CN104894290A

CN104894290A - 犬瘟热和犬冠状病毒双重pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN104894290A
Application number: CN201410076305.0A
Authority: CN
Inventors: 孙园园; 刘骏; 王水明; 王云; 王富海; 张帆; 钱科; 赵鹏; 翟路翀
Original assignee: NANJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA; ZHENJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION QUARANTINE BUREAU
Current assignee: NANJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA; ZHENJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明公开了一种用于犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒和用于犬瘟热和犬冠状病毒快速鉴别检测的双重PCR方法。根据犬瘟热病毒和犬冠状病毒的基因组序列各设计一对PCR引物，可以扩增出相对应的特异性片段，实现对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的检测与鉴别。本发明利用双重PCR技术，单管同步检测犬瘟热病毒和犬冠状病毒，降低了对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的检测成本和工作量，实现了对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的鉴别检测。本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、节时省力并且易于观察结果的双重PCR方法，操作简便，特异性强、灵敏度高、可重复性高，且没有复杂的后处理。

Description

犬瘟热和犬冠状病毒双重 PCR 检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及犬瘟热病毒和犬冠状病毒试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种用于同步进行犬瘟热病毒和犬冠状病毒的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒对犬瘟热病毒和犬冠状病毒进行同步双重PCR检测的生物学检测方法。

背景技术

犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）与犬冠状病毒（canine coronavirus，CCV）是2种严重危害养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护的病毒性传染病病源（程悦宁等，2013；孙园园等，2009）。在临床上常常发生犬瘟热与犬冠状病毒的混合感染，使临床症状复杂化，给疾病的诊断带来困难（Soma等，2011）。目前临床上对CDV和CCV的诊断主要依靠传统的病原学和血清学诊断方法，病毒的分离培养和电镜观察特异性较强，但耗时长、需要专业仪器、不适于快速诊断和基层应用的要求（李天松等，2012；Cha等，2012）。血清学检测方法相对简便，但机体感染病毒后需潜伏一定时期才能出现病毒血症，不利于早期诊断。因此，建立一种快速、简捷、准确且能同时检测CDV和CCV的方法，对犬腹泻的早期诊断、疫情监控、流行病学调查等具有重要意义（Erles等，2003）。

病原体的PCR检测需要合成相应的特异PCR扩增引物，并设计适合每对引物的PCR的扩增条件，即可在临床检测中获得良好的结果，因此，该方法已在国内外的兽医临床检测中广泛应用。针对病原体核酸序列设计的双重PCR，需要针对不同的病原体设计各自特异且保守的寡核苷酸引物，并同时在同一个体系中进行反应，由于引物之间的相互作用的复杂性，故双重PCR扩增体系需要进行各方面条件的优化和调整。

根据CDV和CCV的病毒基因特征，以双重PCR技术在CDV和CCV快速鉴别诊断中的应用为研究内容，着力于建立可同时快速区别诊断CDV和CCV的双重PCR诊断方法，探讨该诊断方法在实际应用中的可行性与局限性，为推进犬瘟热与犬冠状病毒病的防控提供技术手段和数据参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于同步进行犬瘟热和犬冠状病毒的检测和鉴别检测的双重PCR检测试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案:犬瘟热病毒和犬冠状病毒在同一PCR反应体系中进行特异性扩增。犬瘟热病毒和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒包括MixPCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。其中: 所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成:

序列为 SEQ ID NOl 的 10 mmol/L 的上游引物 0.5 μ L ；

序列为 SEQ ID Ν02 的 10 mmol/L 的下游引物 0.5 μ L ；

序列为 SEQ ID Ν03 的 10 mmol/L 的上游引物 0.5 μ L ；

序列为 SEQ ID Ν04 的 10 mmol/L 的下游引物 0.5 μ L ；

10XPCR buffer 缓冲液 2.5 μ L ；

25 mmol/L MgCl₂ 2 μ L ；

10 mmol/ L dNTP I μ L ；

5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L ；

灭菌水 14.2 μ L ；

合计22 μ L,为单次反应的用量。

所述阳性对照管，管内为犬瘟热病毒和犬冠状病毒各自的重组质粒，比例为1:1，2 μ L〜20 μ L，其DNA序列如下:

犬瘟热病毒重组质粒pMD18-T-CDV的DNA序列为SEQ ID Ν05 ；

犬冠状病毒重组质粒pMD18-T-CCV的DNA序列为SEQ ID Ν06。

所述阴性对照管，管内为无犬瘟热病毒和犬冠状病毒感染的犬肌肉组织DNA样品，2μ L〜20 μ L。

所述灭菌去离子水管:1〜2mL。

用所述试剂盒进行犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测方法，步骤如下:

(1)制备待测样品核酸模板

取100 μ L〜200 μ L或100mg〜200mg待检样品，用商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因组DNA，即为待测样品核酸模板；

(2) PCR扩增检测:取3 μ L待测样品核酸模板和阴性对照管或3 μ L待测样品核酸模板阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增；

PCR扩增条件是:

