CN104931326B - 一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种斑马鱼代谢物的提取方法，步骤如下：1)将斑马鱼样品用生理盐水冲洗干净后迅速浸没于液氮中保存备用；2)将样品在‑80℃温度下研磨变成匀质浆体；3)将浆体状样品加入‑20℃预冷的提取液中，进行两次微波萃取，将离心后收集两次上清液混合后加入灭菌去离子水，经离心、静置、干燥后得到混合溶液；4)将混合溶液真空干燥后，通过甲氧氨基盐酸盐‑吡啶溶液、N‑甲基‑N‑(三甲基硅烷)‑三氟乙酰胺两步法进行衍生化，得到斑马鱼代谢物衍生化样品。本发明的优点是：该斑马鱼代谢物的提取方法简单、准确，易于实施，用于斑马鱼暴露于低浓度纳米材料实验，可使斑马鱼毒性检测的灵敏性提高。

Description

一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及环境毒理与生物医学，特别是一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用。

背景技术

代谢物分析是一种重要的生物体征和毒理指标的分析方法，通过对生物体内代谢物进行定性或定量的分析可以在生物体内发生的一系列变化以及发生变化的节点，有助于生物毒性的判断以及环境污染等情况的分析。

本发明所使用的受试生物为斑马鱼。斑马鱼具有体型小、易于养殖繁殖以及成本低等优点，在生态毒理等领域的使用十分广泛。且斑马鱼在遗传、生理和药理反应方面与人类存在高度的相似性，因此可作为良好的模式动物。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用，该提取方法工艺简单、易于实施，用于纳米材料对斑马鱼低浓度暴露的毒性实验，相对于其他的毒性检测方法更灵敏和简便的得到更多可用的数据。

本发明的技术方案：

一种斑马鱼代谢物的提取方法，步骤如下：

1)将斑马鱼样品用生理盐水冲洗干净后准确称重，然后迅速浸没于液氮中保存备用；

2)将上述斑马鱼样品置于盛有液氮的研钵中在-80℃温度下研磨5分钟至斑马鱼组织变成匀质浆体；

3)将上述浆体状斑马鱼样品加入-20℃预冷的提取液中，在40℃温度下微波萃取30分钟，微波萃取功率为(样品罐数+2)×100W，离心后收集第一次上清液，然后在固体残留物中再加入相同量的上述-20℃的提取液，继续在40℃温度下微波萃取30分钟，离心后收集第二次上清液；

4)将第一次上清液与第二次上清液混合，在混合液中加入灭菌去离子水，4000rpm下离心5分钟，静置5分钟后溶液分层，上层溶液是甲醇/水相，下层溶液为氯仿相，两相分离后将氯仿相用氮气吹干，然后将甲醇/水相转移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；

5)将上述混合溶液放入冷冻干燥机内以-30℃—-50℃真空干燥后，采用两步法进行衍生化：首先加入浓度为20mg/mL的甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液，密封后涡旋1分钟，后将其在3000rpm下离心1分钟，再在30℃下温浴90分钟，然后加入硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)，37℃下温浴30分钟，得到斑马鱼代谢物衍生化样品并转移到适合GC-MS分析的内衬管中保存。

所述步骤3)提取液为甲醇、氯仿与水的混合液，混合液中甲醇、氯仿与水的体积比为2.5:1:1，其中甲醇、氯仿与水均为色谱纯；斑马鱼样品与提取液的用量比为0.3-0.5g：15mL。

所述步骤4)中斑马鱼样品与灭菌去离子水的用量比为0.3-0.5g：500μL。

所述步骤5)中斑马鱼样品与甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液的用量比为0.3-0.5g：50μL，斑马鱼样品与硅烷化试剂的用量比为0.3-0.5g：80μL。

