CN104815337A

CN104815337A - 一种peg修饰的磁性氧化石墨烯的制备及其抗肿瘤活性

Info

Publication number: CN104815337A
Application number: CN201510242930.2A
Authority: CN
Inventors: 陈卫红; 郑秀文; 甄国荣
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明涉及一种对肿瘤能够实现诊断与治疗的多功能纳米粒子。常温常压下，将羧基化Fe₃O₄磁性纳米粒子水溶液与氨基化PEG化修饰的氧化石墨烯（GO）水溶液混合，在EDC缩合条件下，制备了具有良好生物相容的磁性氧化石墨烯纳米材料。又通过π-π堆垛作用将水难溶性芳香结构的抗癌药物阿霉素（DOX）负载到Fe₃O₄-PEG-GO上，制备出抗肿瘤、成像和生物相容性于一体的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米粒子，利用MRI结合其他检测手段研究抗癌药物肿瘤治疗效果，获得抗癌药物对肿瘤的治疗效果，为构建新型肿瘤纳米药物诊疗平台提供新的方法和途径。

Description

一种PEG修饰的磁性氧化石墨烯的制备及其抗肿瘤活性

技术领域

本发明涉及纳米材料制备及其生物应用领域，特别涉及一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、肿瘤治疗的材料制备方法及其应用。

背景技术

诊疗学（Theranostics），是指将诊断和治疗集成一个材料体系，在过去几年里，这个新兴生物医学领域的研究获得了越来越多的广泛关注。超顺磁性Fe₃O₄ 纳米粒子本身作为常用的 T2 磁共振成像对比剂，也可以用于热疗以及药物载体，是构建纳米诊疗平台的最佳载体之一。Fe₃O₄磁性纳米粒子以三维聚集体的形式存在要比单分散性的磁性纳米粒子呈现出更高的弛豫率，从而能够提高 MRI 成像效果。氧化石墨烯（GO）是由石墨经化学氧化、超声剥离制备得到，其含有大量的含氧活性基团，如羰基、羧基、羟基和环氧基等。环氧基与羟基基主要位于GO的基面上，而羰基和羧基则通常分布于GO的边缘处。这些含氧基团的存在使得GO具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，且易于功能化修饰。氧化石墨烯的sp2离域电子体系以及含氧基团的的结构特性使其可以通过化学键，π-π相互作用，离子键以及氢键等非共价键作用实现化疗药物或基因的装载。基于此，我们通过共价偶联的方法，将羧基修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子连接到GO表面，形成了Fe₃O₄纳米粒子的聚集体，该磁性复合材料具有良好的生物相容性，更重要的是，与单分散的Fe₃O₄纳米粒子相比，前者具有更高的 MRI T2 弛豫时间，可以有效改善 MRI 成像效果。近年来GO和磁性纳米粒子的复合材料的制备以及其在材料化学、生物医学等领域的应用研究发展迅速。磁功能化的GO复合材料因其具有磁介导的靶向载药，MRI 等应用而备受瞩目。与单分散的Fe₃O₄纳米粒子相比，组装在 GO 表面的Fe₃O₄纳米粒子 T2 弛豫率显著提高，有利于改善生物 MRI 成像效果。GO上含有大量的含氧活性基团，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性。同时，GO 比表面积巨大，具有在氧化过程中尚未完全破坏的残留芳香体系，使其对不溶于水的芳香类药物分子表现出超强的吸附能力，考虑到Fe₃O₄纳米粒子和氧化石墨烯的上述特点，我们设计、合成了Fe₃O₄纳米粒子-氧化石墨烯（Fe₃O₄-GO）复合体系，目的是利用 GO 可控装载抗肿瘤药物，同时，利用磁性纳米粒子实现该多功能药物系统的磁靶向输运及生物 MRI成像功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种实现磁靶向、T2模式成像诊断、肿瘤治疗的特异性诊疗功能纳米粒子及其制备方法，该方法操作简单、反应条件温和，Fe₃O₄纳米粒子-氧化石墨烯（Fe₃O₄-GO）复合体系抗肿瘤效果好，具有靶向肿瘤功能，且具有T2模式成像的特性。

本发明的一种一种PEG 修饰的磁性氧化石墨烯的制备及其抗肿瘤活性，所述复合材料通过π-π吸附作用将DOX偶联到复合材料表面，合成复合材料集靶向、成像诊断和治疗一体的具有生物相容性的诊疗功能。

本发明的一种具有成像功能的复合材料的制备方法，包括：

选用75 mL Fe₃O₄磁性纳米粒子的正己烷溶液、75 mL DMSA的丙酮溶液（1.5 mg DMSA/mL）和0.188 mL三乙胺加入到在250 mL三口烧瓶中，60 ℃水浴下搅拌4 h，然后加入50 mL乙醇，超声30 min，进行磁分离，除去上清留沉淀，重复磁分离二次。用25%的四甲基氢氧化铵调 pH 值为10，透析24 h，最后用盐酸将其pH调至中性。

