CN104974973A - 生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法。通过如下方法生产软骨素：培养引入了衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因并具有产生软骨素之能力的产生UDP-葡糖醛酸的细菌；以及从该细菌中收集软骨素。
Description
本申请是申请日为2008年4月24日的中国专利申请200880013071.8“生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法。
背景技术
软骨素是一种包括葡糖醛酸(GlcUA)残基和N-乙基-D-半乳糖胺(GalNAc)残基的二糖重复结构的多糖(-GlcUAβ(1-3)-GalNAcβ(1-4)-，在本说明书中，也称为软骨素糖骨架)。硫酸软骨素是由软骨素的硫酸化组成的多糖。
传统上从动物的软骨、器官等提取和纯化软骨素和硫酸软骨素。然而，近年来，因为诸如软骨和器官之类的材料不足，已经研究了人工合成对于软骨素和硫酸软骨素而言常见的糖骨架的技术。
已经报道了软骨素合酶，其通过交替地将GlcUA和GalNAc从它们的供体底物转移至受体寡糖而产生软骨素，并且已经提出了应用该酶生产软骨素的方法。
J.Biol.Chem.275(31)，24124-24129(2000)公开了衍生自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的软骨素合酶。
此外，WO 2003/102193和WO 2003/102194公开了衍生自人类的软骨素合酶。
此外，US 2003-0109693(JP 2003-199583 A)公开了由大肠杆菌(Escherichia coli)K4株产生的新软骨素合酶(KfoC)。
然而，在通过酶方法生产软骨素的情况下，需要制备昂贵的材料，诸如作为受体的寡糖和作为GlcUA和GalNAc的供体的糖核苷酸，因此期望应用更便宜的材料生产软骨素的方法。
已知大肠杆菌K4株产生具有软骨素骨架结构的多糖作为荚膜。然而，其结构由包括GalNAc残基、GlcUA残基和果糖残基的三糖的重复单元组成，其中所述的果糖残基与GlcUA残基的C3-羟基连接。此外，在大肠杆菌中已经检测到了超过100种化学上不同的荚膜多糖。例如，大肠杆菌K5株产生具有肝素/硫酸乙酰肝素的糖骨架的荚膜多糖K5(J.Biol.Chem.，272(5)，p2682-2687，1997)。然而，还不知道有产生软骨素本身的大肠杆菌的存在。因此，应用大肠杆菌生产软骨素的方法是未知的。
尽管美国公开专利申请2007-0281342公开了通过应用引入了衍生自多杀性巴氏杆菌的软骨素合酶基因的重组革兰氏阳性菌生产软骨素的方法，然而期望在软骨素的发酵生产中有更进一步的发展。
发明内容
本发明的一个目的是提供能够生产软骨素的新微生物，以及应用该微生物生产软骨素的新方法。
本发明的发明人进行了深入的研究，结果发现引入了衍生自大肠杆菌K4株kfoA和kfoC基因的产生UDP-葡糖醛酸的细菌诸如大肠杆菌K5株高效地产生软骨素，因此完成了本发明。
本发明的一个目的是提供引入了衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因并且具有产生软骨素的能力的产生UDP-葡糖醛酸的细菌。
在本文中，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因优选为编码选自由以下(A)和(B)所组成的组的蛋白的基因：
(A)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质；以及
(B)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。
所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因优选为选自由以下(a)和(b)组成的组的DNA：
(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和
(b)在严格条件下与包含和SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码包含UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为编码选自由以下(C)和(D)所组成的组的蛋白的基因：
(C)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质；以及
(D)包含SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有软骨素合酶活性。
此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为选自由以下(c)和(d)组成的组的DNA：
(c)包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA；和
