CN104846009A - 一种水稻工程保持系的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻工程保持系的构建方法，包括：步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为育性调控基因突变体株系。本发明还公开了水稻工程保持系在水稻育种中的应用。本发明将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题。本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中。

Description

一种水稻工程保持系的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种水稻工程保持系的构建方法及其应用。

背景技术

水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。“三系法”杂交水稻对种质资源利用率低以及“两系法”杂交水稻杂交制种安全性约束是影响杂交水稻种植推广面积进一步扩大的重要因素。发明新的育种技术，开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。普通隐性核不育材料不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。

针对隐性核雄性不育材料的繁殖问题，育种家也先后提出多种解决方案，主要包括：(1)根据雄性不育机理，通过施加缺失的代谢中间物质(如氨基酸、黄酮、脂肪酸等物质)，使突变不育株恢复育性而得以繁殖；(2)在雄性不育株中，利用条件控制(如诱导性)启动子驱动育性恢复基因表达，给予适合的启动子表达条件时，育性恢复基因表达，育性恢复而得以繁殖；而不给予适合启动子表达的条件时，育性恢复基因不表达，即为不育系。此外，也可以利用条件控制启动子驱动作物内源育性基因的抑制因子表达而达到上述同样的目的。以上这些方案在不同作物的实际生产中得到了不同程度的应用，但由于不育系的育性转换不能被完全精确地控制，或者不育系中含有转基因成分并因而造成杂交种中含有转基因等问题，都没有得到广泛的应用。

随着分子设计育种思想和技术的进步，开发能够精确控制的不带转基因成分的不育系的繁殖技术，成为分子设计杂交育种技术领域亟需解决的问题。1993年6月11日，国外生物技术公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一项PCT专利申请，该专利提出以下技术思想：在隐性雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死(败育)基因以及筛选标记基因(如荧光蛋白基因)三套元件，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通过在纯合的雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件，由此获得该雄性不育植株的保持系，保持系与不育株杂交即可繁殖不育系和保持系。两种方法提出了利用精确的分子生物技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的应用问题，为开展分子设计杂交育种提供了技术框架。相比较而言，三元件系统考虑到花粉逃逸和转基因生态风险的问题，较双元件系统思路更加缜密。2006年，美国杜邦先锋公司在三元件系统技术思路基础上，首先在玉米中实现了基于核不育突变材料的种子生产技术，并命名为Seed Production Technology(SPT)技术。2010年9月，在中国科技部“国家高技术研究发展计划”的支持下，三元件系统技术思想在水稻中得到了证实和应用，并被称之为“智能不育杂交育种技术”或“第三代杂交水稻技术”。通过项目的实施，将有力推动智能不育分子设计技术在作物育种中的研究应用，使我国在水稻杂交育种领域继续保持国际领先优势，为促进生物育种产业的发展提供技术和产品支持。

从思路上来说，SPT技术几乎完美，既可以实现普通核不育系的繁殖，又可以消除人们对于转基因风险的担忧，因为杂交后代植株中没有外源的转基因元件，不存在转基因生物安全问题。但是在实际操作过程中会遇到以下几个问题：(1)转化受体取材受到限制，因为互补载体要转化到不育植株中去，因此只有选择不育水稻植株的幼穗诱导愈伤组织；取材受到很大限制，并且有效取材时间很短；(2)育性恢复基因的导入对突变不育株的表型恢复并不十分理想，对于后续的制种产量影响很大。原因可能与载体序列在受体基因组上的插入位点有关，侧翼序列的特征对育性恢复基因的表达水平可能会有影响。

发明内容

本发明的一个目的克服现有技术的不足，并提供至少后面将说明的优点。

本发明另一个目的是提供一种水稻工程保持系的构建方法，本发明通过CRISPR/Cas9系统将外源报告基因整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题。

本发明还有一个目的提高水稻工程保持系在水稻育种中的应用，本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种水稻工程保持系的构建方法，包括：

步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，

步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系。

优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。

优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述步骤一中，将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包括：

(1.1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物

上游序列：5’-GCAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO：1)

下游序列：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO：2)；

(1.2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤(1.1)中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

(1.3)将外源报告基因构建到表达载体上得到重组表达载体；

(1.4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；

(1.5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大小与外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的水稻转基因株系，并且在靶位点定点插入整合。

优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述步骤(1.3)中，所述表达载体采用过表达载体。

优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述重组表达载体中，所述外源报告基因的核苷酸序列前构建有水稻胚乳特异性启动子Gt1。

较优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述育性调控基因为水稻EAT1基因。

较优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述步骤(1.1)中的引物序列为：

上游序列：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’(SEQ ID NO：3)

