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CN104797590A - 用于去除dna的方法 - Google Patents

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CN104797590A
CN104797590A CN201380056811.7A CN201380056811A CN104797590A CN 104797590 A CN104797590 A CN 104797590A CN 201380056811 A CN201380056811 A CN 201380056811A CN 104797590 A CN104797590 A CN 104797590A
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fermented liquid
aluminum chloride
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microorganism
polymerize aluminum
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CN201380056811.7A
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C·霍博尔
C·J·克普卡
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Novo Nordisk AS
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Abstract

一种用于从发酵液中去除残留DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：a)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且b)从该发酵液中分离絮凝的微生物。

Description

用于去除DNA的方法
发明领域
本发明涉及一种非常有效的用于从发酵液中获得蛋白质产物的方法，其中该蛋白质产物不含残留的宿主细胞DNA。
发明背景
用于从发酵液中沉淀出杂质的铝化合物的用途是已知的：WO94/01537披露了可溶性铝酸盐结合通过加入一种酸的同步pH调整的用途；US 3,795,586披露了一种两阶段工艺，藉此通过使用絮凝剂(如铝酸盐)将第一非酶组分从发酵液中去除，并且然后用另一种絮凝剂沉淀出可溶性酶产物；并且WO 96/38469披露了结合另一种絮凝剂、溶液的澄清和膜浓缩的WO 94/01537的方法。
然而，从发酵液中去除残留的宿主细胞DNA是非常困难的，因此在本领域中迫切需要开发程序来克服残留DNA的问题。
发明概述
已经出人意料地发现，已经用聚合氯化铝处理的发酵液不含残留宿主细胞DNA，意味着每克发酵液的DNA小于10ng，即低于检测限，因此本发明要求：
一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
b)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)从该发酵液中分离微生物，并且
b)将聚合氯化铝添加至该发酵液。
一种用于从发酵液和后续下游工艺液体中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液和后续下游工艺液体包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将聚合氯化铝添加至该发酵液并且添加至该后续下游工艺液体，
b)从该发酵液中分离絮凝的微生物并且
c)在添加聚合氯化铝之后精制该后续下游工艺液体。
附图说明
图1披露了PCR扩增的残留DNA片段的琼脂糖凝胶电泳，所述残留DNA片段来自未处理培养液和实例1的GC850TM絮凝样品的超滤浓缩物(UF浓缩物)。由对应泳道中的凝胶上的条带(箭头)指示残留DNA的存在。该PCR条带的强度与样品中存在的残留DNA的量直接关联。
图2披露了PCR扩增的残留DNA片段的琼脂糖凝胶电泳，所述残留DNA片段来自未处理培养液和实例1的NordPAC18TM絮凝样品的超滤浓缩物(UF浓缩物)。由对应泳道中的凝胶上的条带(箭头)指示残留DNA的存在。
图3披露了PCR扩增的残留DNA片段的琼脂糖凝胶电泳，所述残留DNA片段来自未处理培养液和实例2的NordPAC18TM、GC850TM和铝酸钠絮凝样品的超滤浓缩物(UF浓缩物)。由对应泳道中的凝胶上的条带(箭头)指示残留DNA的存在。
发明的详细说明
本发明涉及一种简单且非常有效的从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法。在本发明的范围之内，宿主细胞DNA被定义为包括来自生产菌株的基因组DNA和编码感兴趣的蛋白质的DNA片段。
