CN105087647B - 一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带生存素(Survivin，又称存活素)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其应用。该rAAV载体是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到。本发明的rAAV的病毒载体可将其携带的Survivin抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制Survivin抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗多种Survivin抗原阳性肿瘤的药物。

Description

一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建 方法与应用

【技术领域】

本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带生存素(Survivin，又称存活素)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗Survivin阳性的肿瘤药物中的应用。

【背景技术】

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus fromrecombinant plasmids:gene correction within the terminal repeats ofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL,Labow MA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Genetics ofadeno-associated virus:isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,Berns KI.Positive andnegative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.JVirol.160:251-258.)。

1984年，美国Paul L.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。

AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)。

如何构建可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域技术人员努力的方向。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种稳定性高、携带生存素(Survivin)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV)载体及其构建方法与应用。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体，将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。

已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将Survivin抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的一种的AAV载体中。

本发明还提供携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入Survivin抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。

本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因Survivin与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。

一种与携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括Survivin重组腺相关病毒的质粒载体、Survivin重组腺相关病毒的病毒载体、被所述Survivin重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述Survivin重组腺相关病毒的病毒载体由所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。

一种与携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，Survivin重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到Survivin重组腺相关病毒的质粒载体；Survivin重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到Survivin重组腺相关病毒的病毒载体；Survivin重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述Survivin重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系。

一种如上所述的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的相关产品在制备抗肿瘤药物中的应用。

具体地，肿瘤为Survivin阳性的恶性肿瘤。所述Survivin阳性的恶性肿瘤包括但不限于肺癌、肠癌、肝癌、乳腺癌等。药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。

用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/Survivin的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有Survivin的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。

上述药物的用量一般为100μl/5×10⁶个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。

为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。

本发明与现有技术对比的有益效果是：

本发明提供了一种稳定性高、携带外源性基因(Survivin)的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)载体可将其携带的Survivin抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在Survivin抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在体外和患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗Survivin抗原阳性的恶性肿瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。

【附图说明】

图1是本发明具体实施方式的携带生存素(Survivin)抗原基因的重组腺相关病毒载体的结构示意图；

图2是本发明具体实施方式的构建携带生存素(Survivin)抗原基因的重组腺相关病毒载体以及制备具有感染性的重组腺相关病毒AAV/Survivin的流程图；

图3是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)载体的PCR鉴定结果图；

图4是本发明具体实施方式的所获得的Survivin基因序列与美国NCI Gene Bank公布的基因序列的对比图；

图5是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体的病毒滴度检测结果图；

图6是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验流程图；

图7是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染外周血单个核细胞的效率检测结果图；

图8a是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染的DC表达CD80水平的检测结果图；

图8b是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染的DC表达CD83水平的检测结果图；

图8c是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染的DC表达CD86水平的检测结果图；

图9是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ水平的检结果图；

图10是本发明具体实施方式的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的病毒载体感染的DC所诱导的CTL杀伤Survivin抗原阳性的肿瘤细胞、杀伤特异性和MHC I类分子(MHCClass I)限制性的检测结果对比图。

【具体实施方式】

下面结合具体实施方式并对照附图对本发明做进一步详细说明。

发明人已经成功地将携带AAV 2型全基因组DNA的pBR322质粒(pBR-AAV2)中的AAV-2的包括rep和cap基因在内的全部结构基因删除，经保留末端重复片段，或保留末端重复片段和p5启动子，并插入寡核苷酸片断，以提高重组腺相关病毒(rAAV)DNA复制的效率和重组腺相关病毒的稳定性，由此获得AAV-2载体的基本骨架。此外，也成功地用巨细胞病毒(CMV)启动子、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、beta肌动蛋白启动子取代AAV-2载体中的p5启动子。而且在此基础上成功地制备具有感染性的rAAV病毒颗粒(参见中国专利ZL201110125683.X)，为研制新的rAAV产品奠定了基础。