GO的PEG修饰简述如下：取GO-COOH 1 mL （1 mg mL^-1），超声30 min后，加入两端带有氨基的PEG水溶液1 mL（10 mg mL^-1），再超声30 min，室温搅拌下，加入EDC 0.5 mL（10 mg mL^-1），继续搅拌2 h，再次加入EDC 1 mL（10 mg mL^-1），继续搅拌10 h。13 000 rpm 离心1 h，弃去沉淀，将上清用100 kDa的超滤管超滤。将截留的GO-PEG 用三次水超声分散。

DMSA-Fe₃O₄纳米粒子水溶液（0.5 mg mL^-1）用三乙胺调pH 值为8.0，加入120 mg EDC和 PEG-GO水溶液（1.79 mg mL^-1），室温下搅拌16 h，然后13 000 rpm离心，用三次水洗涤沉淀，重复三次，即可得到用 Fe₃O₄磁性纳米粒子-GO复合材料（Fe₃O₄-PEG-GO）。

将抗癌药物阿霉素（Doxorubicin，DOX）和Fe₃O₄-PEG-GO混合，使GO吸附阿霉素24 h，然后利用透析袋（截留分子量8 000~14 000）进行透析，透析液为pH 7的PBS，透析48 h，其间每隔12 h换液一次，制得Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料。

一种具有成像功能的复合材料的抗肿瘤活性实验的方法：

(1)利用 WST 细胞增殖抑制分析试剂盒评估纳米材料对细胞的毒性。当细胞在96孔板中长到50-60%时，加入不同量的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料。孵育24 h后，WST-1被加入到样品孔和对照孔（未加纳米材料）中，37℃细胞培养箱内孵育2 h后，用酶标仪记录在 490 nm 处的吸收值。细胞的相对存活率等于（OD450 样品/OD450 对照）×100%。

所述步骤 (1) 中所述Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料中DOX浓度为0.25、0.5、1、2 μg/ml。

所述步骤 (1) 中PBS缓冲溶液的 pH 值为 7。

步骤(2) Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料与肿瘤细胞孵育24 h，上清用 PBS 洗三次，收集细胞加入核磁管，进行细胞 MRI 成像。

所述步骤 (2) 中所述Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料中Fe浓度为2.5、5、10、20、40 μg /ml。

有益效果

(1) 本发明通过多步合成法，合成Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和；

(2) 本发明利用EDC化学缩合反应，将氨基化的PEG衍生物共价偶联到GO纳米材料，再将羧基化Fe₃O₄与氨基化的GO共价偶联，制备出Fe₃O₄-PEG-GO复合材料，最后将抗癌药物负载到Fe₃O₄-PEG-GO复合材料，制备出集磁靶向、成像诊断和化疗一体的诊疗功能纳米探针；

(3) 本发明中从细胞层次研究Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料诊疗探针对肿瘤靶向、成像和治疗的可行性、选择性和特异性，提高微小病灶的检出率，获得肿瘤治疗及疗效评价的可视化信息。

附图说明

图 1为制备的Fe₃O₄纳米材料的TEM 图。

图2为制备的 Fe₃O₄-PEG-GO纳米材料的TEM 图。

图3为制备的PEG-GO纳米材料的红外图谱。

图4为制备的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米材料的紫外可见吸收图谱。

图5为所得的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米材料对肿瘤细胞的WST细胞毒性检测结果图。

图6为所得的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米材料对肿瘤细胞的MRI检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定

的范围。

实施例 1

(1) 选用75 mL 10 nm Fe₃O₄磁性纳米粒子正己烷溶液（图1为Fe₃O₄磁性纳米粒子的TEM）、75 mL DMSA的丙酮溶液（1.5 mg DMSA/mL）和0.188 mL三乙胺加入到在250 mL三口烧瓶中，60 ℃水浴下搅拌4 h，然后加入50 mL乙醇，超声30 min，进行磁分离，除去上清留沉淀，重复磁分离二次。用25%的四甲基氢氧化铵调 pH 值为10，透析24 h，最后用1 M的盐酸将其pH调至中性；

(2) 取GO-COOH 1 mL （1 mg mL^-1），超声30 min后，加入两端带有氨基的PEG水溶液1 mL（10 mg mL^-1），再超声30 min，室温搅拌下，加入EDC 0.5 mL（10 mg mL^-1），继续搅拌2 h，再次加入EDC 1 mL（10 mg mL^-1），继续搅拌10 h。13 000 rpm 离心1 h，弃去沉淀，将上清用100 kDa的超滤管超滤。将截留的GO-PEG 用三次水超声分散。利用红外光谱表征了所制备的GO和PEG修饰的GO，通过光谱对比证明PEG对GO的成功的进行了修饰（图3）。GO-PEG的红外光谱中在2918 cm^-1和2874 cm^-1处均出现非常明显的峰，归属为亚甲基的伸缩振动，由于GO本身在该处吸收峰不明显，所以这个亚甲基的峰来源于PEG。此外，在 GO-PEG的红外光谱中，1460 cm^-1处有一明显的峰，该峰归属于酰胺键的伸缩振动。

