CN105056303A - 一种组合物、制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、制剂及其用途。该组合物包括脐带间充质干细胞、生长因子、透明质酸或其盐。本发明还提供了具有快速高效修复面孔缺损的干细胞制剂。充分利用干细胞的增殖分化能力、玻尿酸和透明质酸钠的保湿以及EGF的促进细胞生长作用，达到稳定高效的修复面孔缺损问题。

Description

一种组合物、制剂及其用途

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、制剂及其用途。

背景技术

从生物学上讲，衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现象，表现为结构的退行性变和机能的衰退，适应性和抵抗力减退。在生理学上，把衰老看作是从受精卵开始一直进行到老年的个体发育史。从病理学上，衰老是应激和劳损，损伤和感染，免疫反应衰退，营养失调，代谢障碍以及疏忽和滥用药物积累的结果。

美容和抗衰老越来越成为人们对美丽追求的手段，相应的也出现了越来越多的美容抗衰老产品，在这些产品中，以外用的护肤产品为主，起到延缓衰老和皮肤保持弹性的目的，但这些产品无法满足有面孔缺损等方面问题的人群对美容抗衰老的需求。而本专利的产品能很好的解决这些面孔缺损问题，起到面部缺损修复和面部年轻化的目的。

目前常采用高浓度血浆浓缩(PRP)进行面部缺损修复，是利用自身血液制作的富含血小板的高浓度血浆。但是PRP制剂无细胞成分，主要是血小板，通过血小板分泌各类生长因子促进周围组织细胞的增殖来达到组织修复的功能，缺损修复能力低，时间长。血小板缺陷、纤维蛋白合成障碍、血流动力不稳定等人群不能使用。PRP制剂需要从自体抽取外周血进行血小板浓缩，属于血液制品，不适用于不具备医疗资质的机构单位。

因此，提供一种快速高效修改面孔缺损的干细胞制剂均有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组合物、制剂及其用途。该制剂充分利用干细胞的增殖分化能力、玻尿酸和透明质酸钠的保湿以及EGF的促进细胞生长作用，达到稳定高效的修复面孔缺损问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种组合物，包括脐带间充质干细胞、生长因子、透明质酸或其盐。

在本发明的一些具体实施方案中，组合物还包括玻尿酸。

在本发明的一些具体实施方案中，以mg/mL计，所述生长因子在所述组合物中的质量体积比为1.5～2.5:1。

在本发明的一些具体实施方案中，以cell/mL计，所述脐带间充质干细胞在所述组合物中的密度为5×10⁵。

在本发明的一些具体实施方案中，所述透明质酸盐为透明质酸钠，所述透明质酸钠在所述组合物的中质量百分含量为5％～10％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述透明质酸或所述玻尿酸在所述组合物的中质量百分含量为10％～20％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取脐带清洗后，剥去动、静脉管和外膜，剪碎成1-2mm2小块，倒置培养；

步骤2：加入完全培养基培养，2～3d后半量换液，培养6～8d，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；所述完全培养基包括X-VIVO15无血清培养基和10ng/ml的EGF；

步骤3：待细胞生长至80％融合，弃去培养液，清洗，经0.25％胰酶消化1-2min，终止消化，400g离心5min，收集细胞；

步骤4：在步骤3获得的细胞中加所述完全培养基重悬，传代培养，收集P2或P3代细胞。

具体的，在本发明的另一些实施方案中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：

1.取脐带一根，PBS+200U/m的双抗溶液冲洗3遍；

2.脐带剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜，中间华氏胶剪碎成1-2mm²小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；

3.加入完全培养基(X-VIVO15无血清培养基+10ng/ml的EGF)5ml，2-3天后半量换液，培养6-8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；

4.带生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1-2min，加FBS终止消化，收集细胞400g离心5min；

5.加完全培养基重悬，根据计数结果接种2-3皿；

6.待细胞生长至80％融合后继续传代。取P2和P3代细胞上清液、P2或P3代细胞进行制剂的制备。

在本发明的一些具体实施方案中，所述生长因子的制备方法包括：

步骤1：取脐带清洗后，剥去动、静脉管和外膜，剪碎成1-2mm2小块，倒置培养；

步骤2：加入完全培养基培养，2～3d后半量换液，培养6～8d，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；所述完全培养基包括X-VIVO15无血清培养基和10ng/ml的EGF；

步骤3：待细胞生长至80％融合，弃去培养液，清洗，经0.25％胰酶消化1-2min，终止消化，400g离心5min，收集细胞；

步骤4：在步骤3获得的细胞中加所述完全培养基重悬，传代培养，收集P2或P3代细胞上清液；

步骤5：取步骤4获得的P2或P3代细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质。

具体的，所述生长因子的制备方法包括：

1.收集P2和P3代上清液，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质

2.滤液再经0.22μm滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质

(浓缩过程采用Slice200切向流器，循环过滤的时间为3h)，浓缩比：浓缩前体积：浓缩后体积为3～4:1。

3.浓缩液用冻干机制成冻干粉，备用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述生长因子的制备方法还包括取步骤5获得的产品浓缩和冻干的步骤。