生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis,IAP)家族的成员之一，是目前发现最强的凋亡抑制因子。Survivin基因位于17q25染色体，全长14700bp，由4个外显子和3个内含子组成。由于Survivin能抑制细胞凋亡，促进DNA复制，缩短G1/S期进程，因此Survivin在肿瘤细胞中的过表达能通过有丝分裂促进细胞的异常增殖。现已发现，Survivin在所有常见恶性肿瘤中表达，包括大肠癌(53.2％)、乳腺癌(83.3％)、小细胞肺癌(85％)、非小细胞肺癌(79.1％)、卵巢癌(51.1％)、胃癌(87％)、肝癌(62％)、宫颈癌(77.7％)、肾癌(69.5％)、膀胱癌(63.8％)、胰腺癌(68％)、非霍奇金淋巴瘤(50％)和神经细胞瘤(47.2％)等等，而在正常组中无表达。因此该抗原具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。更有研究发现该抗原高表达与肿瘤的多药耐药呈正相关。该抗原具有抗原性，是细胞免疫反应的靶抗原，可以成为逆转癌细胞耐药的一个新靶点。实验证明，阻断Survivin基因的表达可增进化疗药物对肿瘤的凋亡诱导作用，增加化疗药物敏感性，甚至逆转耐药。因此Survivin已经成为备受关注的抗肿瘤治疗的靶点。

本发明的AAV/Survivin即是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入Survivin抗原基因得到重组腺相关病毒载体，与载体相关的产品包括质粒、病毒和细胞系。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由美国Life Technologies公司完成。

实施例1、Survivin重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

一、材料及其来源：

1.四种具有不同启动子的AAV 2型(AAV-2)pBR322质粒(pBR-AAV2)：该质粒由发明人构建成功(见中国专利ZL201110125683.X，0056～0059段pBR-AAV2质粒的改建、PCR扩增启动子、将扩增的启动子插入改建的pBR-AAV2质粒中等内容)。四种启动子分别为AAV p5启动子、巨噬细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子和人β-肌动蛋白(β-actin)启动子。该质粒的特点为两端完整的重复末端片断(TR)序列,并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率，并且剔除AAV-2的包括复制蛋白基因(rep)和包膜蛋白基因(cap)在内的全部结构基因。

2.人肺癌组织：来源于手术切除的癌组织，免疫组化证实Survivin抗原阳性。

3.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的人生存素抗原(Survivin)基因序列设计(GenBank:HM625836)。

二、构建本实施例携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体(如图1和2所示)，具体过程包括以下步骤：

1.获取总c DNA，具体方法为：采用Trizol试剂(美国Life Technology公司生产)获取肿瘤组织的总mRNA。首先将Survivin抗原阳性的肺癌组织反复碾磨后，加入5mlTrizol，按照其说明书进行操作。离心获取上清液后，以75％(V/V)乙醇洗涤二次，再加入无水乙醇，离心沉淀。沉淀物以去离子水溶解，得到总mRNA溶液，将浓度调至10ng/μl。以10μl总mRNA溶液为模板，进行逆转录反应(RT)，合成总cDNA。逆转录反应体系，以总反应体系为25μl为例，包括：0.5μg oligo(dT)15(美国Promega公司)、0.5mM dNTPs(美国Promega公司)以及200U M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)。反应条件为37℃，1小时，得到总cDNA。

2.获取Survivin cDNA，具体方法为：以所述总cDNA为模板，在引物1：ACGCGTACCgCCAgATTTgAATCg和引物2：CCTCgAgCCTCAATCCATggCAgC的引导下PCR扩增，得到Survivin cDNA。PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，60℃35秒，72℃70秒，共30个循环；最后72℃8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，在517bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到长度为517bp SurvivincDNA(如图3所示)。再进行DNA序列测定，其核苷酸序列如图4所示，进一步证明PCR扩增的Survivinc DNA基因序列正确。

3.构建携带Survivin cDNA的重组腺相关病毒载体：分别对携带4种不同启动子的pBR-AAV2质粒和Survivin cDNA分别用限制性内切酶进行酶切后，进行DNA连接反应。所用限制性内切酶均购自美国Promega公司。酶切反应体系为：1μg pBR-AAV2质粒或SurvivincDNA；10U限制性内切酶Mlu I和xba I(购自美国Promega公司)，2.5μl 10×缓冲液C以及19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时。连接反应体系为：500ng酶切后的质粒，300ng酶切后的Survivin cDNA，10IU T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：在4℃下8小时。分别得到携带有AAV的p5启动子和Survivin cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有CMV启动子和Survivin cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有SV40早期启动子和Survivin cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有beta肌动蛋白启动子和Survivin cDNA的重组腺相关病毒载体。

4.将连接后的重组腺相关病毒载体分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到大量的重组腺相关病毒(AAV/Survivin)的质粒载体。

