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CN104911269B - 鉴别气溶胶中布鲁氏菌a19疫苗株的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

鉴别气溶胶中布鲁氏菌a19疫苗株的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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CN104911269B CN201510355509.2A CN201510355509A CN104911269B CN 104911269 B CN104911269 B CN 104911269B CN 201510355509 A CN201510355509 A CN 201510355509A CN 104911269 B CN104911269 B CN 104911269B
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Abstract

本发明公开了一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物、探针及试剂盒，本发明提供的布鲁氏菌属细菌与A19疫苗株鉴别诊断的RPA‑LFD引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低均可以检测到3×100cfu的布鲁氏菌属细菌或布鲁氏菌A19疫苗株细菌，本发明提供的试剂盒不仅仅可用于鉴别布鲁氏菌A19疫苗株菌株与气溶胶样本，还可用于其他临床样本如血液、奶样等的鉴别检测。

Description

鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测技术(Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA-LFD)快速鉴别诊断气溶胶等临床样本中布鲁氏菌A19疫苗株的引物与探针以及试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌(主要为牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌等)引起的人和多种家畜共患的传染病，也是我国法定检疫和净化的重要病原。近年来发病率呈现逐年上升趋势，尤其是对奶畜危害极大，流产率高达50％-80％，乳、肉产量减少10％-20％。据《兽医公报》统计，2013年全国共发生布鲁氏菌病3620次，42720头牛羊发病。因此，布鲁氏菌病给社会经济发展与稳定、国家公共卫生安全等构成严重威胁。
布鲁氏菌病的传染源主要是患病动物及带菌者，它们通过分泌物、乳汁、体液等将布鲁氏菌排出体外，污染环境，同时布鲁氏菌粘附在空气中的灰尘悬浮粒子上，形成气溶胶进而传播，感染其他动物和人。养殖场环境中的布鲁氏菌气溶胶的分布可造成布鲁氏菌病的传染与流行，给畜牧业生产和人类健康带来严重危害，尤其是当前集约化、高密度养殖环境下更容易形成布鲁氏菌气溶胶性的流行。因此，通过监测养殖场环境中布鲁氏菌气溶胶，可以有效地预警预报布鲁氏菌病的暴发与流行。
我国动物布鲁氏菌病防控的主要策略是检疫与净化。目前我国牛群免疫常用的牛种布鲁氏菌A19活疫苗株在抗原与抗体的诊断上会对布鲁氏菌病野毒感染造成干扰。这是因为我国目前使用的布鲁氏菌病诊断方法不能对自然感染和人工疫苗免疫进行鉴别诊断，必然导致一些自然感染的病畜逃避检疫，使患病动物长期存在，对牛群和人类的安全长期构成威胁，因此，我国很难实行布鲁氏菌病的检疫、扑杀、净化的防控规程。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物、探针及试剂盒，该试剂盒能够特异、灵敏、简易、快速的现场鉴别诊断气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株。
为实现本发明目的，采用如下技术方案：
一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物对和探针组合，其中Brucella-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示；A19-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo.4所示，反向引物序列如SEQIDNo.5所示，探针序列如SEQIDNo.6所示。
本发明还提供了一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的试剂盒，该试剂盒包含上述引物对与探针组合。
本发明进一步提供了一种用于快速鉴别诊断气溶胶样本中布鲁氏菌A19疫苗株的方法，包括如下步骤：
(1)检测样本DNA的提取或检测样本裂解处理；
(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，进行RPA扩增；
(3)用侧流层析试纸条检测上述RPA扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有布鲁氏菌A19疫苗株。
优选的是，步骤(2)中所述RPA扩增体系为：RPA反应体系为50μL：其中包括2.1μL10μM的正向引物，2.1μL 10μM的反向引物，0.6μL 10μM的探针，rehydration缓冲液29.5μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH2O 11.2μL；将上述47.5μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液2.5μL，上下颠倒混匀后于恒温水浴38℃反应20-30分钟。
