CN105051061B

CN105051061B - 用于扩增干细胞的组合物和方法

Info

Publication number: CN105051061B
Application number: CN201480017350.7A
Authority: CN
Inventors: 周蓬勃
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2034-01-29
Also published as: CN105051061A; US20150368613A1; WO2014120714A1; US9783783B2

Abstract

本申请涉及通过使用增强干细胞生长和增殖的多肽来扩增干细胞群的方法。本申请还涉及新型的同源异型盒蛋白的突变体(例如，HOXA9和HOXB4突变蛋白)及其在扩增某些干细胞群上的用途。本申请还提供了用于治疗需要移植干细胞的对象的方法。

Description

用于扩增干细胞的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本发明要求2013年1月30日提交的美国临时专利申请号61/758,541的优先权，其整个内容通过引用并入本发明。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号CA118085和CA098210的政府支持下完成的。美国政府具有本发明的某些权利。

发明领域

本申请涉及通过使用增强干细胞生长和增殖的、并且在扩增过程中维持细胞的干性的多肽来扩增干细胞群的方法。本申请还涉及新型的同源异型盒蛋白突变体(例如，HOXA9和HOXB4突变蛋白)及其在扩增某些干细胞群上的用途。本申请还提供了用于治疗患有疾病或病症的对象的方法，所述疾病或病症需要以干细胞为基础的治疗。

发明背景

干细胞发育成几种不同的细胞类型。首先，干细胞分为两类：胚胎的和成体的。在发育中的胚胎中，干细胞分化成特化的胚胎组织。在成体生物体中，干细胞和祖细胞作为该机体的修复系统发挥作用，补充特化的细胞，并且还保持再生性的器官(例如血液、皮肤或肠组织)的正常周转。成体干细胞可以分化进入多种通路。间充质干细胞是产生多种细胞类型(包括骨的细胞(骨细胞)、软骨的细胞(软骨细胞)、脂肪细胞(脂细胞)和结缔组织(即，肌腱))的成体干细胞。神经干细胞是脑中的成体干细胞，其产生三种主要的细胞类型：神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞。上皮干细胞是沿着消化道存在于深隐窝中的成体干细胞。皮肤干细胞是存在于表皮的基底层和毛囊底部中的成体干细胞。

造血干细胞(HSC)是多能的、非对称性自我更新的细胞，其通过连续多轮的分化产生所有成熟的血细胞。具体地，在经重组型人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)处理后，已经在胚胎骨髓、胚胎肝脏、脐带血(UCB)、成体骨髓和外周血中鉴定出了HSC，所述HSC能够分化成三种细胞系，包括红系骨髓(myeloerythroid)(即，红血细胞、粒细胞、单核细胞)、巨核细胞(即，血小板)和淋巴细胞(即，T细胞、B细胞和自然杀伤细胞)。在临床移植操作中使用这些HSC来治疗多种疾病，包括恶性的和非恶性的病症。目前，HSC的移植被用于治疗血液系统疾病，例如白血病和骨髓衰竭。通过HSC的扩增可以允许使用有限数量的样品(例如，脐带血)或较低总数的HSC(例如，较少的HSC移动剂)，这将改善移植预后并且有助于满足对干细胞移植的需求。然而，对HSC几乎不能扩增，这很大程度上限制了目前对HSC移植的应用，因此缺少用于治疗患者的HSC。

已经集中地研究了支配自我更新过程的信号，以通过瞬时增强增殖途径或阻断分化信号来促进HSC的扩增，这些会是非常理想的增加用于移植的HSC数量的方式。人体研究揭示，成体HSC可以在经历重复多轮的不对称性自我更新的同时，维持干细胞库，但是几乎很少扩增或没有扩增。与此相反，胚胎的和新生儿的干细胞可在培养物中维持2-3个月，并伴有HSC数量的绝对升高。参见Ando,K.et al.,Blood.2006；107(8):3371-3377；和Dahlberg,A.et al.,Blood.2011；117(23):6083-6090。

同源异型盒(HOX)基因编码的转录因子在胚胎发育过程中调节模式的产生，并且在出生前和出生后调节造血。正如与其3'至5'端染色体位置相关的转录顺序所反映的，在发育早期阶段，HOX基因的表达受时间和空间上的调节。然而，HOX基因表达的时-空性调节在造血中是观察不到的，相反则是呈现出复杂的、重叠的非谱系特异性表达模式。某些HOX基因在HSC和祖细胞中高表达，并且通常随细胞最终分化成成熟的、谱系特异性的血细胞而下调。参见Sauvageau,G et al.,Proc Natl Acad Sci US A.1994；91(25):12223-12227。然而，迄今为止，在造血过程中HOX基因的转录调节机制大部分仍然是未知的。

鉴定出在CD34⁺HSC和早期祖细胞中高表达的HOX基因，这导致发现在细胞培养物中和在骨髓移植之后，经由逆转录病毒转导的HOXB4的表达促进鼠HSC的选择性扩增。参见Sauvageau,G et al.,Genes Dev.1995；9(14):1753-1765。此外，转导有HOXB4的HSC的增殖的增强并没有改变HSC的分化。参见Thorsteinsdottir,U.et al.,Blood.1999；94(8):2605-2612；和Antonchuk,J.et al.,Cell.2002；109(1):39-45。

相反的，当其他HOX基因如HOXA9在HSC中组成性表达时，骨髓性白血病的情况便会发生。参见Kroon,E.et al.,Embo J.1998；17(13):3714-3725；and；和Care,A.et al.,1999；18(11):1993-2001.。此外，当分析HOX蛋白的过表达在不同物种中的影响时，观察到HOX诱导的HSC增殖的幅度具有物种特异性的变化。具体地，与在小鼠和狗的细胞中观察到的相比，在来自人类和狒狒的细胞中观察到的效应较为适中。参见Zhang,XB et al.,JClin Invest.2008；118(4):1502-1510.。另外的研究揭示，在移植了表达有逆转录病毒转导的HOXB4的HSC的两年后，在大型哺乳动物中发生了骨髓性白血病，这突出了这种基因操作的风险。参见Zhang,XB.,J Clin Invest.2008；118(4):1502-1510。总的来说，目前的研究表明，HOX的易位表达不太可能产生一种HSC扩增的方法，以能够促使HSC增殖达到产生治疗显著量的HSC所必需的水平。

因此，为了潜在的人类治疗的应用，有必要通过瞬时递送方法放大HOX在HSC中的表达水平。为此目的，相较于整合逆转录病毒，直接的蛋白转导方法产生了与离体的鼠HSC的增殖相当的水平，但是HOX蛋白较短的半衰期使得有必要频繁补充所述重组蛋白，而所述补充对于大规模离体扩增HSC是不切实际的。参见Krosl,J.et al.,Nat Med.2003；9(11):1428-1432。最近，有研究试图通过修饰HOXB4蛋白天然肽的N-末端结构域来稳定该蛋白。参见美国专利号8,039,463。然而，虽然在N-末端的突变导致了蛋白稳定性的提升，但是这样的突变体不能超越野生型HOXB4蛋白，因而长期再增殖的能力有所降低。

发明概述

一些HOX蛋白，包括HOXB4和HOXA9蛋白，易于通过CUL4泛素连接酶进行泛素化以及随后的降解。本发明已经在HOX蛋白HD区的第一α螺旋内鉴定出了降解信号(降解决定子)。具体地，所述降解决定子包括赖氨酸-谷氨酸-Xaa-谷氨酸(“LEXE基序”[SEQ ID NO:2])序列，其位于HOX蛋白HD区的第一α螺旋结构域内。本发明还已经确定，在所述LEXE基序内的突变使得HOX蛋白的产生显著的稳定性。因此，本发明提供了突变的HOX(或者“HOX(m)”)蛋白及其在扩增干细胞中的用途。

在某些实施方式中，所述HOX(m)蛋白是HOXB4(m)蛋白。所述人HOXB4蛋白的所述HD区由氨基酸163-221组成，所述LEXE基序位于第175-178位。在具体的实施方式中，本发明所述HOXB4(m)蛋白包括在175、176、178位的至少一个上发生氨基酸替换(例如，如SEQ ID NO:3中所述所示)。在本发明的某些方面，HOXB4(m)蛋白在位于HOXB4多肽的LEXE基序内的175、176、178位氨基酸中的至少两个含有氨基酸突变，即，所述三个保守氨基酸L175、E176和E178中的至少两个发生突变(例如，替换)。在其他实施方式中，在所述LEXE基序内，HOXB4(m)蛋白在所有三个所述保守氨基酸上含有氨基酸替换。

在其他实施方式中，所述HOX(m)蛋白是HOXA9(m)蛋白。所述人HOXA9蛋白的所述HD区由氨基酸207-263组成，所述LEXE基序位于第219-222位。在具体的实施方式中，本发明所述HOXA9(m)蛋白包括在219、220、222位的至少一个上发生氨基酸替换(例如，如SEQ ID NO:6中所述所示)。在本发明的某些方面，HOXA9(m)蛋白在位于野生型HOXA9蛋白的LEXE基序内的219、220、222位氨基酸中的至少两个上含有氨基酸突变，即，所述三个保守氨基酸L219、E220和E222中的至少两个发生突变(例如，替换)。在其他实施方式中，HOXA9(m)蛋白在位于LEXE基序内的所有三个所述保守氨基酸上含有氨基酸突变。

本文所公开的HOX(m)蛋白具有独特的特点。例如，本申请所述HOXB4和HOXA9突变蛋白具有比其野生型HOX蛋白对应物更长的寿命，这是因为所述新型的突变蛋白包括在所述野生型HOX蛋白同源结构域的降解决定子区(例如，LEXE基序)的突变，所述突变抑制CUL4泛素连接酶对所述HOX蛋白的翻译后调节。具体地，本发明已经证实，所述HOXB4或HOXA9蛋白的所述LEXE基序的突变阻止CUL4A泛素连接酶和所述HOXB4或HOXA9蛋白同源结构域的第一α螺旋结构域之间的相互作用。因此，在所述LEXE基序上具有突变的HOX(m)蛋白是抗降解的蛋白，并且比野生型HOX蛋白存在的时间更长。

在其他实施方式中，基于向干细胞群提供扩增所述干细胞群有效量的HOX(m)蛋白，本申请提供了用于扩增干细胞群的方法。在某些实施方式中，所述HOX(m)多肽是HOXB4(m)蛋白。在其他特定的实施方式中，所述HOX(m)多肽是HOXA9(m)蛋白。

