CN105085613B - 新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途。具体地，本发明提供了对硫链丝菌素侧链的喹那啶酸部分进行甲基取代而获得硫链丝菌素类似物。所获得的硫链丝菌素类似物比硫链丝菌素在抗菌活性和水溶性方面均有显著提高。

Description

新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途

技术领域

本发明属于药物领域和生物技术工程领域，具体地，本发明涉及一类新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途。

背景技术

硫肽类抗生素是一类富含硫元素、结构被高度修饰的大环聚肽类天然产物，迄今已有大约100个天然成员被发现[Chem.Rev.,2005,105,685；Plos One2012,7,e45878]。这类抗生素选择性的作用于细菌的核糖体，从而抑制其蛋白质的合成[Bioorg.Med.Chem.Lett.,2004,14,5573；J.Nat.Prod.,2009,72,841；J.Am.Chem.Soc.,2008,130,12102]；此外，其强烈的抗疟、抗肿瘤以及免疫抑制等活性也被陆续报到[Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51,12414]。如何通过结构的衍生克服其理化性质的缺陷(水溶性差导致的生物利用度低等)以满足临床应用的需要成为了硫肽类抗生素当前研究的重点之一。

硫链丝菌素(Thiostrepton)是硫肽类抗生素家族中较早发现的成员之一，由于其优良的抗菌活性，很早就在工业上得到广泛的应用。但是由于其结构复杂，直到1989年才借助X晶体衍射技术最终确定了其分子结构。结构上，硫链丝菌素除了具有硫肽类抗生素的特征大环骨架外，还具有一个特殊的喹哪啶侧环，因此合成途径非常复杂。即使是在有机合成化学高度发达的今天，通过化学全合成来获得产品也是一项艰巨的挑战。直到2004年才首次报道了硫链丝菌素的化学全合成[Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,5087；Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,5092],但是整个合成过程操作繁琐，产率低下。

为了提高硫链丝菌素的抗菌活性以及其它特性，本领域一直在尝试开发硫链丝菌素的各类衍生物或类似物，然而迄今为止尚未成功开发出具有活性更高等优点的硫链丝菌素类似物。因此，本领域迫切需要开发各类新型的硫链丝菌素类似物。

发明内容

本发明的目的是提供一类具有更高活性的新型硫链丝菌素类似物。

本发明的另一个目的是提供所述的硫链丝菌素类似物的制法和用途。

本发明的另一目的是提供了一种用于制备硫链丝菌素类似物的突变合成元及其制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了一种硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述硫链丝菌素类似物具有式I所示的结构：

式中，R₁为未取代的或取代的C1-C6烷基，其中所述的取代指具有选自下组的取代基：卤素、NH₂、OH、NO₂、或CF₃；R₂为H或F；R₃为H或F。优选地，所述R为未取代的C1-C6烷基。所述C1-C6烷基指C1、C2、C3、C4、C5、C6烷基。

在另一优选例中，所述R₁为未取代的或取代的甲基、乙基或丙基，其中所述的取代指具有选自下组的取代基：卤素、NH₂、OH、NO₂、或CF₃。优选地，所述R₁为未取代的甲基、乙基或丙基。

在另一优选例中，所述R₁为未取代的或取代的甲基。优选地，所述R₁为未取代的甲基。

在另一优选例中，所述硫链丝菌素类似物具有式Ia所示的结构：

本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐的用途，所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐被

(a)用于制备抗菌的组合物；

(b)用于抑制微生物生长的组合物；

(c)用于制备治疗微生物或细菌感染的组合物；和/或

(d)用作饲料添加剂。

本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制微生物生长或者杀灭微生物的方法，包括步骤：在需要处理的场所使用本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐。

本发明的第五方面，提供了一种制备药物组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体进行混合，从而形成药物组合物。

本发明的第六方面，提供了一种治疗动物细菌感染的方法，包括步骤：给需要治疗的动物使用本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐或本发明第二方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的动物包括：哺乳动物、家畜(如牛、猪、羊等)、家禽(如鸡、鸭、鹅等)、水产养殖的动物。

