CN104774261B

CN104774261B - Foxm1 肽和包含foxm1 肽的药剂

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Publication number: CN104774261B
Application number: CN201510127580.5A
Authority: CN
Inventors: 西村泰治; 横峰和典; 角田卓也; 中村佑辅
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2028-08-12
Also published as: EP2189471B1; AU2008290049B2; TW200922616A; CN108117584B; CN108117584A; SG183717A1; CN101835792B; CA2696597C; AU2008290049A1; KR101543624B1; EP2189471A1; JPWO2009025196A1; US20150265689A1; MX2010002002A; US9073968B2; US20110195081A1; EP3263585A3; US9415096B2; JP5555952B2; RU2010110567A

Abstract

本发明的目的是通过如下提供对于日本约30％的以高水平表达叉头框M1(FOXM1)的各种类型的癌症患者实现癌症免疫治疗的手段：鉴定可结合于HLA‑A2的源自FOXM1的肽以活化可杀死癌细胞的人杀伤T细胞。具体公开的是选自如下(A)或(B)项的肽：(A)包括SEQ ID NO:1至3中任一个所示的氨基酸序列的肽，和(B)在包括SEQ ID NO:1至3中任一个所示的氨基酸序列的肽中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基并且具有诱导细胞毒(杀伤)T细胞的活性的肽。

Description

FOXM1肽和包含FOXM1肽的药剂

本申请是中国申请200880112387.2的分案申请，该母案的国际申请日为2008年8月12日，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

技术领域

本发明涉及作为针对高表达叉头框M1(FOXM1)的癌症(如胆管癌、肺癌和胰腺癌)的疫苗有用的新肽，和包含这些肽的用于治疗和预防肿瘤的药物。

背景技术

在日本，胆管癌(胆囊癌和胆管癌)死亡的数目正在增加，在2005年，有16,586人死于此癌。在大多数胆管癌病例中，在早期不存在主观症状。与消化道腔体内形成的癌症(如胃癌和结肠癌)相比，胆管癌的准确的显示和诊断显影(diagnostic imaging)是困难的。因此，胆管癌难以早期检测，当胆管癌被发现时，癌症往往已经发展并无法切除。除外科治疗之外，还进行放疗和化疗以治疗胆管癌，但它们疗效不佳，因此亟需建立新的治疗方法。

在日本，肺癌死亡的数目也在增加，在2005年，有62,063人死于此癌。目前日本癌症死亡中肺癌占19.0％，并已成为2000年以来癌症死亡的首要原因。吸烟被认为是肺癌发生的最大原因。除吸烟外，吸入石棉或氡气也被认为引起肺癌。作为预防肺癌的措施，人们倡导戒烟和进行健康检查。然而，尽管吸烟人群在日本正在减少，但2005年仍估计有大约3千万人。此外，最近已证明，健康检查中广泛进行的简单胸部X-光显影和痰液测试对于肺癌的早期检测无效，而且它们并不导致癌症死亡的减少。考虑到上述情况，预期肺癌死亡的数目在未来会持续增加。

肺癌的症状包括咳嗽、血痰、呼吸急促和胸痛，但在大多数情况下，症状在早期不存在。在很多病例中当症状出现时癌症已经发展。为此，当最先发现癌症时，一半以上的患者是不能手术治疗的，因此肺癌被看作难治性癌症中的一种。手术后恢复率不像其他癌症那么好，而且手术后的总的五年存活率仅不及50％。在近年来，随着以手术切除为中心，结合放疗、化疗等的多科性治疗的进步，早期肺癌的五年存活率正在增加；然而，晚期肺癌的治疗效果没有很大的改进，而且亟需建立新的治疗策略。

在日本，胰腺癌死亡的数目正在增加，在2005年，有22,927人死于此癌。目前，日本癌症死亡中胰腺癌占7.0％，在肺癌、胃癌、结肠癌和肝癌后排名第五位。胰腺癌没有特异性的症状，而且在很多病例中，当症状出现时，癌症已经发展。即使是诊断显影发展的今天，全日本胰腺癌患者中大约40％属于具有远端转移的晚期病例，而且发现很多患者具有不能切除的局部发展的癌症。因此，患者总的五年存活率是5％以下，而且诊断后的预后非常差。由于诊断中的难度，胰腺癌发病作为癌症死亡的原因特别是发达国家中正逐渐增加。当先，虽然以手术切除为中心，结合放疗、化疗等的多科性治疗正在开展，但是在治疗效果方面没有明显的改进，亟需建立新的治疗策略。已显示胰腺癌的发病要因涉及多种因素，如生活习惯(包括吸烟、肥胖、饮食、饮酒和喝咖啡)，以及慢性胰腺炎、糖尿病、遗传因素等。

在另一个方面，分子生物学和肿瘤免疫学的近期发展阐明，细胞毒性(杀伤)T细胞和辅助T细胞可识别癌细胞中特异性高表达的蛋白质被降解而产生、并经由HLA分子被呈递到癌细胞或抗原呈递细胞的表面的肽，并引起免疫反应以破坏癌细胞。此外，已经鉴定了许多源自这些细胞的、能刺激这样的免疫反应以攻击癌症的肿瘤抗原蛋白质和肽，而且抗原特异性肿瘤免疫治疗正在得到临床应用。

HLA I类分子在身体的所有有核细胞的表面上表达。它结合于细胞质或细胞核中产生的蛋白质在胞内降解所产生的肽，并表达在细胞表面。在正常细胞的表面，源自正常自体蛋白质的肽结合于HLA I类分子，并且不被免疫系统的T细胞识别和破坏。在另一个方面，在形成癌症的过程中，癌细胞有时大量表达在正常细胞中几乎不表达或略微表达的蛋白质。此时HLA I类分子结合于癌细胞内特异性高表达的蛋白质胞内降解而产生的肽，然后在癌细胞的表面上表达肽，于是杀伤T细胞识别并仅破坏癌细胞。通过将所述癌症-特异性抗原或肽施用于个体，可破坏癌细胞且可抑制癌生长而不伤害正常细胞。这称为使用癌症-特异性抗原的癌症免疫疗法。HLA II类分子主要在抗原呈递细胞的表面上表达。所述分子结合于源自癌症-特异性抗原的肽，其通过胞内降解由细胞外并入抗原-呈递细胞的癌症-特异性的抗原而产生，然后在细胞的表面上表达肽。识别它们的辅助T细胞被活化，并通过产生活化其他免疫活性细胞的多个细胞因子来诱导或增强针对肿瘤的免疫反应。

因此，如果开发靶向在癌症中特异性高表达的抗原的免疫疗法，这样的疗法可有效地仅仅消灭癌症，而不引起对正常自体组织的任何有害事件。还期望的是疗法可用于其他治疗均无能为力的任何末期癌症患者。此外，通过将癌症特异性抗原和肽作为疫苗预先施用于具有发生癌症的高风险的个体，可预防癌症的发生。

本发明人首先使用cDNA微阵列对27,648个人基因进行了全基因组基因表达分析，以研究这些基因在25个肝内胆管癌病例中和在多个正常器官(包括它们在胚胎期)的表达谱(expression profile)。结果，本发明人发现叉头框M1(FOXM1)(GenBank登录号NM_202003)在许多肝内胆管癌病例的组织中非常高度表达。类似于且除肝内胆管癌之外，还发现FOXM1在几乎所有的肺癌、膀胱癌和胰腺癌病例中高度表达。此外，FOXM1的高表达见于多种癌症如子宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)、乳腺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、肝细胞癌、结肠癌和慢性髓细胞性白血病的40％以上病例中。这些事实提示FOXM1可在多种癌症中作为癌症-特异性抗原。FOXM1在胚胎肝中并在正常成人器官中表达，其在消化道如胃、小肠和大肠、胸腺和睾丸中轻微表达；然而，表达水平明显低于癌部分。

提示FOXM1与癌症发病和细胞增殖调节有关的文件的实例包括非专利文件1至10。然而，这些文件都没有描述FOXM1作为针对癌症的疫苗的用途。

[非专利文件1]Yoshida Y,Wang I-C,Yoder HM,Davidson NO,Costa RH.:Theforkhead box M1transcription factor contributes to the development and growthof mouse colorectal cancer.Gastroenterology 132:1420-1431,2007.

