CN105028197A - 一种石蒜属植物外植体的消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石蒜属植物外植体的消毒方法，该方法包括：从石蒜属植物果实中取出种子，将所述种子表面消毒后置于温水中浸泡，吸胀后取出，再置于升汞中进行涡旋振荡离心处理，处理完成后漂洗干净，获得无菌外植体。本发明将石蒜属植物种子进行温水浸泡后，使种子充分吸水吸胀，再置于升汞中进行短时涡旋振荡，使升汞充分渗入种子中，不仅能够实现充分杀菌，降低石蒜属植物种子的污染率，使污染率控制在5.0％左右，而且能够保持种子的活力，获得较高的种子萌发率。

Description

一种石蒜属植物外植体的消毒方法

技术领域

本发明属于植物快速繁殖技术领域，尤其涉及一种石蒜属植物外植体的消毒方法。

背景技术

石蒜属植物无菌播种体系的建立对其规模化生产繁育、杂交育种和良种选育及石蒜碱的提取具有重要意义。

石蒜属植物的繁育研究多集中在无性繁殖，而种子繁殖是在不影响母鳞茎生长的前提下获得观赏植物花色及花型等自然变异的重要途径。无菌播种较基质播种可以显著提高种子萌发率、促进原生鳞茎发育及增殖，在短期内获得大量无菌苗，这也是解决石蒜属植物快速繁育问题的关键。

目前，关于石蒜属植物无菌播种的报道十分有限。

姚丽娟(姚丽娟，杨燕萍，徐晓薇等.换锦花繁殖技术研究[J].北方园艺.2010(12)：83-85.)初步筛选出换棉花无菌播种的较适培养基MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L，但试验过程中出现污染的比例高达2/3。

而佘琳芳(佘琳芳.石蒜属植物小鳞茎的繁殖技术及其化学调控研究[D].浙江大学，2014.)通过实验证明无菌播种可以明显提高种子繁殖系数(一粒种子最多获得了7个小鳞茎)，但由于污染率过高，未能筛选出最佳培养基配方。

可见，石蒜属植物尚未建立较为成熟的无菌播种繁育体系，这也在很大程度上限制了其规模化生产繁育、园林应用与推广。

现在应用于石蒜属植物无菌播种繁育体系中的消毒方法主要有：果皮燃烧法(佘琳芳.石蒜属植物小鳞茎的繁殖技术及其化学调控研究[D].浙江大学，2014.)、次氯酸钠浸泡法。但是都由于试验中污染率过高而未能筛选出较优的无菌播种灭菌方法。

因此，如何有效地降低污染率成为了石蒜属植物无菌播种技术的关键。

发明内容

本发明提供了一种石蒜属植物外植体的消毒方法，该方法可显著降低石蒜属植物无菌播种过程中种子的污染率，减少细菌、真菌对种子的污染，且提高种子的萌发率。

一种石蒜属植物外植体的消毒方法，包括：

从石蒜属植物果实中取出种子，将所述种子表面消毒后置于温水中浸泡，吸胀后取出，再置于升汞中进行涡旋振荡离心处理，处理完成后漂洗干净，获得无菌外植体。

所述表面消毒的方法包括：将种子置于体积浓度为75％的乙醇中浸泡30～40秒。种子在浸泡前先进行表面消毒可以避免浸泡过程中表面细菌的渗入，降低种子的污染率。

将种子置于温水中浸泡的目的在于使种子充分吸水吸胀以降低渗入种子内部的灭菌试剂的浓度，减小其对种子的伤害，从而保持种子活力。作为优选，所述浸泡的温度为35～38℃，时间为5～6小时。

升汞作为常规的消毒试剂被广泛应用于种子的消毒中，一般采用的质量浓度为0.1％。常规的消毒方法通常是将种子直接浸泡于升汞中进行消毒，并在短时间内取出种子，用清水多次冲洗种子，以避免升汞渗入种子中的浓度过高，伤害种子，降低种子活力。上述方法由于时间较短造成升汞只能对种子进行表面的杀菌，种子内部的消毒效果较差；想要提高消毒效果只能延长浸泡时间，但这又会造成种子活力的降低，影响后续的播种繁殖过程。

通常，内生菌较少的种子采用上述直接在升汞中短时浸泡的方式就可以实现种子的消毒，种子污染率较低；但是，石蒜属植物种子是一种易受内生菌侵染的种子，采用上述直接在升汞中短时浸泡的方法进行消毒，种子的污染率仍然较高，所以上述常规方法不适用于石蒜属植物种子。