实施例 2

(1) DMSA-Fe₃O₄纳米粒子水溶液（0.5 mg mL^-1）用三乙胺调pH 值为8.0，加入120 mg EDC和 PEG-GO水溶液（1.79 mg mL^-1），室温下搅拌16 h，然后13 000 rpm离心，用三次水洗涤沉淀，重复三次，即可得到用 Fe₃O₄磁性纳米粒子-GO复合材料（Fe₃O₄-PEG-GO）。如图2所示， GO 的大小为几十到几百个纳米的很薄的片状结构，磁性纳米粒子更多的接在 GO 片层边缘处，并形成了聚集体；

(2) 将抗癌药物阿霉素（Doxorubicin，DOX）和Fe₃O₄-PEG-GO混合，使GO吸附阿霉素24 h，然后利用透析袋（截留分子量8 000~14 000）进行透析，透析液为pH 7的PBS，透析48 h，其间每隔12 h换液一次，制得Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料；

(3) 通过物理吸附的方式，将 DOX 吸附到Fe₃O₄-PEG-GO磁性纳米复合材料上。对其进行紫外可见光谱表征，结果如图4所示。DOX在490 nm处有明显的吸收峰，Fe₃O₄-PEG-GO吸附DOX后，也出现了DOX的吸收带，但最大吸收峰明显红移，表明阿霉素已成功地装载到了Fe₃O₄-PEG-GO上。

实施例3

(1) 在 96 孔细胞培养板中培养HeLa细胞，每孔细胞密度大约为5000个，在CO₂浓度为5%的37℃培养箱中培养 24 h；

(2) 除去上清，在各孔中分别加入含铁浓度为0.25 μg mL^-1、0.5 μg mL^-1、1 μg mL^-1、2 μg mL^-1的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料的100 μL的新鲜1640细胞培养液（每孔重复3个），孵育 24 h；

(3) 每孔加10 μL 的WST溶液，置 37℃细胞培养箱中孵育2 h，使用酶标仪在490 nm处检测各孔的紫外吸收值；

(4) Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料对细胞的WST分析如图5所示。Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料在铁含量浓度为20 μg mL^-1时，即阿霉素的浓度为1 μg mL^-1时，对 HeLa 细胞具有明显毒性，当铁浓度达到40 μg mL^-1，阿霉素的浓度为 2 μg mL^-1时，细胞的相对存活率为 76%，存在显著性差异，证明了复合材料对肿瘤细胞具有一定的杀伤能力。

实施例4

(1) 在6孔细胞培养板中培养HeLa细胞，每孔细胞密度大约为1×10⁶个细胞，并补足每孔2 mL 的培养液，在CO₂浓度为5%的37℃培养箱中培养 24 h；

(2) 除去上清，在孔中分别加入含有铁浓度为2.5 μg mL^-1、5 μg mL^-1、10 μg mL^-1、20 μg mL^-1、40 μg mL^-1的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料的2 mL的新鲜培养基，孵育 24 h；

(3) 除去上清培养液，并用含有10%胎牛血清的1640细胞培养液，将6孔板2个孔中的细胞收集到1.5 mL离心管中，离心收集细胞，用 PBS 洗三次，收集细胞加入核磁管用，1%琼脂糖进行凝固，进行细胞 MRI 成像；

(4) 所用 MRI 成像设备为 11.7 T Bruker micro2.5 micro-MRI system，采用多片多回波序列（MSME），图像为其对应的 T2 加权影像，实验参数：TR=2500 ms，matrix=128×128，FOV=20×20 cm，slice thickness=1 mm；

(5) 结果如图6所示。可以发现，磁性纳米材料与HeLa细胞孵育后，当材料铁浓度为10 μg/mL时，可以获得很好的细胞MRI 成像。

Claims

1.一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米复合材料，其特征在于：为了增加其水溶性，通过EDC化学在GO表面键合氨基化的PEG衍生物，获得GO-PEG。

2.取GO-COOH水溶液，加入两端带有氨基的PEG水溶液，再超声30 min，室温搅拌下，加入EDC，继续搅拌2 h，再次加入EDC，继续搅拌10 h。

3.13 000 rpm 离心1 h，弃去沉淀，将上清用100 kDa的超滤管超滤。

4.一种如权利要求 1 所述的具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米复合材料的制备方法，其特征在于：选用10 nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的正己烷溶液加入含有DMSA的丙酮溶液，60 ℃水浴下搅拌4 h，然后加入2倍体积的乙醇，超声30 min，进行磁分离，除去上清留沉淀，重复操作2次。

5.根据权利要求 2 所述的一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米复合材料的制备方法，其特征在于：DMSA-Fe₃O₄纳米粒子水溶液加入EDC和GO-PEG水溶液，室温下搅拌16 h，然后13 000 rpm离心，用三次水洗涤沉淀，重复三次。

6.根据权利要求 3 所述的一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米复合材料的制备方法，其特征在于：将抗癌药物阿霉素DOX和Fe₃O₄-PEG-GO混合，使GO吸附阿霉素24 h，然后透析除去过量的DOX。

7.根据权利要求4所述的一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、肿瘤治疗的Fe₃O₄-PEG-GO/DOX纳米复合材料在作为抗肿瘤药物载体中的应用。