(d)在严格条件下与包含和SEQ ID NO：3互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有软骨素合酶活性的蛋白的DNA。
此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为编码选自由以下(E)和(F)所组成的组的蛋白的基因：
(E)包含SEQ ID NO：6氨基酸序列的蛋白质；以及
(F)包含SEQ ID NO：6氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有软骨素合酶活性。
此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为选自由以下(e)和(f)组成的组的DNA：
(e)包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的DNA；和
(f)在严格条件下与包含和SEQ ID NO：5互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有软骨素合酶活性的蛋白的DNA。
所述的产生UDP-葡糖醛酸的细菌优选为大肠杆菌K5株。
本发明的另一目的是提供生产软骨素的方法，其至少包括以下步骤(1)和(2)：
(1)培养如上所述的细菌；以及
(2)从该培养物中收集软骨素。
本发明的另一目的是提供生产硫酸软骨素的方法，其包括：通过如上所述的方法生产软骨素；以及然后将该软骨素硫酸化以产生硫酸软骨素。
本发明的另一目的是提供包含衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因的载体。
附图说明
图1是显示了用于表达kfoA和kfoC基因的载体结构的图。
图2是显示了kfoA和kfoC蛋白表达的图(照片)。泳道1显示没有引入质粒的菌株(对照)，泳道2显示引入了pTrcHis-kfoCA的菌株，以及M显示分子量标记。
图3显示了对于用软骨素酶ABC(cABC)处理的级分L(A)、没有用cABC处理的级分L(B)以及用热灭活的cABC处理的级分L(C)，采用荧光HPLC系统的二糖组成分析的结果。
图4显示了对于用cABC处理的级分E(A)、没有用cABC处理的级分E(B)以及用热灭活的cABC处理的级分E(C)的荧光二糖分析的结果。
图5显示了对于用cABC处理的级分S(A)、没有用cABC处理的级分S(B)以及用热灭活的cABC处理的级分S(C)的荧光二糖分析的结果。
图6显示了对于用cABC处理的软骨素标准品(A)、用cABC处理的软骨素标准品和用cABC处理的级分L的混合物(B)的荧光二糖分析的结果。
图7是显示了应用(A)抗-KfoC抗体(EK-C)作为一抗、(B)抗-KfoA抗体(EK-A)作为一抗以及(C)正常兔血清，KfoA、KfoC和KfoΔC蛋白表达的图(照片)。泳道1和5显示分子标记MagicMarkXP标准品(Invitrogen)，泳道2显示引入了pTrcHis-kfoCA的菌株，泳道3显示引入了pTrcHis-kfoΔCA的菌株，以及泳道4显示引入了pTrcHis-kfoA的菌株。
具体实施方式
在下文中，将详细地描述本发明。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌是引入了衍生自大肠杆菌K4株的kfoA和kfoC基因的产生UDP-葡糖醛酸且具有产生软骨素的能力的细菌。
“产生UDP-葡糖醛酸的细菌”提供了UDP-葡糖醛酸，其可被用于产生包含葡糖醛酸的多糖。对“产生UDP-葡糖醛酸的细菌”没有限制，只要其产生UDP-葡糖醛酸，并且其实例包括属于葡糖酸醋杆菌属的细菌，诸如汉森葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii)和木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)；属于根瘤菌(Rhizobium)属的细菌，诸如Rhizobium meffloti；属于醋酸杆菌(Acetobacter)属的细菌，诸如木醋杆菌(Acetobacter xylinum)；属于欧文氏菌(Erwinia)属的细菌，诸如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)；属于硫杆菌(Thiobacillus)属的细菌，诸如氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)；属于木杆菌属(Xylella)属的细菌，诸如苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；属于中华根瘤菌属(Sinorhizobium)属的细菌，诸如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)；属于红球菌(Rhodococcus)属的细菌，诸如玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)；属于克雷伯氏菌(Klebsiella)属的细菌，诸如产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)；属于肠杆菌(Enterobacter)属的细菌，诸如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)；属于埃希氏杆菌(Escherichia)属的细菌，诸如大肠杆菌。