本申请进一步提供了用于在需要以干细胞为基础的治疗的对象中治疗疾病、病症或异常的方法。在一个非限制性实施方式中，所述治疗方法包括将治疗有效量的干细胞群移植给需要该移植的对象，所述干细胞群已经在HOX(m)蛋白存在的条件下进行了扩增。

附图简述

图1.CUL4A靶向HOXB4用于泛素依赖性降解。A.通过用抗MYC和β肌动蛋白(上样对照)的抗体进行免疫印迹，确定在293T细胞中共转染了递增水平的MYC-CUL4A后得到的MYC-HOXB4的稳态水平。B.在敲低shCUL4A之后，进行对HOXB4半衰期的脉冲追踪分析。C.在转染了所示质粒、经MG132处理、在变性条件下用Ni²⁺-NTA琼脂糖珠进行沉淀并用抗MYC抗体进行免疫印迹之后，在293T细胞中检测了在显性负相的CUL4A水平升高后导致的HOXB4的体内泛素化。D.为了确定CUL4A和CUL4B对内源性HOXB4蛋白水平的生理学效应，纯化了来自Cul4a和Cul4b敲除小鼠及其野生型同窝的骨髓干细胞和骨髓祖细胞，并用抗HOXB4抗体进行免疫印迹分析。上图显示了通过PCR对Cul4a^-/-和Cul4b^-/Y小鼠的基因型鉴定。E.HeLa细胞经6mgshCONTROL或6mg shCUL4A质粒转染48小时，并进行SDS-PAGE以及用抗CU4A抗体进行免疫印迹。将β肌动蛋白的水平确定为上样对照。

图2.CUL4A靶向多个HOX蛋白用于降解。通过用适当的抗体进行免疫印迹，确定了转染的CUL4A水平升高导致所示HOX蛋白的稳态水平有所降低。对应于MYC-CUL4A转染水平的升高，代表性的HOX旁系同源组蛋白的稳态水平有所降低，包括A.HOXA1、B.HOXA2、C.HOXB7、D.HOXB8、E.HOXA11和F.HOXB13。β肌动蛋白的水平由免疫印迹确定为上样对照。

图3.HOXB4同源结构域包含CUL4A依赖性的降解决定子。A.对所有HOX旁系同源组的同源结构域的序列比对发现保守的LEXE基序。B,C.HOXB4LEXE突变体的半衰期。在将所述MYC标记的蛋白转染进HeLa细胞、进行³⁵S-Met标记，以及用抗MYC抗体进行免疫沉淀之后，对HOXB4LEXE突变体(M1：L175D；M2：L175D、E176K；M3:L175D、E176K、E178K)进行了脉冲追踪分析。在每个时间点存留的HOXB4和所述LEXE突变蛋白的百分比都相对于时间点0上的每个蛋白进行了基准化。示出了在每个时间点存留的HOXB4或LEXE突变蛋白的百分比。D.通过用抗GFP或MYC抗原表位标签或作为上样对照的β-actin的抗体进行免疫印迹，确定了在MYC-CUL4A水平升高时得到的GFP-HOXB4同源结构域融合蛋白的稳态水平。

图4.抗降解的HOXB4使得32D髓细胞系具有增殖优势。A.通过用抗HA抗体进行免疫印迹，确定32D稳定系中HA-HOXB4(野生型或突变的)的表达水平。B.32D稳定系在无血清培养基中的累积扩张。C.对HA-HOXB4(野生型的或突变的)在32D稳定系中的半衰期进行放线菌酮追踪分析。在所示时间点通过免疫印迹确定HA-HOXB4或HA-HOXB4(m)的水平。将β-肌动蛋白的水平确定为上样对照。D.在稳定表达所示转基因的32D细胞中，通过定量PCR(qPCR)确定HOXB4和HOXB4(m)的mRNA表达水平，并与感染了对照的MIGRI逆转录病毒的32D细胞进行比较。将数据对相同细胞系中的b-肌动蛋白的表达进行基准化。每个样本的数据为三个平行样。误差条示于每个柱中。

图5.直接转导抗降解的重组型HOXB4蛋白将G-CSF动员的CD34+细胞维持在比野生型HOXB4更原始的状态。A.HOXB4在CD34+UCB细胞中的mRNA表达水平与在G-CSF动员的CD34+细胞中的mRNA表达水平的比较。B,C.在向G-CSF动员的CD34+细胞中加入野生型或抗降解的重组型HOXB4蛋白后，对粒细胞-单核细胞(CFU-GM)和红系(BFU-E,CFU-E)集落形成细胞进行比较。D.在加入野生型或抗降解的HOXB4蛋白后，对G-CSF动员的CD34+细胞的限制稀释CAFC测定法。E.在初次移植12周后，在NSG小鼠中的经野生型或抗降解的重组型HOXB4蛋白处理过的G-CSF动员的CD34+细胞的多谱系移植物(每组n＝8)。该实验独立重复三次。

图6.重组型TAT-HA-HOXB4和TAT-HA-HOXB4(m)蛋白在G-CSF动员的CD34+细胞中的定位。A.纯化的重组型TAT-HA-HOXB4和TAT-HA-HOXB4(m)的考马斯染色胶。将约1μg的每种重组蛋白上样到9％SDS-PAGE胶。我们一致性地观察到所述TAT-HA-HOXB4(m)重组蛋白比所述TAT-HA-HOXB4蛋白跑的略高。然而，我们对两个构建体进行了完整的测序，但是并没有观察到TAT-HA-HOXB4(m)上有任何额外的不期望的突变。B.为了确定重组型HOXB4蛋白的胞内定位，将1μg野生型或抗降解的HOXB4蛋白和1x105个G-CSF动员的CD34+细胞在QBSF-60培养基中孵育30分钟，然后用2％多聚甲醛冰上固定10分钟。以400rpm离心5分钟将固定的细胞离心涂片到玻片上，然后再用100％乙醇固定10分钟。样品在室温下经PBS+0.1％Triton X-100、1％BSA和5％山羊血清封闭30分钟。在封闭缓冲液中以1:50稀释HA.11单克隆抗体，并将所述抗体与样品室温孵育1小时。在封闭缓冲液中以1:500稀释Alexa Fluor 488山羊抗小鼠二抗，并将所述二抗与样品室温孵育30分钟。用DAPI复染细胞，并用FluorSave试剂盖上盖玻片，随后由荧光显微镜进行目测。

图7.在加入了重组的野生型或抗降解的HOXB4蛋白之后，在KG1细胞中对所鉴定的HOXB4转录靶点进行定量RT-PCR。向5x105个KG1细胞中加入所示量的重组型HOXB4蛋白，并在所示时间进行收获。如前所述将蔗糖随所述重组蛋白一起加入，至250mM的终浓度。使用TRIzol试剂提取RNA，并合成cDNA用于HOXB4转录靶点的实时定量PCR。

图8.在集落形成细胞测定法中，脐带血CD34+细胞对重组型TAT-HA-HOXB4和TAT-HA-HOXB4(m)的应答相似。在UCB34+细胞上施用纯化的重组型TAT-HOXB4或TAT-HOXB4(m)并对CFU-GM或BFU-E进行计数。

图9.HOXA9(m)蛋白维持HSC的潜能并促进增殖但不增加HSC的分化。A.对只表达MIGR1逆转录病毒载体的(对照组)、只表达野生型HOXA9蛋白的、或只表达重组型HOXA9(m)蛋白的永生化骨髓祖细胞(32D细胞)的FACS分选揭示，相较于表达野生型HOXA9蛋白的32D细胞，当在HSC中表达纯化的重组型HOXA9(m)蛋白时，在6天时间里(D3-D6)HSC的分化显著减少。在每个FACS数据点下显示的数字表明了展示巨噬细胞标记物(即分化的细胞)的细胞百分比(％)。B.集落形成测定法。在向G-CSF动员的CD34+32D细胞加入野生型HOXA9或重组型HOXA9(m)蛋白后，对粒细胞-单核细胞(CFU-GM)、粒细胞-红细胞-巨噬细胞-单核细胞(CFU-GEMM)和红系(BFU-E，CFU-E)集落形成细胞的比较表明，表达HOXA9(m)蛋白的细胞不改变该细胞的原始性质，因而可以在不直接和不最终分化HSC的情况下扩增细胞。

发明详述

在描述本发明组合物和方法之前，应当理解，本发明并不限于所描述的特定的组合物、方法和实验条件，这是因为这样的组合物、方法和条件是可以变化的。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而并不意图限制本发明。

分离的HOX突变蛋白

术语“肽”或“蛋白”或“多肽”是指线性系列的氨基酸残基，所述残基通过相邻氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接。

当用于指代分子(例如肽、蛋白或多肽)时，术语“分离的”和“纯化的”是指已将所述分子从其天然存在的环境中移出并且所述分子基本上不含其他分子(例如其他蛋白)。“基本上不含”其他蛋白，是指目的蛋白占组合物中总蛋白的至少60％、70％、80％、90％或95％(以干重计算)。当分离的蛋白质是重组产生的，其也可以基本上不含培养基，即培养基代表的体积少于所述蛋白制剂体积的约20％、少于所述蛋白制剂体积的约10％、少于所述蛋白制剂体积的约5％。例如，本发明所述蛋白可纯化至均一或其他不同程度的纯度。纯化的水平可以基于预期的用途。在某些非限制性实施例中，如下面进一步所述，分离的HOX突变蛋白可纯化自表达该突变蛋白的细胞，或者可以通过使用已知的蛋白合成方法而合成性制得。

同源异型盒(HOX)蛋白在活化时促进某些干细胞群的增殖的转录因子家族。泛素连接酶(即CUL4A和CUL4B)通过与存在于HOX肽的同源结构域区中的结合域相互作用，来对HOX蛋白进行翻译后调节。具体地，当CUL4A和HOX蛋白相互作用时，所述HOX转录因子被泛素化并由蛋白酶介导降解。HOX蛋白家族成员包含高度保守的同源结构域区(HD)，其包括三个单独的α螺旋结构域，其中第一个包含降解决定子域，当功能性HOX蛋白通过所述HOX HD区的所述第二个α螺旋结构域结合DNA时，降解决定子域是背对DNA的。HOX蛋白的HD区的非限制性例子包括跨越氨基酸第163-221位的人HOXB4蛋白同源结构域(HOXB4 HD)区。类似地，人HOXA9蛋白包含跨越氨基酸第207-263位的高度保守的同源结构域(HOXA9 HD)区。