本发明的第七方面，提供了一种制备饲料组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合，从而形成含有硫链丝菌素类似物或其盐的饲料组合物。

在另一优选例中，所述饲料组合物用于家畜(如牛、猪、羊等)养殖、家禽(如鸡、鸭、鹅等)养殖或水产养殖中。

本发明的第八方面，提供了一种可用于产生本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)突变菌株，其特征在于，所述的菌株中硫腺苷甲硫氨酸转移酶(TsrT)被失活或敲除。

本发明第九方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物的方法，包括步骤：

(a)用突变合成元饲喂权利要求7所述的劳伦链霉菌(Streptomycin laurentii)

突变菌株，从而产生权利要求1所述的硫链丝菌素类似物；和

(b)从发酵产物中分离出所述的硫链丝菌素类似物。

在另一优选例中，所述的突变合成元具有式II所示的结构：

式中R₁、R₂、R₃如上所述；R₄为未取代的或取代的C1-C5烷基或C7-C8芳基。在另一优选例中，所述R₄选自甲基、乙基、正丙基、苄基和正丁基。

在另一优选例中，所述的突变合成元具有式IIa所示的结构：

在另一优选例中，所述的突变合成元具有式IIb所示的结构：

本发明第十方面，提供了一种制备具有式II所示突变合成元的方法，包括步骤：

(a)式III化合物与醇R₁OH进行反应，生成式IV化合物；

(b)式IV化合物与RCH₂CHO进行反应，生成式II所示的突变合成元；

式中，R₁、R₂、R₃、R₄如上所述。

在另一优选例中，所述R₁CH₂CHO为丙醛。

在另一优选例中，步骤(a)所述的醇R₄OH任选自下组：甲醇、乙醇、正丙醇或正丁醇。

在另一优选例中，步骤(a)所述的反应在二氯亚砜作用下反应。

在另一优选例中，步骤(b)所述的反应在三氟乙酸、硫酸铁和双氧水的作用下反应。

本发明第十一方面，提供了一种化合物，所述化合物具有式II所示的结构，

式中，R₁、R₂、R₃、R₄如上所述。

在另一优选例中，所述化合物用作制备式I所示化合物的中间体。

本发明的第十二方面，提供了一种具有式II所示突变合成元的用途，所述突变合成元用于制备本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定本发明的范围。

图1表示突变合成元4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯的化学合成路线。

图2为喹啉-2-羧酸甲酯的¹H NMR(500MHz,CDCl₃)。

图3为喹啉-2-羧酸甲酯的¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)。

图4为4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯的¹H NMR(500MHz,CDCl₃)。

图5为4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯的¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)。

图6为12'-甲基-硫链丝菌素的¹H NMR(400MHz,CDCl₃：CD₃OD＝4:1)。

图7为12'-甲基-硫链丝菌素的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃：CD₃OD＝4:1)。

图8为12'-甲基-硫链丝菌素的gHMBC(400MHz,CDCl₃：CD₃OD＝4:1)。

图9为12'-甲基-硫链丝菌素的gCOSY(400MHz,CDCl₃：CD₃OD＝4:1)。

图10为12'-甲基-硫链丝菌素的gHSQC(400MHz,CDCl₃：CD₃OD＝4:1)。

图11表示通过喂养突变株SL1102获得12'-甲基-硫链丝菌素的HPLC分析结果，其中，图11A为野生型Streptomyces laurentii ATCC31255的发酵结果；图11B为突变株SL1102的负对照的发酵结果；图11C为突变株SL1102与4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯共同发酵产生12'-甲基-硫链丝菌素的发酵结果。

图12为斑马鱼幼鱼、成鱼感染海分支杆菌的动物模型实验结果。图12中，A显示了幼鱼感染海分支杆菌后(尾静脉注射)不同抗生素给药的作用效果；B显示了不同抗生素作用下的幼鱼生存曲线(每组10只)；C图显示了成鱼感染海分支杆菌(腹腔注射)后，不同抗生素给药治疗，感染部位组织切片情况；D图显示了不同抗生素作用下成鱼的生存曲线(每组20只)。

