CN105018407A - 一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物酶工程技术领域。本发明将编码脯氨酸氨肽酶的基因以pMA5为表达载体，导入枯草芽孢杆菌WB600得到重组菌，并实现分泌表达，胞外酶活达到36.0U/mL，为脯氨酸氨肽酶的工业化生产和食品工业中的应用奠定了很好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物酶工程技术领域。
背景技术
氨肽酶(aminopeptidases，简称Aps，EC3.4.11)是一类从蛋白或多肽N段逐个水解氨基酸的外肽酶，在蛋白水解物脱苦，蛋白和多肽的N端测序，蛋白原料深加工和生物活性肽制备等方面都有着重要的作用。脯氨酸氨肽酶(prolyl aminopeptidase，简称PAP，EC3.4.11.5)是具有严格底物特异性的氨肽酶，特异地水解多肽或蛋白N-端的脯氨酸残基，在蛋白类食品水解加工产物苦味的去除，胶原蛋白水解等方面都有着较好的应用前景。
目前对氨肽酶的研究主要集中在基因克隆、表达、纯化和特性表征上，大肠杆菌由于培养条件简单、生长繁殖快而成为最广泛使用的表达系统，但由于其致病性、较易形成包涵体和较低的分泌效率而限制了其在食品工业中的应用；毕赤酵母作为一种简单的单细胞真核表达系统可以对异源蛋白进行修饰并分泌到培养基中，因此也有在毕赤酵母中进行表达的，但由于毕赤酵母需要甲醇诱导和培养周期长而使其在食品工业中的应用受到限制。
目前脯氨酸氨肽酶的表达大多来自野生菌，主要集中在其性质研究且表达水平低，而且大多数脯氨酸氨肽酶都为胞内酶。目前为止，还未见有脯氨酸氨肽酶在枯草芽孢杆菌中表达的报道，本发明着眼于此且针对目前脯氨酸氨肽酶表达效率低、胞外分泌能力弱的缺点利用枯草芽孢杆菌表达系统对脯氨酸氨肽酶进行高效表达，并通过适当的分泌策略使其更多的分泌到胞外。
发明内容
本发明首先提供了一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌是将编码脯氨酸氨肽酶的基因以pMA5为表达载体，导入枯草芽孢杆菌WB600而得到的重组菌。
所述编码脯氨酸氨肽酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种构建所述分泌表达脯氨酸氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌的方法，是将目的基因通过BamH I、Mlu I酶切位点与表达载体pMA5连接，转化至枯草芽孢杆菌WB600中，筛选得到阳性转化子。
本发明还提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌生产脯氨酸氨肽酶的方法，是将重组枯草芽孢杆菌活化后，按1％的接种量接种于分泌培养基中37℃，220rpm培养24h，脯氨酸氨肽酶分泌到胞外。所述分泌培养基是添加了5％山梨醇和2mM CaCl2的TB培养基。
本发明实现了脯氨酸氨肽酶的分泌表达，发酵24h胞外酶活达到36.0U/mL。
附图说明
图1脯氨酸氨肽酶基因扩增结果(M：2000DNA Marker，1、2：目的基因PCR)
图2重组质粒单、双酶切验证(M1：10000DNA Marker，1：重组质粒Mlu I单酶切，2：重组质粒双酶切，3：PCR产物，M2：2000DNA Marker)
图3枯草芽孢杆菌重组质粒单、双酶切验(M1：10000DNA Marker，1、2重组质粒BamHI单酶切，3、4：重组质粒双酶切，5：PCR产物)
图4重组枯草芽孢杆菌表达SDS-PAGE结果((a)：WB600(pMA5)对照，(b)：WB600(pMA5-pap)重组菌，M：低分子量蛋白标准，1：WB600(pMA5)全细胞，2：WB600(pMA5)发酵上清液，3：WB600(pMA5)破碎后上清；4：WB600(pMA5-pap)全细胞，5：WB600(pMA5-pap)发酵上清液，6：WB600(pMA5-pap)破碎后上清)
图5分泌表达SDS-PAGE结果(M：低分子量蛋白标准，1：TB发酵上清液，2：STB发酵上清液)
图6第二次Hitrap Q HP离子交换层析
图7重组脯氨酸氨肽酶最适pH
图8重组脯氨酸氨肽酶pH稳定性
图9重组脯氨酸氨肽酶最适温度
图10重组脯氨酸氨肽酶温度稳定性
图11重组脯氨酸氨肽酶动力学参数
图12重组脯氨酸氨肽酶耐盐性
具体实施方式
材料和检测方法
LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH7.0。
TB培养基：1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母粉，72mM K2HPO4，17mM KH2PO4，0.4％甘油。
分泌培养基(STB)：1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母粉，5％山梨醇，72mM K2HPO4，17mMKH2PO4，0.4％甘油，2mM CaCl2。
pMA5、PrimeSTARMax DNA polymerase、限制性内切酶BamH I和Mlu I、T4连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。