三、重组腺相关病毒的质粒载体的鉴定

1.PCR鉴定：应用上述提及的引物1和引物2的引导下进行PCR扩增，以能否扩增出现Survivin cDNA为鉴定标准。PCR扩增条件和反应体系如上述提及的相同。反应结束后，对PCR产物进行1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，在517bp处出现一条特异性条带即可判定为AAV/Survivin的质粒载体构建成功。将该目的条带回收并纯化后得到长度为517bpSurvivin cDNA，如图3所示。图3中：1为DNA分子量标准；2和3表示2个阳性克隆。

2.DNA序列测定:将AAV/Survivin进行DNA序列测定。其测序结果的核苷酸序列如图4所示，与美国基因库中公布的Survivin的基因序列99％同源，证明所获得的AAV/Survivin正确，进一步证明构建AAV/Survivin的质粒载体成功。

实施例2、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的制备及滴度测定(如图2和图5所示)

材料及其来源：

A.实施例1-1构建的携带有Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体。

B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心刘勇教授构建(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cellresponse against cervical cancer cells by human papillomavirus type16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associatedvirus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)。

C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAVp细胞株：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心建立(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapidinduction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by humanpapillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells byan adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)。

D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Invotrogen公司。

E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清)：购自美国Cellgro公司。

F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。

G.DNA拷贝数标准：分别为1012拷贝数(copies)/μl至109(copies)/μl，购自美国ProMAGE公司。

一、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的制备

参照图2，用下述方法制备重组腺相关病毒(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：

A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μgAAV/Survivin的质粒载体，1.0μg pHelper质粒，4.0μl Lipofectin和50.0μl含5％(V/V)胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。

B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。

C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。

D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV的病毒液。

E.将收集的rAAV的病毒液过滤除菌。将获得的携带肿瘤抗原基因－生存素基因全长Survivin cDNA的AAV病毒命名为AAV/Survivin的病毒载体。

二、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的病毒滴度测定

采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的AAV/Survivin的病毒载体进行病毒滴度测定，具体方法包括以下步骤：仅所用的DNA探针为针对Survivin基因的特异性探针。

A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒颗粒DNA。

B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。

C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。

D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，探针为“实施例1中所获得的Survivin cDNA”。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2％(V/V)琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。

E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒DNA进行DNA杂交。AAV/Survivin的病毒载体的检测结果如图5所示。图5中，1为标准品，2-5为4批AAV/Survivin，每批AAV/Survivin的病毒载体的滴度都能达到10¹²拷贝/ml。

实施例3、AAV/Survivin的病毒载体导入单核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验

材料及其来源：

A.重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体：AAV/Survivin的病毒载体。

B.AIM-V细胞培养基：购自美国Life Technologies公司。

C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素2，4，7(IL-2,4,7)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)购自美国R&D公司。

D.Survivin阳性的原代肿瘤细胞：分别为从患者的肿瘤组织中分离的肝癌细胞、肺腺癌细胞、肠癌细胞和乳腺癌细胞。

E.Survivin阳性细胞株：7721肝癌细胞株，从美国组织细胞储存中心(ATCC)获得。

F.Survivin阴性原代细胞：抗原阴性的皮肤上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞，从ATCC获得。

一、杀灭肿瘤实验

如图6所示，将本发明的携带Survivin抗原基因的rAAV的病毒载体感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验的整个过程包括以下步骤：

A.取肿瘤患者50-150毫升外周血，用血细胞分离仪(或淋巴细胞分离液)按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AIM-V培养基混匀后，加入细胞培养皿，置于恒温二氧化碳培养箱中培养2小时。

B.分离细胞，除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(单核细胞，monocyte,Mo)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。

C.在单核细胞中加入一种(或多种，效果更佳)本发明实施例1-2获得的rAAV的病毒载体，加入量约为100-1000MOI，同时再加入GM-CSF(800IU/mL)，继续培养4小时。

D.除去步骤C的旧培养基，补充含GM-CSF，IL-4(800IU/mL)以及TNF-α(20IU/mL)的AIM-V培养基，继续培养。

E.培养6天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合，在AIM-V培养基中加入IL-2(20IU/mL)以及IL-7(500IU/mL)，继续培养。