能够产生感兴趣的蛋白质的微生物
该微生物宿主细胞可以是任何属的宿主细胞。所希望的蛋白质与能够产生感兴趣的蛋白质的宿主细胞可以是同源的或异源的。
术语“同源蛋白质”意指由源于其中产生它的宿主细胞的基因编码的蛋白质。
术语“异源蛋白质”意指由相对于其中产生它的宿主细胞为外来的基因编码的蛋白质。
如在此使用的，术语“重组宿主细胞”意指包含编码所希望的蛋白质的基因(一种或多种)并且能够表达所述基因(一种或多种)而产生该希望的蛋白质的宿主细胞。可以使用本领域熟知的技术经由转化、转染、转导或诸如此类的方法使所希望的蛋白质编码基因(一种或多种)进入重组宿主细胞中。
当所希望的蛋白质是一种异源蛋白质时，能够产生该希望的蛋白质的重组宿主细胞优选地是真菌或细菌来源的。重组宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该希望的蛋白质的基因和所述蛋白质的来源。
如在此使用的，术语“野生型宿主细胞”是指天然地包含编码所希望的蛋白质的基因(一种或多种)并且能够表达所述基因(一种或多种)的宿主细胞。
“其突变体”可以是一种其中一个或多个基因已经被缺失(例如，为了富集所希望的蛋白质制剂)的野生型宿主细胞。
在一个优选实施例中，该重组或野生型微生物宿主细胞是细菌或真菌。
该微生物宿主细胞可以是酵母细胞，例如假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酿酒酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属菌株。在另一方面，该菌株是卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、或卵形酵母菌株。
该微生物宿主细胞可以是丝状真茵菌株，例如枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)菌株。
在另一方面，该菌株是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
在一方面，该真菌宿主细胞是选自下组的菌株，该组由以下各项组成：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和木霉属(Trichoderma)。
在一个更优选的实施例中，该丝状真菌宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：木霉属和曲霉属宿主细胞，具体地为哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉菌株，尤其是里氏木霉菌株。
在另一个优选实施例中，该重组或野生型微生物宿主细胞是细菌。微生物宿主细胞的实例包括选自下组的宿主细胞，该组包括革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)，或包括革兰氏阴性细菌，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)。
在一方面，该细菌宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
在另一方面，该细菌宿主细胞是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubspecies Zooepidemicus)。
在另一方面，该细菌宿主细胞是鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)、不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)菌株。在另一方面，该细菌宿主细胞是大肠杆菌。
在另一方面，该细菌宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属、布丘氏菌属(Buttiauxella)和假单胞菌属。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
感兴趣的蛋白质
根据本发明，感兴趣的蛋白质可以是肽或多肽。根据本发明的优选肽含有从5到100个氨基酸；优选从10到80个氨基酸；更优选从15到60个氨基酸。根据本发明的有待回收的优选肽是一种抗微生物肽、脂肽或另一种功能肽，如布拉齐甜蛋白(brazzein)。
优选的多肽可以是可由微生物产生的任何蛋白质。该蛋白质可以是一种酶。
在一个优选的实施例中，该感兴趣的蛋白质是一种酶。在一个优选实施例中，该方法应用于一种水解酶(根据酶命名法(EnzymeNomenclature)；国际生物化学联合会命名委员会的建议(Recommendations of the Nomenclature Committee of the InternationalUnion of Biochemistry)的EC3类)。