符号说明

图1中，TFA：三氟乙酸

图11中，TSR：硫链丝菌素；12'-Me-TSR:12'-甲基-硫链丝菌素。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对硫链丝菌素生物合成基因簇的克隆以及生物合成机制的研究，利用突变生物合成方法，意外地发现，当用甲基取代硫链丝菌素4-乙酰上的H时，制备的硫链丝菌素衍生物，不仅生物活性比母体化合物生物活性有所提高，而且水溶性提高了1倍。在此基础上完成了本发明。

值得说明的是，在本发明人对硫链丝菌素结构改造的研究过程中，发现当硫链丝菌素类似物的水溶性增加时，一般情况下其生物活性很难提高，甚至还会有很大程度的降低。

活性成分

如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明化合物”和“本发明的硫链丝菌素类似物”可以互换使用，都指甲基取代的硫链丝菌素，如式I所示的12'-甲基-硫链丝菌素。

应理解，所述术语还包括本发明化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

一类优选的硫链丝菌素类似物具有下式I所示的结构式：

式中，R₁、R₂、R₃、R₄如上所述。

在另一优选例中，所述硫链丝菌素类似物具有式Ia所示的结构：

如本文所用，术语“12'-Me-TSR”表示12'-甲基-硫链丝菌素，其结构式如式Ia所示。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。可以由阳离子与本发明化合物上的带电荷基团(例如氨基)形成盐。合适的阳离子包括氢离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子。适合形成盐的碱包括但并不限于：碱金属和碱土金属的氢氧化物(如NaOH、KOH)、碱金属和碱土金属的氧化物、碱金属和碱土金属的碳酸盐(如Na₂CO₃)、氨水等。

本发明人不仅通过对甲基取代硫链丝菌素的大量发酵以及分离纯化，确证了化合物的结构。此外，通过抗菌活性实验证实了，本发明的甲基取代硫链丝菌素比硫链丝菌素的抗菌活性有显著提高；通过水溶性实验证实了，本发明的甲基取代的硫链丝菌素比硫链丝菌素的水溶性有显著提高。

本发明化合物除了抗菌的活性成分用于制备药物以及作为饲料添加剂用于制备饲料组合物之外，本发明化合物还可用作制备其他硫链丝菌素类似物的中间体，可用于进一步化学衍生产生其他硫链丝菌素的类似物。

突变合成元

如本文所用，术语“突变合成元”指参与本发明甲基取代硫链丝菌素生物合成的化合物，其中所述的化合物具有式II所述的结构。此化合物被用于合成或制备本发明的硫链丝菌素类似物，可以自行制备。

本发明还提供了一种制备具有式II所示突变合成元的方法，包括步骤：

(a)式III化合物与醇R₁OH进行反应，生成式IV化合物；

(b)式IV化合物与RCH₂CHO进行反应，生成式II所示的突变合成元；

式中，R₁、R₂、R₃、R₄如上所述。

在另一优选例中，所述R₁CH₂CHO为丙醛。

在另一优选例中，步骤(a)所述的醇R₄OH任选自下组：甲醇、乙醇、正丙醇或正丁醇。

在另一优选例中，步骤(a)所述的反应在二氯亚砜作用下反应。

在另一优选例中，步骤(b)所述的反应在三氟乙酸、硫酸铁和双氧水的作用下反应。

出发菌株

如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指编号为ATCC31255的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)。本发明的出发菌株保存在美国模式培养物寄存库(ATCC)，编号为Streptomyces laurentii ATCC31255。应理解，出发菌株不仅包括编号为Streptomyces laurentii ATCC31255的菌株，还包括其衍生菌株。