“产生UDP-葡糖醛酸的细菌”优选为属于埃希氏杆菌属并能产生UDP-葡糖醛酸的细菌，以及更优选为属于大肠杆菌并能产生UDP-葡糖醛酸的细菌。
其具体的实例包括大肠杆菌K5菌株。K5菌株被保藏在美国典型培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，美利坚合众国)，登录号为ATCC23506并且可从ATCC的目录或主页上获得。
待引入kfoA和kfoC基因的菌株可以是大肠杆菌K5菌株的衍生菌株，并且此类衍生菌株可通过遗传重组将基因突变引入该大肠杆菌K5株或将基因引入该大肠杆菌K5株而获得。也就是说，本发明的细菌的一方面包括：通过将衍生自大肠杆菌K4株的kfoA和kfoC基因引入大肠杆菌K5株而获得的菌株；通过将衍生自大肠杆菌K4株的kfoA和kfoC基因引入大肠杆菌K5株并进一步引入基因突变而获得的菌株；以及通过将衍生自大肠杆菌K4株的kfoA和kfoC基因引入大肠杆菌K5株并进一步引入另一基因而获得的菌株。
衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因的实例包括编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质的DNA，以及包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA。
一般而言，在一个或几个组成蛋白质的氨基酸中的替换、缺失、插入或添加对该蛋白质的活性没有影响，因此，许多情况下，衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因可以是编码这样的蛋白的基因，所述蛋白包含SEQ ID NO：2氨基酸序列，并且包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。
本文所使用的短语“一个或几个氨基酸”是指可能引起替换、缺失、插入或添加，但不会损害UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性的氨基酸数目。具体而言，该数目例如是1至20的整数，优选为1至10的整数，更优选为1至5的整数。
同时，衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因可以是编码这样的蛋白的基因，所述蛋白包含与SEQ ID NO：2的整个序列的同一性不少于90％、优选同一性不少于95％、更优选同一性不少于98％的氨基酸序列，并具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。
可通过PCR应用大肠杆菌K4株的染色体DNA作为模版获得衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因。
大肠杆菌K4株已被保藏在美国典型培养物保藏所(American TypeCulture Collection)(ATCC)，登录号为ATCC23502并且可从ATCC的目录或主页上获得。
可通过点特异性诱变(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.Enzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.Enzymol.，154，367(1987))等修饰SEQID NO：1的核苷酸序列以将一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加引入到SEQ ID NO：2的氨基酸序列上，从而获得编码包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加的包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2的整个序列的同一性不少于90％的氨基酸序列，且具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性的蛋白质的基因。
还可通过以下方法获得该基因：通过在严格条件下与包含和SEQ IDNO：1的核苷酸序列或其部分序列互补的核苷酸序列的DNA杂交来筛选编码具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性的蛋白质的DNA。