优选的是，步骤(3)的具体步骤为：每个取RPA反应产物取2μL与98μL PBST试纸条检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)混合，将一个测流层析试纸条(LFD)浸入，5min之内观察结果，若Brucella-RPA-LFD与A19-RPA-LFD两个检测组合同时出现检测条带和对照条带，则该样品中布鲁氏菌A19疫苗株阳性；Brucella-RPA-LFD检测组出现检测条带和对照条带，而A19-RPA-LFD检测组仅出现对照条带，则说明该样品中含有布鲁氏菌A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌；Brucella-RPA-LFD与A19-RPA-LFD两个检测组均未出现检测条带而同时出现对照条带，则说明检测样本中不含有布鲁氏菌属细菌。出现其他情况则说明RPA-LFD布鲁氏菌A19鉴别检测不成立。
本发明还提供含有上述两组引物与探针组合的用于鉴别诊断布鲁氏菌A19疫苗株的试剂盒。该试剂盒中还包括大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁(MgAc)溶液、侧流层析试纸条(特异性检测生物素与FAM标记基因扩增产物)、PBST试纸条检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)、灭菌去离子双蒸水(ddH2O)，TE缓冲液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K、布鲁氏菌A19疫苗株标准阳性模板。
以布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌基因组差异DNA序列为鉴别靶序列，应用RPA-LFD技术，可以实现布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌毒株现场快速鉴别诊断。RPA技术通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在37-39℃，整个过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量级(tracelevels)的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物，更适合低浓度的临床检测模板。而且RPA反应对模板纯度要求不高，适用于无法提取核酸的实地检测。目前，RPA反应可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和LFD试纸条三种不同方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的方法。
RPA-nfo反应的引物与探针的设计目前没有具体的规则，只能经过RPA反应用侧流层析试纸条(LFD)检测，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针组合。在RPA-nfo正向引物的扩增靶序列中设计一条带FAM标记的特异探针，同时反向引物用生物素标记，生物素标记的RPA产物与FAM标记的特异探针杂交、FAM标记的特异探针与抗FAM抗体的金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线，即检测条带。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线，即对照条带。这样RPA技术与侧流层析技术结合，即RPA-LFD技术，可以通过侧流层析试纸条(LFD)读取结果，本方法既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅仅使用普通的加热装置如水浴锅和侧流层析试纸条就可以通过肉眼观察结果。因此，RPA-LFD技术在布鲁氏菌气溶胶等临床样本的现场诊断以及疫苗株A19的鉴别方面具有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供的RPA技术是近年来新出现的一种在扩增速率和产量上均优于PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术的新方法，其反应在30min内就能从单个模板分子得到大约1012扩增产物。
(2)本发明提供的布鲁氏菌属细菌与A19疫苗株鉴别诊断的RPA-LFD引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低均可以检测到3×100cfu的布鲁氏菌属细菌或布鲁氏菌A19疫苗株细菌，Brucella-RPA-LFD检测组与大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌均无交叉反应。A19-RPA-LFD检测组与其他布鲁氏菌株以及大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌均无交叉反应。
(3)本发明提供的布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD引物与探针组合以及试剂盒不仅仅可用于布鲁氏菌A19疫苗株菌株与气溶胶样本的检测，还可用于其他临床样本如血液、奶样等的检测。