[非专利文件2]Gusarcova GA,Wang I-C,Major ML,Kalinichenko VV,AckersonT,Petrovi V,Costa RH.:A cell-penetrating ARF peptide inhibitor of FOXM1inmouse hepatocellular carcinoma treatment.J.Clin.Invest.117:99-111,2007.

[非-专利文件3]Radhakrishnan SK,Bhat UG,Hughes DE,Wang I-C,Costa RH,Gartel AL.:Identification of a chemical inhibitor of the oncogenictranscription factor forkhead box M1.Cancer Res.66:9731-9735,2006.

[非-专利文件4]Takahashi K,Furukawa C,Takano A,Ishikawa N,Kato T,Hamaya S,Suzuki C,Yasui W,Inai K,Sone S,Ito T,Nishimura H,Tsuchiya E,NakamuraY,Daigo Y.:The neuromedin U-growth hormone secretagogue receptor 1b/neurotensin receptor 1oncogenic signaling pathway as a therapeutic target forlung cancer.Cancer Res.66:9408-9419,2006.

[非-专利文件5]Kim I-M,Ackerson T,Ramakrishna S,Tretiakova M,Wang I-C,Kalin TV,Major ML,Gusarova GA,Yoder HM,Costa RH,Kalinichenko VV.:The forkheadbox m1transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells duringdevelopment of lung cancer.Cancer Res.66:2153-2161,2006.

[非-专利文件6]Wonsey DR,Folletie M.:Loss of the forkheadtranscription factor FoxM1causes centrosome amplification and mitoticcatastrophe.Cancer Res.65:5181-5189,2005.

[非-专利文件7]Obama K,Ura K,Li M,Katagiri T,Tsunoda T,Nomura A,SatohS,Nakamura Y,Furukawa Y:Genome-wide analysis of gene expression in humanintrahepatic cholangiocarcinoma.Hepatology 41:1339-1348,2005.

[非-专利文件8]Laoukili J,Kooistra MRH,Brás A,Kauw J,Kerkhoven RM,Morrison A,Clevers H,Medema RH.:Foxm1is required for execution of the mitoticprogramme and chromosome stability.Nature Cell Biol.7:126-136,2005.

[非-专利文件9]Kalinichenko VV,Major M,Wang X,Petrovic V,Kuechle J,Yoder HM,Shin B,Datta A,Raychaudhuri P,Costa RH.:Foxm1b transcription factoris essential for development of hepatocellular carcinomas and is negativelyregulated by the p19ARF tumor suppressor.Genes Dev.18:830-850,2004.

[非-专利文件10]Wang X,Kiyokawa H,Dennewitz MB,Costa RH.:The forkheadbox m1b transcription factor is essential for hepatocyte DNA replication andmitosis during mouse liver regeneration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:16881-16886,2002.

发明内容

[本发明要解决的问题]

本发明要实现的目标是开发一种手段，用来实施通过增强癌症患者的抗癌免疫力来抑制癌症生长的免疫治疗，作为一种新型治疗方法来治疗难以通过外科手术治疗、化疗和放疗等作为胆管癌、肺癌、胰腺癌等的治疗方法治疗的转移性或难治性癌症。更具体地，本发明的一个目的是鉴定源自在癌症中特异性高表达的蛋白质、并且能诱导癌症患者中针对所述癌症的强免疫反应而不导致不良反应的肽，并在肿瘤免疫治疗中应用这些肽。本发明识别源自在上述癌症中特异性高表达的蛋白质并经由HLA-A2呈递于杀伤T细胞的肽，从而使免疫治疗能够用于大约30％的患有上述癌症的日本人患者。

[解决问题的手段]

在本申请中，本发明人通过将人CD8阳性杀伤T细胞与经具有HLA-A2结合基序的人FOXM1肽冲激(pulsed)的、源自人外周血单核细胞的树突细胞共培养来体外刺激人CD8阳性杀伤T细胞，从而诱导FOXM1肽特异性杀伤T细胞。是否存在对每种FOXM1肽特异性的杀伤T细胞的诱导作用，是通过使用ELISPOT测定法检测由识别通过HLA-A2呈递的肽而活化的杀伤T细胞所产生γ-干扰素(IFN-γ)来检查的。结果，鉴定了新型FOXM1肽，它们可以成为免疫治疗的潜在候选靶抗原。此外还发现，使用上述肽诱导的FOXM1-反应性CTL针对表达内源性FOXM1和HLA-A2分子的癌细胞具有特异性的细胞毒性。而且所述CTL以HLA I类限制性的方式识别靶细胞。

更具体地，本发明提供了如下：

[1]下面(A)或(B)的肽：

(A)包含SEQ ID NO:1至3中任一氨基酸序列的肽；

(B)包含SEQ ID NO:1至3中任一氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，并且其中所述肽显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性。

[2][1]的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。

[3][1]的肽，其中C-末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。

[4]诱导针对癌症的免疫力的试剂，其包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。

[5]用于治疗和/或预防癌症的药剂，其包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。

[6]用于诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。

[7]用于诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含编码[1]的肽的一种或多种多核苷酸作为活性成分。

[8]用于诱导细胞毒性(杀伤)T细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。

[9]针对[1]的肽的抗体。

[10]使用[1]的肽诱导的细胞毒性(杀伤)T细胞、辅助T细胞或包含它们的免疫细胞群体。

[11]抗原呈递细胞，其呈递包含[1]的肽及HLA抗原的复合物。

[12][11]的抗原呈递细胞，其是通过[6]或[7]的药剂诱导的。

[13]一种外来体，其呈递包含[1]的肽及HLA抗原的复合物。

[14][13]的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A*0201)。

[15]诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将抗原呈递细胞与[1]的肽接触的步骤。

[16]诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将编码[1]的肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞的步骤。

[17]诱导细胞毒性(杀伤)T细胞的方法，其包括将T细胞与[1]的肽接触的步骤。

本发明还提供如下：

[18]诱导针对癌症的免疫力的方法，其包括将[1]的肽施用于受试者的步骤。

[19]用于治疗和/或预防癌症的方法，其包括将[1]的肽施用于受试者的步骤。

[20][1]的肽在制备用于诱导针对癌症的免疫力的药剂中的用途。

[21][1]的肽在制备用于治疗和/或预防癌症的药剂中的用途。

[22][1]的肽，用于诱导针对癌症的免疫力。

[23][1]的肽，用于治疗和/或预防癌症。

附图简述

图1显示的是ELISPOT测定法和细胞毒性测试的结果。从HLA-A2阳性健康个体和乳腺癌患者的外周血分离CD8阳性T细胞。针对用以每种FOXM1肽冲激过的源自单核细胞的树突细胞刺激而获得的杀伤T细胞，进行ELISPOT测定法检查，确定它们是否与FOXM1肽特异性反应而产生IFN-γ。此外，通过细胞毒性测试检查是否表达FOXM1的细胞以HLA-A2限制性方式特异性地受到损害。将T2-A2细胞用作ELISPOT测定法中的靶细胞。T2-A2细胞是通过将HLA-A2基因引入TAP基因表达缺陷的小鼠T2细胞系而产生的细胞系。由于T2-A2细胞中的TAP缺陷，只有当外源添加的肽具有与HLA-A2分子结合的能力时，该肽与HLA-A2分子形成的复合物才会在细胞表面上表达。将Panc-1细胞(其为HLA-A2阳性的且表达FOXM1)和PK-8细胞(其为HLA-A2阴性和FOXM1阳性的)用于评价细胞毒活性。结果，来自两个健康个体的使用FOXM1362-370、373-382和640-649肽诱导的杀伤T细胞识别结合于HLA-A2并表达在T2-A2细胞上的FOXM1362-370、373-382和640-649肽而产生IFN-γ。此外，来自乳腺癌患者的使用上述肽诱导的杀伤T细胞，它们显示针对panc-1细胞的强细胞毒活性，但不显示针对PK-8细胞的细胞毒活性。因此，发现被诱导出来的杀伤T细胞特异性识别FOXM1，以HLA-A2限制性方式显示针对癌细胞系的强细胞毒活性。由此可见，FOXM1362-370、373-382和640-649肽可以通过HLA-A2限制性的方式诱导FOXM1-特异性人杀伤T细胞，而且这样的杀伤T细胞可损害表达FOXM1的癌细胞。

