CN104963000B - 一种快速构建单细胞dna测序文库的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于构建单细胞DNA测序文库的方法和试剂盒，更具体的，本发明涉及用于构建高通量测序的单细胞DNA测序文库的方法和试剂盒。

Description

一种快速构建单细胞DNA测序文库的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及用于构建单细胞DNA测序文库的方法和试剂盒，更具体的，本发明涉及用于构建高通量测序的单细胞DNA测序文库的方法和试剂盒。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，Sanger测序已进入广大科研人员的研究中。但是科技的不断革新使得这种双脱氧核苷酸终止的测序模式愈发不能满足测序的需求，于是新的高通量测序(也称第二代测序)模式应运而生。这种测序技术使得测序费用更低，测序通量更高，测序时间更短。高通量测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、IllUmina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前为止，HiSeq2000每个run可以达到6个人基因组30X覆盖的测序通量，约600G/run数据，在测序时间上Hiseq2500可以达到平均每8分钟读取一个碱基的速度。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于临床的研究迅猛发展。

随着测序技术的发展，测序成本的降低，基因组测序技术已成为一种常规技术。以往的基因组测序或者转录组测序都是基于多细胞的水平进行的，然而这种的测序模式忽略了细胞间的异质性，以及忽略了细胞间异质性所导致的基因表达、细胞行为、药物反应的差异。近期针对肿瘤发病人群中循环肿瘤细胞的研究也成为一热点。肿瘤图谱的绘制，对于研究肿瘤的进化，包括肿瘤的转移不同发病时间段肿瘤的特异性，以及肿瘤扩散都有极为关键的意义。此外，单细胞研究在早期胚胎发育过程尤其是植入前胚胎的筛选有非常大的临床指导意义。基于单细胞在临床研究中的迫切性，对单细胞基因组的测序也愈发重要。

目前针对单细胞DNA测序文库构建主要是通过全基因组扩增(Whole GenomeAmplification，WGA)的方式使得基因组DNA大量复制，复制后的基因组DNA能够达到微克级量，足量的经过扩增后的基因组DNA再通过文库制备流程进行基因组DNA文库制备。目前市场上关于WGA扩增方式主要有两种：第一种为链置换方式，该扩增方式主要是采用phi29酶恒温扩增，从而实现对基因组DNA的链置换方式的扩增；第二种为通过聚合酶作用实现的两部扩增法，该扩增方式通过两次PCR实现对基因组DNA的扩增。扩增后的基因组DNA可以通过多种方式来构建测序文库(见图1)。比较经典的有两种方式：第一种为比较基础的基因组DNA文库制备方法，此方法中基因组DNA经过超声或者酶切打断，打断后的DNA进行末端修复，加A，加接头，最后通过PCR得到所需的上机测序文库；第二种是通过转座酶的方式将基因组DNA打断的同时加入接头，最后通过PCR得到所需的上机测序文库。目前市场所推出的针对单细胞测序文库构建的试剂盒也是基于以上方案设计，首先单细胞基因组DNA经过WGA扩增的过程，扩增后的基因组DNA再进行常规的测序文库构建。以上所述单细胞DNA测序文库构建方法和试剂盒主要存在两方面的缺陷：首先，从WGA到建库的流程复杂，所需时间也较长，至少两天的时间才能完成整个流程，不适合大规模的生产应用；其次，WGA扩增所引入的PCR碱基偏好性较大，从而导致整个基因组的覆盖度和均一性较差。因此，迫切需要一种新的方法和试剂盒来改善目前单细胞DNA测序文库构建的结果。

发明内容

鉴于目前单细胞DNA测序文库构建过程中所遇到的问题，本发明人发现了新的更加简化、更加快速、更加均一的单细胞DNA测序文库的构建方法，其可适用于多种第二代测序平台，包括但不限于如Roche/454 FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等测序平台。