(4)本发明提供的布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD检测方法使用方便，无需特殊仪器设备，仅仅在38℃下，30min就能对待测样本的粗裂解物进行布鲁氏菌A19疫苗株的灵敏、特异、快速地鉴别检测，适合现场或基层布鲁氏菌病A19疫苗株与野毒株的鉴别诊断工作，也可用于布鲁氏菌属细菌的检测。
(5)使用本发明的试剂盒能够有效鉴别诊断布鲁氏菌病的自然感染和人工疫苗免疫，避免自然感染的病畜逃避检疫，及时的发现患病动物的存在。
附图说明
图1布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD检测组合的引物与探针的筛选，ControlPrimer/Probe Mix扩增组为TwistAmp nfo kit提供的引物、探针与模板的RPA扩增结果；Brucella-RPA-LFD组为本发明筛选出的特异性检测布鲁氏菌属细菌的引物与探针以布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA为模板的扩增结果；A19-RPA-LFD组为本发明筛选出的特异性检测布鲁氏菌A19疫苗株的引物与探针以布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA为模板的扩增结果；NC是以ddH2O代替模板的阴性对照。
图2布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD灵敏度检测，模板分别为3×108cfu–3×10-1cfu牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA，NC是以ddH2O代替模板的阴性对照组。
图3布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD特异性检测，B.abortus A19、B.suisS2、B.melitensis M5-90、B.ovis、B.canis、E.coli O157:H7、Y.enterocolitica O:9、Salmonella、S.aureus、M.bovis的模板分别为牛种布鲁氏菌疫苗株A19株、猪种布鲁氏菌疫苗株S2株、羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株、绵羊种布鲁氏菌63/290株、犬布鲁氏菌RM6/66株、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA；NC是以ddH2O代替模板的阴性对照组。
图4气溶胶等临床样本的布鲁氏菌A19疫苗株RPA-LFD鉴别诊断，+：模板为牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA，NC：以ddH2O代替模板的阴性对照组，1-10：布鲁氏菌核酸阳性气溶胶样本，其中1-3号样本为A19疫苗株核酸阳性气溶胶样本，11-13：布鲁氏菌核酸阳性血液样本，其中11和12号样本为A19疫苗株核酸阳性血液样本，14-16：布鲁氏菌核酸阳性奶样样本，其中14和15号样本为A19疫苗株核酸阳性奶样样本，17-20：分别为布鲁氏菌阴性气溶胶、血液、奶样以及流产胎儿临床样本。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。
1.试验材料
牛种布鲁氏菌疫苗株A19株(B.abortus A19)，猪种布鲁氏菌疫苗株S2株(B.suisS2)，羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株(B.melitensis M5-90)，绵羊种布鲁氏菌63/290株(B.ovis63/290)，犬布鲁氏菌RM6/66株(B.canis RM6/66)，大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、牛分支杆菌(M.bovis ATCC19210)、临床上确诊为布鲁氏菌阳性的气溶胶、血液和奶样DNA样本等均由山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。
引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNA Amplification nfoKits购自TwistDX公司，侧流层析试纸条(HybriDetect Dipsticks)购自Milenia公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
2.实验仪器
恒温水浴锅，离心机，掌上离心机，涡旋仪，MS-I型多功能微生物采样器(青岛众瑞智能仪器有限公司)等。
实施例一、引物与探针的设计和筛选
本发明根据布鲁氏菌属细菌保守的VirB基因(GengBank No.AF226278)设计布鲁氏菌属细菌通用型Brucella-RPA-LFD的2条特异性探针，在探针的两侧设计了4条正向引物和2条反向引物。同时根据A19疫苗株在基因组22840-22846位点处缺失7个核苷酸序列(AGATTTC)而设计特异性检测A19疫苗株的A19-RPA-LFD反向引物4条，在该缺失位点上游设计2条正向引物和4条特异性探针。RPA-nfo反向引物定位于此可以将A19疫苗株与其他布鲁氏菌属细菌进行鉴别诊断。
RPA-nfo的引物长度一般为30-35nt，引物过短会严重影响重组酶的活性。长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46-52nt，nfo核酶切割位点距离探针5’端30个碱基左右，距离3’端16-22个碱基左右。目前，RPA-LFD引物与探针的设计没有具体的操作规则，必须经过RPA反应用侧流层析试纸条(LFD)检测，通过试验筛选，才能获得可用于临床检测的引物与探针。