工程菌株

本发明还提供了可用于生产本发明化合物的工程菌。

在本发明的一个优选例中，提供了一种生产本发明硫链丝菌素类似物的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)突变菌株，其中，所述的菌株中硫链丝菌素生物合成基因簇中的硫腺苷甲硫氨酸转移酶基因(tsrT)敲除。该工程菌株的制备方法可以参见中国专利申请，申请号：2011103591762。

活性成分的制备

本发明提供了一种制备式I化合物的方法，包括步骤：

用式II化合物对经基因改造的工程菌株进行饲喂；

从培养基中提取式I化合物。

离心弃去上清液，丙酮浸泡菌体，过滤除去不溶物，滤液经减压浓缩抽干，获得的膏状物先用100-200目硅胶预装的正相柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，收集式I化合物的流出液，最终得到目标产物。

本发明人通过对式I化合物的大量发酵以及分离纯化确证了化合物的结构；通过抗菌活性实验证实了本发明的活性化合物比硫链丝菌素的抗菌活性有显著的提高；通过水溶性实验证实了本发明的活性化合物比硫链丝菌素的水溶性有显著的提高。

药物组合物和施用方法

本发明化合物具有优良的抑菌(抗菌)活性，因此可用作抗菌素(或抗生素)，且其性质有助于制成注射剂。

本发明化合物可施用于哺乳动物(如人)，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部等方式给药。所述化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。需要指出，本发明的化合物可以混合给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他活性成分(如抗生素)联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的个体而言，日给药剂量通常为1～1000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、个体健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

饲料添加剂和饲料组合物

本发明还提供了本发明化合物在饲料领域中的应用。本发明化合物因为具有优良的抗菌和抑菌性，非常适合作为饲料添加剂。

本发明还提供了一种制备饲料组合物的方法，包括步骤：将本发明化合物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合，从而形成含有硫链丝菌素类似物(或其盐)的饲料组合物。

本发明的主要优点包括：

(a)提供了一种具有式I结构的新颖的、具有活性更高等优点的硫链丝菌素类似物。

(b)以本发明的硫链丝菌素类似物为基础，有助于制备其他类型硫链丝菌素衍生物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本发明的内容。

实施例1突变合成元4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯的合成

1.喹啉-2-羧酸甲酯的合成

将10mmol喹啉-2-羧酸溶解于10ml甲醇中，在冰水浴下缓慢滴入0.92ml二氯亚砜，缓慢升温至室温，加热回流12小时。反应液冷却至室温，小心倾倒入碳酸氢钠的饱和液中，然后用二氯甲烷多次萃取。萃取液合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经柱分离得产品1.59克，产率为85％。

对喹啉-2-羧酸甲酯进行NMR鉴定，鉴定结果如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.32(d,J＝8.5Hz,1H),8.21(d,J＝8.5Hz,1H),7.89(dd,J＝8.0,1.0Hz,1H),7.80(ddd,J＝8.5,7.0,1.5Hz,1H),7.66(ddd,J＝8.0,7.0,1.0Hz,1H),4.10(s,3H)(图2)。

¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ166.0,147.9,147.6,137.4,130.8,130.4,129.4,128.7,127.6,121.1,53.3(图3)。

2.4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯的合成

将0.38克硫酸亚铁加入到50ml丙醛溶液中，丙醛溶液中含有10.0mmol喹啉-2-羧酸甲酯和0.97ml三氟乙酸。在冰水浴条件下，缓慢加入30％双氧水5.5ml，30分钟后再次加入30％双氧水5.5ml，继续反应90分钟。缓慢升温至室温，以5％的硫代硫酸钠溶液终止反应，再加入饱和碳酸氢钠溶液中和剩余的三氟乙酸。用乙酸乙酯多次萃取水相，萃取液经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩后，经柱分离，获得产品4-丙酰-2-喹啉酸甲酯共1.95g,产率为80％。

对4-丙酰-2-喹啉酸甲酯进行NMR鉴定，鉴定结果如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.35～8.33(m,2H),7.82(ddd,J＝8.3,6.9,1.4Hz,1H),7.73～7.70(m,1H),4.10(s,3H),3.11(q,J＝5Hz,2H),1.29(t,J＝5Hz,3H)(图4)。

¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ203.9,165.4,148.5,147.47,144.6,131.1,130.6,130.2,128.7,125.3,118.9,53.4,35.7,7.9(图5)

LC-MS(EI⁺)m/z244.20[M+H]⁺.