预变性:95 °C 5分钟；

循环:94 °C变性45秒，58 °C退火30秒，72°C延伸45秒，35个循环；

延伸,72 °C 10分钟；

(3)结果判定:

在550bp和225bp位置有两条扩增条带，分别为犬瘟热病毒和犬冠状病毒特异性扩增条带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阴性。

在本发明的PCR扩增引物的设计上，遵循一般的引物设计要求，设计和针对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的特异性引物，且保证在相同的退火温度下均能获得较好的扩增。针对特异性引物在扩增靶序列内部的不同位置，从而可以方便地通过扩增片段的长度的不同

鉴别出犬瘟热病毒和犬冠状病毒。

本发明的优点是

(1)本发明可以快速地对待检样品是否感染犬瘟热病毒和犬冠状病毒进行鉴定和鉴别检测，具有较高的灵敏度。本发明可以组装成临床检测犬瘟热病毒和犬冠状病毒病原的双重PCR检测试剂盒，供兽医临床和实验室检测所用。

(2)本发明提供的扩增试剂均经试验反复验证和优化，具有市场上同类PCR检测试剂盒相应优点。归纳起来为:

1)特异性好:本发明与其它病毒DNA无交叉扩增，假阳性率低。

2)灵敏度高:本发明对犬瘟热病毒和犬冠状病毒检测的最低检测量分别约为0.1ng。

附图说明

图1双重PCR特异性试验电泳；

图2双重PCR灵敏度试验电泳；

图1：M，DL2000 plus DNA Marker；1，阴性对照；2～7，质粒DNA浓度分别为 0.01、0.1、0.5、1、10 和100 ng/μL。

图2：M，DL2000 DNA Marker；1，疫苗(含犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒)；2，CCV和CDV阳性模板混合物；3，CCV阳性组织；4，CDV Vero 细胞培养液；5，Vero 细胞培养液；6，阴性对照。

具体实施方式

本发明引物的设计及筛选

根据已知的犬瘟热病毒核酸序列和犬冠状病毒核酸序列的基因组全长序列，利用应用ClustW软件进行多重比对,用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,分别标记为:SEQ ID NOl……SEQ ID NO4。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用核酸提取试剂盒分别提取犬瘟热病毒和犬冠状病毒细胞毒DNA，采用权利要求1设计的引物分别扩增，排除有非特异性扩增的引物。

获得引物:

表1 引物序列

引物名称	引物序列(5’- 3’)
		SEQ ID NOl	GAATTCATGATACTGAATGGAGATGGTAT
SEQ ID NO2	GTC GACTCAGGGATTTTAACGGTTACATG
		SEQ ID NO3	TGTGAAAGCTAAGGAGGAG
SEQ ID NO4	GGATAAACAGAATCACTACCG

阳性对照品的制备

采用市售商品化试剂盒提取阳性犬瘟热病毒和犬冠状病毒细胞培养物的核酸，用Mix PCR反应液管分别扩增犬瘟热病毒和犬冠状病毒DNA，反应分别能扩增出一条550 bp和225 bp左右的条带。用胶回收试剂盒回收扩增的目的条带，利用分光光度计测定回收的核酸的浓度。分别将其与PMD18-T载体进行连接反应，4°C连接过夜，将连接产物转化至JM109感受态细胞，抗性筛选、摇菌、PCR鉴定阳性者，提取重组质粒，测序验证，获得含目的片段的重组质粒PMD18-T-CDV和PMD18-T-CCV，将两种病毒的阳性质粒等比例混合，分装每支50 μ L,浓度控制在80〜100ng/µL。

阴性对照品的制备

采用市售商品化核酸提取试剂盒分别提取无犬瘟热病毒和犬冠状病毒感染犬肌肉组织的DNA。用灭菌去离子水稀释，将浓度控制在80〜100ng/μ L，分装为每支50 μ L。

制备待检样品的核酸模板

取100 μ L〜200 μ L或100mg〜200mg待检样品，采用市售商品化核酸提取试剂盒提取样品中的基因组，反转录后即为核酸模板。

扩增体系的建立和优化

以标准阳性毒株核酸为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增的退火温度，然后在优化的退火温度下，优化反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、PCR缓冲液浓度和Taq酶浓度。优化的 Mix PCR 反应液中包含:10×PCR buffers 2.5 μ L,25 mmol/L MgCl2 2μ L, lOmmol/L dNTP I μ L, Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L, 10 μ mol/L 引物 SEQ ID NOU SEQID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04各0.5 μ L，灭菌双蒸水14.2 μ L0在优化的退火温度和循环条件下，两个体系可以实现对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的鉴定。优化的Mix PCR反应液的扩增条件是:

预变性:95 °C 5 min ；

循环: 95 °C 5分钟；循环:94 °C变性45秒，58 °C退火30秒，72°C延伸45秒，35个循环；延伸72 °C 10分钟；:4 °C保存。

特异性和灵敏度

采用上述优化的体系和扩增条件，对标准阳性犬瘟热病毒和犬冠状病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、健康犬组织等核酸提取物进行扩增，均无非特异性扩增条带。