术语“严格条件”是指在其中形成所谓的特异性杂交、且不形成非特异性杂交的条件(参见Sambrook，J.等，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，等)。“严格条件”的具体实例包括这样的条件：在42℃在含有50％甲酰胺、4×SSC、50mMHEPES(pH 7.0)、10×Denhardt溶液、100μg/ml鲑精DNA的溶液中杂交，在室温下用2×SSC、0.1％SDS溶液洗涤，并且然后在60℃用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。
可通过将得到的基因引入到合适的宿主中以表达该蛋白并然后根据J.Biol.Chem.，277(24)，p21567-21575，2002中描述的方法测量UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性，从而判断如上所述获得的基因是否编码具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性的蛋白。
衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因的实例包括编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质的DNA以及包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA。衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因的实例还包括编码包含SEQID NO：6氨基酸序列的蛋白质的DNA以及包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的DNA。
衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因可以是编码这样的蛋白的基因，所述蛋白包含SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列，并且包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并且具有软骨素合酶活性。
衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因可以是编码这样的蛋白的基因，所述蛋白包含与SEQ ID NO：4或6的整个序列的同一性不少于90％、优选同一性不少于95％、更优选同一性不少于98％的氨基酸序列，并具有软骨素合酶活性。
本文所使用的术语“软骨素合酶活性”是指将GlcUA从GlcUA供体或将GalNAc从GalNAc供体交替地转移至糖链的非还原端的活性。
可通过PCR应用大肠杆菌K4株的染色体DNA作为模版来获得衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因。此外，还可根据WO2007/145197中描述的方法获得编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列的kfoC基因，诸如包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的DNA。
可通过点特异性诱变等修饰SEQ ID NO：3或5的核苷酸序列以将一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加引入到SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列上，从而获得编码包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加的包含SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4或6的整个序列的同一性不少于90％的氨基酸序列，并且具有软骨素合酶活性的蛋白质的基因。
还可通过以下方法获得该基因：通过在严格条件下与包含和SEQ IDNO：3或5的核苷酸序列或其部分序列互补的核苷酸序列的DNA杂交来筛选编码具有软骨素合酶活性的蛋白质的DNA。
术语“一个或几个”和“严格条件”的定义与上面描述的相同。
可通过将得到的基因引入至合适的宿主以表达该蛋白并然后根据US 2003-0109693(JP 2003-199583 A)中描述的方法测量软骨素合酶活性，从而判断如上所述获得的基因是否编码具有软骨素合酶活性的蛋白。
可通过将衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因引入至如上所述的产生UDP-葡糖醛酸的细菌中而获得本发明的细菌。
在本发明中使用的术语“引入”包括应用载体诸如质粒或噬菌体将两个基因引入到产生UDP-葡糖醛酸的细菌中，以及通过同源重组等将两个基因引入到产生UDP-葡糖醛酸的细菌的染色体上。
对在本文中应用的载体诸如质粒或噬菌体没有特别地限制，只要它们可以用于将基因引入到大肠杆菌中，它们的实例包括pTrcHis(Invitrogen公司)、pET载体(Novagen)和pGEX载体(AmershamPharmacia)。