突变合成元4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯的合成流程见图1。

NMR和LC-MS结果表明，本发明人成功合成了突变合成元4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯。

实施例2工程菌株的构建及发酵产物分析

突变株SL1102的构建过程请参见专利公布号为CN103102396A的中国发明专利文献。

发酵产物分析

分别将野生型Streptomyces laurentii ATCC31255和突变株SL1102进行发酵，发酵条件如下：

野生型Streptomyces laurentii ATCC31255发酵；突变株SL1102不加4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯发酵；和突变株SL1102用4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯饲喂发酵。

发酵产物分别用HPLC进行分析，结果如下：

图11表示通过喂养突变株SL1102获得甲基代硫链丝菌素的HPLC分析。图11A为野生型Streptomyces laurentii ATCC31255的发酵结果；图11B为突变株SL1102(突变株ΔTsrT)的负对照(无4-并酰-喹啉-2-羧酸甲酯)的发酵结果；图11C为突变株SL1102与4-并酰-喹啉-2-羧酸甲酯共同发酵产生12'-甲基-硫链丝菌素的发酵结果。

结果表明，野生型菌株能够正常产生TSR，不加突变合成元的突变株既不产硫链丝菌素，也不产12'-甲基-硫链丝菌素；而用突变合成元饲喂的突变株具有合成12'-甲基-硫链丝菌素的能力。

实施例312'-甲基-硫链丝菌素的发酵、检测、分离纯化和结构鉴定

将突变株ΔTsrT接种于50ml预发酵培养基中(含TSB15g/L，可溶性淀粉15g/L，蔗糖50g/L)，28℃培养48小时。将5ml预发酵菌液接种于50ml发酵培养基中(含TSB15g/L，硫酸钙15g/L，酵母提取物11g/L，葡萄糖50g/L，七水磷酸氢二钾0.05g/L，七水硫酸镁0.1g/L，硫酸钠0.2g/L，七水硫酸锌0.001g/L，七水硫酸亚铁0.002g/L，碳酸钙0.3g/L)并加入突变合成元4-丙酰-喹啉-2-羧酸甲酯至终浓度为0.2mmol，28℃，250rpm下培养。培养120小时后处理发酵液和菌丝。

离心后上清弃去，菌体用丙酮浸泡过夜，过滤除去不溶物，滤液经减压蒸馏抽干得深褐色膏状物。膏状物第一步进行粗分，用100-200目硅胶预装的正相柱，梯度洗脱条件见表1。

表1

甲基代硫链丝菌素出现在95％二氯甲烷/5％甲醇的洗脱部分中，将洗脱液减压抽干，溶于10ml甲醇，然后进行HPLC制备。

HPLC的制备条件为：

仪器：Agilent1100HPLC系统

柱子：Agilent ZORBAX SB-C18column(9.4x250mm,PN880975-202)