本发明是基于以下的事实：本发明人发现，单细胞经过细胞裂解后，释放基因组DNA，基因组DNA经过预扩增和二次扩增后即可得到可以上机测序的文库。本发明中只包含细胞裂解、预扩增和二次扩增三步反应，并且三步反应完全可以在一个体系中完成，中间无需有转管或者纯化的步骤。依据本发明，单细胞DNA测序可以得到有效的测序结果，并且可以用于多种的信息分析。

因此，本发明的第一个方面是提供一种用于构建单细胞DNA测序文库的方法，其特征在于，包括：

裂解细胞，释放基因组DNA；

将基因组DNA进行预扩增；

将预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述单细胞DNA测序文库。

根据本发明的方法，所述将基因组DNA进行预扩增的酶为热稳定的聚合酶，可以是一种，也可以是两种或者两种以上的组合。包含但不局限于以下的一种或者几种：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold 360，Platinum Taq，KAPA 2G Robust.

根据本发明的方法，所述将基因组DNA进行预扩增的引物为一段特殊设计的引物。该引物从5’端开始有三部分主要结构：第一部分为通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同，长度为1至70个碱基，优选的为10-50个碱基，更优选的为10-30个碱基。本通用区域为最终文库结构的一部分，在二次扩增时生成能直接用于测序的文库。此外，该通用区域在一次扩增过程中使生成的产物自身形成类似发卡的结构，不再继续被扩增，使预扩增实现线性扩增，使最终结果基因组覆盖更均匀。第二部分为简并碱基区域，该区域只包含两种不互补的碱基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G，长度为2-20个碱基，优选的为5-15个碱基，更优选的为5-10个碱基。该设计避免了预扩增过程中引物的交叉杂交或自杂交，以实现预扩增的均一性。第三部分为随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G，并且在最后三个随机简并碱基之间加入两个硫代修饰，长度为1-8个碱基(详见图4)，优选的，其长度为2-6个碱基；最优选的，其长度为3或4个碱基。本发明中特殊的简并碱基区域的设计提高了产物在基因组上的覆盖度。

根据一个特别优选的实施方式，该预扩增引物序列为

5′GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N3′

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基。N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。

硫代修饰为在寡聚核苷酸合成时将连接两个单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧换成硫，加入硫代修饰后碱基不容易被核酸外切酶切掉，从而可以增加引物的特异性，防止扩增过程中引物二聚体的出现。

根据本发明的方法，所述将基因组DNA进行二次扩增的酶为热稳定的聚合酶，可以是一种，也可以是两种或者两种以上的组合。包含但不局限于以下的一种或者几种：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold 360，Platinum Taq，KAPA 2GRobust。

根据本发明的方法，所述将基因组DNA进行二次扩增的引物由两部分组成。从DNA5’端开始，第一部分为外延伸区，该区域含有可以和上机测序通用杂交引物相结合的区域，第二部分为引物匹配区，该区域含有可以和预扩增引物杂交区域。在不同的实施方案中，外延伸区可以含有barcode序列，用于区分不同的样本或者给样本引入特殊的特征标记。所述barcode序列可以由ATCG四种碱基随意组合，碱基长度可以不固定。

根据一个特别优选的实施方式，该二次扩增引物序列为：

primer1：5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3′

indexprimer：5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3′

其中index primer中下划线部分碱基代表barcode序列。

根据本发明的方法，所述将细胞裂解的酶为Proteinase K，或者Protease，或者二者的组合。

在一种实施方式中，本发明所述裂解的细胞为单细胞或者多细胞。

在另一种实施方式中，本发明所述起始样本为DNA，包括但不限于基因组DNA，线粒体DNA，长片段PCR产物，或者长片段染色质免疫共沉淀DNA。

在又一种实施方式中，本发明所述起始样本为RNA反转录产物cDNA。

本发明的第二个方面提供了一种用于构建单细胞DNA测序文库的试剂盒，该试剂盒包含：1.将细胞进行裂解的裂解缓冲液和裂解酶；2.用于预扩增的引物、缓冲液和DNA聚合酶；3.用于二次扩增的引物、缓冲液和DNA聚合酶。

根据本发明的试剂盒，所述将基因组DNA进行预扩增的酶为热稳定的聚合酶，可以是一种，也可以是两种或者两种以上的组合。包含但不局限于以下的一种或者几种：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold 360，Platinum Taq，KAPA 2GRobust.

