CN104877016A - 折叠氯代毒素、氯代毒素变异体与折叠氯代毒素变异体及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种折叠氯代毒素、氯代毒素变异体与折叠氯代毒素变异体及其制备工艺，该折叠氯代毒素，肽序列为MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR-NH2，该折叠氯代毒素变异体的肽序列为：MCMPCFTTDHQMARSCDDCCGGSGRGSCYGPQCLCR-NH2；其由丝氨酸(Ser, S)取代氯代毒素肽序列中的赖氨酸(Lys, K)构成。本发明开拓了氯代毒素及其衍生物在生物与药学中具有潜在应用价值，对于生命健康与个性化医疗等方面产生良好的经济与社会效益。

Description

折叠氯代毒素、氯代毒素变异体与折叠氯代毒素变异体及其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种折叠氯代毒素、氯代毒素变异体与折叠氯代毒素变异体及其制备工艺。

背景技术

近年来有学者发现一段由36 个氨基酸残基组成的多肽——氯代毒素（chlorotoxin，简称CTX）。该CTX 具有良好的肿瘤靶向性，能够特异性结合多种肿瘤细胞，如神经胶质瘤、恶性肉瘤、肠癌以及前列腺癌等。研究表明，CTX 通过基质金属蛋白酶-2（MMP-2）介导进入肿瘤细胞，而MMP-2 只在肿瘤细胞表面高量表达，正常细胞表面不表达，这就解释了CTX 特异性结合肿瘤细胞的原因。同时，研究显示CTX 虽然对无脊椎动物有强烈毒性，却对哺乳动物无毒。目前已有利用CTX 修饰的放射治疗药物131I-TM-601，正在接受FDA 审批，并已进入II 期临床试验阶段。还有研究将CTX 与荧光染料连接用于手术过程的肿瘤显像等。因此，CTX 可能成为一种肿瘤特异性非常高的靶向头基。

目前学界的研究方向都是基于氯代毒素（chlorotoxin），而对于其氯代毒素的折叠结构和变异结构缺少研究和创新，因此，限制了氯代毒素的应用潜力。

发明内容

本发明的第一个目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种折叠氯代毒素。

本发明的第二个目的是提供一种上述折叠氯代毒素的制备工艺。

本发明的第三个目的是提供一种氯代毒素变异体。

本发明的第四个目的是提供一种折叠氯代毒素变异体。

本发明的第五个目的是提供一种上述折叠氯代毒素变异体的制备工艺。

为实现本发明的第一个目的，为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是其肽序列为MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR-NH2；

其结构式为：

为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案是包括有以下步骤：

按以下等比例构建反应体系：将40毫克的氯代毒素称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2-4毫摩尔盐酸胍、10-200毫摩尔谷胱甘肽、10wt%二甲亚砜混合溶液的容器中；

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应1-24小时，获得折叠氯代毒素产物。

为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案还可以包括以下步骤：

是按以下数值等比例构建反应体系：氯代毒素称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠、3毫摩尔还原谷胱甘肽、1毫摩尔氧化谷胱甘肽、酸碱度pH～7.8的混合溶液的容器中，反应体系中氯代毒素浓度为0.05毫克/毫升；

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应6天，获得折叠氯代毒素产物。

为实现本发明的第三个发明目的，本发明的技术方案是该氯代毒素变异体的肽序列为：

MCMPCFTTDHQMARSCDDCCGGSGRGSCYGPQCLCR-NH2；

其由丝氨酸(Ser, S)取代氯代毒素肽序列中的赖氨酸(Lys, K)构成，其结构式为：

为实现本发明的第四个目的，本发明的技术方案是

该折叠氯代毒素变异体的肽序列为：

MCMPCFTTDHQMARSCDDCCGGSGRGSCYGPQCLCR-NH2；

其由丝氨酸(Ser, S)取代氯代毒素肽序列中赖氨酸(Lys, K)构成，

该折叠氯代毒素变异体的结构式为：

为实现本发明的第五个目的，本发明的技术方案是包括以下步骤：

按以下数值等比例构建反应体系：38毫克氯代毒素变异体称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2-4毫摩尔盐酸胍、10-200毫摩尔谷胱甘肽、10wt%二甲亚砜混合溶液的容器中；