在特别优选的实施例中，选自下组的酶是优选的，该组由以下各项组成：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、角质酶、裂解酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、氧化酶、漆酶、过氧化物酶和天冬酰胺酶。
淀粉酶：一种淀粉酶可以是根据本发明产生的所希望的酶。淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶以及麦芽糖淀粉酶。
α-淀粉酶可以来源于芽胞杆菌属，例如来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。其他α-淀粉酶包括来源于芽孢杆菌属菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB12513或DSM 9375的α-淀粉酶，所有的这些详细描述在WO 95/26397中，或冢本(Tsukamoto)等人，《生物化学和生物物理研究通讯》(Biochemical and Biophysical Research Communications)，151(1988)，25-31页中描述的α-淀粉酶。
其他α-淀粉酶包括来源于丝状真菌、优选曲霉属菌株(例如米曲霉和黑曲霉)的α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，所希望的酶是来源于米曲霉的α-淀粉酶，如具有显示在WO 96/23874中的SEQ ID NO：10中的氨基酸序列的α-淀粉酶。
所希望的酶还可以是来源于黑曲霉的α-淀粉酶，尤其是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在原始登录号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”的α-淀粉酶。
所希望的酶还可以是一种β-淀粉酶，例如披露于W.M.福格蒂(W.M.Fogarty)和C.T.凯利(C.T.Kelly)，《工业微生物进展》(Progress inIndustrial Microbiology)，第15卷，112-115页，1979中的任何植物和微生物的β-淀粉酶。
所希望的酶还可以是一种麦芽糖淀粉酶。“麦芽糖淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。一种感兴趣的麦芽糖淀粉酶是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048；4,604,355；以及6,162,628中。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、Termamyl SCTM、Termamyl UltraTM、StainzymeTM、NatalaseTM、NovamylTM和BANTM(诺维信公司)、RapidaseTM和PurastarTM(购自杰能科国际有限公司)。
所希望的酶还可以是普鲁兰酶，包括葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.41)，其作用于支链淀粉的非还原端以产生葡萄糖，也称为α-糊精6-葡聚糖水解酶或真普鲁兰酶或极限糊精酶；作用于支链淀粉中的α-(1,6)-糖苷键以产生麦芽三糖的普鲁兰酶；水解α-(1,4)-键以产生异葡糖基麦芽糖的异普鲁兰酶；以及作用于α-(1,4)-键以产生潘糖的新普鲁兰酶。
蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选为微生物来源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所描述的镰刀菌属的蛋白酶。
其他适合的蛋白酶是描述于例如WO 2005/115445中的用于胰酶替代的拟诺卡菌属蛋白酶。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafectEffectenzTm、以及Excellenz P1000(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶或角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)例如来自如在EP 258068和EP 305216中描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶；来自腐质霉属例如特异腐质霉属(H.insolens)(WO 96/13580)的角质酶；来自假单胞菌属菌株(这些中的一些现在改名为伯霍尔德杆菌属)的脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌(P.sp.)