检测波长：UV＝254nm

流动相：A＝H₂O；B＝CH₃CN

流速：3ml/min。

流动相梯度配比为见表2。

表2

时间(min)	A％	B％
			0	40	60
20	40	60

按上述的HPLC的洗脱条件，收集12'-甲基-硫链丝菌素的流出液，最终得到目标产物。对目标产物进行鉴定，结果如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃:CD₃OD＝4:1):8.83(s,1H),8.32(s,1H),8.31(s,1H),8.22(s,1H),7.60(s,1H),7.59(s,1H),7.31(s,1H),7.07(s,1H),6.89(d,J＝9.9Hz,1H),6.73(d,J＝2.0Hz,1H),6.56(s,1H),6.38(q,J＝6.5Hz,1H),6.37(dd,J＝9.6,5.6Hz,1H),6.24(q,J＝7.0Hz,1H),5.84(s,1H),5.80(d,J＝8.8Hz,1H),5.76(d,J＝9.6Hz,1H),5.70(s,1H),5.63(d,J＝2.0Hz,1H),5.36(s,1H),5.32(d,J＝6.4Hz,1H),5.06～5.04(m,1H),4.96～4.93(m,1H),4.74(q,J＝7.0Hz,1H),4.47(d,J＝3.1Hz,1H),4.43～4.39(m,1H),4.10(m,1H),3.83(q,J＝6.5Hz,1H),3.82～3.80(m,1H),3.68(m,1H),3.62～3.60(m,1H),3.17(t,J＝12.0Hz,1H),2.32(m,1H),2.96～2.93(m,2H),2.98(d,J＝4.6Hz,1H),1.92(m,1H),1.74(q,J＝6.6Hz,3H),1.64～1.60(m,2H),1.63(d,J＝7.0Hz,3H),1.55～1.53(m,1H),1.46(d,J＝7.0Hz,3H),1.32(d,J＝6.6Hz,3H),1.31(d,J＝6.6Hz,3H),1.29(m,2H),1.18(s,3H),1.10(t,J＝6.4Hz,3H),1.00(d,J＝6.5Hz,3H),0.90(t,J＝7.0Hz,3H),0.85(d,J＝6.5Hz,3H)(图6)。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃:CD₃OD＝4:1):174.1,173.9,172.6,170.9,170.7,170.2,169.5,168.6,166.9,166.7,166.1,163.4,162.8,162.7,162.6,162.3,161.4,160.3,157.4,155.1,153.8,150.7,150.5,146.9,144.0,134.7,133.4,132.7,132.6,130.2,129.2,129.0,128.5,128.4,126.3,124.5,123.4,118.9,105.0,104.3,104.0,79.5,77.9,72.2,70.2,68.2,68.1,67.0,66.6,64.8,59.5,58.2,56.3,53.6,52.3,50.1,39.0,35.7,31.1,29.3,23.3,23.0,20.3,19.5,19.4,19.3,16.3,16.2,16.0,12.1,11.0(图7)。

HRMS(m/z)[M+H]⁺测量值为1678.5130(C₇₃H₈₈N₁₉O₁₈S₅计算值为1678.5153)。

图8、图9、图10分为为12'-甲基-硫链丝菌素的gHMBC、gCOSY和gHSQC图谱。

鉴定结果表明，本发明人成功制备了12'-甲基-硫链丝菌素。

实施例4硫链丝菌素类似物的抗菌活性

对12'-甲基-硫链丝菌素、5'-氟-硫链丝菌素、6'-氟-硫链丝菌素和硫链丝菌素进行抗菌活性的测定，方法如下：在96孔板中，将溶于二甲亚砜的12'-甲基-硫链丝菌素、5'-氟-硫链丝菌素、6'-氟-硫链丝菌素和硫链丝菌素分别加入培养基至0.256μg/mL并逐级稀释至0.00025μg/mL。将测试菌加入培养基至10⁷-10⁸cfu/mL(根据0.5McFarland标准)并培养过夜。测试菌不能生长所对应的最小浓度为MIC。

最小抑制浓度(MIC)测试结果显示，12'-甲基-硫链丝菌素、5'-氟-硫链丝菌素、6'-氟-硫链丝菌素的抗菌活性均优于硫链丝菌素(见表3)。

表3

单位:μg/mL；^a革兰氏阳性菌，^b革兰氏阴性菌

从上表中可以看出，本发明的硫链丝菌素类似物，在抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和临床分离得到的多重耐药菌(PRSP、MRSA、VRE等)方面，显著优于天然TSR，其生物活性是TSR的两倍以上。本发明人还首次发现硫链丝菌素及其衍生物对于多粘菌素耐药性革兰氏阴性菌也具有较强的抗菌作用，而早期研究中人们认为硫肽类抗生素对于革兰氏阴性菌是没有抑菌作用的。