[实施本发明的方式]

除非另外限定，本申请中使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。

本发明的肽是限制于HLA-A2的表位，HLA-A2是一种多见于日本人群和白种人群的HLA等位基因。利用与HLA-A2的结合亲和力作为指标，选择了源自FOXM1的候选HLA-A2结合肽。来自两个健康个体的使用FOXM1362-370、373-382和640-649肽诱导的杀伤T细胞识别结合于HLA-A2并表达在T2-A2上的FOXM1362-370肽(YLVPIQFPV(SEQ ID NO:1))、FOXM1-373-382肽(SLVLQPSVKV(SEQ ID NO:2))和FOXM1-640-649肽(GLMDLSTTPL(SEQ ID NO:3))而产生IFN-γ。来自乳腺癌患者的使用上述肽诱导的杀伤T细胞显示针对panc-1细胞的强细胞毒活性，但不显示针对PK-8细胞的细胞毒活性。因此，证实了所诱导的杀伤T细胞是以HLA-A限制性方式特异性识别FOXM1，并显示针对癌细胞系的强细胞毒活性。因此，揭示了FOXM1-362-370(YLVPIQFPV(SEQ ID NO:1))、FOXM1-373-382(SLVLQPSVKV(SEQ ID NO:2))和FOXM1-640-649(GLMDLSTTPL(SEQ ID NO:3))中任一个肽均能以HLA-A2限制性方式诱导FOXM1-特异性人杀伤T细胞，而且这样的杀伤T细胞能伤害表达FOXM1的癌细胞。除肝内胆管癌之外，发现FOXM1在肺癌、膀胱癌和胰腺癌的几乎所有病例中也与肝内胆管癌类似地高度表达。此外，FOXM1在多种癌症如子宫颈癌、卵巢癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、肝细胞癌、结肠癌和慢性髓细胞性白血病的40％以上病例中高表达。这些事实显示FOXM1作为多种癌症的免疫治疗的靶标是有用的。

(1)本发明的肽和包含所述肽的用于诱导抗癌免疫力的试剂

本发明的肽是下述(A)至(D)中的任一个。

(A)包含SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列的肽。

(B)包含SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，并且其中所述肽显示细胞毒性(杀伤)T细胞-诱导活性。

(C)(B)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和

(D)(B)的肽，其中C-末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。

在本申请中，“显示诱导杀伤T细胞的活性的肽”是指“具有刺激杀伤T细胞(细胞毒性T细胞/CTL)的T细胞-诱导活性的肽”。

本发明的肽是具有少于40个氨基酸，优选少于20个氨基酸，更优选少于个15氨基酸，包括SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列，并显示诱导杀伤T细胞的活性的肽(表位肽)。或者，本发明的肽(表位肽)可包括包含SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，只要保留诱导杀伤T细胞的能力即可。被取代、缺失、插入和/或添加的残基数目通常为五个氨基酸或更少，优选四个氨基酸或更少，更优选三个氨基酸或更少，甚至更优选一个氨基酸或两个氨基酸。

已知变体肽(即，包含通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基修饰原始氨基酸序列而获得的氨基酸序列的肽)保留原始生物活性(Mark DF等,(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6；Zoller MJ和Smith M,(1982)核酸Res 10:6487-500；Dalbadie-McFarland G等(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13)。氨基酸修饰优选保留原始氨基酸侧链的性质。氨基酸侧链的性质的实例显示如下：疏水氨基酸侧链(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；亲水氨基酸侧链(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；和共同具有如下官能团或特征的侧链：脂族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基侧链(S、T、Y)；含硫原子侧链(C、M)；含羧酸和酰胺侧链(D、N、E、Q)；含碱侧链(R、K、H)；和含芳环侧链(H、F、Y、W)。括号中的字母显示氨基酸的单字母代码。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽(免疫源性肽)是九肽(9-聚物)或十肽(10-聚物)。

为了获得具有高结合亲和性和杀伤T细胞诱导活性的肽，可通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸来修饰天然存在的FOXM1的部分肽的氨基酸序列。在本申请中，术语“数个”指五个以下，优选三个以下，更优选两个以下。此外，由于与HLA抗原具有高亲和性的肽序列的规律性是已知的(Kubo RT,等,(1994)J.Immunol.,152,3913-24；Rammensee HG,等,(1995)Immunogenetics.41:178-228；Kondo A,等(1995)J.Immunol.155:4307-12)，可依据该规律性来修饰本发明的肽(表位肽)，从而增强它们与HLA抗原的亲和力。例如，可通过用赖氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起第二个氨基酸来获得具有高HLA-A2结合亲和力的肽。类似地，还可通过用缬氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸来获得具有高HLA-A2结合亲和力的肽。

当表位肽的序列与具有不同功能的内源或外源蛋白的氨基酸序列的部分相同时，可引起副作用如自身免疫病或针对特定物质的变态反应症状。为了避免这样的副作用，修饰的表位肽不应与已知蛋白质的氨基酸序列相同。为此，需要使用可用的数据库进行同源性检索以确认不存在与修饰的表位肽显示100％同源性且具有不同功能的内源或外源蛋白质。通过此步骤，可以避免由上述用于增加与HLA抗原的结合亲和力和/或用于增加杀伤T细胞诱导活性的氨基酸序列修饰引起的风险。

虽然上述与HLA抗原具有高结合亲和力的肽预期非常有效地作为癌症疫苗，但需要检查使用高结合亲和力作为指标选择的候选肽是否实际上具有杀伤T细胞诱导活性。杀伤T细胞诱导活性可通过如下确认：诱导具有人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，更具体地，诱导源自人外周血单核白细胞的树突细胞；用目标肽刺激它们；然后将它们与CD8阳性细胞混合；再测量对于靶细胞的细胞毒活性。反应系统可使用表达人HLA抗原的转基因动物(如在，例如，BenMohamed L,等(2000)Hum.Immunol.61(8):764-79,Related Articles,Books,和Linkout中所描述的)。例如，可用⁵¹Cr等放射标记靶细胞，然后可依据靶细胞释放的放射性计算细胞毒活性。或者，可通过在具有固定化肽的抗原呈递细胞存在的条件下测量由杀伤T细胞产生和释放的IFN-γ；并使用抗-IFN-γ单克隆抗体在培养基中显现IFN-γ产生区，来检查靶细胞。

如实施例所示，检查肽的杀伤T细胞诱导活性的结果显示，与HLA抗原具有高结合亲和力的肽不一定具有高诱导活性。然而，含有FOXM1-362-370(YLVPIQFPV(SEQ ID NO:1))、FOXM1-373-382(SLVLQPSVKV(SEQ ID NO:2))和FOXM1640-649(GLMDLSTTPL(SEQ IDNO:3))中任一个的氨基酸序列的九肽显示特别高的杀伤T细胞诱导活性。