F.培养至6-12天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。

二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测

A.rAAV的病毒载体感染外周血单个核细胞的效率检测

采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对肿瘤相关抗原－生存素(Survivin)的特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明rAAV感染的单核细胞或未成熟的DC，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，重组腺相关病毒AAV/Survivin感染外周血单个核细胞的效率检测结果如图7所示。图7为启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子的AAV/Survivin的病毒载体的感染效率，AAV/Survivin的病毒载体感染外周血单个核细胞的效率为98.5％，即约98.5％的外周血单个核细胞可被rAAV病毒感染，证明本发明的AAV/Survivin的病毒载体具有较高的感染效率。同时提示90％左右的DC可进行抗原提呈，刺激T淋巴细胞。另外3种启动子的AAV/Survivin的病毒载体感染树突状细胞的效率也均在90％左右。

B.树突状细胞(DC)表达的CD分子水平的检测

DC表达CD80、CD83以及CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这三种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的DC表达CD80、CD83以及CD86的水平进行检测，以Survivin蛋白刺激的DC以及无刺激的DC为对照。其中，AAV/Survivin的病毒载体感染的DC表达CD80、CD83以及CD86水平的检测结果如图8a-8c所示，为启动子为p5启动子的AAV/Survivin的病毒载体感染的DC表达的CD80、CD83和CD86的平均水平，被AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所表达的CD分子水平较高(表达效率分别为42.07％、82.54％和74.21％)。证明构建和制备的Survivin抗原基因的rAAV感染外周血单核细胞后，所诱导的DC的功能强大。另外，CMV启动子、SV40早期启动子、β-肌动蛋白启动子的三种AAV/Survivin的病毒载体感染的DC表达CD80、CD83和CD86的平均水平较高，提示可有效刺激Th1反应，细胞免疫反应。

C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测

CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平(以Survivin蛋白刺激的DC以及无刺激的DC所诱导的CTL为对照)，DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，最后利用流式细胞仪检测结果。其中，被AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平如图9所示，为启动子为SV40早期启动子的AAV/Survivin的病毒载体感染的DC刺激产生的CTL表达IFN-γ平均水平，被AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平明显高于对照。证明被本发明构建和制备的携带肿瘤抗原－生存素基因rAAV感染的DC所诱导的CTL功能强大。另外，p5启动子、CMV启动子、β-肌动蛋白启动子的三种AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平也较高，提示细胞免疫反应较强，亦即CTL的杀伤活性高。

三、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞试验

被AAV/Survivin的病毒载体感染的DC与淋巴细胞混合培养结束后，将被AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)按20:1(淋巴细胞:肿瘤细胞)与Survivin阳性的肿瘤细胞混合后，采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性、MHC class I限制性和杀伤特异性。检测结果如图10所示，被本发明的AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL能够有效地裂解(杀伤)Survivin阳性的肿瘤细胞，杀伤率可达60％以上，提示杀死肿瘤细胞的作用较强。

以Survivin抗原阴性的肝、乳腺和肺细胞为对照，再用上述相同的方法检测上述被AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL杀伤肿瘤细胞的特异性。如图10所示，被本发明构建和制备的携带Survivin抗原基因的rAAV(AAV/Survivin)的的病毒载体感染的DC所诱导的CTL对Survivin抗原阴性的细胞无杀伤作用，表明该杀伤作用具有Survivin抗原特异性，证明被本发明构建和制备的AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对抗原阴性的细胞无杀伤作用。

对于上述Survivin阳性的原代肿瘤细胞和细胞株，先用MHC class I抗体(购自美国R&D公司)进行预处理后，再采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性。检测结果如图10所示，表明Survivin阳性的肿瘤细胞杀伤作用不明显，基本未被杀伤，证明该杀伤作用具有MHC Class I限制性，为CTL的杀伤作用的特征。该结果证明被本实施例构建和制备的AAV/Survivin的病毒载体感染的DC所诱导的CTL具有MHC Class I限制性。

综合上述检测结果，证明被本实施例构建和制备携带肿瘤抗原－生存素Survivin特异抗原的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL对Survivin阳性的肿瘤细胞具有较好的疗效，可用于制备抗肿瘤药物。

实施例4、肿瘤治疗的临床实验

应用上述本发明的技术，即将实施例1-3中被AAV/Survivin的病毒载体感染从肿瘤患者分离的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输22例III-IV期Survivn抗原阳性的癌症患者，其中包括6例非小细胞肺腺癌、3例原发性肝癌、8例乳腺癌和5例肠癌。