本申请所用的术语“野生型HOX蛋白”或“HOX蛋白”，不论所述HOX蛋白起源于何种生物体，应指同源异型盒蛋白家族成员，其包括位于所述HOX蛋白HD区的第一个α螺旋内的保守的LEXE基序。野生型HOX蛋白的非限制性例子包括：HOXA1(NP_005513.1)、HOXA2(NP_006726.1)、HOXB4(AAG45052.1，NP_076920orNP_076920.1)(HOXB7(NP_004493.3)、HOXA9(NP_689952.1)、(HOXB9(NP_076921，NP_076921.1)、HOXA11(NP_005514.1)、HOXA13(AAC50993，NP_000513.2)，及其同源物。本申请所用的术语“同源物”应指在非人脊椎动物物种中的人HOX基因或蛋白的直系同源物。例如，人HOXB4的同源物是指来自非人脊椎动物物种的HOXB4。在某些实施方式中，人野生型HOX蛋白的同源物具有基本上等同于(即，至少80-85％、至少90-95％或更高的序列同一性)所述人野生型HOX蛋白的氨基酸序列。此外，人HOX蛋白的同源物保留和人HOX蛋白相同的功能，例如，调节CUL4介导的HOX蛋白降解的能力。

更具体地，本申请中所指的术语“HOXB4”或“野生型HOXB4”是Antp同源异型盒家族(也被称为B4、HOX2、HOX2F和HOX-2.6同源异型盒)的成员，并编码带有同源异型盒DNA结合域的核蛋白。所述人HOXB4基因位于人的第17条染色体(q21.32)，包含2,875对碱基。术语“HOXB4基因”包括以NC_000017.10(人HOXB4)为代表的核酸分子。所述HOXB4基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠和鸡中是高度保守的，因此所述术语“HOXB4基因”还包括所述人HOXB4基因在这些其他哺乳动物物种中的同源物。

所述HOXB4基因生成mRNA转录子，包括NM_24015和NM_024015.4，其翻译成以AAG45052.1或NP_076920.1为代表的“HOXB4蛋白”或“野生型HOXB4蛋白”或“HOXB4多肽”。来自人的由251个氨基酸组成的野生型HOXB4蛋白的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:1中。

HOX野生型蛋白的另一个例子是以NP_689952.1为代表的“HOXA9蛋白”或“野生型HOXA9蛋白”。来自人的由272个氨基酸组成的野生型HOXB4蛋白的氨基酸序列描述于SEQ IDNO:5中。所述HOXA蛋白是同源异型盒A9或“HOXA9基因”的产物，所述HOXA9基因位于第7条染色体(NC_000007.13)并且编码DNA-结合的转录因子。术语“HOXA9基因”包括以NG_029923.1为代表的核酸分子，其翻译成SEQ ID NO:5中所述的HOXA9蛋白(NP_689952.1)。所述HOXA9基因在黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡和斑马鱼中是高度保守的，因此所述术语“HOXA9基因”还包括来自这些其他动物物种的人HOXA9基因的同源物。

本文所使用的术语“变体”是指在群体中自然发生的在基因、转录子或蛋白的序列上具有一个或多个改变的核酸分子。例如，基因变体或蛋白变体可以与报告的或特定的核苷酸或蛋白序列分别共享至少90％、95％、98％、99％或更高的序列同一性。

一些HOX蛋白，包括HOXB4和HOXA9蛋白，通过CUL4泛素连接酶进行泛素化和随后的降解。本发明已经在所述HOX蛋白HD区的第一α螺旋内鉴定了降解信号(降解决定子)。具体地，所述降解决定子包括在所述HOX蛋白HD区的第一α螺旋内的赖氨酸-谷氨酸-Xaa-谷氨酸(“LEXE基序”[SEQ ID NO：2])序列，其中Xaa可以是以下氨基酸的任一个：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或缬氨酸(V)。所述LEXE基序位于所述人野生型HOXB4蛋白的第175-178位氨基酸。所述人HOXA9蛋白的LEXE基序在第219-222位氨基酸。

按照本申请，所述LEXE基序的突变可以导致HOX蛋白水平的显著稳定，所述显著稳定是CUL4介导的HOX蛋白降解降低的结果。

本发明中所指的术语“抗降解的”或“抗蛋白酶降解的”，是指蛋白质，特别是不容易受到泛素蛋白酶体降解的影响，或者与相较于野生型HOX蛋白具有降低的泛素蛋白酶体降解相关的HOX蛋白。在本发明的一个方面，抗降解的蛋白不受泛素连接酶(例如，CUL4A)的翻译后调节。

在某些实施方式中，提供了抗降解的HOX突变蛋白(“HOX(m)蛋白”或“突变的HOX蛋白”)。在本发明的某些方面，提供了抗降解的HOXB4突变蛋白(“HOXB4(m)”)。在其他方面，提供了抗降解的HOXA9突变蛋白(“HOXA9(m)”)。这些突变的HOX蛋白在细胞中显著更稳定并且和减少的蛋白酶体介导的降解相关。可通过测定细胞中表达的蛋白的量并且随时间的推移将这样的量和野生型蛋白的量进行比较，来评估蛋白质稳定性。例如，相较于野生型蛋白，更稳定的蛋白更不易受蛋白酶体介导的降解的影响。例如，“更稳定的”蛋白或“抗降解”的蛋白可以在所选的时间点表现出超出野生型HOX蛋白水平1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多的蛋白量的升高。或者，抗降解的蛋白的特征在于相较于野生型(未修饰的)蛋白，具有更长的半衰期。

蛋白稳定性可由已知的任何方法测得，包括但不限于Western印迹或蛋白芯片，其可检测一段时间内存在于一个或多个细胞中的蛋白量。例如，可建立具有相同比例的标记蛋白(例如，β肌动蛋白)的细胞或细胞系。随后向这些细胞转染或向其提供等量的野生型蛋白(例如，野生型HOXB4)或突变蛋白(HOXB4(m))，并培养相等的一段时间。随后将所述表达野生型蛋白的细胞中的标记蛋白的比例和所述表达突变蛋白的细胞中的标记蛋白的表达进行比较，并且随后将这一比例和在测量野生型和突变蛋白的量时得到的比例进行比较。使用这种比较，可以得出以下结论：如果在表达野生型蛋白的细胞中确定的比例不同于在表达突变蛋白的细胞中确定的比例，那么突变蛋白的稳定性已经改变。例如，如果野生型蛋白的比例低于突变蛋白的比例，那么所述突变蛋白更稳定。

在另一例子中，蛋白稳定性可通过确定突变蛋白相对于野生型蛋白的半衰期而测得。用于确定蛋白的半衰期的方法是本领域普通技术人员熟知的，并且任何这样的方法可以与本发明一起使用。测定蛋白半衰期的非限制性例子是脉冲追踪测试。例如，培养细胞并用代谢性标记的或生物合成标记的蛋白(³⁵S、³H或¹⁴C)(例如，野生型HOX或HOX突变蛋白)转染或孵育细胞。随后使这些细胞经历之后的“追踪”期，其中进一步将细胞与用于标记的前体蛋白的未标记对应物孵育。收获样品并且免疫沉淀蛋白，通过SDS PAGE分离所述蛋白，并确定被标记的蛋白的水平。通过将被标记的蛋白在0小时的水平和那些“被追踪”(例如：60分钟)的蛋白进行比较，提供蛋白周转速率的指标，进而提供蛋白的半衰期。

更具体地，可由以下方法确定蛋白稳定性：通过磷酸钙沉淀法(Promega)或通过Fugene 6试剂法(Roche)，用表达质粒(即，pGreen Lantern-1)瞬时转染细胞(例如，HeLa细胞或293T细胞)以表达微克量的特定的HOX突变蛋白和野生型蛋白。随后在每次转染中，使用pcDNA3表达载体对DNA总量进行基准化。在所有的瞬时转染实验中，可包括进2μg等份的pGREEN LANTERN-1质粒，以测量转染效率并比较被转染的蛋白的稳态水平。免疫印迹、免疫沉淀、用于脉冲追踪分析蛋白半衰期的[³⁵S]甲硫氨酸和半胱氨酸的代谢标记、以及体内泛素化测定法的步骤已被全面描述并且是本领域普通技术人员所熟知的。简单地说，将被转染的细胞在不含蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM中饥饿1小时，用[³⁵S]甲硫氨酸和[³⁵S]半胱氨酸(100μCi/ml)的混合物脉冲标记30分钟，并在DMEM中用过量的甲硫氨酸(～3mM)和半胱氨酸(～1mM)追踪一段时间(例如，0.5-5小时)。在每个时间点，在加有蛋白酶抑制剂(PharMingen)的裂解缓冲液(例如，150mM NaCl,1.0％Nonidet P-40,50mM Tris,pH 8.0)中裂解细胞。用单克隆抗体对等量的包含野生型和突变的HOX蛋白的提取物进行免疫沉淀两次，并在9％SDS-PAGE上溶解。随后在各时间点通过PhosphorImager扫描(MolecularDynamics公司)可视化³⁵S标记的突变的和野生型HOX蛋白并定量。随后使用单独的抗体以类似的方式测量这样的细胞中内源性HOX蛋白的半衰期或细胞中转染的突变蛋白的半衰期。在脉冲追踪分析之前，用UV以10J/m²辐射细胞并随后在DMEM中恢复8h，以评价UV辐射对野生型HOX或HOX突变蛋白的稳定性的效应。在一些情况下，在追踪基质中包括了100μM的MG132蛋白酶体抑制剂(Peptide International)，并且可以观察到突变的HOX蛋白的稳定性。

在特定的实施方式中，本申请所述突变的HOX蛋白在所述HOX HD区的LEXE基序内包含点突变。在具体方面，所述HOX(m)蛋白是HOXB4(m)蛋白。在一个实施方式中，所述HOXB4(m)蛋白包括在175、176和178位置中的至少一个中的氨基酸取代(例如，如SEQ ID NO:3所示)。在另一实施方式中，HOXB4(m)蛋白在所述HOXB4多肽的LEXE基序内的175、176、178位氨基酸中的至少两个中含有氨基酸突变，即，所述三个保守氨基酸L175、E176和E178中的至少两个发生突变(例如，替换)。在其他实施方式中，所述HOXB4(m)蛋白在位于LEXE基序内的所有三个所述保守氨基酸上含有氨基酸突变。