如上所述，本发明提供显示杀伤T细胞诱导活性的肽，更具体地，包括SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列和其变体(即，取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列)的肽。优选地，包括SEQ ID NO:1至3中任一个的九个氨基酸或其变体的肽的氨基酸序列与其他内源蛋白质的氨基酸序列不同。特别地，具有高HLA-A2结合亲和力的肽可通过如下获得：用亮氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起的第二个氨基酸，和/或用缬氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸。

本发明的肽可包括修饰如糖基化、侧链氧化和磷酸化，只要肽不丢失它们的诱导杀伤T细胞活性。其它修饰包括，例如，D-氨基酸和其它氨基酸类似物，它们可用于增加肽的血清半衰期。

用于获得和产生本发明的肽的方法没有特定的限制。它们可以是化学合成的肽或通过基因重组技术产生的重组肽。

本发明的化学合成的肽可根据化学合成方法如Fmoc方法(芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl)方法)和t-Boc方法(叔丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl)方法)来合成。本发明的肽还可以利用多种商业上可得到的肽合成仪来合成。

可通过获得具有编码肽的核苷酸序列的DNA，或其变体或同源物，并将它们引入合适的表达系统，来以重组蛋白质的形式产生本发明的肽。

使用的表达载体可优选为任何能够在宿主细胞中自主复制，或可整合入宿主细胞的染色体，并在合适的位置含有启动子以允许表达编码肽的基因的载体。可通过将上述表达载体引入宿主来产生具有编码本发明的肽的基因的转化体。宿主可为任何细菌、酵母、动物细胞和昆虫细胞，且可根据宿主的不同使用已知技术将表达载体引入宿主。

在本发明中，可通过培养如上所述制备的转化体，在培养物中产生并积累肽，并由培养物收集本发明的肽，从而分离重组肽。

当转化体是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞如酵母时，用于这些微生物的培养基可为天然或合成培养基，只要它包含碳源、氮源、矿物质等，可以被微生物利用，并允许有效率地培养转化体。培养条件可以是常规用于培养微生物的那些。培养后，可使用常规的肽分离和纯化方法来从转化体的培养物中分离和纯化本发明的肽。

本领域的技术人员基于关于编码SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列的DNA核苷酸序列的信息可适当地产生或获得包含在SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列的肽。具体地，编码包含在SEQID NO:1至3中任一个的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列并显示杀伤T细胞诱导活性的肽的基因可通过本领域的技术人员已知的任何方法产生，如化学合成、遗传工程技术和诱变。例如，作为一种遗传工程技术，定点诱变方法是有用的，因为它可将特定的突变引入特定的位置。其可根据Molecular Cloning:Alaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989(下文中称为Molecular Cloning,第2版)和Current Protocols in MolecularBiology,Supplement 1-38,John Wiley&Sons(1987-1997)(下文中称为CurrentProtocols in Molecular Biology)等中描述的方法来进行。

本发明的上述肽可诱导针对癌症的免疫力，如在下面的实施例中所示。因此，本发明提供包含本发明的一种或多种肽作为活性成分的、用于诱导针对癌症的免疫力的试剂。

本发明诱导免疫力的药剂可制备成将两种以上表位肽组合的混合制剂。通过组合多种肽而配制的、能诱导免疫力的药剂，可以是鸡尾酒(cocktail)，或者也可以是使用标准技术相互结合的。要组合的表位肽(epitope peptides)可以是这样的肽，它们具有源自同一基因的不同氨基酸序列；或者也可以是这样的肽，它们具有源自不同基因的氨基酸序列。当施用本发明的肽时，施用的肽被以高密度呈递给抗原呈递细胞的HLA抗原，随后，诱导出可与被施用的肽和HLA抗原之间形成的复合物特异性反应的杀伤T细胞。或者，通过将由受试者收集的树突细胞与本发明的肽接触(或通过用本发明的肽冲激由受试者收集的树突细胞)，可获得将本发明的肽呈递于其细胞表面的抗原呈递细胞。通过将这些抗原呈递细胞施用回受试者，可在受试者体内诱导杀伤T细胞，结果，可增强呈递本发明的肽的靶细胞的免疫反应。

当体外或体内(优选体外)使用时，本发明用于诱导针对癌症的免疫力的试剂可诱导辅助T细胞、杀伤T细胞或包括这些细胞的免疫细胞群体，从而提供针对癌症的免疫力。

(2)本发明用于治疗和/或预防癌症的药剂(癌症疫苗)

实施例中显示，本发明的肽可在体内诱导对癌细胞特异性的杀伤T细胞。在另一方面，先前的发明显示，FOXM1在肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、宫颈癌、骨肉瘤、乳腺癌、软组织肉瘤和结肠癌等的大多数病例中高表达。因此，我们预期，包括一种或多种本发明的肽作为活性成分的诱导免疫力的试剂，可以有效地用作治疗和/或预防癌的药剂。就是说，可以预期，通过将本发明的肽连同合适的佐剂注入体内，或通过用肽冲激抗原呈递细胞如树突细胞后将它们注入体内，可以诱导和活化攻击肿瘤的杀伤T细胞。因而，结果是，可预期产生抗癌效果。此外，可将编码本发明的肽的基因掺入合适的载体。呈递人抗原的细胞(树突细胞等)和用重组DNA转化的细菌如BCG结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，或基因组中整合有编码本发明的肽的DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作治疗和/或预防人癌症的活疫苗。用于癌症疫苗的剂量和施用方法与用于常规天花疫苗和BCG疫苗的那些相同。

在本发明中，术语“疫苗”(亦称为“免疫原性组合物”)指当被接种于动物时能诱导抗肿瘤免疫力或抑制多种癌症的物质。本发明提示，包括SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽，其可诱导针对FOXM1呈递细胞的特异性的强免疫应答。因此，本发明也包括用于通过使用包含SEQ ID NO:1至3中任一个的氨基酸序列或其包括取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的变体的肽来诱导抗肿瘤免疫力的方法。通常，抗肿瘤免疫力包括如下免疫应答：

(1)针对含有FOXM1-表达细胞的肿瘤的杀伤T细胞的诱导，

(2)识别含有FOXM1-表达细胞的肿瘤的抗体的诱导，和

(3)抗肿瘤细胞因子的产生的诱导。

当特定的肽通过接种动物而诱导出这些免疫应答中的任一种时，确定该肽具有诱导抗肿瘤免疫力的作用。肽的诱导抗肿瘤免疫力的作用可通过观察宿主中的免疫系统对于肽的体内或体外应答来加以检测。

例如，用于检测诱导杀伤T细胞的方法是熟知的。侵入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递于T细胞和B细胞。T细胞以抗原特异性的方式应答于抗原呈递细胞所呈递的抗原，通过抗原的刺激作用分化成杀伤T细胞(还称为细胞毒性T细胞或CTL)，然后增殖。在本申请中，此过程被称为T细胞的“活化”。特定的肽对杀伤T细胞的诱导作用，可通过利用该肽冲激过的抗原呈递细胞将肽呈递于T细胞，然后检测杀伤T细胞的诱导来进行评价。此外，抗原呈递细胞具有活化CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞(eosinophil)和NK细胞的作用。由于CD4⁺T细胞在抗肿瘤免疫中是重要的，因此可将对于这些细胞的活化的影响作为指标，用来评价肽的抗肿瘤免疫力诱导作用。

对于使用树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞诱导的杀伤T细胞而言，评价它们的诱导效果的方法是本领域公知的。在抗原呈递细胞中，DC具有最强的杀伤T细胞诱导效果。在此方法中，首先，将测试肽与DC接触，然后将DC与T细胞接触。从与DC接触过的T细胞中检测出对靶细胞具有细胞毒作用的T细胞。如果T细胞显示针对靶细胞的细胞毒活性，则意味着测试肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。例如，可使用⁵¹Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为指标，检测杀伤T细胞针对靶细胞如肿瘤的活性。或者，可使用³H-胸腺嘧啶摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价肿瘤细胞损害的程度。