在引入衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因时，可以使用该基因的天然启动子，但优选应用在大肠杆菌中强有力的启动子，诸如lac启动子、trp启动子、trc启动子、PR启动子或lacUV启动子。
可以一个接一个地引入或使用单个载体同时引入衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和kfoC基因。更优选应用携带kfoA和kfoC基因两者的载体，诸如质粒或噬菌体，因为可以容易地完成所述基因的引入和表达。
可以这样引入衍生自大肠杆菌K4株的kfoA和kfoC基因，以使得将它们表达为与其它肽的融合蛋白。
其它肽的实例包括聚组氨酸标签和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)标签。以融合蛋白形式表达基因产物是优选的，因为这样可以很容易地进行基因产物的检测(表达的确认)。
可通过已知的转化方法进行基因的引入。所述方法的实例包括电穿孔方法、DEAE-葡聚糖方法和磷酸钙方法。
可通过以下方法确认基因的引入：检测基因的方法，例如RT-PCR或RNA印迹；特别地检测重组蛋白质表达的方法，诸如蛋白质印迹；以及如上所述的活性测量方法。
如果所导入的衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因在产生UDP-葡糖醛酸的细菌中工作的话，则该细菌获得了产生软骨素作为荚膜多糖的能力。
<2>生产软骨素的方法
本发明的生产软骨素的方法至少包括以下步骤(1)和(2)。
(1)培养本发明的细菌。
(2)从该培养物收集软骨素。
可通过用于培养属于埃希氏杆菌属的细菌的一般方法进行所述培养。
对培养基没有特别的限制，只要其能用于培养属于埃希氏杆菌属的细菌，并且其优选实例包括LB培养基(Luria-Bertani培养基)(每升含有10.0g的细菌用胰蛋白胨、5.0g的细菌用酵母提取物和5.0g的NaCl)和CYG培养基(2.0％酪蛋白氨基酸、0.5％酵母提取物和0.2％葡萄糖，高压灭菌前调节pH至7.0)。在应用含有抗生素抗性基因的载体来引入基因的情况下，所述培养基优选含有相应于该基因的抗生素。
对培养条件没有特别地限制，只要属于埃希氏杆菌属的细菌能够生长即可，为了能高效地生产软骨素，优选在20至40℃培养8至72小时。
为了高效地生产软骨素，可以在板或流体培养基中预培养细菌。
对从培养物中收集软骨素的方法没有特别地限制，只要能收集软骨素即可，并且其实例包括以下中描述的方法。具体而言，将收集的重组细胞重悬在PBS(磷酸盐缓冲的盐水)等中；用溶菌酶、DNA酶I和蛋白酶K处理该细胞；并且移除蛋白质。例如可通过用软骨素酶处理该级分并进行二糖组成分析来检测软骨素。
<3>生产硫酸软骨素的方法
可通过进一步把从本发明中公开的重组细菌中制备的软骨素硫酸化而制备硫酸软骨素。
可通过已知的硫酸化糖胺聚糖的方法来进行所述的硫酸化，对所述方法没有特别地限制，其实例包括在JP 61-47701 A中描述的方法。
此外，可应用用于将硫酸基团转移至软骨素的酶(磺基转移酶)来进行所述硫酸化。在存在3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸(PAPS)作为硫酸根供体的情况下，磺基转移酶能通过对由本发明公开的重组细菌产生的软骨素作出反应而产生硫酸软骨素。用于将硫酸基团转移至软骨素的已知的磺基转移酶的实例包括软骨素6-O-硫酸基团转移酶(J.Biol.Chem.，275(28)，21075-21080(2000))和半乳糖胺基聚糖4-硫酸根基团转移酶(JP2000-4877 A).
实施例
下面，将参考实施例详细地描述本发明。
实施例1：制备KfoC/KfoA共表达载体
<KfoA基因的扩增>
应用大肠杆菌K4菌株的染色体DNA作为模板，根据J.Biol.Chem.，277卷，24期，21567-21575中描述的方法进行PCR，然后将得到的PCR产物插入到pTrcHis(组氨酸融合蛋白表达载体，Invitrogen)中，由此产生pTrcHis-kfoA。
所使用的引物如下：
K4A-SP：5′-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3′(SEQID NO：7)和
K4A-AS：5′-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3′(SEQID NO：8)。
<KfoC基因的扩增>
应用大肠杆菌K4菌株的染色体DNA作为模板，根据P 2003-199583A中描述的方法进行PCR，然后将得到的PCR产物插入到pTrcHis中，由此产生pTrcHis-kfoC。
所使用的引物如下：
K4C-SP：5′-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3′(SEQID NO：9)和