在另一方面，所述HOX(m)蛋白是HOXA9(m)蛋白。在具体的实施方式中，本发明的HOXA9(m)蛋白包括在219、220、222位的至少一个位置中的氨基酸替换(如SEQ ID NO:6中所述)。在其他实施方式中，HOXA9(m)蛋白在所述野生型HOXA9蛋白的所述LEXE基序内的氨基酸219、220、222中的至少两个位点中含有氨基酸突变，即，所述三个保守氨基酸219、220和222中的至少两个发生突变(例如，替换)。在其他实施方式中，在所述LEXE基序内，HOXA9(m)蛋白在所有三个所述保守氨基酸上含有氨基酸突变。

在许多实施方式中，在所述LEXE基序内的至少两个或所有三个所述保守氨基酸上的所述突变是非保守性替换。本文所用的术语“非保守性替换”，是指一个氨基酸被另一个具有不同特性(即，电荷、极性、疏水性)的氨基酸替换(即，点突变)。保守性替换的例子包括将疏水残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或甲硫氨酸)替换成极性的或带电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸)。同样地，本发明考虑将带电荷的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)替换成不带电荷的残基，包括但不限于：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甘氨酸。在某些实施方式中，非保守性替换包括以带电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或谷氨酸)替换不带电荷的、疏水性氨基酸(例如亮氨酸)。例如，可用带电荷的氨基酸(例如，带正电荷的氨基酸(Arg,His或Lys)或带负电荷的氨基酸(Asp或Glu))替换HOXB4中的L175或HOXA9中的L219。在具体的实施方式中，所述非保守性氨基酸替换包括用带正电荷的氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸替换带负电荷的残基(即，谷氨酸)。本发明所述的HOX突变蛋白的非限制性例子包括具有L175D、E176K和E178K的氨基酸替换的HOXB4(m)蛋白(例如，如SEQ.ID.NO:4)。本发明所述的HOX突变蛋白的另一个非限制性例子包括L219D、E220K和E222K的氨基酸替换(例如，如SEQ.ID.NO:7)。

根据本发明，可以在来自除人以外的物种的野生型HOX蛋白上进行相同或相似的替换，以得到稳定的HOX突变蛋白。在某些实施方式中，对于来自其他动物物种(例如小鼠、黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡或斑马鱼)的HOXB4蛋白，可以通过在LEXE基序内进行替换而发生突变(类似于对上述人HOXB4蛋白的替换)。在另一实施方式中，对于来自其他动物物种(例如小鼠、黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡或斑马鱼)的HOXA9蛋白，可以通过在LEXE基序内进行替换而发生突变(类似于对上述人HOXA9蛋白的替换)。

可以利用多种表达/宿主系统。这些系统包括，但不限于，微生物(如转化有重组型噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体的细菌)；转化有酵母表达载体的酵母；感染有病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；转染有病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)或转化有细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)的植物细胞系统；或者动物细胞系统。在重组蛋白的生产中有用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、W138、BHK、HepG2细胞、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、32D细胞和293细胞。当翻译后修饰(例如糖基化和多肽处理)对于活性很重要时，则优选哺乳动物宿主细胞。哺乳动物的表达允许生成分泌性的或可溶性的多肽，所述多肽可从生长培养基中回收得到。

通过使用适当的宿主-载体系统，在允许生产的条件下培养转化有表达载体(所述表达载体包含本申请所述核酸分子)的宿主细胞，重组性地生成了HOX突变蛋白。转化的细胞可用于长期的、高产量的蛋白质生产。一旦用包含可选的标记物以及所想要的表达盒的载体转化了这样的细胞，可以允许所述细胞在富集培养基中生长一到两天然后再被转入选择性培养基。设计可选的标记物，以允许成功表达所导入序列的细胞进行生长和恢复。可以使用适合于所使用的细胞系的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性团块。随后可以使用本领域普通技术人员已知的蛋白纯化技术通过适宜的纯化方案将所述蛋白从所述细胞中分离出来。

在某些实施方式中，所述蛋白纯化技术在一个水平上涉及对蛋白质组分和非蛋白质组分的分级分离。在已经从其他材料中分离了多肽的情况下，可以使用色谱技术和电泳技术进一步纯化目的多肽，以实现部分的或完全的纯化(或者纯化至均一)。特别适合制备多肽的分析方法或本发明所述分析方法包括，但不限于，离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。

本领域技术人员将熟知适合在纯化中使用的各种技术。这些包括，例如，色谱法、HPLC、用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等或通过热变性进行的沉淀，随后进行离心；色谱法步骤，例如亲和层析(例如，蛋白A-琼脂糖)、离子交换、凝胶过滤、反相法、羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦法；凝胶电泳法；以及这些技术的组合。如本领域中一般已知的，据信进行所述各种纯化步骤的顺序是可以改变的，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生合适的用于制备基本纯化的多肽的方法。

本领域技术人员将熟知用于量化多肽的纯化程度的各种方法。这些包括，例如，确定活性组分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评估组分内的多肽的量。用于评估多肽组分的纯度的示范性方法是计算所述组分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性进行比较，并从而计算纯化程度，所述纯化程度在本文中通过“倍数纯化数值”进行估值。用于表示结合活性的量的实际单位将取决于在纯化之后所选择的特定的测定技术，以及所述多肽是否表现出可检测的结合活性。

用于扩增干细胞的方法

本文所公开的HOX(m)蛋白具有独特的特点。例如，在细胞中，本发明所述HOXB4和HOXA9突变蛋白具有比其野生型HOX蛋白对应物更长的寿命，这是因为所述新型的HOX突变蛋白包括位于该HOX蛋白同源结构域的降解决定子区(例如，LEXE基序)内的突变。在所述降解决定子内的突变抑制CUL4泛素连接酶对所述HOX蛋白的翻译后调节。例如，所述HOXB4或HOXA9蛋白的所述LEXE基序的突变阻止CUL4A泛素连接酶和所述HOXB4或HOXA9蛋白同源结构域的第一α螺旋结构域之间的相互作用。因此，本发明所述HOXB4或HOXA9突变蛋白是抗降解的蛋白，这是因为由于对所述LEXE基序的修饰抑制了CUL4A介导的降解，因此所述突变蛋白比野生型HOXB4或野生型HOXA9蛋白存在的时间更长。

基于向干细胞群提供能扩增所述干细胞群的有效量的HOX(m)多肽，本发明提供了用于扩增干细胞群的方法。在某些实施方式中，所述HOX(m)多肽是HOXB4(m)蛋白。在特定的实施方式中，所述HOX(m)多肽是HOXA9(m)蛋白。

本文使用的“扩增(expanding)”或“扩增(expansion)”是指通过在异源或同源的细胞群中增殖现有的干细胞，而不是将非干细胞的细胞(即，终末分化细胞)转化成干细胞，来提升干细胞的数量。

术语“有效量(amount effective)”或“有效量(effective amount)”是指所述肽或材料的量将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师所寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学应答。例如，提供给细胞的HOX(m)蛋白的有效量可以是增加这样的细胞的增殖所必需的量。精确的量取决于用以提供所述HOX(m)蛋白的具体的方式。

在某些实施方式中，使用基于核酸的方式将所述HOX(m)蛋白提供给干细胞群。一方面，在干细胞群中瞬时表达外源性HOX(m)基因，随后使用内源性细胞机器转录和翻译所述基因。例如，通过本领域普通技术人员熟知的转导、转染或电穿孔方法，将编码HOX(m)蛋白的核酸导入干细胞群。

在某些实施方式中，在载体上携带被导入所述细胞的编码HOX(m)蛋白的核酸。不同类型的载体或构建体可用于转导或转化干细胞。这些包括质粒或病毒载体。术语“病毒载体”是指包含所有或部分的病毒基因组的载体，所述病毒基因组能够被导入到细胞中并表达。这样的病毒载体可以包括天然的、突变的或重组的病毒。这样的病毒可以具有RNA或DNA基因组。合适的病毒载体的例子包括，但不限于，腺病毒、腺相关病毒(AAV)、杆状病毒、细小病毒、疱疹病毒、痘病毒、塞姆利基森林病毒、牛痘病毒以及逆转录病毒和杂交载体。逆转录病毒载体已被广泛用于基因疗法，特别是那些基于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的基因疗法，以在宿主生物体或细胞群中表达目的基因和/或蛋白。此外，基于鼠逆转录病毒的载体可用于细胞的高效转导。然而，用基于鼠逆转录病毒的载体转导人细胞需要激活所述细胞以允许表达。以下非穷尽的列表提供了用于在细胞群(包括但不限于干细胞)内表达蛋白的方式的一些例子。

整合型载体，如逆转录病毒或慢病毒，通常用于基因疗法，从而可以和本申请所述方法结合使用，以表达HOXB4突变蛋白。在一个实施方式中，作为反转录病毒载体的亚类的慢病毒载体，可用于高效转导(参见，例如，Haas et al.,2000；Miyoshi et al.,1999；Caseet al.,1999)并且还能够转导非分裂细胞。因此，慢病毒载体并不需要诱导细胞进入细胞周期，并且进而将避免在一些细胞中可能由细胞周期的诱导而导致的多能性的丢失。其他逆转录病毒组如泡沫病毒(spumavirus)(例如泡沫病毒(foamy virus))也能够有效地转导非分裂细胞。

可以在本方法中使用的其他类型的病毒载体包括腺病毒载体(参见Fan et al.,2000；Knaan-Shanzer et al.,2001；and Marini et al.2000)、腺相关病毒(AAV)载体(参见Fisher-Adams et al.,1996)、基于SV40的载体(参见Strayer et al.,2000)或杂交载体的形式。例如，参见Feng et al.,1997。可以容易地生产高滴度的腺病毒载体，并且所述载体也能转导非分裂细胞。

在某些实施方式中，使用AAV载体在细胞群中表达HOX(m)蛋白。AAV载体是非致病性的，能转导增殖的和非增殖的细胞(包括CD34+细胞)，并稳定整合进细胞基因组。参见Grimm and Kleinschmidt(1999)。此外，AAV载体不诱导宿主免疫应答，并且可以在无辅助系统中产生。在长期培养物中，AAV载体能有效转导CD34+细胞。参见Chaterjee et al.,(1999)。

在其他实施方式中，可使用非整合性方法来表达外源蛋白，例如使用腺病毒、杆状病毒或瞬时转染能够游离表达的质粒。在本发明的某些方面，优选导致将导入的基因非整合进细胞基因组中的载体。在其他方面，优选允许所导入的基因瞬时表达的病毒载体。在另外的其他方面，优选在宿主细胞中具有较短的生命周期的载体。