通过这些方法确认表现杀伤T细胞诱导活性的测试肽，是表现DC-活化作用和随后的杀伤T细胞诱导活性的肽。因此，表现诱导针对肿瘤细胞的杀伤T细胞的活性的肽可用作针对呈递FOXM1的癌症的疫苗。此外，已通过与肽接触而获得了诱导针对癌症的杀伤T细胞之能力(活性)的抗原呈递细胞，可用作针对癌症的疫苗。此外，通过抗原呈递细胞呈递肽而获得了细胞毒性的杀伤T细胞还可用作针对癌症呈递FOXM1的疫苗。利用抗原呈递细胞和杀伤T细胞进行抗肿瘤免疫，使用这样的抗肿瘤免疫的癌症治疗方法称为细胞免疫疗法(cytoimmunotherapy)。

通常，当使用肽进行细胞免疫疗法时，可通过组合具有不同结构的多个肽来增强诱导杀伤T细胞的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多个类型的肽片段的混合物是有利的。

肽对抗肿瘤免疫力的诱导还可通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来评价。例如，当在用肽免疫的实验室动物中诱导出针对肽的抗体，而这些抗体抑制肿瘤细胞的生长、增殖和/或转移时，则确定该肽可诱导抗肿瘤免疫力。

可通过施用本发明的疫苗来诱导抗肿瘤免疫力，而为治疗和/或预防癌症提供可能。治疗癌症和/或预防癌症发生的效果可包括抑制癌细胞生长、癌细胞的退行(regression)和癌细胞产生的抑制。患癌症的个体的死亡率降低、血中的肿瘤标志物减少、和与癌症有关的可检测症状的减少也包括在治疗和/或预防癌症的效果中。优选地，疫苗针对癌症的治疗和/或预防效果与无疫苗施用的对照的情况相比是统计学上显著的。例如，优选效果是以5％以下的显著性水平观察到的。统计学方法如Student t-检验、Mann-WhitneyU检验、ANOVA等可用于确定统计显著性。

在本发明中，受试者优选是哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、非人灵长类(non-human primate)、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛(cattle)，但不限于此。

本发明的肽可体内或回体(ex vivo)施用于受试者。此外，为了产生用于治疗和/或预防癌症的免疫原性组合物，可使用本发明的免疫原性肽，也就是，选自SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列的九肽和其突变肽。

更具体地，本发明提供用于治疗肿瘤或预防肿瘤生长、转移等的药剂，其包括一种或多种本发明的肽作为活性成分。本发明的肽特别有用于治疗肿瘤如胰腺癌、胆管细胞癌、胃癌、结肠癌、非小细胞肺癌、睾丸癌、子宫颈癌、骨肉瘤和软组织肉瘤。

本发明的肽可作为通过常规配制方法配制的药剂直接施用于受试者。这样的配制物除了本发明的肽之外，可根据需要包含可药用的载体、赋形剂等。本发明的药剂可用于治疗和/或预防多种肿瘤。

此外，为了有效地建立细胞免疫力，包含一种或多种本发明的肽作为活性成分的用于治疗和/或预防肿瘤的药剂中可混入佐剂。所述药剂可与其他活性成分(如抗肿瘤剂)一起共施用。适当的制剂还包括颗粒。适当的佐剂描述于文献(Johnson AG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.,7:277-89)中。佐剂的实例包括弗氏不完全佐剂、BCG、海藻糖二霉酚酸酯(trehalose dimycolate)(TDM)、脂多糖(LPS)、硫酸铝钾佐剂、硅石佐剂、磷酸铝、氢氧化铝和明矾(alum)，但不限于此。此外，可方便地使用脂质体配制物、其中药物结合于具有数微米直径的珠子的颗粒制剂和其中脂质结合于上述肽的制剂。施用方法可为口服施用、皮内注射、皮下注射、静脉注射等，并可包括全身施用(systemic administration)和靶肿瘤附近的局部施用。

本发明的肽的剂量可根据要治疗的疾病、患者的年龄和体重、施用方法等而适当地调节。剂量通常为0.001mg至1000mg，优选0.01mg至100mg，更优选0.1mg至10mg。优选地，几天一次到几个月一次进行施用，但本领域的技术人员可容易地选择适当的剂量和施用方法；而且这些参数的选择和优化完全在常规技术的范围内。制剂的形式没有特定的限制，可以是为通过加入赋形剂(如糖)而粒化的或冷冻干燥的。

可加入本发明的药剂用于增加杀伤T细胞诱导活性的助剂(auxiliary agent)包括：BCG细菌等的菌体组分，包括胞壁酰二肽(MDP)；Nature,vol.344,p873(1990)中描述的ISCOM；J.Immunol.vol.148,p1438(1992)中描述的皂苷系列(saponin series)的QS-21；脂质体和氢氧化铝等。此外，还可使用免疫刺激物(immunostimulant)如香菇多糖(lentinan)、西佐喃(sizofiran)和溶链菌(picibanil)作为助剂。还可以使用增强T细胞的生长和分化的细胞因子等，如IL-2、IL-4、IL-12、IL-1、IL-6和TNF，以及活化NK-T细胞的α-半乳糖基神经酰胺，以及通过结合于Toll-样受体来活化天然免疫系统的脂多糖(LPS)和CpG，等等，作为助剂。

本发明的疫苗组合物包含引发杀伤T细胞的组分。脂质已被鉴定为用于针对病毒抗原进行体内初次刺激(priming)的物质。例如，可将棕榈酸残基结合于赖氨酸残基的ε-氨基和α-氨基，然后与本发明的免疫原性肽连接。脂质化的肽可通过掺入胶束或颗粒，或封装入脂质体，或在佐剂中乳化来直接施用。脂质初次刺激的另一个实例是用大肠杆菌脂蛋白如三棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinyl-seryl-serine)(P3CSS)当将其共价结合于合适的肽时进行引发(Deres K.,等,(1989)Nature342:561-4)。

本发明的免疫原性肽可通过病毒载体或细菌载体表达。适当表达载体的实例包括无毒力的病毒宿主如牛痘(vaccinia)和禽痘(fowlpox)。例如，可以使用痘苗病毒作为载体来表达编码所述肽的核苷酸序列。将重组牛痘病毒引入宿主细胞，表达出免疫原性肽，引发免疫应答。也可以使用例如在美国专利No.4,722,848中描述过的使用牛痘载体的免疫方法。也可以使用卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)(BCG)。Stover CK等,(1991)Nature31:456-60中描述了BCG载体。其他多种可用于治疗性施用或免疫的载体在本领域内是已知的，这些载体包括腺病毒载体和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒样杆菌(伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))载体和脱毒的炭疽毒素载体。参见，例如，Shata MT等,(2000)Mol.Med.Today 6:66-71；Shedlock DJ和Weiner DB等,(2000)J.Leukoc.Biol.68:793-806；和Hipp JD等,(2000)In Vivo 14:571-85。

可通过如下方式在患者体内有效地诱导杀伤性T细胞：在体外将抗原肽添加至从患者收集的细胞或来自另一个与之共有部分HLA等位基因的个体的细胞(同种异体细胞(allogeneic cell))，并呈递抗原，然后将这些细胞血管内施用给患者或局部施用到肿瘤处等。或者，通过将肽添加至患者的外周血淋巴细胞并在体外培养它们而在体外诱导杀伤T细胞，而后可将这些细胞可以血管内施用给患者或局部施用到肿瘤处等。这样的细胞转移治疗已经被实施作为癌症治疗，并且是本领域技术人员中熟知的一种方法。

本发明的癌症类型无特别限制，具体的例子包括食道癌、乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌、胰腺癌、恶性黑素瘤(黑素瘤)、恶性淋巴瘤、骨肉瘤、嗜铬细胞瘤、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、脑肿瘤、慢性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、肉瘤等。适合应用本发明的癌症的实例包括胆管癌、肺癌、胰腺癌和膀胱癌。