用灭菌去离子水梯度稀释阳性质粒DNA，用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发明的最低检测限分别约为0.1ng。

试剂的制备

Mix PCR 反应液:10 × PCR buffers 2.5 μ L,25 mmol/L MgCl2 2 μ L, l0 mmol/LdNTP 1 μ L,Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L，10 μ mol/L 引物 SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ IDN03、SEQ ID N04各0.5 μL，灭菌双蒸水14.2 μ L，共22 μ L，每个试剂盒提供足做48个反应的量共 22 ×48=1056 μ L。

试剂盒的组装

如上所配制的阳性对照、阴性对照各1支，Mix PCR反应液1支，灭菌去离子水2支，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。

序列表

<110>中华人民共和国镇江出入境检验检疫局；中华人民共和国南京出入境检验检疫局

<120>犬瘟热病毒和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法

<160>6

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GAATTCATGATACTGAATGGAGATGGTAT

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 2

GTC GACTCAGGGATTTTAACGGTTACATG

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 3

TGTGAAAGCTAAGGAGGAG

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 4

GGATAAACAGAATCACTACCG

<210>5

<211>550

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 5

GAATTCATGATACTGAATGGAGATGGTATGATTATTATGAAAGCCCACTTTTGAACTCCGGATGGCTTACCATTCCTCCCAAAAACGGAACAATCTTTGGATTGATAAACAAAGCAGGTAGAGGAGACCAGTTCACTGTACTCCCCCATGTGTTAACATTTGCGCCCAGGGAATCAAGTGGAAATTGTTATTTACCTATTCAAACATCTCAAATTATAGATAGAGATGTCCTCATTGAGTCCAATATAGTGGCGTGTTGCCTACACAGAGTTTTAGATATGTCATAGCAACGTATGACATATCACGAAGTGATCATGCTATTGTTTATTATGTTTATGACCCAATCCGGACGATTTCTTATACGCACCCATTTAGACTAACTACCAAGGGTAGACCTGATTTCCTAAGGATTGAATGTTTTGTGTGGGATGACAATTTGTGGTGTCACCAATTTTACAGATTCGAGGCTGACATCGCCAACTCTACAACCAGTGTTGAGAATTTAGTCCGTATAAGATTCTCATGTAACCGTTAAAATCCCTGAGTCGAC

<210>6

<211>225

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 6

TGTGAAAGCTAAGGAGGAGTCTGTTAAATCTGAATATGCTTACGCCATATTAAAGGAGGTTATCGGCCCTAAGGAAATTGTACTCCAATGGGAAGCTTCTAAGACTAAGCCTCCACTTAACAGAAATTCAGTTTTCACTTGTTTTCAGATAAGTAAGGATACTAAAATTCAATTAGGTGAATTTGTGTTTGAGCAATCTGAGTACGGTAGTGATTCTGTTTATCC

Claims

1.一种犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征是:它包括Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中: 所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成:

序列为SEQ ID N0.1的10 mmol/L的上游引物0.5 μ L ；

序列为SEQ ID N0.2的10 mmol/L的下游引物0.5 μ L ；

序列为SEQ ID N0.3的10 mmol/L的上游引物0.5 μ L ；

序列为SEQ ID N0.4的10 mmol/L的下游引物0.5 μ L ；

10XPCR buffer 缓冲液 2.5 μ L ；

25 mmol/L MgCl2 2 μ L ；

10 mmol/L dNTP 1 μ L ；

5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L ；

灭菌水14.2 μ L ；合计22 μ L,为单次反应的用量；

所述阳性对照管:管内为犬瘟热病毒和犬冠状病毒各自的重组质粒，比例为1:1，2 μ L〜20 μ L，其DNA.序列如下:

犬瘟热病毒重组质粒PMD18-T-CDV的DNA序列为SEQ ID N0.5 ；

犬冠状病毒重组质粒PMD18-T-CCV的DNA序列为SEQ ID N0.6 ；

所述阴性对照管:管内为无犬瘟热病毒和犬冠状病毒感染的犬肌肉组织DNA样品，2 μ L

〜20 μ L ; 所述灭菌去离子水管:1〜2mL。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是: 所述犬瘟热病毒和犬冠状病毒在同一PCR反应体系中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将犬瘟热病毒和犬冠状病毒鉴别与区分。

3.一种采用权利要求1所述试剂盒用于的犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR疾病诊断目的的检测方法，步骤如下:

(1)制备待测样品核酸模板取100 μ L〜200 μ L或100mg〜200mg待检样品，用商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因组DNA，即为待测样品核酸模板；

(2)PCR扩增检测:取3 μ L待测样品核酸模板和阴性对照管，或3 μ L待测样品核酸模板和阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增； PCR扩增条件是: 预变性:95 °C 5分钟；循环:94 °C变性45秒，58 °C退火30秒，72°C延伸45秒，35个循环；延伸72 °C 10分钟；

(3)结果判定:在550 bp和225 bp位置有两条扩增条带，分别为犬瘟热病毒和犬冠状病毒特异性扩增条带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阴性。