下游序列：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’(SEQ ID NO：4)。

较优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

水稻工程保持系在水稻育种中的应用，所述水稻工程保持系由任一所述的方法获得。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9系统将外源报告基因整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题。外源片段的定点整合综合考虑了育性调控基因和筛选报告基因的表达，避免了以前转基因的随机整合位点导致的目的基因表达的不确定性。

本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。

定义

为了便于理解本发明，定义了大量术语和短语

本发明中的“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3”’与序列“5’-C-A-T-3”’反向互补。

术语“基因”是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列成为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。

“野生型基因”是指一种从来源中分离的基因，本发明的“野生型基因”是首先利用水稻不育突变体通过图位克隆方法得到突变基因的位置，然后从水稻野生型中获得该位置处的对应的基因的序列，即为“野生型基因”。而“突变的基因”是指一种基因，与“野生型基因”相比，其具有序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。

“等位基因”一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因。它可能出现在染色体某特定座位上的两个或多个基因中的一个。本发明中的纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中的育性调控基因与野生型水稻中的育性调控基因为等位基因。

“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为传统上的水稻工程保持材料和不育材料的保持方法的原理流程图；

图2为本发明的水稻工程保持材料和不育材料的保持方法的原理流程图；

图3为CRISPR/Cas9系统中的pP1C.2载体的质粒图谱；

图4为CRISPR/Cas9系统中的pP1C.1载体的质粒图谱；

图5为pJIT163-hGFP载体的质粒图谱；

图6为pSB130M载体的质粒图谱；

图7为转基因水稻PCR产物检测凝胶电泳图，其中T为转基因株系的扩增结果，CK为阳性对照；

图8中(a)为转基因株系的稻穗照片，(b)为转基因水稻种子的照片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图1所示，以前的保持水稻工程系的实验思路是把育性恢复基因和红色荧光蛋白基因一起转到突变体中，让突变体恢复育性，并且育性恢复基因连锁了红色荧光蛋白基因，这个思路很大的一个限制就是取材限制，不育株转化必须用幼穗诱导愈伤，一般是幼穗发育的第4期左右，而这个生长期很短。而本发明的思路是，如图2所示，利用基因组编辑技术将外源基因定点插入在植物基因组上。本发明提供一种一种水稻工程保持系的构建方法，包括：

步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，

步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系。

本发明以普通野生型水稻为转化受体，解决了转化不育突变体的取材限制，外源片段的定点整合综合考虑了育性调控基因和筛选报告基因的表达，避免了以前转基因的随机整合位点导致的目的基因表达的不确定性。

在上述的方案中，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。这是正向遗传学上的思路。当然，在反向遗传学的研究中，如果已明确了育性调控基因在染色体上的位置，则不需要此步骤。

作为优选，所述步骤一中，将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包括：

(1.1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物

上游序列：5’-GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO：1)

下游序列：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO：2)；

(1.2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤(1.1)中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

(1.3)将外源报告基因构建到表达载体上得到重组表达载体；

(1.4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转到水稻野生型水稻植株中，得到转基因植株；

(1.5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大小与外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的野生型水稻转基因株系。

作为优选，所述表达载体采用过表达载体。

作为优选，为了使外源报告基因在水稻种子中表达，所述外源报告基因的核苷酸序列前构建有水稻胚乳特异性启动子Gt1。

作为优选，在本发明的一个实施例中，所述育性调控基因为水稻EAT1基因。

在上述的方案中，水稻EAT1基因在步骤(1.1)中相匹配的引物序列为：

上游序列：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’(SEQ ID NO：3)

下游序列：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’(SEQ ID NO：4)

作为优选，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

水稻工程保持系在水稻育种中的应用，所述水稻工程保持系由任一所述的方法获得。

本发明不是针对某一个具体基因的，只要是普通雄性核不育基因都可以采用本发明的方法进行种质创造。本发明采用如下的思路实现：

1)本发明的申请人利用辐射诱变得到纯合隐性水稻普通雄性核不育突变体(基因型为aa)，采用图位克隆的方法定位并克隆所述水稻不育系的育性调控基因A。

2)根据克隆的基因在水稻基因组上的具体位置，分析水稻野生型基因组中该育性调控基因A上下游的序列，选择设计外源报告基因的整合位点。通过CRISPR/Cas9系统实现定点插入，将报告基因定点整合到育性调控基因侧翼序列，整合位点要保证外源报告基因插入后与育性调控基因能够紧密连锁，共分离。

3)将荧光筛选标记基因R表达元件连接到另一植物表达载体pSB130M(含双T-DNA)上，得到载体pSB130M-R。筛选报告基因表达元件包括水稻胚乳特异性启动子、荧光基因全长读码框和终止子序列。