根据本发明的试剂盒，所述将基因组DNA进行预扩增的引物为一段特殊设计的引物。该引物从5’端开始有三部分主要结构：第一部分为通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同，其长度为1至70个碱基，优选的为10-50个碱基，更优选的为10-30个碱基。第二部分为简并碱基区域，该区域只包含两种不互补的碱基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G，长度为2-20个碱基，优选的为5-15个碱基，更优选的为5-10个碱基。第三部分为随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G，并且在最后三个随机简并碱基之间加入两个硫代修饰(详见图4)。其长度为1-8个碱基，优选的，其长度为2-6个碱基；最优选的，其长度为3或4个碱基。

根据一个特别优选的实施方式，该预扩增的引物序列为

5′GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N3′

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基。N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。

根据本发明的试剂盒，所述将基因组DNA进行二次扩增的酶为热稳定的聚合酶，可以是一种，也可以是两种或者两种以上的组合。包含但不局限于以下的一种或者几种：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold 360，Platinum Taq，KAPA 2GRobust.

根据本发明的试剂盒，所述将基因组DNA进行二次扩增的引物由两部分组成。从DNA 5’端开始，第一部分为外延伸区，该区域含有可以和上机测序通用杂交引物相结合的区域，第二部分为引物匹配区，该区域含有可以和预扩增引物杂交区域。在不同的实施方案中，外延伸区可以含有barcode序列，用于区分不同的样本或者给样本引入特殊的特征标记。所述barcode序列可以由ATCG四种碱基随意组合，碱基长度可以不固定。

根据一个特别优选的实施方式，该二次扩增引物序列为：

primer1：5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3′

indexprimer：5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3′

其中index primer中下划线部分碱基代表barcode序列。

根据本发明的试剂盒，所述将细胞裂解的酶为Proteinase K，或者Protease，或者二者的组合。

在一种实施方式中，本发明所述裂解的细胞为单细胞或者多细胞。

在另一种实施方式中，本发明所述起始样本为DNA，包括但不限于基因组DNA，线粒体DNA，长片段PCR产物，或者长片段染色质免疫共沉淀DNA。

在又一种实施方式中，本发明所述起始样本为RNA反转录产物cDNA。

本发明的第三个方面提供了一种引物序列，从DNA 5’端开始，包括：第一部分的通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同；第二部分的简并碱基区域，该区域只包含两种不互补的碱基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G；第三部分的随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G。

根据一个优选的实施方式，第一部分通用区域的长度为1-70个碱基，优选10-50个碱基，更优选10-30个碱基；第二部分简并碱基区域的长度为2-20个碱基，优选5-15个碱基，更优选5-10个碱基；第三部分随机简并碱基区域的长度为1-8个碱基，优选2-6个碱基，更优选为3或者4个碱基。

根据另一个优选的实施方式，第三部分随机简并碱基区域中最后三个随机简并碱基之间含有两个硫代修饰。

根据本发明一个特别优选的实施方式，该预扩增的引物序列为

5′GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N3′

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基。N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。

本发明的第四个方面提供了一种引物序列，从DNA 5’端开始，包括：第一部分的外延伸区，该区域含有可以和上机测序通用杂交引物相结合的区域；第二部分的引物匹配区，该区域含有可以和预扩增引物杂交区域。

根据一个优选的实施方式，该外延伸区含有barcode序列，用以区分不同的样本或者给样本引入特殊的特征标记。所述barcode序列由ATCG四种碱基随意组合，碱基长度不固定。