菌株SD705(WO95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 12/137147))；来自稻瘟菌(Magnaporthe grisea)(WO 10/107560)的角质酶；来自门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)(US 5,389,536)的角质酶和来自褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WO 11/084412)的脂肪酶。其他有用的脂肪酶可以是芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达托斯(Dartois)等人(1993)《生物化学与生物物理学学报》(Biochemica et BiophysicaActa)，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992，WO11/084599)、嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)、或短小芽胞杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体。
其他适合的脂肪酶是描述于例如WO 2006/136159中的用于胰酶替代的脂肪酶。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例为如在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。
可商购获得的纤维素酶包括CelluzymeTM、CarezymeTM、和CellucleanTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和PuradaxTMHA(杜邦公司)、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
木聚糖酶：木聚糖酶包括1,4-(β)-D-木聚糖-木聚糖水解酶、(EC3.2.1.8)、4-木聚糖水解酶、内切-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-D-木聚糖酶、1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶、β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖木聚糖水解酶、β-D-木聚糖酶，其将直链多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖，由此分解作为植物细胞壁的主要成分之一的半纤维素。可商购获得的木聚糖酶的实例为EconaseTM(AB维斯塔公司(AB Vista))。
天冬酰胺酶：天冬酰胺酶也称为L-天冬酰胺酶和L-天冬酰胺酰胺基水解酶。(EC 3.5.1.1)是一种催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶。
AcrylawayTM(诺维信公司)为可商购获得的天冬酰胺酶的实例。
甘露聚糖酶：甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)包括催化β-D-甘露糖苷(也称为甘露聚糖)中的末端非还原性β-D-甘露糖的水解的所有酶。
甘露聚糖酶的商业实例为MannawayTM(诺维信公司)。
植酸酶：在目前情况下，植酸酶是一种催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为(1)肌醇和/或(2)它的单-，二-，三-，四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。
植酸酶包括3-植酸酶(肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(肌醇六磷酸盐6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。
可商购获得的植酸酶的实例包括RonozymeTM(DSM营养产品)、NatuphosTM(BASF)、FinaseTM(AB Vista)、QuantumTM XT和Blue(ABVista)、PhyzymeTM产品系列(杜邦公司)和AxtraTM PHY产品系列(杜邦公司)。其他优选的植酸酶包括描述于WO 98/28408、WO 00/43503、和WO 03/066847中的那些。
裂解酶：裂解酶可以是细菌或真菌来源的果胶酸裂解酶。包括化学或遗传修饰的突变体。在一个优选的实施例中，该裂解酶来源于芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)，或一种来源于这些来源中任一种的变体，例如，正如在US 6,124,127、WO 1999/027083、WO 1999/027084、WO 2002/006442、WO 2002/092741、WO 2003/095638中所述的，可商购获得的果胶酸裂解酶包括爱派(XPect)；派克沃(PectawashTM)和派克威(PectawayTM)(诺维信公司)。