实验发现，先将种子进行温水浸泡后，再将浸泡于升汞溶液中的石蒜属植物种子连同升汞溶液一同进行涡旋振荡，种子的污染率显著降低；分析其原因可能是涡旋振荡过程可以使升汞溶液短时间内快速渗入种子中起到杀菌消毒作用；由于涡旋振荡时间较短，加上振荡前已经对种子进行温水浸泡处理，所以升汞不易对种子造成损伤，不会影响种子的活力。

作为优选，所述涡旋振荡离心的频率为2000～2500转/分钟；时间为8～10分钟。

作为优选，浸泡完成后，先将吸胀的种子置于体积分数为75％的乙醇中进行表面消毒，再将消毒后的种子置于升汞中进行涡旋振荡离心处理。所述表面消毒的时间为30～40秒。种子浸泡过程和升汞涡旋振荡过程中间也应该进行消毒，可以进一步避免种子受到污染。

同样，从石蒜属植物果实中取出种子的过程也应该进行消毒，所以，所述石蒜属植物果实的消毒过程包括：用表面活性剂浸泡石蒜属植物果实，后用流水冲洗至无明显泡沫，再用乙醇进行表面灭菌。

所述表面活性剂为吐温或洗洁精。作为优选，表面活性剂浸泡的时间为15～20min。

所述表面灭菌的过程包括：将石蒜属植物果实置于体积浓度为95％的乙醇中浸泡3～5秒后，点燃石蒜属植物果实，燃烧至果实外表皮自然熄灭。

进一步地，所述的石蒜属植物外植体包括：换棉花自交种子、忽地笑自交种子、长筒石蒜与换锦花杂交后的种子、换锦花与红蓝石蒜杂交后的种子。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将石蒜属植物种子进行温水浸泡后，使种子充分吸水吸胀，再置于升汞中进行短时涡旋振荡，使升汞充分渗入种子中，不仅能够实现充分杀菌，降低石蒜属植物种子的污染率，使污染率控制在5.0％左右，而且能够保持种子的活力，获得较高的种子萌发率。

附图说明

图1为实施例5中所述的五种方法消毒后的效果对比图。

图2为实施例1中换锦花自交种子无菌播种萌发20天的状态图。

图3为实施例2中忽地笑自交种子无菌播种萌发15天的状态图。

图4为实施例3中长筒石蒜与换锦花杂交种子无菌播种萌发5天的状态图。

图5为实施例3中长筒石蒜与换锦花杂交种子无菌播种萌发30天的状态图。

图6为实施例4中换锦花与红蓝石蒜杂交种子无菌播种萌发30天的状态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明不仅仅局限于下列实施例。

实施例1

(1)于9～10月采收成熟的换锦花自交果实，置于含少许Tween-20的水中浸泡15分钟，用流水冲洗2小时；于超净工作台上，用镊子夹住果柄将果实浸没于(v/v)95％乙醇3～5秒后，于酒精灯上点燃，燃烧至果皮自然熄灭，再用镊子和解剖刀剥出完整种子，将种子用(v/v)75％酒精表面灭菌30秒，再用去离子水漂洗3遍。

(2)选取色泽黑亮、成熟饱满的种子放于盛装清水的干净柱形瓶中，水面没过种子即可，再将柱形瓶置于37℃水浴锅中水浴6小时。

(3)浸泡完成后将种子夹出放入50mL灭菌离心管，每管放入种子总体积小于等于离心管体积的1/3；向离心管中加入75％乙醇浸泡摇晃消毒30秒，倒出酒精后，再加入(w/v)0.1％升汞溶液至恰好浸没种子。手按住离心管于涡旋振荡器(VOTERSHAKER，型号WH-861)上离心8分钟，最后用无菌水漂洗5遍，每遍不少于3分钟。

(4)于超净工作台上，用无菌镊子夹住种子，种孔朝下，使种子约1/2部分轻插入培养基内，每培养皿接种6粒，每柱形瓶接种4粒。

(5)用于接种的培养基以MS培养基(MurashigeandSkoog，1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

(6)接种完成后，将外植体置于无菌培养室进行光照培养。培养条件为：光照强度约12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度(25±2)℃。

