CN105085677B - 抗vegfr2人源纳米抗体ntv1及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗VEGFR2人源纳米抗体，包括框架区和互补决定区，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明还提供一种制备抗VEGFR2纳米抗体药物的制备方法，包括以下步骤：a.采用噬菌体展示技术筛选与VEGFR2结合的纳米抗体；b.纳米抗体的表达纯化；c.采用AlphaScreen技术测定抗原和抗体间的相互作用，进一步筛选出的亲和力最高的抗体。本发明得到具有更高亲和力和良好抗肿瘤活性的人源纳米抗体NTV1。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的VEGFR2纳米抗体蛋白，成功研发人源抗VEGFR2纳米抗体药物，开辟了靶向VEGFR2抗体的药物研发的新领域。

Description

抗VEGFR2人源纳米抗体NTV1及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及一种VEGFR2纳米抗体、该抗体的制备方法以及该抗体在制备抗癌症药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，截止2012年，全世界有超过820万人死于癌症，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。但是肿瘤的治疗仍然是当今医学界的难题，研究人员一直在寻找肿瘤治疗的新方向。通过研究肿瘤发现，血管生成是肿瘤发生、发展的必要条件，而血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)作为血管生成关键因子VEGF的受体也成为抗肿瘤药物的靶向的研究热点。

肿瘤血管为肿瘤的生长提供了充足的营养供给，同时也促进了癌细胞的扩散和转移。VEGF是主要作用于血管内皮细胞的生长因子，具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能。已有研究证实VEGF的高表达与实体肿瘤的形成及其转移、风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病性视网膜病变、动脉硬化等疾病有着密切关系。VEGF通过与血管内皮细胞膜上的特异性受体VEGFR结合来激活信号传导。VEGFR家族的成员包括：VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。它们均为跨膜蛋白，由胞外的7个免疫球蛋白样的功能域、胞内的酪氨酸激酶功能域和中间的一段跨膜序列组成。其中VEGFR2定位于人4q11-12，由1356个氨基酸构成，可促进血管内皮细胞增殖、迁移及增加毛细血管通透性。研究已经证实，肿瘤血管内皮细胞的有丝分裂与肿瘤微血管的渗透性主要是通过VEGF与VEGFR2的相互作用而发生的。VEGFR2在健康的成人身体内表达水平很低甚至不表达；而在许多肿瘤中，例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、肝细胞癌、成血管细胞瘤、脑胶质瘤等的肿瘤血管内皮细胞中是高表达的。另外，VEGFR2胞外区部分缺失实验证实：VEGF主要是通过与VEGFR2胞外的I-III区特异性结合来发生信号传导的。

自从Kohler和Milstein发明杂交瘤技术制备单克隆抗体以来的几十年中，抗体已被广泛应用于临床疾病的诊断和治疗。目前治疗性单克隆抗体药物已经成为生物制药中增长最快的领域，单抗药物以靶向性强、疗效明确、副作用小等优势在自身免疫性疾病、癌症等领域应用广泛。其中，抗肿瘤血管生成抗体具有靶向性、特异性、专一性等特性，能特异性阻断肿瘤血管的发生发展，降低对其他组织的杀伤作用。目前用于临床的抗肿瘤血管生成的抗体药物贝伐单抗(bevacizumab，Avastin)于2004年被美国FDA批准用于非小细胞肺癌的治疗，并在其他肿瘤的治疗中表现出良好的疗效。然而，由于其对VEGFR1和VEGFR3的也有抑制作用，全面阻断了VEGF介导的相关信号通路，导致患者出现高血压、鼻出血、蛋白尿等严重不良反应。骆驼体内天然存在缺失轻链的重链抗体，其可变区是最小的功能性抗原结合片段。一般来说，这类抗体的相对分子质量为15KDa，仅为常规抗体的1/10，其分子高度为4.8nm，直径为2.2nm，故称为纳米抗体(nanobody)。纳米抗体作为最小的功能性抗原结合片段，独特的生物学结构特征赋予了它们许多优势，如稳定性强、可溶性好、免疫原性低、容易表达等等。纳米抗体含有3个互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)。从纳米抗体的立体结构发现，较长的CDR3与相邻的CDR1或CDR2由二硫键连接成环来稳定构象。传统抗体Fab片段及单链抗体ScFv抗体的抗原结合区形成凹形的或平面结构，只能识别位于抗原表面的位点，而重链抗体的CDR3较长，可形成稳定的大凸环结构，深入具有裂缝凹陷结构的抗原内部，例如酶的活性位点、病毒与宿主细胞结合位点等。因此纳米抗体具有更加广泛的抗原结合力。其次，纳米抗体的CDR1区和骨架区存在半胱氨酸残基(Cys)，可以和CDR3区中的Cys残基形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和结构变化。另外，纳米抗体具有分子量小、穿透力较强并且可以制备成多功能抗体或者携带化药等特点，使得这类抗体在对实体瘤和需要穿过血脑屏障疾病的治疗中具有显著优势。除此之外，随机突变及噬菌体展示等技术的引入也使得纳米抗体文库的构建及特异性纳米抗体的筛选过程变得更加便捷、高效。VEGFR2是最重要的药物靶点之一，具有广阔的研发前景和重要的现实意义。然而，传统抗体亲和力成熟、蛋白表达纯化和生物效应的技术瓶颈严重的限制了VEGFR2抗体药物的研发。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种具有高亲和力和良好抗肿瘤活性的、高效、毒副作用低且易于生产的抗VEGFR2人源纳米抗体。