乙酰乳酸脱羧酶(EC 4.1.1.5)属于被称为裂解酶(具体地说，裂解碳-碳键的羧酸分解酶)的这组酶。商业化酶MaturexTM(诺维信公司)广泛用于酿造业。
木糖异构酶：可商购获得的木糖异构酶例如是SweetzymeTM(诺维信公司)或GenSweetTM(杜邦公司)。
乳糖酶：乳糖，一种葡萄糖与半乳糖的二聚体，是牛奶中的主要的糖，其在很大程度上是哺乳动物尤其是人类中牛奶不耐受的原因。β-半乳糖苷酶或乳糖酶(EC 3.2.1.23)水解个体碳水化合物中的二聚体，由此增加在消费期间对牛奶的耐受性和消化牛奶的能力。乳糖酶的替代名称还包括外切-(1,4)-β-D-半乳聚糖酶。
可商购获得的乳糖酶例如包括Lactozyme PureTM(诺维信公司)和GODO-YNL2乳糖酶(杜邦公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中描述的那些。
其他过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
发酵液
本发明对于工业规模的任何发酵可以是有用的，例如用于具有至少50升、优选至少500升、更优选至少5,000升、甚至更优选至少50,000升的培养基的任何发酵。
可以通过本领域中任何已知的方法来发酵产生感兴趣的蛋白质的微生物。发酵培养基可以是如描述于例如WO 98/37179中的基本培养基，或者该发酵培养基可以是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中该复合氮源可以如WO 2004/003216中所述被部分水解。
该发酵可以按照分批、重复分批、补料分批、重复补料分批或连续发酵工艺来进行。
在补料分批工艺中，在开始发酵之前，不添加包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物或者将其一部分添加到培养基中，并且对应地，在发酵过程中，将全部或剩余部分的包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物进行补料。被选定为补料的这些化合物可以一起补料或分开补料到该发酵工艺中。
在重复补料分批或连续发酵工艺中，在发酵过程中另外补入完全起始培养基。起始培养基可与结构元素补料(一种或多种)一起或分开补入。在重复补料分批工艺中，以规律的时间间隔去除包含生物质的发酵液的一部分，而在连续工艺中，连续进行发酵液的一部分的去除。由此，发酵工艺补充有相应于撤出的发酵液量的一部分新鲜培养基。
在本发明的优选实施例中，来自补料分批发酵工艺的发酵液是优选的。
絮凝
本发明的方法可应用于未处理的发酵液或者已经初步进行(但不限于)例如pH调节和/或温度调节的发酵液。pH可以调节至在pH 2到pH 11范围之内的pH。可以用本领域中已知的任何酸或碱调节pH。
根据本发明，可以用水将该发酵液稀释高达2000％(w/w)；优选地可以用水将该发酵液稀释10％-2000％(w/w)；更优选地可以用水将该发酵液稀释100％-1500％(w/w)；更优选地可以用水将该发酵液稀释100％-1000％(w/w)；更优选地可以用水将该发酵液稀释200％-800％(w/w)。
根据本发明，用水稀释意指该稀释介质可以是水，或者它可以是来自感兴趣的蛋白质生产的超滤渗透物，或者它可以是来自感兴趣的蛋白质生产的再循环水或工艺液体，或者它可以是来自加热器的冷凝物或者它可以是以上提及的任何组合，例如水和超滤渗透物的混合物。
然后可以将单价或二价盐，尤其是钠和/或钙盐和/或镁盐，例如氯化钠、氯化钙或氯化镁添加到该发酵液中。优选实施例为钙盐，尤其是氯化钙。
可以按照0.01％-10％(w/w)每千克发酵液(未稀释)；优选0.5％-10％(w/w)每千克发酵液(未稀释)；更优选1％-9％(w/w)每千克发酵液(未稀释)；尤其是2％-8％(w/w)每千克发酵液(未稀释)的浓度将该单价和二价盐添加至该发酵液中。
铝化合物
我们已经发现，聚合氯化铝在去除残留宿主细胞DNA中是极其有效的。
特别有用的聚合氯化铝包括具有化学式Aln(OH)mCl(3n-m)的化合物和聚合氯化铝以及具有CAS号：1327-41-9的氯化羟铝(aluminiumchlorohydrate)。
有用的聚合氯化铝的实例包括羟铝基氯化物(luminumchlorohydrate)、可获自古尔布兰德森公司(Gulbrandsen)的GC850TM(Al2(OH)5Cl)、或者NordPac 18(可获自诺沃挪第克公司(NordiskAluminat A/S)，丹麦)，其为具有经验式(brutto formula)Al(OH)1,2Cl1,8的铝配合物。具有化学式Al(OH)1,2Cl1,8的有用的聚合氯化铝的另一个实例是PAX-XL 100(可获自凯米拉公司(Kemira))。有用的聚合氯化铝的另外两个实例是PAC(可获自上海浩天水处理设备有限公司(Shanghai Haotian Water Treatment Equipment Co.,Ltd)，以固体形式供应)或PAC(可获自天津市凯瑞特科技有限公司(Tianjin Kairuitetechnology Ltd.)，以液体形式供应)。具有化学式Al(OH)1,2Cl1,8的有用的聚合氯化铝的另一个实例是PAX18(可获自凯米拉水处理公司(Kemira Water Solutions)。