在具体的实施方式中，使用载体表达HOXA9(m)蛋白，所述载体不会导致HOXA9(m)蛋白的组成性表达。可以在HOXA9(m)蛋白的表达中使用的这样的载体的具体的、非限制性例子，包括PINCO、MIGR1和pRS。

在一个实施方式中，本发明所述突变的HOX基因在组成型启动子的控制下表达。自然存在的组成型启动子控制必需的细胞功能的表达。其结果是，由组成型启动子控制的基因在所有的细胞生长条件下表达。用于本发明所述方法的示例性的组成型启动子包括，但不限于针对以下编码某些组成型或“管家”功能的基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(UPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)(参见Scharfmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1991)88:4626-4630)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、肌动蛋白启动子(参见Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1989)86:10006-10010)，以及其他本领域技术人员已知的组成型启动子。此外，许多病毒启动子在干细胞中组成性地发挥功能。这样的病毒启动子的非限制性例子包括SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复(LTRS)和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。因此，可以使用任何上述参考的组成型启动子以控制插入载体或构建体的异源基因的转录。例如，可以将HOX基因或HOX突变基因序列插入载体或构建体，并且可由组成性活化的启动子驱动表达，以实现所希望的HOX(m)蛋白(例如HOXB4)的表达。

在另一实施方式中，本申请所述突变的HOX基因在诱导型启动子的控制下表达。处于诱导型启动子控制下的基因在存在诱导剂的条件下被表达(例如，某些金属离子的存在极大地提升了在金属硫蛋白启动子控制下的转录)。诱导型启动子包括反应元件，当所述反应元件结合其诱导因子时，刺激转录。例如，存在针对血清因子、类固醇激素、视黄酸和环AMP的反应元件。可以选择含有特定的反应元件的启动子，以获得可诱导的反应，并且在一些情况下，所述反应元件本身可与不同的启动子连接，从而赋予所述重组基因(例如，突变的HOX基因)可诱导性。因此，通过选择适当的启动子(组成型vs.诱导型；强vs.弱)，有可能在遗传修饰的细胞中控制试剂的存在及其表达水平。考虑到上述公开的因素，对用于表达基因或其产物的这些因素的选择和优化被认为是在本领域普通技术范围内的，无需过度实验。因此，在某些实施方式中，在诱导型启动子的控制下表达HOX(m)基因，并将所述HOX(m)基因导入干细胞群。

在其他实施方式中，作为对基于核酸方式的替换，通过基于蛋白质的方式，将HOX(m)蛋白提供给所述细胞，其在本文中也被称为蛋白转导。

蛋白转导是将蛋白质从外部环境内化进所述细胞。这个过程依赖于少数蛋白和肽的能够穿透细胞膜的固有特性。可将这些运输部分的转导特性赋予被表达成与其形成融合蛋白的蛋白。本文所用的术语“转运部分”是指能够跨越细胞膜并且能将本发明所述的多肽转运进干细胞的肽。

在具体的实施方式中，所述转运部分是HOX(m)蛋白本身的一部分，即，是HOX(m)蛋白固有的或内在的。在本实施方式中，HOX(m)蛋白被直接加入到所述干细胞群中，并通过其自身的跨膜渗透活性从细胞培养基跨越细胞膜。参见Amsellem S,et al.,Nat.Med.(2003)9(11):1423-1427。

在另一实施方式中，突变的HOX蛋白与外源的(或异源的)转运部分连接或融合。这样的异源转运部分的例子包括，但不限于，HIV-1转录反式激活(Tat)肽、Chariot^TM蛋白、富含精氨酸的肽、触角来源的穿膜肽、单纯疱疹病毒1型VP22蛋白和+36GFP。

触角肽：触角基序来源于果蝇同源蛋白家族，所述家族是一类参与发育过程的反式激活因子。这些蛋白通过以三螺旋序列排列的含60个氨基酸的羧基末端区(称为同源结构域)识别并结合DNA。触角的同源结构域(AntpHD)能够跨越神经元细胞膜并被输送至细胞核。

单纯疱疹病毒VP22蛋白：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22蛋白是结构性多肽，形成位于成熟病毒粒子的包膜和衣壳区之间的病毒外壳的主要成分。它是小型的碱性蛋白，约38kDa大小，由UL49基因编码。

HIV TAT蛋白转导结构域：HIV-1反式激活基因的产物TAT已显示是潜伏期HIV中的转录调节子，并且对于HIV复制是必需的。它是从分别有72个和14个氨基酸的两个外显子形成的含86个氨基酸的蛋白质。

Chariot蛋白：Chariot是2843道尔顿的肽，并且与目标蛋白(Active Motif公司)形成非共价复合物。

如美国专利号6,399,764(B1)和6,072,048中所述，能用于蛋白转导的肽的其他非限制性例子包括富含精氨酸的肽、来自结核分枝杆菌Mce1蛋白的+36GFP和Mtb载体域。

当通过基于蛋白的方式将HOX(m)蛋白提供给细胞时，可以以介于0.1μg和10mg的量，介于0.1μg和5mg、0.1μg和3mg、0.1μg和1mg、0.1μg和0.5mg、0.1μg和200μg、0.1μg和100μg、0.1μg和50μg、0.1μg和10μg、0.1μg和5μg、0.5μg和2μg的量提供所述HOX(m)蛋白。在另一实施方式中，将1μg纯化的HOXB4(m)或HOXA9(m)蛋白提供给含有基质的干细胞。

在某些这样的实施方式中，当向培养基中的旨在被扩增的干细胞群中提供HOX(m)蛋白时，HOX突变蛋白的适当的剂量可以介于0.1μg/mL和10μg/mL，例如，5mg/mL、3mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、200μg/mL 100μg/mL、10μg/mL、5μg/mL1μg/mL或任何介于以上列举值的值。可以以每天1至4次，每天一次或两次，或隔天一次的方案将所述HOX(m)蛋白施用于干细胞培养物上。

在许多实施方式中，本扩增方法所用的细胞包括干细胞或其群。本文使用的“干细胞”或“干细胞群”是指具有自我更新和分化的能力来产生至少一种功能性的终末细胞类型的细胞。

本申请所述干细胞(例如，成体干细胞和造血干细胞)包括所有本领域已知的、已经在哺乳动物器官或组织中鉴定的干细胞。干细胞可以包括，但不限于多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、骨髓干细胞和淋巴样干细胞。造血干细胞是被表征得最充分的干细胞。从骨髓、血液、脐带血、胎肝和卵黄囊中分离的造血干细胞，是产生血细胞的祖细胞，或者其在移植后重新派生出多个造血谱系，并且为了接受者的生命可以重新开始造血。当被移植入经受致命辐射的动物或人类时，造血干细胞可以重新填充红细胞、嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞库。

本文中使用的“祖细胞”是指具有有限的自我更新能力并且能分化以产生至少一种功能性的终末细胞类型的细胞。

本发明中使用的“造血细胞”是指正常存在于血液中的细胞以及产生正常存在于血液中的细胞的细胞，例如存在于骨髓中的细胞。本文中“正常地”包括治疗人以改变血液或骨髓中的细胞的数量或质量的情况。“造血干细胞”是造血细胞的亚类，其在本文中是指产生所有血细胞类型的多能干细胞。

本领域熟知，造血细胞包括多能干细胞(例如，淋巴干细胞)和/或定向分化成特定造血谱系的祖细胞。定向分化成特定造血谱系的祖细胞可以是T细胞系、B细胞系、树突状细胞系、朗格汉斯细胞系和/或淋巴组织特异性巨噬细胞系。对造血干细胞和祖细胞谱系的讨论参见Sieburg et al.2006，Schroeder et al.2010，Dykstra et al.2007和美国专利号7,994,114，其内容通过引用并入本文。

在本发明所述方法中使用的造血干细胞可由血液或血液产品获得。本文使用的“血液产品”定义为获自含有来自造血细胞的机体或机体的器官的产品。这样的来源包括未分级的骨髓、脐带血、外周血、肝脏、胸腺、淋巴和脾脏。未分级的血液产品可直接从供体获得，或从冷冻保存液中恢复。对于本领域普通技术人员来说，以多种方式从所有上述的粗制的或未分级的血液产品中富集具有“造血干细胞”特征的细胞是显而易见的。例如，可以从更分化的后代中获得血液产品。对于更成熟的、分化的细胞，可以经由其表达的细胞表面分子对其进行选择。此外，可通过选择CD34+细胞分级和/或分选所述血液产品。

CD34+细胞能够自我更新并且具有多潜能性，并且使用例如，可商购的磁性抗CD34珠(Dynal公司，Lake Success,N.Y.)来实现对这样的CD34+细胞的选择。对于造血干细胞和祖细胞，自我更新和多能性的示例性附加标记物包括，但不限于，CD38-/低、SCA-1⁺、lin^-、c-kit⁺/CD117+、CD59+、Ty1/CD90+。

在一个实施方式中，由本申请方法扩增的干细胞是成体干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞存在于或来源于脑、肝、心脏、肾、皮肤、胰腺、膀胱、胆囊、大肠、小肠、胃、骨骼肌或肺。

在另一实施方式中，所述干细胞是造血干细胞。在另一实施方式中，所述造血干细胞获自或来源于脐带血、外周血、骨髓或脾脏。在具体的实施方式中，所述造血干细胞是人的造血干细胞。

可在扩增所述干细胞群之前收获或收集造血干细胞。“收获”造血祖细胞定义为使细胞从基质脱落或分离。其可以通过使用许多方法而得以实现，例如酶的、非酶的、离心的、电的、或基于尺寸的方法，或者优选通过用基质冲洗(例如，孵育所述细胞的基质)所述细胞。通过使用本发明，可进一步收集、分离并进一步扩增所述细胞，生成更大的群。

用于分离造血干细胞的方法是本领域熟知的，并通常涉及随后的基于细胞表面标记物和功能特性的纯化技术。造血干细胞和祖细胞可以从骨髓、血液、脐带血、胎肝和卵黄囊中分离得到，并产生多个造血谱系以及可以重新开始造血用于接受者的生命。参见，例如，美国专利号5,759,793和5,716,827。在从外周血中分离造血干细胞和祖细胞的方法的一个非限制性的例子中，将PBS中的血液装入Ficoll管(Ficoll-Paque,Amersham)并于1500rpm离心25-30分钟。离心后，收集白色中心环作为为含有造血干细胞的原血样品组分。