(3)本发明的抗体

本发明还涉及能够识别作为表位(抗原)的本发明上述的肽的一部分或完整的肽的抗体，并涉及通过使用该蛋白或该肽体外刺激而诱导的杀伤T细胞。通常，杀伤T细胞显示出比抗体更强的抗肿瘤活性。

此外，与本发明的肽相似，本发明抗体可用作针对表达FOXM1的癌症的预防剂和/或治疗剂，只要这些抗体能抑制FOXM1癌症抗原的活性。在实际应用中，本发明的肽或抗体可以按原样施用，或通过与可药用载体和/或稀释剂，视需要加上佐剂，一起注射施用。或者，它们可以通过喷雾方法等经粘膜通过透皮吸收施用。更具体地，在本申请中，人血清白蛋白是载体的实例；而PBS、无菌水等是稀释剂的实例。

本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并可以用本领域技术人员已知的方法来生产。

例如，多克隆抗体可通过如下获得：用本发明的肽作为抗原免疫哺乳动物或鸟类物种，并从哺乳动物或鸟类物种收集血液，从收集的血液中分离和纯化抗体。例如，可免疫哺乳动物，如小鼠、仓鼠、豚鼠、家禽(chicken)、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊和牛、或鸟类物种。免疫的方法是本领域技术人员已知的，抗原可例如在例如7到30天的间隔施用2到3次。剂量可以是，例如，每次施用约0.05毫克到2毫克的抗原。对施用途径没有特定限制，且可以合适地选自皮下施用、皮内施用、腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用等。此外，抗原可以在溶解于适当的缓冲液，例如，含常规的佐剂如弗氏完全佐剂或氢氧化铝的缓冲液后施用。

将经免疫的哺乳动物或鸟类物种饲养一段时间后，当抗体效价增加时，可将另外用例如100微克到1000微克的抗原对它们进行免疫。最后施用后一到两个月，可从经免疫的哺乳动物或鸟类物种收集血液，血液可以通过常规方法来分离，来获得识别本发明肽的多克隆抗体作为多克隆抗血清，所述的常规方法如离心、用硫酸铵或聚乙二醇沉淀、层析如凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

在另一方面，单克隆抗体可以通过制备杂交瘤获得。例如，杂交瘤细胞可以通过将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合而获得。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以通过细胞融合方法获得，如下文所示的方法。

使用来自于经免疫动物的脾细胞、淋巴结细胞、B淋巴细胞等作为产生抗体的细胞。将本发明的肽用作抗原。可用小鼠和大鼠等动物作为免疫动物，将抗原施用于这些动物可通过常规方法来进行。例如，通过将作为抗原的本发明的肽的悬浮液或乳剂与佐剂如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂以静脉内、皮下、皮内、腹膜内等施用于动物几次来免疫动物。从经免疫动物中获得产生抗体的细胞，如脾细胞，并可以通过已知方法(G.Kohler等,Nature,256,495(1975))将它们与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。

对于小鼠，用于细胞融合的杂交瘤细胞系的实例包括，例如，P3X63Ag8、P3U1、Sp2/0等。将融合促进剂如聚乙二醇和仙台病毒用于细胞融合，而且在细胞融合后将次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培养基用于通过常规方法选择杂交瘤。通过细胞融合获得的杂交瘤可以通过有限稀释法等进行克隆。根据需要，产生特异识别本发明肽的单克隆抗体的细胞系可以通过使用本发明的肽在以酶免疫测定方法的筛选中获得。

除上述方法之外，可以通过使用本发明的肽、表达所述肽的细胞、或其裂解物体外刺激人淋巴细胞(如感染了EB病毒的淋巴细胞)来调节免疫细胞。可与本发明的肽结合的人抗体可以通过将经免疫的淋巴细胞与人来源的骨髓瘤细胞如U266(特开昭63-17688(未审查、已公开的日本专利申请))进行融合来获得。

为了从这样获得的杂交瘤产生需要的单克隆抗体，可以用常规培养方法或腹水形成方法培养杂交瘤，并可以从培养物上清液或腹水中纯化单克隆抗体。从培养物上清液或腹水中纯化单克隆抗体可以通过常规方法进行。例如，可将硫酸铵分级、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等合适地组合和使用。

可以使用本发明肽，表达所述肽的细胞、或其裂解物来免疫具有一组人抗体基因的转基因动物。可以从经免疫的转基因动物中收集产生抗体的细胞，并将它们与上述骨髓瘤细胞系融合以获得杂交瘤。然后可以从杂交瘤中产生需要的单克隆抗体(WO92/03918；WO94/02602；WO94/25585；WO94/33735；WO96/34096)。

此外，也可以使用癌基因使产生抗体的免疫细胞(如经免疫的淋巴细胞)永生化，并用来制备单克隆抗体。

这样获得的单克隆抗体也可以使用基因操作技术(Borrbaeck和Larrick,(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies)进行调节。例如，可通过从产生抗体的细胞(如杂交瘤和经免疫的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，将其插入合适的载体，和将后者引入宿主细胞来制备重组抗体。

本发明的抗体还可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它们可与本发明的肽结合即可。抗体片段可以是Fab、F(ab’)₂、Fv、或单链Fv(scFv)，其中其中scFv中源自H和L链的Fv片段以合适的接头连接在一起(Huston等,(1998)Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83)。更具体地，可通过用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Co等,(1994)J Immunol 152:2968-76；Better和Horwitz,(1989)Methods Enzymol 178:476-96；Pluckthun和Skerra,(1989)Methods Emzymol178:497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol 121:652-63；Rousseaux等,(1986)Methods Enzymol 121:663-9；Bird和Walker,(1991)Trends Biotech 9:132-7)处理抗体来制备抗体片段。

本发明的抗体包括通过将抗体与多种分子如聚乙二醇(PEG)结合而获得的修饰抗体。可通过本技术领域已知的常规的化学修饰方法来进行修饰抗体。

本发明的抗体包括嵌合抗体和人源化抗体，嵌合抗体包含源自非人抗体的可变区和源自人抗体的恒定区，人源化抗体包括源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)和源自人抗体的恒定区。这样的抗体可以用本技术领域已知的常规方法制备。人源化抗体通过用具有需要的结合活性的啮齿动物的CDR区取代人抗体的CDR序列区而获得(Verhoeyen等,(1988)Science 239:1534-6)。因此，与嵌合抗体相比，人源化抗体是其中人抗体的较小区域被非人来源的相应区域取代而获得的抗体。

还可以制备除人源框架区和恒定区外还具有人源可变区的完整人抗体。例如，在一种体外方法中，可以使用展示人抗体片段的噬菌体重组文库来进行筛选(Hoogenboom和Winter,(1992)J Mol Biol 227:381-8)。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物来产生人抗体(US6,150,584、US5,545,807、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425和US5,661,016)。

如上所述获得的抗体可通过本领域的常规方法纯化至均质。例如，可以使用普通的蛋白质分离和纯化方法。可通过柱层析法如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等的组合来分离和纯化抗体；然而，分离和纯化方法不限于此(Antibodies:A Laboratory Manual,Ed Harlow和David Lane,(1988)Cold SpringHarbor Laboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。蛋白A柱用的实例包括HyperD、POROS和Sepharose F.F(Pharmacia)。

除了亲和层析外，层析的实例包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.等)。液相色谱如HPLC和FPLC也可以用于层析。