聚合氯化铝的浓度将通常处于以每千克发酵液(未稀释)计0.1％-10％(w/w)的范围内；优选以每千克发酵液(未稀释)计0.5％-5％(w/w)的范围内。
在添加聚合氯化铝之后，可以调节pH。pH可以调节至在pH 2到pH 11范围之内的pH。可以用本领域中已知的任何酸或碱调节pH。
我们要求一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
b)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
也可以在已经将该微生物从该发酵液中分离之后添加聚合氯化铝；因此我们还要求：
一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)从该发酵液中分离该微生物，并且
b)将聚合氯化铝添加至该发酵液。
还可以按照两个步骤或更多个步骤添加聚合氯化铝，例如在将该微生物从该发酵液中去除之前；然后再次在已经去除该微生物之后，比如在后续下游工艺液体中。
因此本发明进一步包括一种用于从发酵液和后续下游工艺液体中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液和后续下游工艺液体包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将聚合氯化铝添加至该发酵液并且添加至该后续下游工艺液体，并且
b)从该发酵液中分离絮凝的微生物
c)在添加聚合氯化铝之后精制该后续下游工艺液体。
聚合物
聚合物广泛用于颗粒凝聚。阴离子和阳离子聚合物是优选的。有用的阳离子聚合物可以是聚胺，并且有用的阴离子聚合物可以是聚丙烯酰胺。有用的聚合物浓度将通常处于以每千克发酵液(未稀释)计0.5％-20％(w/w)的范围内；优选以每千克发酵液(未稀释)计1％-10％(w/w)的范围内。
有用的阴离子聚合物的实例是SuperflocTMA 130(凯米拉公司)。有用的阳离子聚合物的实例是PolycatTM(凯米拉公司)、C521(凯米拉公司)、和C591(凯米拉公司)。
后续下游操作
可以通过本领域已知的方法，例如但不限于过滤，例如滚筒过滤、膜过滤、压滤机终端过滤、交叉流动过滤、或离心来去除絮凝的细胞。
然后可以通过本领域已知的方法将得到的蛋白质溶液进一步加工或精制。例如，可以通过常规程序回收该蛋白质，所述程序包括但不限于进一步过滤(如超滤和透析过滤)、提取、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶。然后，分离的蛋白质可用本领域已知的各种程序进一步纯化和/或修饰，所述程序包括但不限于层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦层析及大小排阻层析)和/或电泳程序(例如制备型等电聚焦电泳)和/或溶解度差异(例如硫酸铵沉淀))和/或萃取。
残留宿主细胞DNA的检测
术语残留宿主细胞DNA包括来自生产菌株的基因组DNA和编码感兴趣的蛋白质的DNA片段。
可以通过本领域已知的各种方法来完成微量残留宿主细胞DNA的检测和定量。开发了许多方法来测定特异性单个靶序列。方法实例为：
·利用斑点印迹的用于检测具有定义起源的特异性DNA的基于杂交的方法、以及使用随机六聚物来产生覆盖这些宿主细胞的全基因组的代表性探针的放射性同位素标记的DNA探针的杂交。
·用于检测具有定义起源的特异性DNA的基于定量PCR的方法，该特异性DNA靶向特异性基因序列，以便使用纯化的、物种匹配的、基因组DNA进行扩增和校准。
·用于检测具有定义起源的特异性DNA的定性PCR方法，该特异性DNA靶向特异性基因序列，以便使用纯化的、物种匹配的、基因组DNA进行扩增和校准。基于可以使用该方法检测的基因组DNA的最低量来确定阈值。
根据本发明，微量DNA的纯化是通过使用FastDNATMSpin试剂盒(安倍生物医疗(MP Biomedicals))来完成的。然后，使用针对该宿主细胞上的染色体位点的特异性引物，可以使该洗脱的样品经历PCR反应。包括多个阳性对照，其中已知量的宿主DNA以不同的浓度添加到PCR反应中。在PCR反应之后，使这些样品经历凝胶电泳，并比较这些DNA条带的强度以便估计在初始样品中的宿主DNA的浓度。在英尼斯(Innis)等人(1990)的PCR规程：方法和应用指南(PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications)(纽约学术出版公司(Academic Press inc.)中提供了PCR的详细规程。
通过使用根据本发明的方法，没有可检出的残留宿主细胞DNA(小于10ng DNA每克发酵液，即，低于检测限)。