输注细胞数为1×10⁸-5×10⁸。治疗疗程：12个月，每月2次。治疗效果以患者的影像学检查瘤负荷量减少；血清肿瘤标志物下降50％以及症状改善为判断标准。经过12个月的观察，如下表所示，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在大部分受试患者体内能够发挥一定的疗效，可有效地减少或消除瘤负荷量，降低血清肿瘤标志物水平，甚至恢复正常以及改善症状。患者在治疗过程中，无明显的毒副作用发生。该试验结果表明通过该种技术制备的CTL不仅具有一定的疗效而且安全性较高，可用于制备抗肿瘤药物。

表一、22例III-IV期Survivn抗原阳性的癌症患者治疗后的疗效观察结果

编号

诊断

临床分期

瘤负荷量

血清肿瘤标志物

症状

状况

1

乳腺癌

III

减少

降低

无

2

乳腺癌

III

消失

恢复正常

无

3

乳腺癌

III

消失

恢复正常

无

4

乳腺癌

III

增加

升高

无

死亡

5

乳腺癌

IV/IV

稳定

降低

无

6

乳腺癌

IV

增加

升高

存在

7

乳腺癌

IV

增加

升高

存在

死亡

8

乳腺癌

IV

减少

降低

存在

9

结肠癌

III

消失

恢复正常

无

10

结肠癌

IV

减少

降低

无

11

结肠癌

IV

减少

降低

存在

死亡

12

结肠癌

IV

减少

稳定

无

13

结肠癌

IV

稳定

升高

存在

14

肺癌

III

消失

恢复正常

无

15

肺癌

III

减少

降低

无

16

肺癌

III

减少

恢复正常

无

17

肺癌

III

增加

稳定

存在

死亡

18

肺癌

IV

减少

降低

无

19

肺癌

IV

减少

稳定

存在

死亡

20

肝癌

IV

消失

恢复正常

无

21

肝癌

IV

稳定

降低

无

22

肝癌

IV

稳定

稳定

存在

工业应用性

实验证明，被本发明Survivin重组腺相关病毒rAAV的病毒载体感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的Survivin重组腺相关病毒载体或与本发明Survivin重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物，在恶性肿瘤如肺癌、上皮细胞恶性肿瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌等的临床治疗和应用中具有重要的意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到的重组腺相关病毒载体；所述重组腺相关病毒载体的构建方法包括以下步骤：

1）改建AAV 2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV 2型pBR322质粒中的AAV 2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶 EcoR I和 EcoR V酶切位点的核苷酸序列 CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端的TR序列或者在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

2）将启动子插入步骤1）得到的改建的AAV 2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV2型pBR322质粒；所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子；

3）获取Survivin cDNA；包括以下步骤：31）从Survivin抗原阳性的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板进行PCR扩增，得到所述Survivin cDNA，其核苷酸序列为：

GCAGAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCACCGACGTTGCCCCCTGCCTGGGAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTCTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTCGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGAAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAG；

4）将步骤2）构建的携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒和步骤3）得到的SurvivincDNA分别用限制性内切酶MluI和xbaI进行酶切反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体。

2.一种如权利要求1所述的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入Survivin抗原基因，得到重组腺相关病毒载体；包括以下步骤：

1）改建AAV 2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV 2型pBR322质粒中的AAV 2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶 EcoR I和 EcoR V酶切位点的核苷酸序列 CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端的TR序列或者在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

2）将启动子插入步骤1）得到的改建的AAV 2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV2型pBR322质粒；所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子；

3）获取Survivin cDNA，包括以下步骤：31）从Survivin抗原阳性的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板进行PCR扩增，得到所述Survivin cDNA，其核苷酸序列为：

GCAGAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCACCGACGTTGCCCCCTGCCTGGGAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTCTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTCGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGAAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAG；

4）将步骤2）构建的携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒和步骤3）得到的SurvivincDNA分别用限制性内切酶MluI和xbaI进行酶切反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体。

3.一种如权利要求1所述的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体的相关产品，其特征在于：所述相关产品为Survivin重组腺相关病毒的质粒载体或Survivin重组腺相关病毒的病毒载体；所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体由权利要求1所述的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述Survivin重组腺相关病毒的病毒载体由所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。

4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体的相关产品的制备方法，其特征在于：

Survivin重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如权利要求1所述的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的培养基进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到Survivin重组腺相关病毒的质粒载体；

Survivin重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到Survivin重组腺相关病毒的病毒载体。

5.一种如权利要求1所述的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或权利要求3所述的相关产品在制备抗肿瘤药物中的应用。