根据本发明一个特别优选的实施方式，该扩增引物序列为：

primer1：5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3′

indexprimer：5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3′

其中index primer中下划线部分碱基代表barcode序列。

本发明基于单细胞基因组DNA经过两次扩增即可得到上机测序文库，省却了基因组DNA经过WGA扩增的步骤。此发明大大缩短了文库构建的时间，使得单细胞基因组DNA文库的大规模操作成为可能。另外一方面也避免了WGA预扩增导致的碱基偏好性以及基因组覆盖度的不均衡。因此本发明更适合大规模实验操作和单细胞数据的分析。

附图说明

图1示出了现有技术中普遍采用的单细胞DNA高通量测序文库构建的方法。

图2示出了根据本发明的一种实施方式的单细胞DNA高通量测序文库构建的方法。

图3示出了根据本发明的四种不同实施方式的DNA高通量测序文库的构建方法。

图4示出了根据本发明的四种不同预扩增引物示例。

图5示出了本发明的基本原理和流程。

图6示出了本发明的试剂盒与市售的Rubicon PicoPLEX DNA-seq kit和RubiconPicoPLEX WGA kit所制备的测序文库在染色体上的覆盖度。

图7示出了本发明的试剂盒与市售的Rubicon PicoPLEX DNA-seq kit和RubiconPicoPLEX WGA kit所制备的测序文库在map比例和Unique比例上的对比结果。

具体实施方式

如前文所述，目前适用于第二代高通量测序平台的单细胞DNA测序文库的构建，主要包括以下步骤(见图1)：细胞裂解；基因组DNA的WGA扩增；WGA扩增产物的文库构建。其中WGA扩增主要有两种方式：基于phi29的恒温扩增和通过聚合酶作用实现的两部扩增，其中后者是通过两步PCR的方式实现对全基因组的扩增。扩增后的WGA产物需要接下来进行上机测序前的文库构建过程。WGA产物的文库构建可以通过两种方式来实验：以转座酶为基础的文库构建流程和以普通DNA文库为基础的文库构建流程，其中前者主要操作步骤包括转座反应、转座终止和PCR反应，后者步骤主要包括DNA打断、末端修复、加A、加接头和PCR反应。目前单细胞DNA测序文库构建的流程复杂，并且至少需要两天的时间。此外，在WGA扩增过程中所引入的碱基偏好性较大，从而导致整个基因组的覆盖度和均一性较差。

图2示出了根据本发明的一种实施方式的单细胞DNA测序文库的构建方法。该方法主要包括以下步骤：单细胞裂解；基因组DNA的预扩增；二次扩增。整个流程只需在一个反应管中进行，中间没有纯化或者转管的步骤。

与现有技术中单细胞DNA测序文库构建方法相比，本发明只需三步反应，仅在一个反应体系中完成，三至四小时即可完成文库构建过程。因此，流程更为简便，成本更为低廉，结果更加高效。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例：根据本发明适用于第二代高通量测序的单细胞DNA测序文库的构建方法

实施例1

实施例1的单细胞DNA测序文库的构建方法主要包括以下步骤(见图3)：

(1)细胞裂解：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于细胞裂解的蛋白酶和蛋白变性试剂以及裂解缓冲体系进行此步骤。

(2)基因组DNA的预扩增，可利用本领域技术人员所熟知的任何热稳定的DNA聚合酶进行，例如：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold 360，PlatinumTaq，KAPA 2G Robust.

本发明中所用预扩增引物主要由三部分组成：通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同；简并碱基区域，该区域只包含两种碱基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G；随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G，并且在最后三个随机简并碱基之间加入两个硫代修饰。

本实施例中所用预扩增引物碱基序列如下：

5′GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N3′

5′GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N3′

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基。N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰

(3)基因组DNA的二次扩增，可利用本领域技术人员所熟知的任何热稳定的DNA聚合酶进行，例如：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold 360，PlatinumTaq，KAPA 2G Robust.