本发明还提供了一种制剂，包含所述组合物和生理盐水，所述生理盐水在所述制剂中的体积百分含量为70％～90％。

具体的，整个制剂中：

生长因子冻干粉浓度为：1.5-2.5mg/ml；(都是以制剂为基准)

脐带间充质干细胞密度为：5×10⁵cell/ml

透明质酸钠质量比为：5％-10％

玻尿酸(透明质酸)体积比为：10％-20％

生理盐水体积比为：70-90％。见图1。

本发明还提供了所述组合物或所述制剂在制备美容和/或抗衰老的药物、保健品和/或化妆品中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述美容为修复缺损。更优选的，所述美容为修复面部缺损。

本发明提供了一种组合物，包括脐带间充质干细胞、生长因子、透明质酸或其盐。本发明还提供了具有快速高效修复面孔缺损的干细胞制剂。充分利用干细胞的增殖分化能力、玻尿酸和透明质酸钠的保湿以及EGF的促进细胞生长作用，达到稳定高效的修复面孔缺损问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示制剂制备的流程图；

图2示实施例4制备的制剂使用前后效果图；其中图2(A)示实施例4制备的制剂使用前效果图；图2(B)示实施例4制备的制剂使用前效果图；

图3示实施例5中细胞增殖曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种组合物、制剂及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

透明质酸钠：透明质酸钠(SODIUMHYALURONATE)为从鸡冠中提取的物质，也可通过乳酸球菌发酵制得，为白色或类白色颗粒或粉末，无臭味，干燥时，氮含量为2.8％-4.0％，葡糖醛酸含量为37.0％-51.0％。在化妆品领域中使用较多，有保湿作用。

玻尿酸：玻尿酸是由双糖单位(葡萄醛酸-N-乙硫氨基葡糖)组成的直链高分子多醣，是一种组织中自然存在的物质。玻尿酸大量存在于人体的结缔组织及真皮层中，是一种透明的胶状物质，具有强大的保湿功能，1公克的玻尿酸可以吸收500C.C的水分，相当于甘油500倍吸水能力。在人类皮肤的真皮层中扮演了基质的重要角色，无论是组织结构上整体的保养或是细胞之间的运送都具有很重要的功能。玻尿酸不仅有保持皮肤弹性的功能，还能锁住大量水分子，对组织具有保湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性，但随着年龄的增长，玻尿酸流失的速度比生长速度快时，肌肤也将渐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性，长久下来便出现皱纹等老化现象。

表皮细胞生长因子：EGF是人体内存在的一种生长因子，它的主要功能是促进皮肤细胞的分裂。研究表明：极微量的EGF即能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各组成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原蛋白等)的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。研究发现，EGF能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态。

脐带间充质干细胞：脐带间充质干细胞(MesnchymalStemCells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。

本发明提供的组合物、制剂及其用途中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脐带间充质干细胞的培养：

1.取健康孕妇脐带一根，PBS+200U/m的双抗溶液冲洗3遍

2.脐带剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜，中间华氏胶剪碎成1-2mm²小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h

3.加入完全培养基(X-VIVO15无血清培养基+10ng/ml的EGF)5ml，2-3天后半量换液，培养6-8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养。

4.带生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1-2min，加FBS终止消化，收集细胞400g离心5min

5.加完全培养基重悬，根据计数结果接种2-3皿。

6.待细胞生长至80％融合后继续传代。取P2和P3代细胞上清液、P2或P3代细胞进行制剂的制备。

实施例2生长因子冻干粉的制备

1.收集P2和P3代上清液，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质

2.滤液再经0.22μm滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质

(浓缩过程采用Slice200切向流器，循环过滤的时间为3h)

3.浓缩液用冻干机制成冻干粉，备用。

实施例3组合物的制备

1.取P2或P3代脐带间充质干细胞一皿，倒去上清液，加PBS清洗1-2遍，加0.25％胰酶消化1-2min，消化完毕，加FBS终止消化，收集细胞，400g离心5min，得到下层细胞；

2.取4-5ml透明质酸钠溶液：1-2ml重悬细胞，3-4ml溶解干细胞生长因子冻干粉

3.用三通管混匀细胞悬液、干细胞冻干粉溶液和0.5-1ml玻尿酸，制成4.5-6ml的组合物。

实施例4制剂的制备(都是以制剂为基准)

实施例2制备的生长因子冻干粉浓度为：1.5-2.5mg/ml；

实施例1制备的脐带间充质干细胞密度为：5×10⁵cell/ml；

透明质酸钠质量比为：5％-10％；

玻尿酸(透明质酸)体积比为：10％-20％；

生理盐水体积比为：70-90％。

实施例5与PRP的对比实验

面孔修复是一个表皮纤维母细胞细胞增殖后填补缺损部位的过程，需要生长因子的刺激作用；本模拟实验通过分别添加PRP和本专利成分培养表皮纤维母细胞，观察细胞增殖情况来对比面孔修复能力和效果。