一种所述斑马鱼代谢物的提取方法的应用，用于斑马鱼纳米毒性检测。

本发明的优点是：该斑马鱼代谢物的提取和分析方法简单、准确，易于实施，用于斑马鱼暴露于低浓度纳米材料实验，可使斑马鱼毒性检测的灵敏性提高。

附图说明

图1是同一批次染毒的斑马鱼成鱼的总超氧化物歧化酶活性对比图。

图2是同一批次染毒的斑马鱼成鱼的丙二醛含量对比图。

具体实施方式

实施例1：

一种斑马鱼代谢物的提取方法，步骤如下：

1)将斑马鱼样品用生理盐水冲洗干净后准确称重，然后迅速浸没于液氮中保存备用；

2)将上述斑马鱼样品置于盛有液氮的研钵中在-80℃温度下研磨5分钟至斑马鱼组织变成匀质浆体；

3)将上述浆体状斑马鱼样品加入-20℃预冷的提取液中，提取液提取液为甲醇、氯仿与水的混合液，混合液中甲醇、氯仿与水的体积比为2.5:1:1，其中甲醇、氯仿与水均为色谱纯，斑马鱼样品与提取液的用量比为0.3g：15mL，在40℃温度下微波萃取30分钟，微波萃取功率为(样品罐数+2)×100W，离心后收集第一次上清液，然后在固体残留物中再加入相同量的上述-20℃的提取混合液，继续在40℃温度下微波萃取30分钟，离心后收集第二次上清液；

4)将第一次上清液与第二次上清液混合，在混合液中加入灭菌去离子水，斑马鱼样品与灭菌去离子水的用量比为0.3g：500μL，4000rpm下离心5分钟，静置5分钟后溶液分层，上层溶液是甲醇/水相，下层溶液为氯仿相，两相分离后将氯仿相用氮气吹干，然后将甲醇/水相转移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；

5)将上述混合溶液放入冷冻干燥机内以-30℃—-50℃真空干燥后，采用两步法进行衍生化：首先加入浓度为20mg/mL的甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液，斑马鱼样品与甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液的用量比为0.3g：50μL，密封后涡旋1分钟，后将其在3000rpm下离心1分钟，再在30℃下温浴90分钟，然后加入硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)，斑马鱼样品与硅烷化试剂的用量比为0.3g：80μL，37℃下温浴30分钟，得到斑马鱼代谢物衍生化样品并转移到适合GC-MS分析的内衬管中保存。

以上斑马鱼样品设为第一组样品。

对比实验：

1)第二组样品

该组斑马鱼代谢物的提取方法，步骤与第一组样品基本相同，不同之处在于：将步骤3)中的微波萃取改变为超声萃取，超声功率为100W。

2)第三组样品

该组斑马鱼代谢物的提取方法，步骤与第一组样品基本相同，不同之处在于：将步骤3)中的提取混合液改变为色谱纯乙醇。

3)第四组样品

该组斑马鱼代谢物的提取方法，步骤与第一组样品基本相同，不同之处在于：

将步骤3)中的提取混合液改变为色谱纯乙醇，同时微波萃取改变为超声萃取，超声功率为100W。

以上四组样品的分析：

分析仪器为安捷伦气相色谱串联质谱。参数设置如下：

气相色谱进样参数为：采用自动进样器进样，进样量1μL，进样口温度230℃、斑马鱼成鱼分流进样比例为1:10，幼鱼不分流、载气为氦气，流速2mL/min。

气相色谱参数为：MDN-35毛细管色谱柱(30m)、温度程序为80℃下恒温2min，然后以15℃/min的速率升温到325℃，恒温6min、传输线温度为250℃。

质谱参数为：离子源温度为250℃、质量扫描范围为70-600m/z、采集速率每秒20个扫描、质谱电子轰击源灯丝开启时间在色谱溶剂延迟170s后、检测器电压1700-1850V、质谱亏损设置为0、灯丝偏置电流为70V、仪器自动调谐。

数据处理工作站的谱图调整的参数设置：

谱图解卷积参数为：力可公司自带的商业软件Chroma TOF、基线消除(BaselineOffset)设置1(0.5-1)、谱图平滑(Smoothing)数据点5(3-7)、峰宽(Peak Width)3s(3s-4s)、信噪比S/N(Signal-Tonoise Ratio)10(2-15).