本发明另一方面的目的是提供一种制备上述抗体的方法。

本发明又一方面的目的是提供上述抗体在制备用于治疗抗肿瘤药物中的用途。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供一种抗VEGFR2人源纳米抗体，包括框架区和互补决定区，其特征在于，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种制备抗VEGFR2纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

a.采用噬菌体展示技术筛选出与VEGFR2结合的纳米抗体，并通过基因比对分析，挑选出重复最高的序列；

b.将上一步筛选出的纳米抗体重新构建于表达载体中，并采用原核细胞表达系统表达，获得高纯度蛋白；以及

c.采用AlphaScreen技术从上一步筛选出的纳米抗体中进一步筛选出的亲和力最高的抗体。

下面对上述步骤进行更详细的描述。

a.采用噬菌体展示技术筛选与VEGFR2结合的纳米抗体

优选地，首先采用生物淘选技术筛选阳性噬菌体，并将阳性克隆在宿主菌TG1中扩增富集；然后进行阳性克隆DNA序列测定、基因比对分析，从中挑选出重复最高的序列。

更优选地，首先采用液相淘选技术将抗原固定在磁珠表面，加入含有人源纳米抗体库的结合液中，筛选阳性噬菌体，并将阳性克隆在宿主菌TG1中扩增富集，优选地，所述扩增进行4轮；然后在最后两轮淘选中随机挑选阳性克隆进行基因测序及基因比对分析，从中挑选出重复次数最高的序列。

b.纳米抗体的表达纯化

优选地，将挑选出的序列应用Not I和BamH I限制性内切酶及DNA重组技术将酶切后的PCR扩增产物插入携带6His-sumo标签的酶切线性化的pET载体中，构建表达质粒；将质粒转化至宿主菌中培养至对数期，诱导表达；收集细菌沉淀，超声法充分裂解细菌，取上清，为粗提蛋白；粗提蛋白经过镍亲和柱及分子筛柱，得到纯化蛋白样品；用电泳检测目的蛋白的表达，对出现频率较高的克隆进行原核系统表达纯化。

c.纳米抗体亲和力筛选优选地，采用AlphaScreen技术测定抗原和抗体间的相互作用，进一步筛选出的亲和力最高的抗体。

本发明还提供以上所述的抗VEGFR2人源纳米抗体在制备用于抗癌症药物中的用途。

其中，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、肝细胞癌、成血管细胞瘤、脑胶质瘤。

本发明人通过深入研究VEGFR2乃至整个VEGFRs受体家族配体识别和受体活化的机制，首次采用噬菌体展示技术筛选出富集人源化纳米抗体并对其进行基因测序及蛋白表达纯化；进一步通过AlphaScreen技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体；得到了具有更高亲和力和良好抗肿瘤活性的人源纳米抗体NTV1。通过表面等离子共振(SPR)技术表征该抗体的动力学行为；细胞实验验证了其抑制血管内皮细胞增殖能力及抑制血管新生活性。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的VEGFR2纳米抗体蛋白，成功研发人源抗VEGFR2纳米抗体药物，开辟了靶向VEGFR2抗体的药物研发的新领域，具有深远的社会意义和广阔的临床应用前景。并且，本发明为相关后续药物研发提供了基础，可以据此研发携带化药或者融合Fc的抗体以增加疗效。

附图说明

图1：显示NTV(1-4)四种纳米抗体氨基酸序列比对。将抗体的基因序列翻译成氨基酸序列，进行多序列比对。未标记的是互补决定区，标记的是框架区。

图2：显示NTV(1-4)蛋白的表达纯化。10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度，标准分子量标在凝胶左侧。从左到右分别为NTV1、NTV2、NTV3、NTV4。

图3：AlphaScreen检测VEGFR2D3和NTV(1-4)之间的反应。(A)AlphaScreen反应示意图，(B-E)NTV1、NTV2、NTV3、NTV4与VEGFR2D3反应的AlphaScreen检测结果。图4：SPR分析NTV1和VEGFR2D3反应动力学。