采用农杆菌介导转基因方法将打靶载体重组载体pP1C.1和供体载体pSB130M-Gt1-DsRed-CaMVTerm共转化到水稻野生型(基因型为AA)中。通过PCR方法筛选到已成功定点整合筛选报告基因R的转基因植株(基因型为AA^R)，将转基因植株作为父本与突变体(aa)杂交，F1代中，通过荧光观察，含筛选报告基因R的种子就是保持系种子(基因型为A^Ra)，保持系种子种下去就可以作为父本与突变体(aa)杂交，进行不育系(aa)和保持系(A^Ra)种子的繁殖。不育系种子不含荧光筛选基因R，保持系种子含筛选荧光基因R，可以通过荧光色选机进行分选。

实施例1

各种水稻组织培养基配方

诱导培养基NB：N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA0.1mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0

继代培养基J3：MS大量盐分，10倍B5微量盐分，J3铁盐FeSO₄·7H₂O41.8mg/L，Na₂EDTA55.9mg/L，DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0

共培养基NBM：N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH 5.6

筛选培养基J3S：继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L

预分化培养基Y：N6大量，CuSO₄3mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH 6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L

分化培养基D：N6大量盐分，10倍B5微量盐分，D铁盐(FeSO₄·7H₂O55.9mg/L，Na₂EDTA 74.5mg/L)，DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA 2mg/L，IAA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L

生根培养基R：MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH 6.0

在本实施例中，该育性调控基因为EAT1(LOC_Os04g51070)基因，纯合隐性水稻普通雄性核不育突变体中的序列和野生型的相比，发生了碱基插入。通过CRISPR/Cas9系统实现定点插入，将报告基因定点插入到育性调控基因侧翼序列，理论上是百分之百连锁。在水稻中，如果连锁率为99％，则报告基因和育性恢复基因的物理距离为250×10³(约250Kb)，本实施例中整合位点选择在育性基因下游1000bp范围内，即1kb之内，两个基因之间没有间隔，遗传表现共分离。

整合位点的设计和合成具体包括：

1、分析育性调控基因EAT1下游序列，设计引物F和R

分析育性基因下游序列1000bp范围内，在该区序列中找到NGG(N为A，T，C或G)，最好是AGG，取NGG前面的20bp作为target序列。

Target序列的正链在5′加GCAA，负链在5′加AAAC。

其中上游的GCAA，下游的CAAA为BbsI酶切形成的粘性末端。

即：

其中一个整合位点的合成引物为；

上游F：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’(SEQ ID NO：3)

下游R：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’(SEQ ID NO：4)

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2、线性化pP1C.2载体，pP1C.2载体的图谱如图3所示

使用BbsI酶切pP1C.2(氨苄抗性)载体，回收3.2kb的片段；

3、重组pP1C.2载体的构建

将引物上下游(SEQ ID NO：3和4)正负链oligos(100μM)等比例混合后，加热到95℃，3min，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA；将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。

然后EcoRI、NheI双酶切重组载体pP1C.2，回收约520bp的DNA片段；

4、重组pP1C.1载体的构建

pP1C.1载体的图谱如图4所示，使用EcoRI、XbaI双酶切pP1C.1(卡那霉素抗性)载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bp DNA片段与酶切后的pP1C.1进行T4DNA酶连接，转化大肠杆菌，得到重组载体pP1C.1，重组载体pP1C.1即为构建好的CRISPR/Cas9系统植物基因整合载体。后续进行重组载体pP1C.1转化农杆菌，然后与pCAMBIA1300-Gt1-DsRED-CaMVTerm载体共转化水稻愈伤组织，筛选阳性克隆，测序验证，整合位点分析等。

实施例2

水稻Gt1启动子的克隆和连接

以水稻基因组DNA为模板，利用引物GT1-F：5-aaAAGCTTCACCCTCAATATTTGG-3(含Hind III酶切位点)(SEQ IDNO：5)，GT1-R：5-aaGGATCCGTTGTTGTAGGACTAATG-3(含BamH I酶切位点)(SEQ ID NO：6)，通过PCR克隆扩增得到Gt1启动子的基因序列，Gt1启动子的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，其中，

PCR扩增体系及程序如下：

PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；然后以94℃变性，40s；52℃退火，40s；72℃延伸，2min，共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。

电泳检测PCR结果，回收目的片段，并与pMD18-T克隆载体(TaKaRa)16℃连接。连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落，过夜培养，提取质粒酶切鉴定阳性克隆。选取阳性克隆(含质粒pMD18-T-Gt1)送公司测序，得到测序正确的pMD18-T-Gt1载体。