在下列实例中进一步阐明本发明，这些实例并不旨在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实例
实例1
从发酵液中去除DNA
该发酵液包含该感兴趣的蛋白质(麦芽糖淀粉酶)和产生该感兴趣的淀粉酶的微生物(枯草芽孢杆菌)。该发酵为本领域已知的深层发酵并且得到的发酵液具有经证实的DNA含量。
对照：使淀粉酶批的冰冻培养液在水浴中融化。将两个独立等分试样的材料在10,000rpm下旋转离心20分钟，保留得到的上清液用于分析，并且将在此得到的上清液描述为“未处理的培养液”对照。
试验：用四个不同的设置来絮凝该发酵液：
使用GC850TM(Al2(OH5)Cl)或NordPAC18TMAl(OH)1,2Cl1,8作为聚合氯化铝盐，并且使用PolycatTM或C521TM作为阳离子聚合物。
保持稀释用水、CaCl2、和A130TM的量恒定。
使用以下组合进行四个絮凝设置：
*这些值是分别针对有待絮凝的培养液的质量进行计算的。
使用以下物质进行此处描述为A、B、C和D的四个絮凝：
A：水、CaCl2、GC850TM、C521TM、A130TM。
B：水、CaCl2、GC850TM、PolycatTM、A130TM。
C：水、CaCl2、NordPAC18TM、C521TM、A130TM。
D：水、CaCl2、NordPAC18TM、PolycatTM、A130TM。
在添加聚合铝酸盐之后用乙酸和/或氢氧化钠溶液调节pH，以便达到所希望的pH 5.5设定点。
使用磁性搅拌棒在室温下将这些絮凝溶液混合直到获得希望质量的絮凝物为止(目测观察)。还使用旋转离心物质上清液(3500rpm，5min)的浊度测量值来确定对应的絮凝的质量。我们的实验数据显示，对于所有四种溶液都获得了可比较的浊度值。
然后将絮凝的物质交付给标准实验室规模的回收工艺，该工艺包括：
·离心(3500rpm，10min)，
·在吸滤器(Nutsch)设备(具有HS9000滤板，7.5-18μm截留值)上进行精细过滤，
·细菌过滤(使用一次性0.22μm真空过滤器)，
·超滤(使用赛多利斯(Sartorius)过滤盒，具有10 kDa截留值)。
在以上提及的所有流处取得独立的一式三份样品，将其交付给残留DNA分析(FastDNATMSpin试剂盒和PCR)；仅仅将该未处理的培养液样品作为单实例(singleton)进行分析。在所有流处取得单个样品，送去进行酶活性分析。
结果
前两个未处理的培养液样品含有高量的残留DNA(参见图1上的箭头)。A和B样品中的一式三份中的两个(A6-2和A6-3，B6-2和B6-3)，相应于用GC850TM的对应的A和B絮凝的超滤(UF)浓缩物质，具有由琼脂糖凝胶上的PCR条带的存在指示的阳性DNA信号(参见图1上的箭头)。
正如所期望的那样，两个其他的未处理的培养液样品也含有高量的残留DNA(参见图2上的箭头)。所有一式三份的C和D样品(C6-1、C6-2和C6-3；D6-1、D6-2和D6-3)，相应于用NordPAC18TM的对应的C和D絮凝的超滤(UF)浓缩物质，具有由琼脂糖凝胶上的PCR条带的缺乏指示的阴性DNA信号(没有箭头，参见图2)。
在PolycatTM与C521TM之间没有明显差异，因为阳离子聚合物受到DNA去除的影响。
NordPAC18和GC850两者都显示出非常好的从发酵液中去除DNA的能力。当使用NordPAC18TM时不可能检测到任何DNA，并且当使用GC850TM时仅仅看出微量的DNA。活性数据支持将GC850TM更换为NordPAC18TM对浓缩物中的酶的浓度没有影响。
实例2
与铝酸钠相比较，使用聚合氯化铝从发酵液中去除DNA：
该发酵液包含淀粉酶和产生该淀粉酶的微生物(枯草芽孢杆菌)。该发酵为本领域已知的深层发酵并且得到的发酵液具有经证实的DNA含量。
对照：使淀粉酶批的培养液在水浴中融化。将三个独立等分试样的材料在10,000rpm下旋转离心20分钟，保留得到的上清液用于分析，并且将在此得到的上清液描述为“未处理的培养液”对照。
试验：针对参比铝酸钠(NaAlO2)对GC850TM(Al2(OH5)Cl)和NordPAC18TMAl(OH)1,2Cl1,8进行了试验。保持稀释用水、CaCl2的量恒定。使阳离子聚合物PolycatTM(凯米拉公司)和阴离子聚合物A130TM(凯米拉公司)的量适配，以便获得在这些样品之间的相似絮凝效率。
使用以下组合进行四个絮凝设置：
*这些值是分别针对有待絮凝的培养液的质量进行计算的。
使用以下物质进行此处描述为A、B、和C的三个絮凝：
A：水、CaCl2、NordPAC18TM、PolycatTM、A130TM。
B：水、CaCl2、GC850TM、PolycatTM、A130TM。
C：水、CaCl2、铝酸钠、A130TM。
在添加聚合铝酸盐之后用乙酸和/或氢氧化钠溶液调节pH，以便达到所希望的pH 5.5设定点。
使用磁性搅拌棒将这些絮凝溶液混合直到获得希望质量的絮凝物为止(目测观察)。还使用旋转离心物质上清液(3500rpm，5min)的浊度测量值来确定对应的絮凝的质量。数据显示，对于所有三种溶液都获得了可比较的浊度值。