进行5组实验，分别取5组等量的小鼠P1代表皮纤维母细胞1×10⁵，接种于10cm皿中，

组A添加培养基(DMEM高糖培养基+10％FBS)5ml,

组B1添加培养基(DMEM高糖培养基+10％FBS)5ml，并添加10％PRP成分；

组C1添加培养基(DMEM高糖培养基+10％FBS)5ml，10％实施例4中的制剂，配方为：

生长因子冻干粉浓度为：1.5mg/ml；

脐带间充质干细胞密度为：5×10⁵cell/ml；

透明质酸钠质量比为：5％；

玻尿酸(透明质酸)体积比为：10％；

剩余为生理盐水；

组C2添加培养基(DMEM高糖培养基+10％FBS)5ml，20％实施例4中的制剂，配方为：

生长因子冻干粉浓度为：2.5mg/ml；

脐带间充质干细胞密度为：5×10⁵cell/ml；

透明质酸钠质量比为：10％；

玻尿酸(透明质酸)体积比为：20％；

剩余为生理盐水；

组C3添加培养基(DMEM高糖培养基+10％FBS)5ml，15％实施例4中的制剂，配方为：

生长因子冻干粉浓度为：2.0mg/ml；

脐带间充质干细胞密度为：5×10⁵cell/ml；

透明质酸钠质量比为：8％；

玻尿酸(透明质酸)体积比为：15％；

剩余为生理盐水；

培养过程中，细胞达80％融合进行传代。

结果见表1：

表1试验结果

由表1、图3结果显示：

B和C1、C2、C3增殖速度明显优于A(P＜0.05)；C1增殖速度也明显优于B(P＜0.05)，具有统计学意义。所以本发明实施例4制备的制剂的促进表皮纤维母细胞的增殖效果明显优于PRP(P＜0.05)。

组别C2和C3增殖速度接近，无统计学差异(P＞0.05)，而C2、C3增殖速度明显优于C1(P＜0.05)，所以细胞增殖速度在专利成分达到15％时最快，浓度再增加，不具有促进增殖效果。

效果验证试验：

随机征集20名具有不同程度的面部局部缺损和坑洼的志愿者，分别于当天，1个月后进行一次缺损部位专利制剂注射，并1一个月后进行效果对比，80％及以上修复和改善的有18例。其中一位患者的改善效果见图2。其中图2(A)为使用本发明实施例4制备的制剂前，图2(B)为使用本发明实施例4制备的制剂后。从图2可以明显看出，本发明提供的制剂具有显著治疗面部缺损的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括脐带间充质干细胞、生长因子、透明质酸或其盐。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括玻尿酸。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，以mg/mL计，所述生长因子在所述组合物中的质量体积比为1.5～2.5:1。

4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，以cell/mL计，所述脐带间充质干细胞在所述组合物中的密度为5×10⁵。

5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，所述透明质酸盐为透明质酸钠，所述透明质酸钠在所述组合物的中质量百分含量为5％～10％。

6.根据权利要求1至5任一项所述的组合物，其特征在于，所述透明质酸或所述玻尿酸在所述组合物的中质量百分含量为10％～20％。

7.根据权利要求1至6任一项所述的组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取脐带清洗后，剥去动、静脉管和外膜，剪碎成1-2mm³小块，倒置培养；

步骤2：加入完全培养基培养，2～3d后半量换液，培养6～8d，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；所述完全培养基包括X-VIVO15无血清培养基和10ng/ml的EGF；

步骤3：待细胞生长至80％融合，弃去培养液，清洗，经0.25％胰酶消化1-2min，终止消化，400g离心5min，收集细胞；

步骤4：在步骤3获得的细胞中加所述完全培养基重悬，传代培养，收集P2或P3代细胞。

8.根据权利要求1至7任一项所述的组合物，其特征在于，所述生长因子的制备方法包括：

步骤1：取脐带清洗后，剥去动、静脉管和外膜，剪碎成1-2mm³小块，倒置培养；

步骤2：加入完全培养基培养，2～3d后半量换液，培养6～8d，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；所述完全培养基包括X-VIVO15无血清培养基和10ng/ml的EGF；

步骤3：待细胞生长至80％融合，弃去培养液，清洗，经0.25％胰酶消化1-2min，终止消化，400g离心5min，收集细胞；

步骤4：在步骤3获得的细胞中加所述完全培养基重悬，传代培养，收集P2或P3代细胞上清液；

步骤5：取步骤4获得的P2或P3代细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质。

9.一种制剂，其特征在于，包含如权利要求1至6任一项所述的组合物和生理盐水，所述生理盐水在所述制剂中的体积百分含量为70％～90％。

10.根据权利要求1至8任一项所述的组合物或如权利要求9所述的制剂在制备美容和/或抗衰老的药物、保健品和/或化妆品中的应用。