本试验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化、筛选，个别碱基的替换或增减都会对试验结果产生重要影响。在引物与探针设计时我们还考虑了一下三个注意点：(1)5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，这样能促引物与扩增靶基因的结合。对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能。(2)引物中最好不要出现特殊序列，比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量过高(>70％)或过低(<30％)都不利于RPA扩增。(3)此外，引物与探针设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、引物-探针互作、发夹结构的序列，减少二聚体的形成。
以牛种布鲁氏菌A19疫苗株DNA为模板，对上述布鲁氏菌属引物与探针以及A19鉴别引物与探针的不同组合进行筛选，最终分别选出一组扩增效率高，特异性强的引物与探针组合，用于布鲁氏菌A19疫苗株RPA-LFD鉴别检测，引物和探针序列分别见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6(表1)。
表1
注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记；dSpacer：核苷酸碱基类似物，是nfo核酸酶切割位点；C3-Spacer：聚合酶延伸阻断物。
实施例二、布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD检测方法的建立
1.实验步骤
(1)细菌基因组DNA的提取
取1ml菌液，按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行细菌总DNA的提取。
(2)布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD反应体系的建立
RPA反应体系为50μL：
将上述47.5μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解。最后加入2.5μL 280mM醋酸镁溶液，上下颠倒混匀，轻轻离心后将反应管置于38℃水浴处理20-30min。每个RPA反应结束后取2μL扩增产物与98μL LFD检测缓冲液混合，每个反应对应一个LFD，将LFD浸入相应的反应混合液，5min之内观察结果，若Brucella-RPA-LFD与A19-RPA-LFD两个检测组合同时出现检测条带和对照条带，则该样品中布鲁氏菌A19疫苗株阳性；Brucella-RPA-LFD检测组出现检测条带和对照条带，而A19-RPA-LFD检测组仅出现对照条带，则说明该样品中含有布鲁氏菌A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌；Brucella-RPA-LFD与A19-RPA-LFD两个检测组均未出现检测条带而同时出现对照条带，则说明检测样本中不含有布鲁氏菌属细菌。出现其他情况则说明RPA-LFD布鲁氏菌A19鉴别检测不成立。
(3)布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-FLD灵敏度检测
利用平板计数法计算牛种布鲁氏菌A19菌液浓度，分别以10倍倍比稀释成3×108–3×10-1cfu/mL菌液，取相应稀释倍数的菌液各1mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各稀释倍数的菌液基因组DNA，用100μL TE溶解，取2μL基因组DNA为模板，按照上述步骤(2)进行RPA扩增，同时以ddH2O为阴性对照，检验本方法的敏感性。
(4)布鲁氏菌A19疫苗株鉴别诊断RPA-FLD特异性检测
以本发明鉴别诊断A19疫苗株的RPA-FLD试剂盒对牛种布鲁氏菌A19疫苗株、猪种布鲁氏菌S2疫苗株、羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株、绵羊种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌，大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA进行扩增，同时以ddH2O为阴性对照，验证本方法的特异性。
2.试验结果
对两组RPA-LFD引物与探针组合分别进行RPA-LFD检测筛选，优化出2种最优的引物和探针组合，结果如图1所示。以10倍倍比稀释的10个梯度的牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA为模板进行检测，结果如图2所示，50μL体系的两组RPA-LFD检测限均为3×100cfu。对5株不同种属的布鲁氏菌和5株其他细菌作为对照菌株，分别进行两种RPA-LFD检测，结果如图3所示，5株布鲁氏菌Brucella-RPA-LFD反应管在侧流层析试纸条的检测线处均出现条带，均为阳性结果；而其他5株细菌菌株和ddH2O对照均未出现检测条带，均出现对照条带。A19-RPA-LFD扩增组只有牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组出现检测条带，其他扩增管均未出现检测条带，均为阴性。说明两组RPA-LFD引物与探针组合分别能特异性检测布鲁氏菌属细菌和布鲁氏菌A19疫苗株。