通过Nist.08数据库的分析对比得到分析结果，表1为四种不同提取方法提取情况表。

表1

表2

表3

表4

表5

从表1-表5可以看出：使用提取混合液-微波萃取的方法提取出的斑马鱼代谢物平均有64种，其包含氨基酸、糖类以及糖类衍生物、油脂类物质以及小分子酸和部分烷烃、烯烃醇类等，种类分布较均匀，其余三种方法提取的物质种类平均在60种以内，且偏差较大；四种方法检测出的氨基酸、部分脂类、糖类和小分子酸在种类上差别不大，但是使用方法一可全面检测出三种糖类：葡萄糖，甘露糖以及果糖，其余方法却并不稳定；另外本方法可以检测出烷烃和烯烃的存在，其余三种方法并未检出；另外作为生物代谢的重要物质乳酸，仅有第一种方法能稳定检测分析出，其余方法出现乳酸的机会随机或响应不高。

所述斑马鱼代谢物的提取方法的应用，用于斑马鱼纳米毒性检测，方法如下：挑选健康成年斑马鱼，将其均匀分为四组，其中三组分别加入0.01mg/L的氧化石墨烯、碳纳米管、量子点氧化石墨烯溶液三种纳米材料中染毒，另一组放入不加入任何纳米材料的盐水中，每日换水喂食，27℃养育21d；然后分别按照斑马鱼代谢物的提取方法的五个步骤操作，将得到斑马鱼代谢物衍生化样品并转移到适合GC-MS分析的内衬管中保存。将得到的四组样品按照与前述相同的方法进行分析。表2为三种不同的纳米材料染毒和对照组经过提取后代谢物提取情况(单位：峰面积/0.1g组织)。

表6

表7

表8

表9

表10

从表4中可以看出：使用该提取方法得到的数据中肌酐的变化显著，可用于评估鱼类肾功能的情况；表1中鸟氨酸的显著变化也可以预示斑马鱼体内代谢情况的改变；但是在总超氧化物歧化酶和丙二醛等酶活指标测量的结果中这种差异并不十分明显。

图1是同一批次染毒的斑马鱼成鱼的总超氧化物歧化酶活性对比图，图中表明：与对照组的斑马鱼相比，经过三种纳米材料处理的斑马鱼的总超氧化物歧化酶活性并没有显著的变化。。

图2是同一批次染毒的斑马鱼成鱼的丙二醛含量对比图，图中表明：与对照组的斑马鱼相比，经过三种纳米材料处理的斑马鱼的丙二醛含量并没有显著变化。

Claims (4)

1.一种斑马鱼代谢物的提取方法，其特征在于步骤如下：

1)将斑马鱼样品用生理盐水冲洗干净后准确称重，然后迅速浸没于液氮中保存备用；

2)将上述斑马鱼样品置于盛有液氮的研钵中在-80℃温度下研磨5分钟至斑马鱼组织变成匀质浆体；

3)将上述浆体状斑马鱼样品加入-20℃预冷的提取液中，所述提取液为甲醇、氯仿与水的混合液，混合液中甲醇、氯仿与水的体积比为2.5:1:1，其中甲醇、氯仿与水均为色谱纯；斑马鱼样品与提取液的用量比为0.3-0.5g：15mL；在40℃温度下微波萃取30分钟，微波萃取功率为(样品罐数+2)×100W，离心后收集第一次上清液，然后在固体残留物中再加入相同量的上述-20℃的提取液，继续在40℃温度下微波萃取30分钟，离心后收集第二次上清液；

4)将第一次上清液与第二次上清液混合，在混合液中加入灭菌去离子水，4000rpm下离心5分钟，静置5分钟后溶液分层，上层溶液是甲醇/水相，下层溶液为氯仿相，两相分离后将氯仿相用氮气吹干，然后将甲醇/水相转移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；

5)将上述混合溶液放入冷冻干燥机内以-30℃—-50℃真空干燥后，采用两步法进行衍生化：首先加入浓度为20mg/mL的甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液，密封后涡旋1分钟，后将其在3000rpm下离心1分钟，再在30℃下温浴90分钟，然后加入硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)，37℃下温浴30分钟，得到斑马鱼代谢物衍生化样品并转移到适合GC-MS分析的内衬管中保存。

2.根据权利要求1所述斑马鱼代谢物的提取方法，其特征在于所述步骤4)中斑马鱼样品与灭菌去离子水的用量比为0.3-0.5g：500μL。

3.根据权利要求1所述斑马鱼代谢物的提取方法，其特征在于：所述步骤5)中斑马鱼样品与甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液的用量比为0.3-0.5g：50μL，斑马鱼样品与硅烷化试剂的用量比为0.3-0.5g：80μL。

4.一种如权利要求1所述斑马鱼代谢物的提取方法的应用，用于斑马鱼纳米毒性检测。