然后将絮凝的物质交付给标准实验室规模的回收工艺，该工艺包括：
·离心(3500rpm，10min)，
·在吸滤器(Nutsch)设备(具有HS9000滤板，7.5-18μm截留值)上进行精细过滤，
·细菌过滤(使用一次性0.22μm真空过滤器)，
·超滤(使用赛多利斯(Sartorius)过滤盒，具有10kDa截留值)。
在以上提及的所有流处取得样品并将其交付给残留DNA分析(FastDNATMSpin试剂盒和PCR)。进行内部对照来评定PCR结果的质量。在所有流处取得单个样品，送去进行酶活性分析。
结果：
在本实验条件下使用的这三种不同的铝盐导致非常相似的絮凝质量，正如在总反应时间和离心之后通过对应上清液的浊度所确定的。通过PCR评定残留DNA的存在(参见图3)。对照样品(培养液)含有大量的DNA(箭头)。NordPAC18TM和GC850TM絮凝两者的UF浓缩物具有阴性PCR信号，因此不可能检测出任何DNA(没有箭头)。铝酸钠絮凝的UF浓缩物对于残留DNA是阳性的(箭头)。
这些结果证明，聚合氯化铝NordPAC18TM和GC850TM相比于铝酸钠具有非常好的DNA去除效率。

Claims (18)

1.一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
b)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
2.一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)从该发酵液中分离该微生物；并且
b)将聚合氯化铝添加至该发酵液。
3.一种用于从发酵液和后续下游工艺液体中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液和后续下游工艺液体包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将聚合氯化铝添加至该发酵液并且添加至该后续下游工艺液体；
b)从该发酵液中分离絮凝的微生物；并且
c)在添加聚合氯化铝之后精制该后续下游工艺液体。
4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白质是一种酶。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该微生物是一种细菌或真菌。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酶是一种水解酶。
7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该发酵液可以用水稀释高达2000％(w/w)。
8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该聚合氯化铝是以每千克发酵液计0.1％-10％(w/w)的浓度添加的。
9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中除了聚合氯化铝之外，还添加了一种或多种絮凝剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中这些絮凝剂选自下组，该组由盐和聚合物组成。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该聚合物是一种阴离子聚合物或阳离子聚合物。
12.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该聚合氯化铝具有化学式Aln(OH)mCl(3n-m)。
13.根据权利要求12述的方法，其中该聚合氯化铝具有化学式Al2(OH)5Cl和/或Al(OH)1,2Cl1,8。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)或b)中的分离是通过离心或过滤进行的。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在添加聚合氯化铝之后将pH调节到在pH 2到pH 11范围之内的pH。
16.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤b)之后每克发酵液有少于10ng的宿主细胞DNA。
17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中，当在步骤b)和/或c)之后进行PCR反应和凝胶电泳时，在步骤b)和/或c)之后每克发酵液有少于10ng的宿主细胞DNA。
18.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中，当在步骤b)和/或c)之后进行PCR反应和凝胶电泳时，在该发酵液中有低于检测限的宿主细胞DNA。
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