脯氨酸氨肽酶酶活测定方法：以L-脯氨酸-对硝基苯胺为底物(底物储藏液用Tris-HCl 7.5配制，浓度为4.25mM)，反应混合物包括1mL稀释后的酶液，2mL Tris-HCl 7.5缓冲液和1mL底物储藏液，50℃水浴反应10min，在405nm处测定吸光值。一个酶活单位(U)定义为50℃每分钟分解L-脯氨酸-对硝基苯胺产生1μM对硝基苯胺所需的酶量。
实施例1脯氨酸氨肽酶枯草芽孢杆菌的构建方法
根据脯氨酸氨肽酶cDNA序列(SEQ ID NO.1)设计引物:上游引物P1：5'CGGGATCCATGGCTGCCAAAC 3'(BamHⅠ)；下游引物P2：5'CGCGACGCGTCTAATCAATAGAGTC 3'(MluⅠ)。扩增得到带有BamHⅠ、MluⅠ酶切位点的目的基因，将目的基因与质粒pMA5用BamHⅠ和MluⅠ进行双酶切，胶回收纯化后16℃连接过夜转化大肠杆菌JM109并涂布含氨苄的LB平板，待长出转化子后进行菌落PCR验证，将阳性转化子培养后提取质粒双酶切验证，验证正确的重组质粒pMA5-pap送上海生工测序。
将构建好的重组质粒pMA5-pap电转化至枯草芽孢杆菌WB600中，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性重组子，具体步骤如下：
(1)新鲜平板挑单菌落接种于3mL LB培养基中，过夜培养；
(2)取2.6mL过夜培养物接入GM培养基中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.85～0.95(大约3～4h)；
(3)将菌液冰水浴10min，于4℃，5000g离心5min收集菌体；
(4)用50mL预冷的电转培养基ETM重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次；
(5)将洗涤后的菌体吹悬于1mL电转培养基ETM中，每管分装60μL；
(6)60μL感受态细胞加入1μL(50ng/μL)DNA，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次(12.5kv/cm，25μF，200Ω，4.5ms～5.0ms)；
(7)电击完毕取出杯子并立即加入1mL RM，37℃，200rpm，复苏3h后涂布卡那霉素抗性LB平板上，37℃过夜培养。
(8)挑取转化子PCR快速验证，提取质粒双酶切验证正确的即为重组枯草芽孢杆菌。
实施例2重组枯草芽孢杆菌分泌表达脯氨酸氨肽酶的方法
挑取LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上的重组枯草芽孢杆菌单菌落于50mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中37℃，220r培养14h，再按1％的接种量接种于50mL STB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中37℃，220r培养24h。发酵结束后，8000r，4℃离心10min，所得发酵上清液即为脯氨酸氨肽酶粗酶液，测得酶活为36.0U/mL。
实施例3重组枯草芽孢杆菌所分泌脯氨酸氨肽酶的特性表征
实施例2中所得粗酶液经过两次Hitrap Q HP离子交换层析后获得基本达电泳纯的脯氨酸氨肽酶，并对其进行表征，结果表明：最适反应温度均为50℃，在50℃及以下表现出良好的温度稳定性；最适反应pH为7.5，在pH6-11之间有较好的pH稳定性；对脯氨酸-对硝基苯胺有严格的底物特异性；米氏常数Km和最大反应速率Vmax分别为0.171mmol L-1和55.99μmol min-1。与重组大肠杆菌表达的胞内脯氨酸氨肽酶特性基本一致，说明在枯草芽孢杆菌中进行分泌表达后并未对酶的结构和特性造成改变。另外还对重组脯氨酸氨肽酶的耐盐性进行了表征，发现其耐盐性与盐的种类无关，在高盐浓度下并未影响该酶的活力反而酶活力有所提高，当NaCl浓度达到4.36M时，剩余酶活还有109.95％，说明该酶能耐受很高的盐浓度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是将编码脯氨酸氨肽酶的基因以pMA5为表达载体，导入枯草芽孢杆菌WB600而得到的重组菌；所述编码脯氨酸氨肽酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种构建权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，是将目的基因通过BamH I、Mlu I酶切位点与表达载体pMA5连接，转化至枯草芽孢杆菌WB600中，筛选得到阳性转化子。
3.一种应用权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌生产脯氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，是将重组枯草芽孢杆菌活化后，接种于额外添加了5％山梨醇和2mM CaCl2的TB培养基中进行发酵培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是将重组枯草芽孢杆菌活化后，按1％的接种量接种于额外添加了5％山梨醇和2mM CaCl2的TB培养基中，于37℃、220rpm培养24h；从发酵上清液中收集得到脯氨酸氨肽酶。
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