连接

将测序正确的载体pMD18-T-Gt1用Hind III与BamH I双酶切，回收Gt1片段，如图5所示的pJIT163-hGFP用HindIII与BamH I双酶切，回收载体片段，得到的载体片段与Gt1片段连接，获得中间载体pJIT163-Gt1-GFP。

DsRed片段的连接

红色荧光蛋白基因的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，用Bam H I和Sma I双酶切克隆载体pMD-18T-DsRed(克隆有红色荧光蛋白基因，本实验室保存)和中间载体pJIT163-Gt1-GFP，回收DsRed基因片段和载体片段，两个片段用T4连接酶16度过夜连接，连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落过夜培养，提取质粒酶切鉴定阳性克隆。即为pJIT163-Gt1-DsRed载体。

DsRed表达元件连接到植物表达载体pSB 130M

pCAMBIA1300质粒图谱如图4所示，用HindIII和Sa/I双酶切pCAMBIA1300和用Hind III和Xho I双酶切pJIT163-Gt1-DsRed(Sal I和Xho I为同尾酶)，分别回收载体片段和Gt1-DsRed-CaMV Term片段，两片段用T4连接酶16度过夜连接，连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落过夜培养，提取质粒酶切鉴定阳性克隆。后续进行重组载体pSB130M-Gt1-DsRed-CaMVTerm转化农杆菌。

实施例3

采用农杆菌介导转基因方法将打靶载体重组载体pP1C.1和供体载体pSB130M-Gt1-DsRed-CaMVTerm共转化到水稻野生型(基因型为AA)中。

农杆菌介导转化

水稻愈伤组织的诱导和继代培养

分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。

划LB板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF 50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50ml液体的共培养基(NBM+As 0.1mM)中，调OD600＝0.5；从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天；3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S；结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

PCR鉴定转基因植株(使用红色荧光蛋白基因的扩增引物)

提取再生苗水稻叶片DNA，利用PCR技术鉴定阳性植株。本发明的申请人根据表达载体上红色荧光蛋白基因序列设计特异性引物：

DsRed-F：5’-ATGGCCTCCTCCGAGAACGT-3’(SEQ ID NO：9)

DsRed-R：5’-CTACAGGAACAGGTGGTGGC-3’(SEQ ID NO：10)

对转基因植株进行PCR验证。PCR扩增体系及程序如下：

反应程序：94℃预变性5min；PCR扩增：然后以94℃变性，40s；53℃退火，40s；72℃延伸，1min；共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR结果。如图7所示，从图7中可以看出，在转化成功的转基因植株中可以扩增出红色荧光蛋白基因。

另外，为进一步确认出红色荧光蛋白基因确实定点插入到靶位点区域，与育性调控基因连锁，本发明的申请人利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物序列，以从转基因植株DNA为模板，扩增红色荧光蛋白基因。

如果外源序列定点整合，则扩增产物为1950bp，产物包含红色荧光蛋白基因所有表达元件，如果没有定点整合，则扩增产物为129bp。

下表为保持系与突变体杂交后的种子的遗传学数据及分子学数据

本发明对SPT技术进行了思路创新，利用最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统将筛选报告基因(红色荧光蛋白基因，DsRed)表达元件定点插入到育性调控基因的侧翼序列，实现育性基因和色选报告基因的连锁。通过转基因T0代植株与不育突变体的杂交，获得保持系，保持系继续与不育突变体杂交，实现不育系和保持系种子的繁殖，并利用荧光分选技术快速分离不育系与保持系两种类型的种子。本发明以普通野生型水稻为转化受体，解决了转化不育突变体的取材限制，外源片段的定点整合综合考虑了育性调控基因和筛选报告基因的表达，避免了以前转基因的随机整合位点导致的目的基因表达的不确定性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，

步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系。

2.如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。

3.如权利要求1或2任一所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包括：

(1.1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物

上游序列：5’-GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

下游序列：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

(1.2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤(1.1)中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

(1.3)将外源报告基因构建到植物表达载体上得到重组表达载体；

(1.4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；

(1.5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大小与外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的水稻转基因株系，并且在靶位点定点插入整合。

4.如权利要求3所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤(1.3)中，所述表达载体采用植物表达载体。

5.如权利要求3所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体中，所述外源报告基因的核苷酸序列前构建有水稻胚乳特异性启动子Gt1。

6.如权利要求3所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述育性调控基因为水稻EAT1基因。

7.如权利要求6所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤(1.1)中的引物序列为：

上游序列：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’

下游序列：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’。

8.如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

9.水稻工程保持系在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻工程保持系由如权利要求1至8任一所述的方法获得。