芯片中，将活化层制作得很厚。因此该活化层在起到增强对生物样品的附着性的同时，还可以充当缓冲层的作用，从而提高OIRD检测生物芯片的灵敏度和分辨率。

在对本实施例提供的生物芯片进行正式的OIRD检测之前，先对背底信号进行调试。调试结果表明，当背底信号的值为2mV时，所获得的OIRD信号的强度达到最大值。因此将背底信号的值设置为2mV，然后开始OIRD检测。

图6a示出了本实施例提供的生物芯片和对应于人IgG抗体反应的OIRD的倍频信号二维扫描图。图6b示出了本实施例提供的生物芯片和对应于兔的IgG抗体反应的OIRD的倍频信号二维扫描图。从图6a和图6b可以看出，采用本实施例提供的生物芯片及本实施例提供的OIRD检测方法，可以检测到倍频信号，而且信号强度大大提高，较现有技术中的基于“三层模型”的生物芯片可提高一个数量级，可有效提高OIRD检测生物芯片的灵敏度和分辨率。

实施例2

本实施例提供一种生物芯片，其结构包括：

载玻片2；

载玻片2上生长的30nm厚的的缓冲层5，由聚合物(聚乙烯)构成，该缓冲层5的材料(聚乙烯)也是一种活化层材料，可有效地对生物样品产生固定作用；

用点样仪在活化层上点制的5mg/mL，2.5mg/mL，1.25mg/mL，0.625mg/mL，312.5μg/mL，156.25μg/mL，78.125μg/mL，39.0625μg/mL共8个浓度兔IgG，每个浓度10个样品点，同时点制30个牛血清白蛋白(BSA)样品点作对照；

流体腔4，覆盖在载玻片2上，并加入兔IgG抗体与芯片反应。

在对本实施例提供的生物芯片进行正式的OIRD检测之前，使用实施例1的调试结果，把背底信号的值设置为2mV，然后开始OIRD检测，以得到上述生物芯片与兔IgG抗体的反应结果及其反应的动态过程。

图7a是本实施例提供的生物芯片和兔IgG抗体反应的OIRD倍频信号的二维扫描图。图7b是反应过程中，用OIRD倍频信号实时监测芯片不同蛋白浓度IgG与兔IgG抗体反应的动态曲线。检测结果表明，采用本实施例提供的生物芯片和OIRD检测方法，能使OIRD检测生物芯片的灵敏度和分辨率提高一个数量级。

根据本发明的其它实施例，其中载玻片2也可以替换成其它材质的衬底，例如玻璃、石英、透明硬质塑料衬底等。

根据本发明的其它实施例，其中构成缓冲层5的材料并不限于上述实施例中的聚合物，例如还可以为SrTiO₃，SiO₂，LaAlO₃等透明材料，以及其它适于用作活化层材料的透明聚合物等。另外，对于能够对生物样品产生足够的附着力的缓冲层材料，缓冲层上的活化层也可以省略。

另外，本发明中所说的术语“透明”，指的是对探测光的波长透明或半透明。

综上，本发明提供了一种基于“四层模型”的生物芯片，通过设置一缓冲层，根据缓冲层厚度的不同，OIRD的基频和倍频信号的强度在负极大值和正极大值之间变化。因此，通过合理地设置缓冲层的厚度，可使OIRD基频和/或倍频信号的强度最佳化，也可同时获取基频和倍频两路信号，从而提高OIRD检测方法的检测灵敏度和分辨率。

另外，本发明提供的无需背底调零的OIRD检测方法，可进一步提高OIRD信号的强度。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种用于斜入射光反射差检测方法的生物芯片，包括：

衬底；

所述衬底上的透明缓冲层；

固定到所述透明缓冲层上的生物样品，

其中，所述缓冲层的厚度被设置为：

i)同时获取所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号和倍频信号；或

ii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号的强度等于其负极大值或其正极大值；或

iii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的倍频信号的强度等于其负极大值或其正极大值。

2.根据权利要求1所述的生物芯片，其中所述缓冲层的厚度被选择为使所述基频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50％，同时使所述倍频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50％。

3.根据权利要求1所述的生物芯片，其中所述透明缓冲层的材料为SiO₂、SrTiO₃LaAlO₃或聚合物。

4.根据权利要求1所述的生物芯片，其中所述生物样品通过活化层固定到所述缓冲层上。

5.根据权利要求1所述的生物芯片，其中所述缓冲层由适于固定所述生物样品的活化材料构成。

6.根据权利要求1所述的生物芯片，还包括流体腔，覆盖在所述衬底上，用于容纳与所述生物样品反应的反应液。

7.一种用于制造根据权利要求1-6中任一项所述的生物芯片的方法，包括：

在衬底上形成透明缓冲层；

在所述透明缓冲层上形成生物样品；

其中所述缓冲层的厚度被设置为：

i)同时获取所述斜入射光反射差检测方法的信号中的所述基频信号和所述倍频信号；或

ii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的基频信号的强度等于其负极大值或其正极大值；或

iii)使所述斜入射光反射差检测方法的信号中的倍频信号的强度等于其负极大值或其正极大值。