K4C-AS：5′-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3′(SEQID NO：10).
<pTrcHis-kfoCA的制备>
按下列方式从上述pTrcHis-kfoA和pTrcHis-kfoC制备pTrcHis-kfoCA。
首先，通过PCR将NotI-SalI位点引入pTrcHis-kfoC的C端序列。应用以下所示的引物进行PCR，以从kfoC的C端侧扩增pTrcHis-kfoC的全长，然后使得到的PCR产物自身连接，由此产生质粒pTrcHis-kfoC-NotI-SalI。
所使用的引物如下：
NotSal-pTrcHisC-rev：
5’-GCGGCCGCAAAACAGCCAAGCTTCGAATTC-3’(SEQ ID NO：11)和
NotSal-pTrcHisC-for：
5’-ACGCGTCGACGGCGGATGAGAGAAGATTTTCA-3’(SEQ ID NO：12)
然后分别在核糖体结合位点(RBS)的上游以及pTrcHis-kfoA的kfoA的C端区域设计引物(NotI-RBS-KfoA-N：5’-GCGGCCGCAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGA-3’(SEQID NO：13)和SalI-KfoA-C：5’-GTCGACCTCTCATCCGCCAAAACA-3’(SEQ ID NO：14))，并用于使用pTrcHis-kfoA作为模版的PCR。然后，将得到的PCR产物插入到pCR4-TOPO(Invitrogen)，由此产生pCR4-TOPO-kfoA。
用NotI-SalI从pCR4-TOPO-kfoA切除含有kfoA的插入片段，并引入到pTrcHis-kfoC-NotI-SalI的NotI-SalI位点上，并且将得到的质粒命名为pTrcHis-kfoCA(图1)。
实施例2
重组的KfoC和KfoA的共表达
通过电穿孔(细胞100μL，200Ω，25μL，2.5kV，小池0.1cm)将表达载体pTrcHis-kfoCA引入到大肠杆菌K5株中，由此产生大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA株。将克隆转移到补充有100ppm氨苄青霉素的LB培养基中，并且然后将种子培养物在37℃温育过夜。将1mL所述种子培养物转移至20mL补充有100ppm氨苄青霉素的CYG培养基中。将重组的细菌在37℃培养3小时(OD600＝1.8，1.7-2.0)，并且然后往该培养物中添加IPTG，终浓度为1.0mM。将得到的培养物在37℃再培养5小时，以诱导重组蛋白的表达。
通过离心从900μL培养物中收集细菌细胞。使得到的细胞悬浮于90μL Laemmli缓冲液(×1)中。在沸水浴中加热10分钟后，使10μL上清液在5/20％滴度凝胶中进行SDS-PAGE，并转移至PVDF膜上，随后进行蛋白质印迹分析以检测重组蛋白的表达。应用稀释至1/2,000的抗-Penta-His-HRP(QIAGEN)检测重组的组氨酸融合蛋白。结果，确认了重组蛋白KfoA和KfoC的表达(图2)。
实施例3
制备多糖及通过二糖分析检测多糖
<细菌细胞的制备>
在补充有100ppm氨苄青霉素的LB培养基中培养大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA株作为种子培养物。然后将该种子培养物(750μL)转移至补充有100ppm氨苄青霉素的CYG培养基(15mL)中，然后在37℃培养3小时。往该培养物中加入IPTG(终浓度：1mM)，并且再培养5小时。
<培养物上清液的制备>
将该种子培养物(1mL)转移到补充有100ppm氨苄青霉素的CYG培养基(20mL)中，并且然后在37℃培养3小时。往该培养物中加入IPTG(终浓度：0.1mM)，并且再培养5小时。
通过离心收集培养上清液。
<多糖级分的制备>
通过以下三种方法从重组的细胞和培养物上清液制备多糖。
制备1)将上述得到的细菌重悬于PBS中，并在37℃用溶菌酶和DNA酶I处理1小时，随后在37℃用蛋白酶K处理1小时。然后，加热使酶失活，并且通过用70％硫酸铵沉淀来除去蛋白质。将得到的上清液级分针对10mM Tris-HCl(pH 8.0)透析，产生样本L。
制备2)根据生产商的说明书，顺序地使用用于纯化质粒的试剂：P1(含有溶菌酶)、P2和P3(QIAGEN)处理上述得到的细菌。通过离心收集后，将上清液进行乙醇沉淀。通过离心收集沉淀，并且将沉淀重悬于100μL无菌水中。在37℃用DNA酶I处理该悬浮液1小时以消化DNA，随后在37℃用蛋白酶K处理1小时。然后，加热使酶失活，并且通过用70％硫酸铵沉淀来除去蛋白质。将得到的上清液级分针对10mMTris-HCl(pH 8.0)透析，产生样本E。
制备3)蒸发培养物上清液(20mL)至干燥。将干燥的物质溶解于1ml蒸馏水中。将得到的溶液针对10mM Tris-HCl(pH 8.0)透析，产生样本S。
<通过二糖分析检测软骨素>
在37℃用在含有50mM NaOAc的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中的cABC(软骨素酶ABC，由Seikagaku公司生产)处理样本L、E和S(每一个为100μL)过夜。