实施例三、气溶胶等临床样本布鲁氏菌A19疫苗株的鉴别诊断
1.实验步骤
(1)气溶胶样本的采集
采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mL pH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中不同区域的气溶胶样本。在室温下12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用于直接裂解处理。
(2)气溶胶等临床样本的现场制备
将气溶胶等临床样本用200μL TE缓冲液(1.0M Tris-HCl(pH8.0)10mL，0.5MNa2EDTA·2H2O(pH8.0)2mL，加蒸馏水至l000mL)重悬，液体样本直接取200μL，然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL 2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃温育1h。
(3)气溶胶等临床样本布鲁氏菌A19疫苗株的鉴别检测
按照步骤(2)中临床样本现场裂解处理的方法，分别对本实验室保存的已经用PCR扩增后测序正确的10份布鲁氏菌阳性气溶胶样本，其中3份布鲁氏菌A19疫苗株阳性，3份奶样和3份血液布鲁氏菌阳性样本，以及2份气溶胶、1份奶样和1份血液布鲁氏菌阴性样本进行处理，同时以牛种布鲁氏菌A19疫苗株DNA和ddH2O分别为阳性、阴性对照，分别进行两组RPA-LFD扩增检测。
2.试验结果
对本实验室确诊的12份气溶胶样本、4份血液样本和4份奶样样本，分别进行了Brucella-RPA-LFD和A19-RPA-LFD检测，其中布鲁氏菌阴性气溶胶样本2份，布鲁氏菌阴性血液和奶样样本各1份，结果如图4和表2所示。以上结果充分说明用本发明提供的两组RPA-LFD引物、探针组合以及试剂盒可用于鉴别诊断布鲁氏菌属细菌和A19疫苗株，该方法具有较高的灵敏度和特异性，最重要的是可以对临床气溶胶等样本直接进行现场快速的诊断。
表2 气溶胶等临床样本布鲁氏菌A19疫苗株的鉴别检测结果
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (6)

1.一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19 疫苗株的引物对和探针，其特征是，Brucella-RPA-LFD 正向引物序列如SEQ ID No.1 所示，反向引物序列如SEQ ID No.2 所示，探针序列如SEQ ID No.3 所示；A19-RPA-LFD 正向引物序列如SEQ ID No.4 所示，反向引物序列如SEQID No.5 所示，探针序列如SEQ ID No.6 所示。
2.一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19 疫苗株的试剂盒，其特征是，该试剂盒包含权利要求1 所述的引物对与探针。
3.如权利要求2 所述的试剂盒，其特征是，包括rehydration 缓冲液、280mM 醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、 PBST 试纸条检测缓冲液、灭菌去离子双蒸水、TE 缓冲液、10％ (w/v)SDS、2％ (w/v) 蛋白酶K、布鲁氏菌A19 疫苗株标准阳性模板；
其中，所述rehydration 缓冲液中含有大肠杆菌来源的recA 重组酶、链置换DNA 聚合酶和单链DNA 结合蛋白。
4. 一种用于快速鉴别气溶胶样本中布鲁氏菌A19 疫苗株的方法，所述方法不用于疾病的诊断，其特征是，包括如下步骤：
(1) 检测样本DNA 的提取或检测样本裂解处理；
(2) 以步骤(1) 中处理的样本为模板，进行RPA 扩增；
所述步骤(2) 中RPA 的扩增体系为：RPA 反应体系为50μL ：其中包括2.1μL 10μM 的正向引物，如SEQ ID No.1 或4所示，2.1μL 10μM 的反向引物，如SEQ ID No.2或5 所示，0.6μL 10μM的探针，如SEQ ID No.3或6所示，rehydration 缓冲液29.5μL，待测样本DNA 或粗裂解产物2μL，ddH2O 11.2μL，将扩增体系混合液47.5μL 加入RPA-nfo 反应管，混匀、溶解，最后加入2.5μL 280mM 的醋酸镁溶液，上下颠倒混匀后于37-39℃反应20-30 分钟；
(3) 用侧流层析试纸条检测上述RPA 扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有布鲁氏菌A19 疫苗株；
步骤(3) 中，样本中是否含有布鲁氏菌A19 疫苗株的判定方法为：
若Brucella-RPA-LFD 与A19-RPA-LFD 两个检测组合同时出现检测条带和对照条带，则该样本中布鲁氏菌A19 疫苗株；
Brucella-RPA-LFD 检测组出现检测条带和对照条带，而A19-RPA-LFD 检测组仅出现对照条带，则说明该样本中含有布鲁氏菌A19 疫苗株以外的其他布鲁氏菌； Brucella-RPA-LFD 与A19-RPA-LFD 两个检测组均未出现检测条带而出现对照条带，则说明检测样本中不含有布鲁氏菌属细菌。
5.如权利要求4 所述的方法，其特征是，所述步骤(3) 为：针对每个RPA 反 应管分别取2μL 扩增产物与98μL PBST 试纸条检测缓冲液混合，将一个侧流层析试纸条浸入相应的反应混合液，5min 之内观察结果即可。
6.如权利要求4 所述的方法，其特征是，上下颠倒混匀后于38℃反应25 分钟。
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