本发明抗体的抗原结合亲和力可使用，例如，吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)和免疫荧光测定法来测量；然而，方法不限于此。对于ELISA，将本发明的抗体固定在平板上，加入本发明的肽，然后加入含有产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化抗体的样本。随后，加入可识别并检测其抗原结合亲和力待测的抗体的标记的第二抗体。洗涤平板后，加入用于检测第二抗体的标记的试剂，并测量吸光度等。例如，酶如碱性磷酸酶可以用作第二抗体的标记物，酶底物如磷酸对硝基苯酯可用作检测试剂。BIAcore(Pharmacia)也可以用于评估抗体活性。

本发明的抗体可检测包含在样品中的本发明的肽。具体地，例如，可通过将癌组织的活检样本与本发明的抗体接触来确认本发明的肽在癌组织中的存在。

在将本发明肽用于癌症的治疗性和/或预防性处理之前，可能的是通过使用本发明的抗体评价本发明肽在将待治疗的癌症中的表达，在治疗开始前预测效果在测试受试者中是否有希望。

此外，由于本发明抗体识别FOXM1肽片段，而该肽的表达在多种癌细胞中增加，所以预期它们的应用不仅可用于诊断中而且还用于治疗。

(4)辅助T细胞，杀伤T细胞，或包含它们的免疫细胞群

本发明还涉及通过用本发明的肽体外刺激诱导的杀伤T细胞和辅助T细胞，或包含杀伤T细胞和辅助T细胞的免疫细胞群。例如，当使用本发明肽在体外刺激外周血淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞时，可诱导出肿瘤反应性的活化T细胞，这些活化T细胞可有效地用于过继免疫治疗(adoptive immunotherapy)，其中将所述细胞血管内施用于癌症患者、局部施用于肿瘤等。或者，作为强力的抗原呈递细胞，树突细胞也可以用本发明肽进行冲激或经遗传转化以表达所述肽，并可通过使用这些树突细胞在体内或体外刺激T细胞来诱导抗肿瘤免疫应答。

优选通过使用本发明的肽和佐剂进行体内或体外刺激，来诱导杀伤T细胞、辅助T细胞或包含它们的免疫细胞群。本申请使用的佐剂的实例包括矿物油、氢氧化铝、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)制剂、溶血性链球菌属(hemolytic Streptococcus)制剂、多孔菌科(Polyporaceae)制剂、其他佐剂、细胞生长因子和细胞因子。

可通过输注由此获得的辅助T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞群，包括将它们向癌症患者血管内、向肿瘤局部输注等，来抑制肿瘤并且预防和/或治疗癌症。

如上所述可抑制肿瘤的杀伤T细胞、辅助T细胞，或包含它们的免疫细胞群，可使用本发明的肽来产生。因此，本发明提供含有本发明肽的细胞培养基。可使用细胞培养基制备能抑制肿瘤的杀伤T细胞、辅助T细胞，或包含它们的免疫细胞群。此外，本发明提供用于生成杀伤T细胞、辅助T细胞，或包含它们的免疫细胞群的细胞培养试剂盒，包括上述细胞培养基和细胞培养容器。

(5)抗原呈递外来体

本发明进一步提供一种称为“外来体”(exosome)的细胞内小泡，该外来体将由本发明肽和HLA抗原形成的复合物呈递到其表面。外来体可以使用例如在第平11-510507号(对应于非日语国际公开的未审查的日本国家阶段公布)和第2000-512161号中公开的日语译文中详细描述的方法进行制备。优选地，可使用从治疗和/或预防的受试者获得的抗原呈递细胞来制备外来体。可将本发明的外来体以与本发明肽相似的方式作为癌症疫苗进行注射。

在本发明中使用的HLA抗原类型应该与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型相匹配。例如HLA抗原类型是HLA-A2，并优选为HLA-A2(HLA-A*0201)。“HLA-A2”表示蛋白，而“(HLA-A*0201)”表示与该蛋白的区段相对应的基因(因为目前没有表示该蛋白区段的术语)。

(6)诱导抗原呈递细胞和杀伤T细胞的方法

本发明提供使用一种或多种本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。可通过使一种或多种本发明的肽接触由外周血单核细胞诱导的树突细胞以刺激树突细胞，从而诱导抗原呈递细胞。当对受试者施用本发明的肽时，可以在受试者体内诱导出在其表面呈递本发明的肽的抗原呈递细胞。或者，可使用回体方法，其中将抗原呈递细胞与本发明的肽接触(或用本发明的肽冲激抗原呈递细胞)，然后将细胞作为疫苗施用于受试者。例如，回体施用方法可包括如下步骤：

(1)从受试者收集抗原呈递细胞；和

(2)使步骤(1)中的抗原呈递细胞接触本发明的肽(或用本发明肽冲激步骤(1)的抗原呈递细胞)。

可将步骤(2)中获得的抗原呈递细胞作为疫苗施用于受试者。

本发明还提供诱导显示杀伤T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法。这种方法包括用包含编码一种或多种本发明肽的多核苷酸的基因体外转染抗原呈递细胞的步骤。要转染的基因可以是DNA或RNA。对于转染，可合适地使用本领域常规进行的多种方法，如脂质转染、电穿孔和磷酸钙方法，但所述方法不限于此。更具体地，转染可如Reeves ME等,(1996)Cancer Res.,56:5672-7；Butterfield LH等,(1998)J.Immunol.,161:5607-13；Boczkowski D等,(1996)J Exp.Med.,184:465-72；和公开的WO2000/509281日语译文中所述进行。当基因转染入抗原呈递细胞时，它们在细胞内被转录和翻译。随后所得的蛋白质经由MHC I类或II类途径进行加工，并经过抗原呈递途径作为部分肽呈递在抗原呈递细胞的表面。

本发明还提供使用一种或多种本发明肽诱导杀伤T细胞的方法。通过将一种或多种本发明肽施用于受试者，可在受试者体内诱导出杀伤T细胞，从而加强靶向在肿瘤组织中呈递FOXM1的癌细胞的免疫系统。或者，可通过在体外使来自受试者的抗原呈递细胞和CD8阳性细胞与一种或多种本发明肽接触，并通过在体外使外周血单核白细胞与抗原呈递细胞接触来刺激细胞，从而诱导活化的杀伤T细胞。在回体治疗方法中，可通过将活化的杀伤T细胞回输(return)入受试者体内来增强靶向受试者癌组织中呈递FOXM1的癌细胞的免疫系统。例如，此方法包括如下步骤：

(1)从受试者收集抗原呈递细胞；

(2)使步骤(1)中的抗原呈递细胞接触本发明的肽(或用本发明的肽冲激步骤(1)的抗原呈递细胞)；

(3)将步骤(2)中的抗原呈递细胞与CD8⁺T细胞混合并共培养来诱导细胞毒性T细胞；和

(4)从步骤(3)的共培养物中收集CD8⁺T细胞。

从步骤(4)中获得的具有细胞毒活性的CD8⁺T细胞可以作为疫苗施用于受试者。

本发明还提供用一种或多种本发明的肽诱导的分离的杀伤T细胞。优选地，通过本发明的方法诱导的杀伤T细胞源自接受治疗和/或预防的受试者。可将所述细胞与其他包含呈递本发明一种或多种肽的抗原呈递细胞或外来体的药剂组合施用。获得的杀伤T细胞对于呈递与诱导所用的肽相同的肽的靶细胞是特异性的。靶细胞是内源性表达FOXM1的细胞或者是用FOXM1基因转染的细胞。通过用本发明的肽进行刺激，在其表面呈递本发明的肽的细胞，如来自胰腺癌、胆管细胞癌、胃癌、结肠癌、非小细胞肺癌、睾丸癌、子宫颈癌、骨肉瘤和软组织肉瘤的癌细胞，可以是攻击的目标。

本发明还提供呈递以HLA抗原和一种或多种本发明肽形成的复合物的抗原呈递细胞。优选从接受治疗和/或预防的受试者收集表达一种或多种本发明的肽或编码这些肽的核苷酸的抗原呈递细胞。本发明的肽、呈递此肽的抗原呈递细胞、外来体、或活化的杀伤T细胞，可以作为疫苗与其他药剂组合施用。