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应1-24小时，获得折叠氯代毒素变异体产物。

为实现本发明的第五个目的，本发明的技术方案还可以是包括以下步骤：

   按以下数值等比例构建反应体系：氯代毒素变异体称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠、3毫摩尔还原谷胱甘肽、1毫摩尔氧化谷胱甘肽、酸碱度pH～7.8的混合溶液的容器中，反应体系中氯代毒素变异体浓度为0.05毫克/毫升，

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应6天，获得折叠氯代毒素变异体产物。

本发明的氯代毒素变异体以及折叠氯代毒素变异体在生物与药学中具有潜在应用价值，氯代毒素变异体以及折叠氯代毒素变异体有望在癌细胞选择性绑定用于靶向肿瘤诊断与治疗、分子探针的体内标记与示踪、药物代谢、筛选与优化等领域得到更广泛的应用，进一步提高药物的靶向缓控释及癌症手术的精确性，对于生命健康与个性化医疗等方面产生良好的经济与社会效益。

另外，本发明的合成工艺条件温和、分离与提纯工艺简便，易实现自动化控制、工艺绿色环保。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1 本发明实施例1不同条件下氯代毒素折叠反应的高效液相分离谱图；

图2 本发明实施例2不同条件下氯代毒素折叠反应的高效液相分离谱图；

图3 本发明实施例3不同条件下氯代毒素折叠反应的高效液相分离谱图；

图4 本发明实施例4不同条件下氯代毒素折叠反应的高效液相分离谱图；

图5 本发明实施例5不同条件下氯代毒素折叠反应的高效液相分离与质谱图；

图6 本发明实施例6中氯代毒素变异体固相合成高效液相分离与液质联用鉴定；

图7 本发明实施例7不同条件下氯代毒素变异体折叠反应的高效液相分离谱图；

图8 本发明实施例8不同条件下氯代毒素变异体折叠反应的高效液相分离与质谱图。

具体实施方式

结合附图1-8，下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：氯代毒素（40毫克）称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔盐酸胍、10毫摩尔谷胱甘肽、10%二甲亚砜混合溶液的试管中，涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，于不同时间点（1小时、2小时、4小时、6小时、10小时、24小时）取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，得到折叠氯代毒素的分离谱图。

实施例2：氯代毒素（40毫克）称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、4毫摩尔盐酸胍、10毫摩尔谷胱甘肽、10%二甲亚砜混合溶液的试管中，涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，于不同时间点（3小时、7小时、24小时）取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，得到折叠氯代毒素的分离谱图。

实施例3：氯代毒素（40毫克）称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔盐酸胍、100毫摩尔谷胱甘肽、10%二甲亚砜混合溶液的试管中，涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，于不同时间点（3小时、7小时、24小时）取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，得到折叠氯代毒素的分离谱图。

实施例4：氯代毒素（40毫克）称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔盐酸胍、200毫摩尔谷胱甘肽、10%二甲亚砜混合溶液的试管中，涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，于不同时间点（3小时、7小时）取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，得到折叠氯代毒素的分离谱图。

实施例5：氯代毒素称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠、3毫摩尔还原谷胱甘肽、1毫摩尔氧化谷胱甘肽、酸碱度pH=7.8的混合溶液的试管中（氯代毒素浓度为0.05毫克/毫升），涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，6天后取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，分离得到纯化的折叠氯代毒素，保留时间为22.8分钟，收率8%。折叠氯代毒素及形成的四组二硫键可通过Moldi-TOF质谱裂分峰鉴定。