本发明中所用二次扩增引物主要由两部分组成：外延伸区，该区域含有可以和上机测序通用杂交引物相结合的区域；引物匹配区，该区域含有可以和预扩增引物杂交区域。

本实施例中所用二次扩增引物碱基序列如下：

primer1：5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3′

indexprimer：5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3′

其中index primer中下划线部分碱基代表barcode序列。

此外，在高通量测序之前，还需要对上述文库进行以下操作：

(4)利用qPCR方法对测序文库进行定量。

(5)根据上机通道的安排及标签序列的不同将样品等量混合。

(6)样品上机。

以下示出根据本发明实施例1的方法进行单细胞DNA样品测序的一个具体实例。

步骤1：单细胞裂解。制备如表1所示的细胞裂解缓冲液，在60℃温浴20分钟，95℃温浴4分钟，然后使样本保持在4℃。

表1

步骤2：基因组DNA预扩增。制备如表2所示的预扩增PCR体系。

表2

PCR反应方案为：a.95℃3分钟→b.16个如下的循环：98℃20秒，15℃50秒，25℃40秒，35℃30秒，65℃40秒，72℃1分钟→c.保持在4℃。

步骤3：基因组DNA二次扩增。制备如表3所示的二次扩增的PCR体系。

表3

PCR反应方案为：a.95℃4分钟→b.5个如下的循环：98℃20秒，63℃25秒，72℃40秒→c.8个如下的循环：98℃20秒，72℃55秒→c.保持在4℃。

步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。

步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2500操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例1构建的单细胞DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例2

实施例2的文库构建方法和实施例1基本相同，不同之处在于，在实施例2中，起始样本是多细胞而不是单细胞(请参考图3)。

以下示出根据本发明实施例2的方法进行多细胞DNA样品测序的一个具体实例

步骤1：多细胞裂解。制备如表1所示的细胞裂解缓冲液，在60℃温浴20分钟，95℃温浴4分钟，然后使样本保持在4℃。

表1

步骤2：基因组DNA预扩增。制备如表2所示的预扩增PCR体系。

表2

PCR反应方案为：a.95℃3分钟→b.16个如下的循环：98℃20秒，15℃50秒，25℃40秒，35℃30秒，65℃40秒，72℃1分钟→c.保持在4℃。

步骤3：基因组DNA二次扩增。制备如表3所示的二次扩增的PCR体系。

表3

PCR反应方案为：a.95℃4分钟→b.5个如下的循环：98℃20秒，63℃25秒，72℃40秒→c.8个如下的循环：98℃20秒，72℃55秒→c.保持在4℃。

步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。

步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2500操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例2构建的多细胞DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例3

实施例3的文库构建方法和实施例1基本相同，不同之处在于，在实施例3中，起始样本是DNA，而不是细胞。在此实施例中，起始样本可以是基因组DNA，线粒体DNA，长片段PCR产物或者长片段的染色质沉淀DNA(请参考图3).

以下示出根据本发明实施例3的方法进行DNA样品测序的一个具体实例

步骤1：长片段DNA的断裂。制备如表1所示的细胞裂解缓冲液，在60℃温浴20分钟，95℃温浴4分钟，然后使样本保持在4℃。或者DNA片段直接95℃温浴4分钟，然后使样本保持在4℃。

表1

步骤2：DNA预扩增。制备如表2所示的预扩增PCR体系。

表2

PCR反应方案为：a.95℃3分钟→b.16个如下的循环：98℃20秒，15℃50秒，25℃40秒，35℃30秒，65℃40秒，72℃1分钟→c.保持在4℃。

步骤3：DNA二次扩增。制备如表3所示的二次扩增的PCR体系。

表3

PCR反应方案为：a.95℃4分钟→b.5个如下的循环：98℃20秒，63℃25秒，72℃40秒→c.8个如下的循环：98℃20秒，72℃55秒→c.保持在4℃。

步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。

步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2500操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例3构建的长片段DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例4

实施例4的文库构建方法和实施例1基本相同，不同之处在于，在实施例4中，起始样本是RNA反转录产物cDNA(请参考图3).