在另一实施方式中，如本领域文献所述，通过在培养中分化胚胎干细胞，或通过在培养中重新编程成纤维细胞或内皮细胞获得造血干细胞。参见，例如，Pereira et al.(Cell Stem Cell 13,205–218,2013)；Wang et al.(Cell Research 22,194-207,2012)；Kaufman(Blood 114,3513-3523,2009)；国际专利申请号PCT/US14/11575；US20090191171A1 and PCT/US2009/060138。

为了直接比较HSC和表达本申请所述HOX突变蛋白的HSC与表达野生型HOX蛋白的HSC之间的扩增能力，开始15天的液体培养，所述培养物由10％的表达wtHOXB4的细胞、10％的表达突变的HOX蛋白的细胞和80％未感染的细胞组成。在不同的时间，通过流式细胞术分析细胞培养物中表达YFP(例如，表达野生型HOX)和GFP(例如，表达突变的HOX蛋白)的细胞的比例。然后通过Western印迹法评估所述HOX蛋白在转导的细胞中的表达，以显示突变的HOX蛋白的表达与HSC细胞的体外扩增相关。类似地，表达更高水平的HOX突变蛋白的细胞比表达野生型HOX蛋白的细胞具有更强的扩增能力。参见，例如，本申请实施例4。

在某些实施方式中，用于扩增干细胞群的方法包括结合刺激因子施用有效量的HOXB4(m)多肽。用于本发明所述方法的刺激因子的非限制性例子包括G-SCF、GM-CSF、M-CSF、干细胞因子(CD117或c-Kit)或FMS样酪氨酸激酶3(FLT-3)或细胞因子。

在另一实施方式中，在细胞生长支持培养基中培养干细胞群。细胞生长支持培养基的非限制性例子包括补充有促血小板生成素、c-Kit配体和Flt3配体的无血清培养基。

处理的方法

野生型HOX蛋白的转导促进造血干细胞(HSC)的增殖，但需要频繁施用来克服其较短的蛋白半衰期(～1小时)。相反地，相对于野生型HOX蛋白，本申请所述抗降解的HOX(m)蛋白赋予髓系祖细胞生长优势。例如，相较于转导野生型HOXB4蛋白，重组的HOXB4(m)蛋白直接转导进人成体HSC后，不仅在体外而且当被移植进NOD/SCID/IL2R-γ^null(NSG)小鼠时，都显著增强了对其在更加原始状态的维持。总之，这些结果表明，本申请所述稳定的HOX(m)蛋白克服了为用于治疗用途而扩增成体HSC和早期祖细胞的主要技术障碍。

移植后的骨髓再生取决于被移植细胞的适当植入。在某些实施方式中，被移植细胞的植入是所述细胞的长期植入。在其他实施方式中，本方法包括改进的造血干细胞(HSC)的植入，所述造血干细胞来源于人脐带血、外周血、骨髓或脾脏。

本文使用的术语“植入(engraftment)”或“移植(engrafting)”是指造血细胞在一段持续的时间(例如，至少3个月、至少六个月、至少一年)内植入骨髓的能力。可以直接地(例如，通过活检)，或通过血液中后代细胞的产生检测由植入产生的移植，所述后代细胞被标记(即，GFP、YFP、RFP)或具有标记物(即，CD34+)，以方便检测。

用于治疗人体疾病、病症或异常的干细胞移植方法是本领域熟知的。例如，参见Manual of Stem Cell and Bone Marrow Transplantation(Cambridge UniversityPress,2009)，Stem cell transplantation:biology,processing,and therapy(Wiley-VCH,2006)，和Practical Hematopoietic Stem Cell Transplantation(Wiley-Blackwell,2007)。这些文献通过引用并入本文。

通过采用经G-CSF处理后被动员进入外周血的成体HSC，进行造血干细胞移植。由于脐带血中能获得的CD34⁺干细胞/祖细胞的数量(1-2x10⁶)是有限的(这一数目对于成年人的移植通常是不够的)，从脐带血或者G-CSF动员的成体骨髓/外周血获得的HSC在移植中具有非常低的成功率。因此，成人需要使用两个或更多个脐带血单元，这需要双重匹配并显著增加了成本。用来源于兄弟姐妹的或无亲缘关系的匹配的骨髓或G-CSF动员的外周血供体的HSC进行移植，至少需要2x10⁶个CD34⁺细胞/kg。类似地，约三分之一的自体移植患者需要额外的数轮G-CSF治疗以动员足够数量的HSC用于移植。本申请所述方法在阐明HOX蛋白稳定性的翻译后调节机制方面提供了重要的进展，所述进展现在可被用来维持HSC和干细胞的增殖潜能和群体再生(repopulative)的潜能。

具体地，本申请表明，HOX突变蛋白在扩增和移植G-CSF动员的HSC方面显示出更强的效应，其可被用于消除对重复HSC动员步骤的需求。

因此，本申请还提供了用于在需要以干细胞为基础的治疗的对象上治疗疾病、病症或异常的方法。在一个非限制性例子中，所述治疗方法包括将根据上文所述的干细胞扩增方法制备的治疗有效量的干细胞群移植到对象中，用于治疗需要移植干细胞的疾病或病症。

在某些实施方式中，可将本申请干细胞移植方法用作对“需要移植干细胞的对象”的治疗的一部分。本文使用的术语“需要移植干细胞的对象”包括，例如，患有病症的对象，所述病症可以通过干细胞移植进行治疗(即，可以受益于干细胞移植)。

可以通过任何合适的施用方式(例如，经皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、或脑池内注射或输注技术(例如，细胞悬浮液))，在含有无毒的、可接受的载剂或归巢分子的制剂中，移植本发明所述扩增的干细胞群。可以，例如，以适于立即释放和植入的形式施用本发明所述扩增的干细胞群。立即释放和植入可通过使用包含本申请所述细胞的合适的靶向剂(即，针对细胞特异性抗体或表面标记物的连接物)来实现。

除了灵长类动物如人类，还可按照本发明所述的方法治疗多种其他哺乳动物。例如，可以治疗哺乳动物，包括，但不限于，牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其他牛类、羊类、马类、犬类、猫类、啮齿类或鼠科物种。然而，也可以在其他物种中实施所述方法，例如禽类物种(例如，鸡)。

使用本发明的方法(在所述方法中需要靶向细胞用于调节)治疗的对象是哺乳动物，包括，但不限于，牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其他牛类、羊类、马类、犬类、猫类、啮齿类或鼠科物种，并且优选人类，男性或女性。

术语“治疗有效量”是指所述扩增的干细胞群的量会引发研究人员、兽医、医学医生或其他临床医师所寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学应答。然而，应该理解，对于任何特定的对象，扩增的干细胞的具体的量和施用频率可以是变化的，并且将取决于多种因素，包括所用的特定细胞的活性，突变的HOX蛋白的稳定性，以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、植入率、药物组合、特定病症的严重性和在对象中正在进行的治疗。在具体例子中，移植入对象的扩增的细胞的治疗有效量是能够将该移植细胞植入所述对象的量，由此该细胞通过引发所希望的生物学应答来改善所述病症的症状。

应该理解，术语“施用(administration of)”和或“施用(administration a)”组合物是指将干细胞提供、递送或移植给需要治疗的对象。在某些实施方式中，施用给对象的干细胞可以是介于1x10⁶到5x10⁸个细胞/kg体重的量，所述量可以以单剂量或多剂量进行递送。在其他实施方式中，施用给对象的干细胞可以是约10⁶、2x10⁶、5x10⁶、10⁷、5x10⁷、10⁸个细胞/kg体重的量，或介于以上所列值的任一个的量。可以以每天1至5次、每天1-3次、每天一次或两次、或隔天一次的方案施用所述细胞。

然而，应该理解，施用给对象的细胞的具体的量和施用频率可针对不同特定患者而变化，并且可以取决于多种因素，包括所用的特定细胞的活性、所提供的细胞的稳定性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、特定病症的严重程度、以及在对象中正在进行的治疗。

对于骨髓被用于治疗某些癌症的高剂量化疗或放疗所破坏的对象，某些类型的干细胞也可以用作移植物。

在一个实施方式中，需要移植干细胞的对象患有造血性和循环性(血细胞等)疾病或病症，包括但不限于：贫血(例如，再生障碍性贫血(特别是重度再生障碍性贫血)、肾性贫血、癌性贫血、继发性贫血、难治性贫血等)，癌症或肿瘤(例如，白血病)；和化疗后引发的造血功能衰竭、血小板减少症、急性髓细胞性白血病(特别是首次缓解(高危组)、二次缓解和之后的缓解)、急性淋巴细胞性白血病(特别是首次缓解、二次缓解和之后的缓解)、慢性粒细胞白血病(特别是慢性期、转移(transmigration)期间)、恶性淋巴瘤(特别是首次缓解(高危组)、二次缓解和之后的缓解)、多发性骨髓瘤(特别是发作后的早期)等。本发明还针对心脏衰竭、心绞痛、心肌梗塞、心律失常、心脏瓣膜病、心肌/心包疾病、先天性心脏病(如房间隔缺损，室间隔缺损，动脉导管通畅，法洛四联症)、动脉疾病(例如，动脉硬化，动脉瘤，等)、静脉疾病(例如，静脉曲张等)，以及淋巴管疾病(例如，淋巴水肿)、镰状细胞疾病和治疗辐射诱导的损伤、自身免疫性疾病、脑性麻痹、严重肢体缺血、退行性关节病、2型糖尿病、心脏衰竭、多发性硬化症、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨疾病(例如，骨炎，骨质疏松症，骨关节炎，骨肉瘤)、皮肤疾病(例如，牛皮癣、湿疹、皮肤癌)、角膜疾病(如圆锥角膜、角膜炎)和脊髓损伤。

用于本治疗方法的干细胞可以是对象自身的细胞(自体移植)或者供体的细胞(同种异体移植)。当使用所述对象自身的干细胞时，可以在化疗或放疗法前收集所述干细胞“体内采集”，这是因为这些治疗可能会损坏干细胞。在治疗后，可将其注射回体内，例如提升或扩增(“体内扩增”)在所述对象中的所述细胞的质量。在另一实施方式中，可以收集和存储所述对象的干细胞，以及在所述对象体外扩增所述干细胞(“离体扩增”)，并且在必要时将所述细胞注射回所述对象。

在本发明具体的实施方式中，将HOXB4(m)或HOXA9(m)蛋白提供给从对象获得的CD34+细胞，在培养中扩增所述细胞，并通过静脉内注射将所述细胞移植进需要其的对象(例如，人类对象或动物对象)中。移植后，可以评估骨髓中CD34+细胞的数目和接受者中的多谱系植入情况，以确定被移植的细胞是否适当地植入了所述骨髓并且正常运行。