将参考下面的实施例进一步说明本发明；然而，不应理解为受限于这些实施例。

本说明书中引用的所有现有技术参考文件均通过提述并入本文。

本发明涉及：

1.下面(A)或(B)的肽：

(A)包含SEQ ID NO:1至3中任一氨基酸序列的肽；

2.项1的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。

3.项1的肽，其中C-末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。

4.一种用于诱导针对癌症的免疫力的试剂，其包含一种或多种项1的肽作为活性成分。

5.一种用于治疗和/或预防癌症的药剂，其包含一种或多种项1的肽作为活性成分。

6.一种用于诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种项1的肽作为活性成分。

7.一种用于诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种编码项1的肽的多核苷酸作为活性成分。

8.一种用于诱导细胞毒性(杀伤)T细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种项1的肽作为活性成分。

9.针对项1的肽的抗体。

10.使用项1的肽诱导的细胞毒性(杀伤)T细胞、辅助T细胞或包含它们的免疫细胞群体。

11.一种抗原呈递细胞，其呈递包含项1的肽及HLA抗原的复合物。

12.项11的抗原呈递细胞，其是通过项6或7的药剂诱导的。

13.一种外来体，其呈递包含项1的肽及HLA抗原的复合物。

14.项13的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A2*0201)。

15.一种诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将抗原呈递细胞与项1的肽接触的步骤。

16.一种诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将编码项1的肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞的步骤。

17.一种诱导细胞毒性(杀伤)T细胞的方法，其包括将T细胞与项1的肽接触的步骤。

18.一种诱导针对癌症的免疫力的方法，其包括将项1的肽施用于受试者的步骤。

19.一种治疗和/或预防癌症的方法，其包括将项1的肽施用于受试者的步骤。

20.项1的肽用于制备诱导针对癌症的免疫力的试剂的用途。

21.项1的肽用于制备治疗和/或预防癌症的药剂的用途。

22.项1的肽，其用于诱导针对癌症的免疫力。

23.项1的肽，其用于治疗和/或预防癌症。

实施例

[实施例1]

(1)选择显示与HLA-A2有亲和力的FOXM1肽

使用BIMAS系统分析人FOXM1的氨基酸序列，并选择了预计与20种以上HLA-A2具有结合亲和力的23种。

[表1-1]

在本发明中鉴定的HLA-A2限制性人杀伤T细胞表位加有下划线。

[实施例2]

通过HLA-A2结合性FOXM1肽诱导人杀伤T细胞

(1)血液收集

经知情同意从健康个体和正在熊本大学医学部附属医院(Kumamoto UniversityMedical School Hospital)经受治疗的HLA-A2阳性乳腺癌患者收集血液样品(50ml)。然后，根据先前报道的方法(Nakatsura,T.等,Eur.J.Immunol.32,826-836,2002)使用Ficoll-Conray密度梯度离心方法分离外周血单核细胞。

(2)从外周血单核细胞分离CD8阳性细胞和诱导杀伤T细胞

由分离的外周血单核细胞诱导FOXM1肽特异性杀伤T细胞。根据Komori,H.等的报道(Komori,H.等,Clin.Cancer.Res.12:2689-2697,2006)诱导杀伤T细胞。首先，使用MACS分离外周血单核细胞中的CD8阳性细胞。在GM-CSF(100ng/mL)和IL-4(20ng/mL)存在的条件下将CD8阴性细胞培养四天用于分化成树突细胞。此后，加入OK-432(0.1KE/mL)用于树突细胞的成熟。在第七天，加入每种FOXM1肽(10μM)，然后在IL-7(10ng/mL)存在的条件下将树突细胞与CD8阳性细胞一起共培养。在与CD8阳性细胞一起共培养两天后，加入IL-2(20IU/mL)。用源自自体CD8阴性细胞的树突细胞进行的抗原刺激，以一周为间隔重复三次，来诱导肽特异性杀伤T细胞。

(3)通过ELISPOT测定法检查FOXM1-特异性杀伤T细胞活性：

使用ELISPOT测定，考察由FOXM1肽诱导的杀伤T细胞是否确实特异性地与这些源自FOXM1的肽反应而产生IFN-γ。ELISPOT测定通过先前报道的方法(Komori,H.等,Clin.Cancer.Res.12:2689-2697,2006)进行。结果，对于用FOXM1362-370、373-382和640-649肽诱导的杀伤T细胞观察到FOXM1肽特异性的杀伤T细胞活化(图1)。图1显示分析FOXM1肽诱导的杀伤T细胞所得到的代表性结果。

(4)通过细胞毒性测试检查杀伤T细胞的细胞毒活性

通过细胞毒性测试来检查诱导的FOXM1肽-特异性杀伤T细胞的细胞毒活性，使用HLA-A2阳性且表达FOXM1的细胞系panc-1和HLA-A2阴性且表达FOXM1的胰腺癌细胞系PK-8作为刺激细胞。使用细胞毒性测试通过铬释放测定法评价杀伤T细胞的细胞毒活性。使用先前报道的方法(Monji,M.等,Clin.Cancer.Res.10:6047-6057,2004)进行铬释放测定。结果，对于用FOXM1362-370、373-382和640-649肽诱导的杀伤T细胞，观察到HLA-A2限制性和FOXM1-特异性细胞毒活性(图1)。

工业实用性

在本发明中，通过鉴定可结合于HLA-A2并活化癌细胞-损害性杀伤T细胞的FOXM1肽，开发了可靶向大约30％的患有高表达FOXM1的胆管癌、肺癌、胰腺癌等的日本人癌症患者的癌症肽疫苗。如果通过HLA-A2呈递于杀伤T细胞的FOXM1肽的有效性可以在探索医疗中证实，那么可改进临床应用于白种人的可能性。通过鉴定由HLA-A2(其在白种人中的阳性频率很高)呈递于杀伤T细胞的肽，可将肽不仅施用于大约30％的患有高表达FOXM1的癌症的日本患者，而且还可施用于很多白种人癌症患者。

Claims

1.由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽。

2.一种用于诱导针对表达FOXM1和HLA-A2的癌症的免疫力的试剂，其包含权利要求1的肽作为活性成分。

3.一种用于治疗和/或预防表达FOXM1和HLA-A2的癌症的药剂，其包含权利要求1的肽作为活性成分。

4.一种用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含权利要求1的肽作为活性成分。

5.一种用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种编码权利要求1的肽的多核苷酸作为活性成分。

6.一种用于诱导细胞毒性T细胞的药剂，其中所述药剂包含权利要求1的肽作为活性成分。

7.针对权利要求1的肽的抗体。

8.使用权利要求1的肽诱导的细胞毒性T细胞、辅助T细胞或包含它们的免疫细胞群体。

9.一种抗原呈递细胞，其呈递包含权利要求1的肽及HLA抗原的复合物。

10.权利要求9的抗原呈递细胞，其是通过权利要求4或5的药剂诱导的。

11.一种外来体，其呈递包含权利要求1的肽及HLA-A2的复合物。

12.一种体外诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将抗原呈递细胞与权利要求1的肽接触的步骤。

13.一种体外诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将编码权利要求1的肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞的步骤。

14.一种体外诱导细胞毒性T细胞的方法，其包括将T细胞与权利要求1的肽接触的步骤。

15.权利要求1的肽用于制备诱导针对表达FOXM1和HLA-A2的癌症的免疫力的试剂的用途。

16.权利要求1的肽用于制备治疗和/或预防表达FOXM1和HLA-A2的癌症的药剂的用途。

17.权利要求1的肽在制备用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的试剂中的用途。

18.编码权利要求1的肽的多核苷酸在制备用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的试剂中的用途。

19.权利要求1的肽在制备用于诱导细胞毒性T细胞的试剂中的用途。