实施例5斑马鱼幼鱼、成鱼感染海分支杆菌的动物模型实验

实验结果如图12所示，图12显示了斑马鱼幼鱼、成鱼感染海分支杆菌的动物模型实验。图12中A显示了幼鱼感染海分支杆菌后(尾静脉注射)，使用不同抗生素给药，通过绿色荧光光密度(海分支杆菌中稳定表达GFP)定量病原菌在斑马鱼幼鱼体内的增殖情况；B显示了不同抗生素作用下的幼鱼生存曲线(每组10只)。实验结果显示，硫肽类抗生素具有较好的体内抗菌活性，尤其是12'-Me-TSR具有显著的抑制胞内菌活性，并且从图B中可以看出12'-Me-TSR能够显著延长幼鱼的生存时间至15天甚至更长，在第12天时12'-Me-TSR实验组仍40％的存活率，而其它实验组的幼鱼已经全部死亡。C图显示了成鱼感染海分支杆菌(腹腔注射)后，使用不同抗生素给药治疗，通过感染部位组织切片抗酸染色直观检测海分支杆菌在成鱼体内的增值情况，从图中可以看出，在成鱼感染动物模型中，硫肽类抗生素具有显著的体内抗菌活性，且12'-Me-TSR具有比其它抗生素更好的效果；D图显示了不同抗生素作用下成鱼的生存曲线(每组20条)，12'-Me-TSR具有比其它抗生素更好的效果。通过上述动物实验，本发明人在海分支杆菌-斑马鱼感染模型水平上，对于硫链丝菌素及其衍生物进行了胞内菌抗菌活力研究。通过对于动物模型生存情况的统计学分析和胞内菌增值情况的荧光定量，本发明人发现12’-烷基-硫链丝菌素具有高于其他衍生物的体内抗菌活性。

实施例6

硫链丝菌素类似物的水溶性测试结果见表4。

表4

单位:μg/mL

从表中数据可以看出，12'-甲基-硫链丝菌素(12'-Me-TSR)的水溶性比硫链丝菌素提高了1倍以上。水溶性的提高能够提高化合物的生物利用度，便于给药。

实施例8药物组合物

化合物

20g

淀粉	140g
		微晶纤维素	60g

按常规方法，将上述物质混合均匀后，装入普通明胶胶囊，得到1000颗胶囊。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述硫链丝菌素类似物具有式I所示的结构：

其中，所述式I具有式Ia所示的结构：

2.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐

(a)用于制备抗菌的组合物；

(b)用于制备抑制微生物生长的组合物；

(c)用于制备治疗微生物感染的组合物；或

(d)用作饲料添加剂。

4.一种体外非治疗性地抑制微生物生长或者杀灭微生物的方法，其特征在于，包括步骤：在需要处理的场所使用权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐。

5.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体进行混合，从而形成药物组合物。

6.一种制备饲料组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合，从而形成含有硫链丝菌素类似物或其盐的饲料组合物。

7.一种制备权利要求1所述的硫链丝菌素类似物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用突变合成元饲喂硫腺苷甲硫氨酸转移酶TsrT被失活或敲除的劳伦链霉菌(Streptomycin laurentii)突变菌株，从而产生权利要求1所述的硫链丝菌素类似物；和

(b)从发酵产物中分离出所述的硫链丝菌素类似物；

其中，所述的突变合成元具有式II所示的结构：

其中，所述的式II突变合成元具有式IIb所示的结构：

8.一种制备具有式II所示突变合成元的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)式III化合物与醇R₁OH进行反应，生成式IV化合物；

(b)式IV化合物与RCH₂CHO进行反应，生成式II所示的突变合成元；

式中，R₁为未取代的甲基；

R₂为H；R₃为H；

R₄为未取代的甲基。

9.一种用于制备权利要求1所述硫链丝菌素类似物的中间体化合物，其特征在于，所述化合物具有式II所示的结构，

其中，所述的式II突变合成元具有式IIb所示的结构：

10.如权利要求9所述的中间体化合物的用途，用于制备权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐。

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