目前用于保存干细胞的方法涉及从胚胎脐带血中收集干细胞和从捐赠的血液中收集干细胞。这些技术的用途很有限，因为在外周血中干细胞总数的比例很小并且由于从输血中可能只能收集到有限量的血液。使用来自成体的干细胞的优点是，使用本发明所述方法可以扩增所述对象的自身的细胞，并且随后再将其引入回所述对象。因此，仍然有未满足的需求，需要收集人干细胞群以进行长期低温保存，例如，在干细胞库中保存，以及为通过自体转移以治疗疾病而冷冻保存的细胞群的最终解冻。用于冷冻保存的干细胞的保存是本领域熟知的。例如，参见Culture of human stem cells(Wiley-Liss,2007)和Cryopreservation and freeze-drying protocols(Humana Press,2007)。这些文献通过引用并入本文。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明，但其不应解释为以任何方式限制本发明。所有引用的参考文献(包括参考文献，授权的专利，和作为引证贯穿本申请的公开的专利申请)的内容在此通过引用明确并入本文。

实施例1.一般方法

细胞培养、质粒和蛋白提取物

在用1μg的所示HOX质粒(泳道1-4)和1、3或9μg的MYC-CUL4A(泳道2-4)转染293T细胞后，确定了针对升高的MYC-CUL4A水平应答的表位标记的HOX蛋白的稳态水平。将所有DNA量针对载体DNA进行基准化，并使用抗MYC(Roche)、抗HA(Covance)和抗β肌动蛋白(SantaCruz)的抗体，利用标准的Western印迹技术检测蛋白水平。

为了测量CUL4A沉默对HOXB4半衰期的效应，用6μg MYC-HOXB4和6μg shCONTROL或6μg shCUL4A瞬时转染HeLa细胞。如之前在Zhang,Y.,et al.Embo J.(2003)；22(22):6057-6067.中所述，进行对转染的HeLa细胞的脉冲追踪。通过免疫沉淀和抗MYC抗体的免疫印迹，确定³⁵S-labeled-MYC-HOXB4和HOXB4降解决定子的突变体的半衰期，并且经由磷酸成像进行定量。

为了确定CUL4A抑制对MYC-HOXB4泛素化的效应，用3μg MYC-HOXB4(泳道1-5)、3μgHIS-泛素(泳道2-5)，和1、3或9μg V5-标记的显性负相的CUL4A(DN-CUL4A,泳道3-5)瞬时转染293T细胞。参见Zhang,Y.,et al.(2003)。被转染的细胞在收获前经25μM MG132处理4hrs。用Ni²⁺-NTA琼脂糖珠(Qiagen)沉淀细胞裂解物，并用抗MYC、V5(Invitrogen)和β微管蛋白(Sigma)的抗体对其进行免疫印迹。

为了确定所述CUL4泛素连接酶对造血祖细胞中内源性HOXB4蛋白水平的效应，从野生型和缺失Cul4a和Cul4b的小鼠中分离骨髓细胞，并使用EasySep^TM小鼠造血祖细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies)富集祖细胞。如之前在Liu,L.,et al.Cell Res.(2012)；22(8):1258-1269中所述，进行基因分型。通过使用标准技术，用抗HOXB4的抗体(CellSignaling)进行Western印迹分析来分析HOXB4的蛋白水平。

使用

多定点诱变试剂盒(Stratagene)生成HOXB4LEXE基序的突变。通过野生型和突变的HOXB4同源结构域(HD)的PCR扩增及其与pEGFP-C2(BD Bioscience)的连接，生成了所述eGFP-HOXB4同源结构域(野生型和突变体)的融合构建体。在用1μg eGFP-HOXB4WT HD(泳道1-4)或1μg eGFP-HOXB4(m)HD(泳道5-8)，连同1μg(泳道2and 6)、3μg(泳道3and 7)或9μg(泳道4and 8)MYC-CUL4A转染293T细胞后，确定了由MYC-CUL4A表达水平的升高而得到的eGFP-HOXB4 HD的稳态水平。将所有DNA量针对载体DNA进行基准化，并使用标准的Western印迹技术检测蛋白水平。

如之前所述，将野生型和突变的HA-HOXB4经逆转录病毒转导进32D细胞，并通过GFP的表达进行分选。参见Zhang,Y.,et al.,(2003).也将单独的MIGRI逆转录病毒载体(缺乏转基因)转导进32D细胞作为阴性对照。通过标准的Western印迹技术确认野生型和突变的HA-HOXB4的异位表达。在IMDM(Mediatech)中培养稳定系，所述IMDM添加有20％血清替代品(Invitrogen)、1％青霉素/链霉素(Mediatech)和2ng/mL鼠IL-3(Miltenyi Biotech)。每三天传代一次细胞，并每天计数。在加入50μM放线菌酮(终浓度)后，测量HOXB4的半衰期。在所示时间收获样品，并通过Western印迹确定HA-HOXB4的水平。

HSC体外测定

为了表达重组蛋白，将野生型和突变的HOXB4亚克隆进所述pTAT-HA表达载体(来自Steven Dowdy博士)。纯化重组蛋白(参见，例如，Lu,SJ.,et al.Stem Cells Dev.(2007)；16(4):547-559)，并使用PD-10柱对其脱盐(GE Healthcare Life Sciences)。经G-CSF动员的CD34+细胞生长在无血清的QBSF培养基(Quality Biological)中，所述QBSF培养基添加有100ng/mL促血小板生成素(Miltenyi Biotech)、c-Kit配体(Amgen)和Flt3配体(Amgen)，并每隔一天补充1μg/mL重组蛋白。用经G-CSF动员的CD34+细胞进行集落形成细胞(CFC)测定法，所述CD34+细胞以3复孔进行培养(500个细胞/板)。每个平板含有1mL半固体培养基，所述半固体培养基含有1.2％甲基纤维素(Corning Chemicals)、20％血清替代品、80μM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、0.125mM血红素(Sigma)、20ng/mLG-CSF(Amgen)、c-kit配体和IL-3(Amgen)，以及6单位/mL促红细胞生成素(Amgen)和1μg/mL重组蛋白。在37℃孵育两周后，评分菌落。

在将G-CSF动员的CD34+细胞移植进NSG小鼠的同时，以96孔的形式将所示数目的G-CSF动员的CD34+细胞加入到MS-5基质细胞中，进行有限稀释的鹅卵石区集落生成(CAFC)实验。每周通过用新鲜培养基(MEM阿尔法(MSKCC)，补充有12.5％马血清(HyClone)、12.5％胎牛血清、80μM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和1μM氢化可的松(Sigma))更换一半培养体积来更换培养物。5周后，使用倒置相差显微镜，对作为MS-5基质层下方的至少五个细胞的相暗造血区的CAFC进行评分。

移植实验

对在MSKCC动物设施中饲养的NOD/SCID/IL2R-γ^null(NSG)小鼠，以250cGy进行辐射(铯源)。经尾静脉注射向每只被辐射小鼠(5只小鼠/组)移植3x10⁵个G-CSF动员的CD34⁺成体HSC(AllCells,LLC,Emeryville,CA)，所述HSC已经由纯化的重组野生型或HOXB4蛋白(1μg/mL)处理过两轮，分别在细胞因子过夜刺激(100ng/mL促血小板生成素、c-Kit配体和Flt3配体)后立即加入和在24小时后加入。在移植过后的12周处死小鼠，并且收获骨髓，通过使用抗人CD19、CD33、CD34和CD45的单克隆抗体(Miltenyi Biotech)用于FACS分析。

实施例2.CUL4A介导HOXB4的泛素化

为研究CUL4A介导的降解是否影响HOXB4，首先进行了实验。MYC标记的HOXB4的稳态水平随MYC-CUL4A水平的上升而下降(图1A)。相反地，通过shRNA对CUL4A的敲低延长了HOXB4的半衰期(图1B，1E)。在加入MG132后，观察到HOXB4被多泛素化，并且显性负相的CUL4A的表达的增强以剂量依赖的方式极大地减少了HOXB4的泛素化(图1C)。

为了确定造血祖细胞中CUL4A和CUL4B对HOXB4稳定性的作用，将来自Cul4a和Cul4b缺失小鼠的造血干细胞和祖细胞中的内源HOXB4蛋白水平和来自其野生型同窝的内源HOXB4蛋白水平进行比较。观察到，Cul4a或Cul4b的缺失导致HOXB4蛋白水平累积的升高(图1D)。总的来说，这些结果表明CUL4A和CUL4B作为HOXB4稳定性的调节剂而发挥作用。为了研究CUL4家族在控制HOXB4的泛素化和降解中的生化机制和功能性意义，本申请中，使用CUL4A来代表CUL4E3连接酶家族的蛋白。

接下来，进行研究以确定其他HOX蛋白质是否受CUL4A介导而降解。的确，代表性的HOX旁系同源组蛋白(包括HOXA1、A2、B7、B8、A11和A13)的稳态水平也随MYC-CUL4A水平的上升而下降(图2)，而HOX辅因子Meis1不受CUL4A介导的降解。因此，CUL4A泛素连接酶对HOX蛋白稳定性的翻译后调节是由保守的机制介导的，例如识别共同的HOX蛋白结构域。

实施例3.CUL4A特异性的HOXB4降解决定子

对存在于所有HOX蛋白中的高度保守的同源结构域的序列比对揭示，在所述全长蛋白质的螺旋I中存在保守的LEXE基序，所述LEXE基序不参与DNA的结合(图3A)。由于几个HOX旁系同源组受CUL4A的翻译后调节，检查了所述保守的LEXE基序是否有可能包括所述CUL4A依赖的降解决定子，或者指示特定的泛素连接酶对其识别进行降解的底物序列。尽管相较于野生型蛋白，所述LEXE[SEQ.ID NO:2]基序的前两个残基的突变延长了HOXB4蛋白的半衰期，但是三重突变体HOXB4(M3)[SEQ.ID No.:4]极大地提高了HOXB4蛋白的稳定性(图3B，C)。

为了确定是否需要天然三级结构情况下的LEXE基序来靶向用于CUL4A介导的降解的蛋白，将野生型或突变的HOXB4同源结构域与eGFP融合，所述eGFP是长寿蛋白，其不是天然的CUL4A底物。eGFP和野生型HOXB4同源结构域的融合使得针对CUL4A介导的降解具有敏感性，而eGFP-HOXB4突变体同源结构域蛋白则对CUL4A水平的上升仍是耐受的(图3D)。这些研究显示，所述HOXB4同源结构域的螺旋I内的LEXE基序构成了可传递的信号，所述信号对于介导CUL4A依赖的降解是必要且充分的。