结果：至培养第8天时，仅出现少量真菌污染，污染率为5.0％。经过4℃沙藏30天的换锦花自交种子于培养第3天开始萌发，30天内发芽率达到79.00％。

图2为换锦花自交种子无菌播种萌发20天后小鳞茎状态，子叶基部逐渐膨大、胚根逐渐伸长。

实施例2

(1)于10～11月采收成熟的忽地笑自交果实，置于含少许Tween-20的水中浸泡20分钟，用流水冲洗3小时；于超净工作台上，用镊子夹住果柄将果实浸没于(v/v)95％乙醇3～5秒后，于酒精灯上点燃，燃烧至果皮自然熄灭，再用镊子和解剖刀剥出完整种子，将种子用(v/v)75％酒精表面灭菌30秒，再用去离子水漂洗3遍。

(2)选取色泽黑亮、成熟饱满的种子放于盛装清水的干净柱形瓶中，水面没过种子即可，再将柱形瓶置于37℃水浴锅中水浴6小时。

(3)浸泡完成后将种子夹出放入50mL灭菌离心管，每管放入种子总体积小于等于离心管体积的1/3；向离心管中加入75％乙醇浸泡摇晃消毒30秒，倒出酒精后，再加入(w/v)0.1％升汞溶液至恰好浸没种子。手按住离心管于涡旋振荡器(VOTERSHAKER，型号WH-861)上离心8分钟，最后用无菌水漂洗5遍，每遍不少于3分钟。

(4)于超净工作台上，用无菌镊子夹住种子，种孔朝下，使种子约1/2部分轻插入培养基内，每培养皿接种6粒，每柱形瓶接种4粒。

用于接种的培养基以MS培养基(MurashigeandSkoog，1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

(5)接种完成后，将外植体置于无菌培养室进行光照培养。培养条件为：光照强度约12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度(25±2)℃。

结果：至培养第8天时，仅出现少量真菌污染，污染率为5.2％。于4℃沙藏30天的忽地笑自交种子于培养第10天开始萌发，30天内发芽率达到60.67％。

图3为忽地笑自交种子无菌播种萌发15天后小鳞茎状态，子叶鞘基部逐渐膨大，开始形成初生鳞茎。

实施例3

(1)于9～10月采收成熟的长筒石蒜(母本)与换锦花(父本)的种间杂交果实，置于含少许Tween-20及洗洁精的水中浸泡20分钟，用流水冲洗3小时；于超净工作台上，用镊子夹住果柄将果实浸没于(v/v)95％乙醇3～5秒后，于酒精灯上燃烧至果皮自然熄灭，用镊子和解剖刀剥出完整种子，将种子用(v/v)75％酒精表面灭菌30秒，再用去离子水漂洗3遍。

(2)选取色泽黑亮、成熟饱满的种子放于盛装清水的干净柱形瓶中，水面没过种子即可，再将柱形瓶置于37℃水浴锅中水浴6小时。

(3)浸泡完成后将种子夹出放入50mL灭菌离心管，每管放入种子总体积小于等于离心管体积的1/3；向离心管中加入75％乙醇浸泡摇晃消毒30秒，倒出酒精后，再加入(w/v)0.1％升汞溶液至恰好浸没种子。手按住离心管于涡旋振荡器(VOTERSHAKER，型号WH-861)上离心10分钟，最后用无菌水漂洗5遍，每遍不少于3分钟。

(4)于超净工作台上，用无菌镊子夹住种子，种孔朝下，使种子约1/2部分轻插入培养基内，每柱形瓶接种4粒。

用于接种的培养基以MS培养基(MurashigeandSkoog，1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

(5)接种完成后，将外植体置于无菌培养室进行光照培养。培养条件为：光照强度约12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度(25±2)℃。

结果：至培养第7天时，仅出现少量真菌污染，污染率为4.33％。种子于培养第8天开始萌发，30天内发芽率达到70.00％。

如图4所示，为长筒石蒜(母本)与换锦花(父本)杂交种子无菌播种萌发5天时状态图，子叶鞘逐渐伸长生长。图5为长筒石蒜(母本)与换锦花(父本)种间杂交种子无菌播种萌发30天时状态图，根系逐渐增多变粗，第一片真叶长出，原生小鳞茎形成。

实施例4

(1)于9～10月采收成熟的换锦花(母本)与红蓝石蒜(父本)种间杂交果实，置于加入少许Tween-20和洗洁精的水中浸泡20分钟，用流水冲洗3小时；于超净工作台上，用镊子夹住果柄将果实浸没于(v/v)95％乙醇3～5秒后，于酒精灯上燃烧至果皮自然熄灭，用镊子和解剖刀剥出完整种子，将种子用(v/v)75％酒精表面灭菌30秒，再用去离子水漂洗3遍。