图5：NTV1对人脐静脉细胞增殖的效应。

图6：NTV1体外抑制HUVEC血管形成效应。

具体实施方式

以下实施例和实验例所用实验仪器和实验材料信息如下：

试剂及试剂盒

质粒小提试剂盒 百泰克

PCR产物回收试剂盒 百泰克

琼脂糖凝胶回收试剂盒 百泰克

琼脂糖生工

蛋白胨sigma

酵母提取物 sigma

Tris-base sigma

生物素 sigma

咪唑 sigma

内切酶BamH1NEB

内切酶Not1 NEB

T4 DNA连接酶Fermentas

Q5-High Fidelity DNA polymerase NEB

麦芽糖 sigma

噬菌体展示库HuSdLTMCreative BioLabs

辅助噬菌体M13K07 helper phage GE Healthcare

磁珠MyOne^TM Streptavidin C1 life technologies

IPTG 生工

PEG8000 sigma

SDS sigma

Tween-20 国药

Biotin CAPture Kit Series S GE Healthcare

Alphascreen Histidine Detection Kit Perkin Elmer

仪器设备

AKTA FPLC系统(GE)

NanoVue spectrophotometer(GE)

centrifuges 5415R(Eppendorf)

Sorvall RC 12BP centrifuge(Thermo)

avanti J-26xp(BECKMAN COULTER)

Incubator/shaker for2L bacterial cultures(Thermo)

层析冷柜(北京德天佑)

PCR machines(Eppendorf)

高压细胞破碎仪

紫外分光光度计(BECKMAN COULTER)

Biorad imager(BIA-Rad)

纯水仪(Milli-Q)

超净工作台(AIRTECH)

高压蒸汽灭菌锅(MIURA)

移液枪(器)(Eppendorf)

Biacore T200(GE Healthcare)

Envision酶标仪(PerkinElmer)

CO2培养箱(Thermo)

平底细胞培养板(Nunclon Denmark)

晶体成像仪(FORMULATRIX)

Art Robbins Instruments(PHOENIX)

晶体培养箱(Molecular Dimensions)

显微镜(OLYMPUS)

恒温摇床(伊孚森生物技术有限公司)

制备实施例

本实施例提供一种制备抗VEGFR2纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

a.采用噬菌体展示技术筛选抗体

将biotin-VEGFR2融合抗原包被在磁珠表面，4℃孵育2小时。PBS洗3次后，用含2％脱脂奶粉的PBS于37℃封闭1小时。将容量为1×10¹²克隆数的人源纳米抗体噬菌体抗体库加至封闭后的免疫管中，37℃结合1小时。用PBST洗10次，PBS洗5次。加入1mL甘氨酸洗脱缓冲液(pH2.2)，室温摇动10min，吸出洗脱液，用Tris中和至pH7.4。吸出洗脱液用10倍体积的TG1室温感染10min，测定滴度并转入37℃加辅助噬菌体M13KO7振摇培养过夜。以上过程进行四轮。从而筛选出对VEGFR2有亲和力的纳米抗体。随机从最后两轮筛选后的培养板上挑选300个克隆，进行基因测序及基因比对。挑选出序列重复次数较高的克隆备用。实验结果显示：共得到8个可能与VEGFR2结合的纳米抗体，经基因比对发现，8个克隆中NTV1和NTV2出现的频率最高，且每个序列互补决定簇保守性不高(如表1和图1所示)。提示噬菌体展示技术可以筛选出与VEGFR2结合的纳米抗体。

b.纳米抗体的表达纯化

将挑选出的序列应用Not I和BamH I限制性内切酶及DNA重组技术将酶切后的PCR扩增产物插入携带6His-sumo标签的酶切线性化的pET载体中，构建表达质粒。以筛选出的序列基因(即NTV1-4)为模版，引入BamH1、Not1酶切位点，将目的基因引入携带6His-sumo标签的Pet-duet表达载体中，构建表达质粒。将切胶回收的NTV1-4基因片段与载体按摩尔比5:1建立10μl连接体系，T4DNA连接酶25℃连接10min。将连接产物转入感受态细胞TOP10，取150μl转化后的菌液涂布于含50μg/ml Amp的LB固体培养基平板，37℃倒置静置培养过夜。挑取克隆，参照以上步骤将表达质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，次晨收LB平板。将100ml灭菌LB液体培养基装入250ml摇瓶，挑取LB平板上的BL21菌株单克隆至其中，37℃，180rpm/min震荡培养过夜；测过夜培养的菌液OD值，接种至4×2L LB(OD值0.15)摇瓶中，24℃，180rpm/min震荡培养；约4小时后测其OD600，当其至0.6～0.8之间时，将摇床温度调至16℃，降温并继续培养至OD值为0.8～1.2之间；加入IPTG(0.5M)，至最终浓度为50～100μM，16℃诱导过夜(16～18h)，离心收集菌体沉淀(4000rpm/min，30分钟)；每2L菌液用30ml HisBuffer A充分混悬后转移至50ml离心管中，冰浴。用高压破碎仪破碎细胞。16000rpm/min,高速离心20分钟，收集上清即为粗提蛋白。将粗提蛋白过镍柱。将镍柱装上FPLC系统，设定洗脱程序进行蛋白洗脱。将收集到的蛋白浓缩至适当的体积(略大于10ml)，过分子筛柱进一步纯化目的蛋白，得到纯化蛋白样品。用12％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。对出现频率较高的克隆NTV1-4进行原核系统表达纯化，如图2所示，结果提示采用本方法可以得到均一稳定的蛋白。