实施例4.HOX(m)蛋白增强32D的增殖

为了确定CUL4A对HOXB4的降解是否影响造血细胞的增殖潜能，将HOXB4或HOXB4(m)通过逆转录病毒转导进32D鼠骨髓祖细胞系，并且发现HOXB4(m)的稳态水平高于野生型HOXB4，而mRNA水平则是相当的(图4A，4D)。接下来，对其在无血清培养基中生长的比较显示，野生型或抗降解的HOXB4的异位表达导致了相对于对照细胞的明显的生长优势。值得注意的是，在培养了15天后，相较于转导了野生型HOXB4的细胞，表达HOXB4(m)的32D细胞显示细胞数量进一步升高了10倍，代表与转导了单独载体的32D细胞相比，细胞数量升高了10,000倍(图4B)。相应地，HOXB4(m)的半衰期基本上长于野生型HOXB4(图4C)，表明增强的HOXB4(m)蛋白稳定性有助于32D髓系祖细胞的生长优势。

实施例5.HOX(m)维持HSC的潜能

对于干细胞移植，来源于外周血的HSC比来源于脐带血(UCB)的HSC更易获得并且更丰富。为了确定HOXB4对出生后HSC扩增的效应，首先将HOXB4在来源于脐带血的CD34+细胞中的表达与其在G-CSF动员的成体外周血中的表达进行比较。如图5A中由定量RT-qPCR所确定的，HOXB4在G-CSF动员的成体CD34⁺细胞中的mRNA水平比在UCB CD34⁺细胞中低12倍，表明HOXB4可能是G-CSF动员的成体HSC体外扩增的限制性因素，并且将HOXB4蛋白异位性导入G-CSF动员的成体CD34⁺细胞可能促进比UCB CD34⁺细胞更强烈的HSC扩增。

改造抗降解的HOXB4(m)蛋白的一个目标是，克服在HSC和祖细胞的基于蛋白的离体扩增中HOXB4不稳定的性质(t_1/2～1小时)。为了阐明HOXB4(m)蛋白的稳定性，用穿透细胞的HIV TAT蛋白转导结构域标记HOXB4和HOXB4(m)，所述HIV TAT蛋白转导结构域允许有效地穿过细胞膜。在大肠杆菌中将TAT-HA-HOXB4和TAT-HA-HOXB4(m)表达成六聚组氨酸标记的融合蛋白，对其进行亲和纯化，并施用于G-CSF动员的成体CD34⁺细胞上，用于在克隆生成实验中进行评估。在G-CSF动员的CD34⁺细胞中观察到重组型HOXB4和HOXB4(m)蛋白进入细胞中并在核周定位(图6B)，这与被转导的TAT融合蛋白的典型点状分布相一致。还观察到了分散的核定位，特别是对于TAT-HA-HOXB4(m)的分散的核定位(图6B)。在加入野生型或抗降解的HOXB4蛋白后，推定的HOXB4靶基因(例如，Hemgn、Laptm4b)的转录活性是相似的(图7)。如图5B-C中所示，相较于野生型HOXB4蛋白，加入HOXB4(m)后的骨髓和红细胞集落形成细胞的总数增加了>10倍。此外，在HOXB4(m)存在的条件下生长的骨髓(CFU-GM)和红系爆发集落形成细胞(BFU-E)明显更大和更多(图5B-C)。相反地，在加入重组的野生型或抗降解的HOXB4蛋白后，UCB CD34⁺细胞反应相似(图8)，进一步强调了HOXB4(m)在G-CSF动员的成体HSC中的效应。

还进行了有限稀释的鹅卵石区集落生成(CAFC)实验来定量经野生型或抗降解的HOXB4重组蛋白处理的G-CSF动员的成体CD34⁺细胞中HSC的数量。未经处理的细胞用作基线对照。由有限稀释法测得，相较于经野生型HOXB4蛋白处理的对照组和G-CSF动员的CD34⁺细胞，加入抗降解的HOXB4(m)蛋白使HSC的数量加倍(图5D)，表明HOXB4重组蛋白延长的半衰期提升了离体维持和扩增G-CSF动员的HSC的效率。

实施例6.经HOX突变蛋白处理的干细胞群的移植

为了确定野生型相比抗降解的HOXB4蛋白对G-CSF动员的成体HSC和祖细胞的植入的效应，用重组蛋白处理CD34⁺细胞，将其移植进经亚致死性辐射的NOD/SCID/IL2R-γ^null(NSG)小鼠，并在移植后10周对其进行分析。相较于对照组和经野生型HOXB4处理过的小鼠，HOXB4(m)蛋白显著增强了原发性移植小鼠骨髓中人CD34⁺细胞的数量，并且还观察到多谱系的植入(图5E)。值得注意的是，在经HOXB4(m)转导的NSG小鼠的移植骨髓中，检测到原始CD34⁺HSC和祖细胞的百分比升高了5倍。因此，所述抗降解的HOXB4(m)蛋白在体外增强G-CSF动员的HSC的增殖，并且在体内比野生型HOXB4更有效地维持HSC的原始状态。

实施例7.尚有待计划开发递送HOXB4的实用方法，以确保安全性和药物的兼容性。

虽然在逆转录病毒转导之后的HOXB4的异位表达没有报道显示会在小鼠中诱发白血病，此后的后续研究已经发现在大型哺乳动物中白血病的发展与它们移植的组成性表达HOXB4的HSC之间具有因果关系。此外，直接转导野生型HOXB4蛋白重现了与增强HOXB4基因的表达相似的HSC的扩增，但是由于蛋白半衰期较短，因此需要频繁补充所述重组蛋白。

本申请中已经确定，CUL4A负责多个HOX蛋白的蛋白酶体介导的降解。此外，本发明已经鉴定，保守的同源结构域基序对于CUL4A相关的活性是有显著决定性的。例如，所述HOXB4同源结构域和CUL4A的非天然底物的融合足以将该蛋白靶向到CUL4A介导的降解，表明所述HOXB4同源结构域包含真正的CUL4A降解决定子(图3D)。

本申请还显示，删除CUL4家族的任何一个成员会导致HOXB4累积的升高，表明CUL4A和CUL4B在体内的作用是多余的。此外，相较于野生型HOXB4，抗降解的HOXB4增强了鼠32D骨髓祖细胞系的增殖和由G-CSF CD34⁺祖细胞产生的更原始的粒细胞和红细胞系集落，进一步揭示，在HOXB4水平有限的造血祖细胞中，抗降解的HOXB4的效应可以被放大。

实施例5.HOXA9(m)蛋白的表达维持HSC的潜能并且促进骨髓祖细胞的扩增

从HOXA9-/-小鼠分离了小鼠骨髓细胞，并用表达对照病毒(例如，PINCO、MIGR1)、野生型HOXA9蛋白或HOXA9(m)蛋白的逆转录病毒对其进行感染，并且对细胞进行分选并用G-CSF诱导。在为期7天中，使用FACS分析在多个时间点确定细胞分化。结果显示，当HOXA9(m)蛋白被转导进32D骨髓祖细胞中时，其抑制髓样分化。

在骨髓祖细胞永生化的条件下培养细胞，并且每2天计数并铺板细胞。随后比较并计数表达野生型HOXA9蛋白或HOXA9(m)蛋白的细胞，以确定生长的细胞的量。此外，进行集落形成测定法(CFU)以评估野生型HOXA9蛋白和HOXA9(m)蛋白对谱系特异性祖细胞的效应。总的来说，HOXA9(m)蛋白的表达促进骨髓祖细胞的增殖而不造成终末分化。因此，本发明所述HOXA9(m)蛋白能够扩增HSC。

Claims

1.一种分离的HOX突变蛋白，其中所述HOX突变蛋白与野生型HOX蛋白的区别是在如SEQID NO:2所述的LEXE基序上具有突变，其中所述突变是非保守性替换；且

其中所述HOX突变蛋白与野生型HOX蛋白水平相比表现出至少1倍的蛋白量的增加；且

其中所述HOX突变蛋白是HOXB4突变蛋白，其中所述HOXB4突变蛋白包含选自以下组成的组：带有Leu175Asp突变的HOXB4蛋白、带有Leu175Asp和Glu176Lys双突变的HOXB4蛋白，和带有Leu175Asp、Glu176Lys和Glu178Lys三突变的HOXB4蛋白，或

其中所述HOX突变蛋白是HOXA9突变蛋白，其中所述HOXA9突变蛋白包含选自以下组成的组：带有Leu219Asp突变的HOXA9蛋白，带有Leu219Asp和Glu220Lys双突变的HOXA9蛋白，和带有Leu219Asp、Glu220Lys和Glu222Lys三突变的HOXA9蛋白。

2.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其中所述HOXB4突变蛋白是SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其中所述HOXA9突变蛋白是SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列。

4.一种扩增培养的干细胞群的方法，所述方法包括向所述培养的干细胞群提供能扩增所述干细胞群的有效量的根据前述权利要求任一项中所述的HOX突变蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述干细胞群是成体干细胞群。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述干细胞群是造血干细胞群。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述造血干细胞群获自脐带血、外周血、骨髓或脾脏。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述HOX突变蛋白是HOXB4突变蛋白，其中通过向培养基施用以将所述HOXB4突变蛋白提供给所述干细胞群。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述HOXB4突变蛋白附着于能够穿过细胞膜的转运部分，从而将所述HOXB4突变蛋白转运进所述干细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述转运部分是HIV-1的转录反式激活因子(TAT)肽、1型单纯疱疹病毒(HSV)DNA结合蛋白VP22、来自结核分枝杆菌Mce1蛋白的Mtb运载体域或果蝇触角(Antp)同源异型转录因子蛋白的转导域。

11.根据权利要求4所述的方法，其中通过使用载体进行转导以向所述干细胞群提供所述HOX突变蛋白，所述载体包含编码所述HOX突变蛋白的多核苷酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体是病毒载体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述病毒载体选自AAV载体和逆转录病毒载体。

14.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括在包含FMS样酪氨酸激酶3(FLT-3)、促血小板生成素(TPO)和/或CD117(c-Kit)的培养基中培养所述干细胞群。

15.根据权利要求4所述方法制备的干细胞群在制备用于治疗需要移植干细胞的对象的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述需要移植干细胞的对象患有血液疾病。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述需要移植干细胞的对象患有白血病、淋巴瘤或贫血。