以下示出根据本发明实施例4的方法进行cDNA样品测序的一个具体实例

步骤1：cDNA片段的断裂。制备如表1所示的细胞裂解缓冲液，在60℃温浴20分钟，95℃温浴4分钟，然后使样本保持在4℃。或者cDNA片段直接95℃温浴4分钟，然后使样本保持在4℃。

表1

步骤2：cDNA预扩增。制备如表2所示的预扩增PCR体系。

表2

PCR反应方案为：a.95℃3分钟→b.16个如下的循环：98℃20秒，15℃50秒，25℃40秒，35℃30秒，65℃40秒，72℃1分钟→c.保持在4℃。

步骤3：DNA二次扩增。制备如表3所示的二次扩增的PCR体系。

表3

PCR反应方案为：a.95℃4分钟→b.5个如下的循环：98℃20秒，63℃25秒，72℃40秒→c.8个如下的循环：98℃20秒，72℃55秒→c.保持在4℃。

步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。

步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2500操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例4构建的cDNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例5

本发明还提供用于根据本发明的实施例1-4构建单细胞DNA测序文库的试剂盒。该试剂盒包含将细胞进行裂解的缓冲液和裂解酶；进行DNA预扩增的引物，缓冲液和DNA聚合酶；进行二次扩增的引物，缓冲液和DNA聚合酶。

根据不同的实施例该试剂盒适用于单细胞，多细胞，基因组DNA，线粒体DNA，长片段PCR产物，长片段染色质免疫共沉淀DNA和单细胞反转录产物cDNA样本。

以下示出根据本发明的试剂盒与市售的的试剂盒分别构建单细胞DNA测序文库的一个具体实例

取人单个单细胞，分别用以下三种试剂盒构建测序文库：

A：Rubicon PicoPLEX DNA-seq kit

B：Rubicon PicoPLEX WGA kit(先WGA扩增基因组DNA，再构建测序文库)

C：本发明的试剂盒

构建好的测序文库利用Illumina Hiseq250036SE(single read)测序平台，上机8M reads，分析其染色体覆盖度。对比结果如图6所示。横坐标代表针对某一特定染色体，将该染色体以每20kb的距离划为一个单元框后，该染色体单元框的数目。纵坐标代表针对某一特定染色体，落在该染色体每个单元框中reads的数目。其中，每个单元框中reads数目越均匀代表该染色体的覆盖度越均一。由图6可以看出，通过本发明的试剂盒制备的DNA测序文库其测序结果比通过Rubicon PicoPLEX DNA-seq kit和Rubicon PicoPLEX WGA kit制备的DNA测序文库在染色体的覆盖度上更为均一，尤其是在基因组的10000kb附近。

另外，构建好的测序文库同样利用Illumina Hiseq2500 36SE(single read)测序平台分析比较了每个试剂盒的map比例和Unique比例。其结果如表4-表6和图7所示。

表4：Rubicon PicoPLEX DNA-seq kit的map和Unique比例分析结果

表5：Rubicon PicoPLEX WGA kit的map和Unique比例分析结果

Sample	Total reads	Mapped reads	Map ratio	Unique reads	Unique ratio
						RW001	13951187	6180677	0.4430	5959442	0.4272
RW002	9168678	4102769	0.4475	4010848	0.4375
						RW003	11725053	5341674	0.4556	5171854	0.4411
RW004	11360477	4841736	0.4262	4591776	0.4042
						RW005	11911934	5247267	0.4405	5085852	0.4270
RW006	12070221	5551332	0.4599	5370253	0.4449
						RW007	13204979	5774781	0.4373	5605729	0.4245
	均值	5291462	0.4443	5113679	0.4295
							标准差		0.0114		0.0136