作为对照，制备了没有用cABC处理的样本L、E和S以及用热失活的cABC处理的样本L、E和S。进行超滤以除去大小等于或大于10,000的大分子，并且通过应用荧光HPLC系统(J Biol Chem.2000 Jul21；275(29)：2269-2275)的二糖成分分析来分析所述样本(图3、4和5)。在HPLC系统中应用Senshu Pak Decosil C22(4.6 I.D.×150mm)作为分离柱，并将荧光检测器的激发和发射波长分别设置为346nm和410nm。
结果，仅在用cABC处理的样本的情况下检测到特定峰。每一样本的二糖组分特征与图6(A)所示的用cABC处理软骨素标准品获得的样本的特征接近一致。同时，在将用cABC处理的软骨素标准品和用cABC处理的样本L混合的情况下，仅检测到一个峰，因此确定样本L含有软骨素(图6(B))。在样本E和S的情况下，得到了相同的结果(数据未给出)。
实施例4
制备KfoΔC/KfoA共表达载体
<KfoΔC基因的扩增>
根据WO2007/145197中描述的方法，克隆了编码N-端截短的KfoC、包含SEQ ID NO：5核苷酸序列的DNA(KfoΔC基因)。将该KfoΔC基因插入到pTrcHis中以获得pTrcHis-kfoΔC。
<pTrcHis-kfoΔCA的制备>
应用限制性酶SphI和SmaI切割实施例1中制备的质粒pTrcHis-kfoCA。
通过使用相同的限制性酶消化质粒pTrcHis-kfoΔC而得到DNA片段(2.9kDa)。按照常规方法将该DNA片段插入到切割后的质粒的AphI-AmaI位点中，然后将得到的质粒命名为pTrcHis-kfoΔCA。
实施例5
抗-KfoA和抗-KfoC抗体的制备
<抗-KfoA抗体的制备>
合成包含SEQ ID No：15的肽序列的寡肽(CIVSR RDGDI AESWSSPEKA NK，纯度：＞70％)，并通过常规方法将4mg该寡肽与KLH(钥孔虫戚血兰素)缀合。通过与完全佐剂混合来制备抗原溶液后，以2周的间隔进行免疫5次。确认了抗体滴度后，收集全血。从每一只兔的血液中分别获得48mL(样本A)和60mL(样本B)的抗-KfoA血清。应用蛋白A柱纯化后，从样本A中获得32ml IgG级分EK-A(IgG浓度：5.30mg/mL)。
<抗-KfoC抗体的制备>
合成了包含SEQ ID No：16肽序列的寡肽(CQEPP GKENE TDRAAGK，纯度：＞70％)，并通过常规方法将4mg该寡肽与KLH(钥孔虫戚血兰素)缀合。通过与完全佐剂混合来制备抗原溶液后，以2周的间隔进行免疫5次。确认了抗体滴度后，收集全血。从每一只兔的血液中分别获得65mL(样本A)和39mL(样本B)的抗-KfoA血清。应用蛋白A柱纯化后，从样本A中获得了39ml IgG级分EK-A(IgG浓度：4.41mg/mL)。
实施例6
以与实施例2中相同的方法将pTrcHis-kfoΔCA引入到大肠杆菌K5株中，得到大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoΔCA株，并且培养该重组株以评估重组蛋白的表达。
将在补充有100ppm氨苄青霉素的LB培养基中培养的种子培养物(0.5mL)转移至补充有100ppm氨苄青霉素的CYG培养基(10mL)中，并随后在37℃培养1.5小时。加入IPTG(终浓度为：1mM)后，再继续培养4小时。从900μL该培养物中收集细菌细胞，并悬浮于90μLLaemmli缓冲液(×1)中。在废水浴中加热10分钟后，将10μL该上清液在7.5％凝胶上进行SDS-PAGE，并转移至PVDF膜上，随后进行蛋白质印迹分析以检测重组蛋白的表达。应用稀释1/1,000的抗-KfoA抗体(EK-A)和抗-KfoC抗体(EK-C)用作用于检测重组蛋白KfoA、KfoC和kfoΔC的一抗。用抗-兔免疫球蛋白HRP(DAKO，#P0448)作为二抗。此外，应用大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA和大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoA进行相同的检验，以比较重组蛋白的表达水平。结果，在大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA和大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoA之间的kfoA和kfoC(kfoΔC)的表达水平没有大的区别(图7)。
实施例7
制备多糖及通过二糖分析检测多糖
<细菌细胞的制备>
以与实施例3中相同的方式，在121℃高压灭菌5分钟后，从大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoΔCA株、大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA和大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoA株制备细菌细胞和上清液。