c.采用AlphaScreen进行进一步筛选及并采用SPR技术测定纳米抗体与VEGFR2的亲和力

由于通过生物淘选技术富集到的阳性克隆可能出现假阳性的结果，故应用AlphaScreen技术从上一步筛选出的抗体中进一步筛选出与VEGFR2亲和力最高的纳米抗体。取1mg发光微粒及含有抗原或抗体反应液分别加入离心管，常温避光孵育1h。将两种微粒混合(浓度为20nM、50nM、100nM、200nM的biotin-NTV(1-4)和His8-VEGFR2D3等比例混合)，孵育15min后在纳米均相时间分辨荧光检测仪中检测光信号，每个浓度重复三次。AlphaScreen检测结果如图3所示，可见采用AlphaScreen技术进一步筛选出了与VEGFR2亲和力最高的纳米抗体NYV1。

应用基于表面等离子体共振技术的BIAcore T200系统研究纳米抗体与VEGFR2的结合能力。在CAP传感器芯片上设置2个通道，一个偶联VEGFR2作为检测通道，另一个不固定VEGFR2作为空白参比通道。以HBS溶液作为工作液，流速为2μL/min；活化与封闭芯片；再以2μL/min2的流速分别以梯度浓度进样纳米抗体，每个浓度级别检测2次；获得结合动态图谱，拟合处理后用软件模块进行参数计算。如图4所示，注射浓度为10μM生物素化的NTV1，使信号达到3500RU左右，将浓度为20nM、60nM、180nM、550nM、1.6μM、5μM的VEGFR2D3流过芯片表面，根据信号变化绘制动力学曲线。通过Biacore T200评估软件计算结合常数(ka)和解离常数(kd)。由kd/ka得到解离平衡常数(K_D)。SPR技术确证了NTV1与VEGFR2的结合能力，其解离常数(K_D)为4.9nM，提示纳米抗体NTV1与VEGFR2具有很高的亲和力，推测其可能具备抗肿瘤功能。

实验例：纳米抗体生物活性测定

本实验例采用MTT实验测定纳米抗体的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞增殖能力，使用微管形成实验测定纳米抗体对HUVECs血管新生的影响。

MTT实验：用HUVECs细胞专用的培养基(5％FBS-ECM)在37℃孵育HUVECs24小时后加入相应浓度的纳米抗体，继续孵育72小时后在细胞培养板中加入MTT染料，4小时后用酶标仪570nm下读取吸光度。

将浓度为1nM、10nM、100nM和1000nM的NTV1加到HUVECs浓度为5×10³细胞/孔的96孔板中，72小时后于570nm波长处读数，设置空白对照。每个浓度重复3次，计算标准差，进行P<0.05的统计学分析，结果如图5所示。由图5可以看出，与对照组相比较，NTV1在浓度为10nM、100nM、1000nM时对HUVECs增殖具有显著的抑制作用，且呈现剂量依赖的关系。

微管形成实验：将4.5×10³HUVECs接种到预先铺被了Geltrix的96孔板中37℃孵育过夜。次日取培养板在倒置显微镜下观察各个孔微管生成情况。

将浓度为0nM、10nM、100nM、1000nM的NTV1加到HUVEC浓度为4.5×10³细胞/孔的96孔板中过夜孵育，用倒置显微镜对内皮细胞官腔形成拍照分析，100倍放大进行人工计数，未加NTV1的作为对照组，计为100％。每个浓度重复3次，计算标准差，进行P<0.05的统计学分析。结果如图6所示，与空白对照相比较(0nMNTV1)，NTV1在100nM、1000nM浓度下，可显著抑制内皮细胞官腔的形成，且随着浓度的升高，该抑制作用有变大的趋势。

上述体外实验表明NTV1可有效抑制HUVECs细胞增殖及微血管生成。

以上实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种抗VEGFR2人源纳米抗体，包括框架区和互补决定区，其特征在于，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的抗体在制备抗癌症药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、肝细胞癌、成血管细胞瘤和脑胶质瘤。