表6：本发明试剂盒的map和Unique比例分析结果

Sample	Total reads	Mapped reads	Map ratio	Unique reads	Unique ratio
						B001	5774330	3799715	0.6580	3418799	0.5921
B002	10798470	7246423	0.6711	6188908	0.5731
						B003	8462321	5705300	0.6742	5168312	0.6107
B004	10292734	6844308	0.6650	6053728	0.5882
						B005	8136865	5508629	0.6770	4853989	0.5965
B006	7455040	5094910	0.6834	4608884	0.6182
						B007	7341969	5056828	0.6888	4612964	0.6283
	均值	5608016	0.6739	4986512	0.6010
							标准差		0.0105		0.0191

*sample：样本编号；total reads：上机产出reads数目；mapped reads：在人基因组上能找到唯一位置的reads数目；map ratio：mapped reads和total reads的比值；Unique reads：mapped reads中去除多余的重复reads后的数目；Unique ratio：Uniquereads和Total reads的比值。

图7更加直接的表示了三种试剂盒制备的DNA测序文库的map比例和Unique比例的对比结果。与对照的市售Rubicon的两种试剂盒所制备的测序文库相比，本发明的试剂盒所制备的测序文库在map比例和Unique比例上有显著的提高。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

1.Zhang CL，et al.(2013)A Single Cell Level Based Method for CopyNumber Variation Analysis by LoW Coverage Massively Parallel Sequencing.PlosOne，doi：10.1371/journal.pone.0054236.

2.Bi W，Breman A，Shaw CA，Stankiewicz P，Gambin T，et al.(2012)Detectionof＞/＝1Mb microdeletions and microduplications in a single cell using customoligonucleotide arrays.Prenat Diagn，32：10-20

3.Zheng YM，et al.(2011)Whole genome amplification in preimplantationgenetic diagnosis.JZUS，12(1)1-11.

4.Spits C，et al.(2006)Whole-genome multiple displacementamplification from single cells.NATURE，1(4)1965-1970

5.Senthilkumar A，et al.(2014)Genome-wide karyomapping accuratelyidentifies the inheritance of single-gene defects in human preimplantationembryos in vitro.Genetics in Medicine，doi：10.1038/gim.2014.45.

6.Fiorentino F，et al.(2014)Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screeningof embryos.Fertil Steril，101(5)：1375-82.

7.Pukazhendhi Gl，et al.(2014)Circulating tumor cells in breastcancer.J Carcinog，doi：10.4103/1477-3163.

8.Castle J，et al.(2014)The significance of circulating tumour cellsin breast cancer：A review.Breast，doi：10.1016/i.breast.2014.07.002.

Claims (35)

1.用于构建单细胞DNA测序文库的方法，其特征在于，包括：

裂解细胞，释放基因组DNA；

将基因组DNA进行预扩增；

将预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述单细胞DNA测序文库,

其中，所述预扩增的引物由三部分组成，从DNA 5’端开始，第一部分为通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同；第二部分为简并碱基区域，该区域只包含两种不互补的碱基，A和C，或A和G，T和C，或T和G；第三部分为随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G，

并且所述方法不包括纯化的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将基因组DNA进行预扩增和二次扩增的酶为一种或多种热稳定性的DNA聚合酶，选自LA-Taq、rTaq、Phusion、Deep Vent、Deep Vent(exo-)、Gold 360、Platinum Taq和KAPA 2G Robust。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一部分通用区域的长度为1-70个碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二部分简并碱基区域的长度为2-20个碱基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第三部分随机简并碱基区域的长度为1-8个碱基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第三部分随机简并碱基区域中最后三个随机简并碱基之间含有两个硫代修饰。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该预扩增的引物序列为