<多糖级分的制备>
针对流动的自来水透析所述上清液(1mL)过夜，并然后冷冻干燥透析的溶液。将冷冻干燥的材料溶解于100μL 50mM Tris-HCl(pH8.0)，以用作多糖级分。
<通过二糖分析来检测软骨素>
以与实施例3中相同的方法，通过二糖成分分析来分析所获得的级分。通过荧光HPLC分析软骨素标准溶液(200μg/mL和100μg/mL)以制得软骨素的校准曲线。在软骨素浓度和不饱和二糖的峰面积ΔDi-0S之间的关系如等式-1所示。
[软骨素；μg/mL上清液]＝
(0.000591×[峰面积]+1.219)/[浓度比率]
(r2＝0.9984) (等式-1)
在从大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoΔCA、大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA制备的样本中检测与不饱和二糖一致的峰(ΔDi-0A)(数据未显出)。表1显示了应用等式-1计算的重组培养物中的软骨素浓度的结果。
表1在重组菌株的培养物中软骨素含量的比较
通过比较大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoΔCA和大肠杆菌K5/pTrcHis-kfoCA之间的软骨素产率，重组菌株K5/pTrcHis-kfoΔCA更适于通过发酵生产软骨素。这一结果提示可通过应用编码N-端截短的KfoC的kfoΔC基因来提高软骨素产量。
工业实用性
通过应用本发明的细菌，可以高效且廉价地生产软骨素和硫酸软骨素。
Claims (9)
1.产生UDP-葡糖醛酸的重组细菌，通过使用载体为该细菌引入了衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因，并且所述细菌具有产生软骨素的能力。
2.根据权利要求1的细菌，其中所述的kfoA基因编码选自由以下(A)和(B)所组成的组的蛋白质：
(A) 包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质；以及
(B) 包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。
3.根据权利要求1的细菌，其中所述的kfoA基因是选自由以下(a)和(b)组成的组的DNA：
(a) 包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的DNA；和
(b) 在严格条件下与包含和SEQ ID NO: 1互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
4.根据权利要求1至3任一项的细菌，其中所述的kfoC基因编码选自由以下(C)和(D)所组成的组的蛋白：
(C) 包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白质；以及
(D) 包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有软骨素合酶活性。
5.根据权利要求1至3中任一项的细菌，其中所述的kfoC基因是选自由以下(c)和(d)组成的组的DNA：
(c) 包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的DNA；和
(d) 在严格条件下与包含和SEQ ID NO: 3互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有软骨素合酶活性的蛋白的DNA。
6.根据权利要求1至3中任一项的细菌，其中所述的kfoC基因编码选自由以下(E)和(F)所组成的组的蛋白：
(E) 包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质；以及
(F) 包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加并具有软骨素合酶活性。
7.根据权利要求1至3中任一项的细菌，其中所述的kfoC基因是选自由以下(e)和(f)组成的组的DNA：
(e) 包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的DNA；和
(f) 在严格条件下与包含和SEQ ID NO: 5互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有软骨素合酶活性的蛋白的DNA。
8.生产软骨素的方法，其至少包括以下步骤(1)和(2)：
(1) 培养根据权利要求1至7中任一项的细菌；以及
(2) 从该培养物中收集软骨素。
9.生产硫酸软骨素的方法，其包括：通过根据权利要求8的方法生产软骨素；以及将所述软骨素硫酸化以产生硫酸软骨素。
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