(2)选取色泽黑亮、成熟饱满的种子放于盛装清水的干净柱形瓶中，水面没过种子即可，再将柱形瓶置于37℃水浴锅中水浴6小时。

(3)浸泡完成后将种子夹出放入50mL灭菌离心管，每管放入种子总体积小于等于离心管体积的1/3；向离心管中加入75％乙醇浸泡摇晃消毒30秒，倒出酒精后，再加入(w/v)0.1％升汞溶液至恰好浸没种子。手按住离心管于涡旋振荡器(VOTERSHAKER，型号WH-861)上离心10分钟，最后用无菌水漂洗5遍，每遍不少于3分钟。

(4)于超净工作台上，用无菌镊子夹住种子，种孔朝下，使种子约1/2部分轻插入培养基内，每柱形瓶接种4粒。

用于接种的培养基以MS培养基(MurashigeandSkoog，1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

(5)接种完成后，将外植体置于无菌培养室进行光照培养。培养条件为：光照强度约12.5μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度(25±2)℃。

结果：至培养第8天时，仅出现2粒真菌污染。杂交种子于培养第10天开始萌发，30天内发芽率达到75.00％。

如图6所示，为换锦花(母本)与红蓝石蒜(父本)成熟杂交种子无菌播种萌发30天时状态图，根系逐渐增多伸长，子叶鞘基部膨大，原生小鳞茎形成，第一片真叶长出。

实施例5

采用五种消毒方法进行实验，比较消毒后的换锦花自交种子的受污染情况。(如图1所示)

编号1的消毒方法为果皮燃烧法(佘琳芳.石蒜属植物小鳞茎的繁殖技术及其化学调控研究[D].浙江大学，2014.)；

编号2、3、4、5的消毒方法分别为手摇次氯酸钠法、手摇升汞法、涡旋次氯酸钠法、涡旋升汞法；上述四种方法除采用的消毒试剂及其浓度以及消毒时的振荡方式不同外，其余步骤相同。

上述方法的结果如表1所示：

表1不同成熟换锦花自交种子的无菌播种消毒方法的比较

注：污染率自无菌播种完成后的培养阶段开始统计直至种子萌发30d，统计萌发过程中出现污染的种子数量，即污染率(％)＝污染种子数/种子总数。

由表1可知，编号5的消毒方法将换锦花自交种子的污染率控制在5.0％左右，且仅于接种7～10天后出现少量真菌污染现象，显著低于另外四种对比消毒方法，说明涡旋升汞法为较优的石蒜属植物无菌播种消毒方法，可显著降低污染率。

另外，与涡旋组合的消毒试剂中，升汞更为适宜，可能取决于两方面原因：一、由于石蒜属植物内生菌较多，其它试剂的灭菌力度不足；二、涡旋振荡方式能够更好的使升汞渗入种子内部进行较为彻底的杀菌消毒。

Claims (9)

1.一种石蒜属植物外植体的消毒方法，包括：

从石蒜属植物果实中取出种子，将所述种子表面消毒后置于温水中浸泡，吸胀后取出，再置于升汞中进行涡旋振荡离心处理，处理完成后漂洗干净，获得无菌外植体。

2.如权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，所述表面消毒的方法包括：将种子置于体积浓度为75％的乙醇中浸泡30～40秒。

3.如权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，所述浸泡的温度为35～38℃，时间为5～6小时。

4.如权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，所述涡旋振荡离心的频率为2000～2500转/分钟，时间为8～10分钟。

5.如权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，浸泡完成后，先将吸胀的种子置于体积分数为75％的乙醇中表面消毒，消毒时间为30秒，再将消毒后的种子置于升汞中进行涡旋振荡离心处理。

6.如权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，所述石蒜属植物果实的消毒过程包括：用表面活性剂浸泡石蒜属植物果实，后用流水冲洗至无明显泡沫，再用乙醇进行表面灭菌。

7.如权利要求6所述的消毒方法，其特征在于，表面活性剂浸泡的时间为15～20min。

8.如权利要求6所述的消毒方法，其特征在于，表面灭菌的过程包括：将石蒜属植物果实置于体积浓度为95％的乙醇中浸泡3～5秒后，点燃石蒜属植物果实，燃烧至果实外表皮自然熄灭。

9.如权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，所述的石蒜属植物外植体包括：换棉花自交种子、忽地笑自交种子、长筒石蒜与换锦花杂交后的种子、换锦花与红蓝石蒜杂交后的种子。