实施例6：将氨基酸按序列（MCMPCFTTDHQMARSCDDCCGGSGRGSCYGPQCLCR-NH2）等比例称量并置于固相合成仪填料管中，称量3-10倍树脂于反应器内，开启多肽固相合成，反应24-36个小时后停止。将粗产物转移抽滤、洗脱、去保护，并以冰冻乙醚洗涤、离心、真空冻干。以粗产物在高效液相色谱进样，以Vydac C18半制备柱分离，流速3.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，分离得到纯化的氯代毒素变异体，保留时间为19.8分钟，收率12%。氯代毒素变异体可通过LC-ESI液相色谱-质谱联用装置由裂分峰鉴定。

实施例7：氯代毒素变异体（38毫克）称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔盐酸胍、200毫摩尔谷胱甘肽、10%二甲亚砜混合溶液的试管中，涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，24小时后取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，得到折叠氯代毒素的分离谱图。

实施例:8：氯代毒素变异体称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠、3毫摩尔还原谷胱甘肽、1毫摩尔氧化谷胱甘肽、酸碱度pH=7.8的混合溶液的试管中（氯代毒素变异体浓度为0.05毫克/毫升），涡旋振荡至少3次直至溶液透明澄清。体系置于4摄氏度冷藏室中，6天后取出产物。高效液相色谱以Dionex C18 Acclaim 120分析柱为层析柱，流速1.00毫升/分钟，洗脱相为：0.1%三氟乙酸水溶液；0.1%三氟乙酸乙腈溶液，5-65%梯度洗脱30分钟，分离得到纯化的折叠氯代毒素变异体，保留时间为23.5分钟，收率7%。折叠氯代毒素变异体及形成的四组二硫键可通过Moldi-TOF质谱裂分峰鉴定。

Claims (7)

1.一种折叠氯代毒素，其特征在于：其肽序列为MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR-NH2；

其结构式为：

。

2.一种如权利要求1所述的折叠氯代毒素的制备工艺，其特征在于包括有以下步骤：

按以下数值等比例构建反应体系：将40毫克的氯代毒素称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2-4毫摩尔盐酸胍、10-200毫摩尔谷胱甘肽、10wt%二甲亚砜混合溶液的容器中；

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应1-24小时，获得折叠氯代毒素产物。

3.一种如权利要求1所述的折叠氯代毒素的制备工艺，其特征在于包括有以下步骤：

按以下数值等比例构建反应体系：氯代毒素称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠、3毫摩尔还原谷胱甘肽、1毫摩尔氧化谷胱甘肽、酸碱度pH～7.8的混合溶液的容器中，反应体系中氯代毒素浓度为0.05毫克/毫升；

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应6天，获得折叠氯代毒素产物。

4.一种氯代毒素变异体，其特征在于：

该氯代毒素变异体的肽序列为：

MCMPCFTTDHQMARSCDDCCGGSGRGSCYGPQCLCR-NH2；

其由丝氨酸(Ser, S)取代氯代毒素肽序列中的赖氨酸(Lys, K)构成，其结构式为：

。

5.一种折叠氯代毒素变异体，其特征在于：

该折叠氯代毒素变异体的肽序列为：

MCMPCFTTDHQMARSCDDCCGGSGRGSCYGPQCLCR-NH2；

其由丝氨酸(Ser, S)取代氯代毒素肽序列中赖氨酸(Lys, K)构成，

该折叠氯代毒素变异体的结构式为：

。

6.一种如权利要求5所述的折叠氯代毒素变异体的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

按以下数值等比例构建反应体系：38毫克氯代毒素变异体称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2-4毫摩尔盐酸胍、10-200毫摩尔谷胱甘肽、10wt%二甲亚砜混合溶液的容器中；

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应1-24小时，获得折叠氯代毒素变异体产物。

7.一种如权利要求5所述的折叠氯代毒素变异体的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

   按以下数值等比例构建反应体系：氯代毒素变异体称量后置于放有100毫摩尔碳酸氢铵、2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠、3毫摩尔还原谷胱甘肽、1毫摩尔氧化谷胱甘肽、酸碱度pH～7.8的混合溶液的容器中，反应体系中氯代毒素变异体浓度为0.05毫克/毫升，

将反应体系涡旋振荡直至溶液透明澄清，反应体系置于4摄氏度冷藏室中，反应6天，获得折叠氯代毒素变异体产物。