5’GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N 3’

5’GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N 3’

5’GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N 3’或

5’GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N 3’

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基，N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将基因组DNA进行二次扩增的引物由两部分组成，从DNA 5’端开始，第一部分为外延伸区，该区域含有和上机测序通用杂交引物相结合的区域，第二部分为引物匹配区，该区域含有和预扩增引物杂交区域。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，二次扩增引物外延伸区含有barcode序列，用以区分不同的样本或者给样本引入特殊的特征标记。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述barcode序列由ATCG四种碱基随意组合，碱基长度不固定。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的细胞为单细胞或多细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于裂解细胞的酶为Proteinase K，或者Protease，或者二者的组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的起始材料为DNA。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的起始材料DNA为基因组DNA、线粒体DNA、PCR产物或染色质免疫共沉淀DNA。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的起始材料为RNA反转录产物cDNA。

16.用于构建单细胞DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，包含：

将单细胞进行裂解的裂解缓冲液和裂解酶；

进行预扩增的引物、缓冲液和DNA聚合酶；和

进行二次扩增的引物、缓冲液和DNA聚合酶，

其中所述预扩增的引物由三部分组成，从DNA 5’端开始，第一部分为通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同；第二部分为简并碱基区域，该区域只包含两种不互补的碱基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G；第三部分为随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G，

并且所述试剂盒不包括用于纯化的试剂。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，将基因组DNA进行预扩增和二次扩增的酶为一种或多种热稳定性的DNA聚合酶，选自LA-Taq、rTaq、Phusion、Deep Vent、DeepVent(exo-)、Gold 360、Platinum Taq和KAPA 2G Robust。

18.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，第一部分通用区域的长度为1-70个碱基。

19.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，第二部分简并碱基区域的长度为2-20个碱基。

20.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，第三部分随机简并碱基区域的长度为1-8个碱基。

21.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，第三部分随机简并碱基区域中最后三个随机简并碱基之间含有两个硫代修饰。

22.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，该预扩增的引物序列为

5’GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N 3’

5’GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N 3’

5’GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N 3’或

5’GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N 3’

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基，N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。

23.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，将基因组DNA进行二次扩增的引物由两部分组成，从DNA 5’端开始，第一部分为外延伸区，该区域含有和上机测序通用杂交引物相结合的区域，第二部分为引物匹配区，该区域含有和预扩增引物杂交区域。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，二次扩增引物外延伸区含有barcode序列，用以区分不同的样本或者给样本引入特殊的特征标记。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述barcode序列由ATCG四种碱基随意组合，碱基长度不固定。

26.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的细胞为单细胞或多细胞。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，用于裂解细胞的酶为Proteinase K，或者Protease，或者二者的组合。

28.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的起始材料为DNA。

29.根据权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的起始材料DNA为基因组DNA、线粒体DNA、PCR产物或染色质免疫共沉淀DNA。

30.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，用于构建单细胞DNA测序文库的起始材料为RNA反转录产物cDNA。

31.一种引物，其序列从DNA 5’端开始，包括：第一部分的通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同；第二部分的简并碱基区域，该区域只包含两种不互补的碱基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G；第三部分的随机简并碱基区域，其中每个碱基可以是A、T、C、或G，其中第三部分随机简并碱基区域中最后三个随机简并碱基之间含有两个硫代修饰。

32.根据权利要求31所述的引物，其特征在于，第一部分通用区域的长度为1-70个碱基。

33.根据权利要求31所述的引物，其特征在于，第二部分简并碱基区域的长度为2-20个碱基。

34.根据权利要求31所述的引物，其特征在于，第三部分随机简并碱基区域的长度为1-8个碱基。

35.根据权利要求31所述的引物，其特征在于，该引物序列为

5’GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N 3’

5’GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N 3’

5’GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N 3’或

5’GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N 3’

其中R代表A或G碱基，M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基，N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。

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