CN104761736B - 一种不对称结构的交联透明质酸钠凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种不对称结构的交联透明质酸钠凝胶的制备方法。该方法采用含有交联剂的透明质酸钠溶液为起始物，加入极少量的交联剂，恒温恒湿条件下梯度浓缩脱水，然后将交联透明质酸钠凝胶在缓冲液中进行透析，透析至凝胶不再膨胀，最后进行制粒得到不对称结构的交联透明透明质凝胶。通过本发明提供的制备方法得到的交联透明质酸钠在微观上具有梯度不对称结构，呈现出外部致密，内部疏松的特点，该结构保证了交联透明质酸钠凝胶可以有效缓冲透明质酸钠酶的攻击作用，大大延长了体内残存时间，同时极少的交联剂加入量也表现优良的生物安全性。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，是一种涉及一种新型交联透明质酸钠的制备方法，该交联透明质酸钠用于医学填充美容，属于医疗领域。
背景技术
透明质酸钠是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，它由(1－β－4) D－葡糖醛酸和(1－β－3)N－乙酰基－D－氨基葡糖双糖单位重复连接而成，广泛使用在修复手术、眼部手术或作为美容填充材料。透明质酸钠具有良好的理化性能及生物相容性，但在体内受到专一性透明质酸酶的作用而迅速降解，半衰期仅为2-3天，存留时间较短，无法满足临床应用需求。交联透明质酸钠是透明质酸钠通过化学交联修饰得到的高分子凝胶，弥补了透明质酸钠存留时间短的弊端，同时保留了天然透明质酸钠良好的生物相容性。
在制备交联透明质酸钠凝胶的过程中，通常采用的交联剂为二乙烯基砜（DVS）、1，4-丁二醇双缩水甘油醚（BDDE）等。上市产品也是以这两种交联剂为主，如DVS交联透明质酸钠产品：VarioDerm、Hylaform、Captique等，BDDE交联透明质酸钠产品：Restylane、Juvederm 、Esthelis等。两种交联透明质酸钠产品最主要的区别便是DVS交联透明质酸钠的质地较硬，而BDDE交联透明质酸钠的质地较软；DVS交联透明质酸钠产品交联度较高，最终产品达到了透析平衡，而BDDE交联透明质酸钠产品的交联度较低，最终产品在体内可以继续膨胀。
上述两种主要的交联剂均为化学活性试剂，都具有毒性或致癌性，未反应的交联剂进入体内，或多或少存在风险；在现有的制备工艺在透析过程中，由于交联后的透明质酸钠凝胶为三维网状立体结构，交联剂包埋其中，很难去除干净；对于DVS交联类透明质酸钠凝胶可以通过延长透析时间来达到最大程度的去除，而对于BDDE交联类透明质酸钠凝胶则是不可行的，因为该类产品最终是达不到透析平衡的，如果延长时间，最终产品的浓度会大大降低，无法满足临床使用需求。因此，对于BDDE交联透明质酸钠产品急需解决的一个难题便是极低的BDDE残留量与最佳的产品的体内残留时间之间的选择与平衡。
通常制备交联透明质酸钠凝胶都是采用固定的反应物浓度进行反应，这样的反应，交联剂的利用率较低，为了到达较好的交联效果，通常加入较多的交联剂进行反应，如此对的交联剂的去除造成更大的困难。
针对以上问题，我们发明了一种交联透明质酸钠的制备工艺，本发明专门针对BDDE交联透明质酸钠凝胶的制备，本工艺采用反应浓度的梯度浓缩方式，从根本上通过降低交联剂的使用量，加入低量的BDDE交联剂，来解决最终交联剂的残留量，同时通过该工艺制备的凝胶在微观上具有梯度结构，外部致密，内部疏松，可以有效的抗透明质酸酶的作用，延长残存时间，且最终产品为透析平衡的凝胶，体内不会发生继续吸水膨胀。
发明内容
本发明的优点
1.加入低量的BDDE交联剂，得到远优于其他工艺同等交联剂加入量的体内残留时间的产品。
2.采用反应物浓度的梯度浓缩的方式，提高BDDE的利用率，最终提高产品的交联度，提升产品的抗酶降能力。
3.采用本发明提供的制备工艺制备的交联透明质酸钠凝胶具有微观结构的不对称性，即表面为致密结构，内部为疏松结构，该结构可以有效地缓冲透明质酸钠酶的攻击作用，获得较长的体内残留时间。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案为：
第一步：交联溶液配制；
第二步：透明质酸钠溶解；
第三步：恒温恒湿条件下的梯度浓缩脱水；
第四步：升高温度二次交联反应；
第五步：透析、制粒。
附图说明
图1 不同梯度浓缩脱水率对透明质酸钠酶的耐受性结果
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作了详细描述：
实施例一
配制1%的氢氧化钠水溶液20ml，加入交联剂BDDE 0.02g，混合均匀后，加入2.0g透明质酸钠，搅拌均匀后，放入10℃反应箱中，设置脱水率为3%/天，反应10天后，再放入40℃水浴锅，加热2h后，取出切成质量为0.5g左右的凝胶，放入PBS缓冲液中，膨胀透析，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20mg/ml。
实施例二
配制1%的氢氧化钠水溶液20ml，加入交联剂BDDE 0.01g，混合均匀后，加入2.0g透明质酸钠，搅拌均匀后，放入10℃反应箱中，设置脱水率为4%/天，反应10天后，再放入40℃水浴锅，加热2h后，取出切成质量为0.5g左右的凝胶，放入PBS缓冲液中，膨胀透析，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20mg/ml。
实施例三
配制1.5%的氢氧化钠水溶液20ml，加入交联剂BDDE 0.007g，混合均匀后，加入2.0g透明质酸钠，搅拌均匀后，放入10℃反应箱中，设置脱水率为5%/天，反应10天后，再放入40℃水浴锅，加热2h后，取出切成质量为0.5g左右的凝胶，放入PBS缓冲液中，膨胀透析，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20mg/ml。
实施例四
配制1%的氢氧化钠水溶液20ml，加入交联剂BDDE 0.005g，混合均匀后，加入2.0g透明质酸钠，搅拌均匀后，放入10℃反应箱中，设置脱水率为4%/天，反应12天后，再放入40℃水浴锅，加热2h后，取出切成质量为0.5g左右的凝胶，放入PBS缓冲液中，膨胀透析，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20mg/ml。
实施例五
分别将实施例一到四制得的样品1、2、3、4与对照样品（对照样品采用2.0g透明质酸钠，加BDDE 0.03g，0脱水率，其它条件相同，反应制得），置于压力挤压装置中，设置挤压孔径为400μm，挤压制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶微粒，然后混合九分之一的未交联、浓度为20mg/ml的透明质酸钠凝胶，混合均匀后，装入10ml西林瓶中，加盖后，121℃高压灭菌20min。
将灭菌好的交联透明质酸钠凝胶用透明质酸酶降解处理后，取酶降解液，与尼克酰胺混合后，37℃水浴120min，再加入氢氧化钾与苯乙酮的混合溶液，冰浴10min后，加入甲酸溶液，60℃水浴5min，待冷却后，测定荧光值。同样方法，处理BDDE不同浓度标准溶液，测定荧光值，绘制标准曲线，得到检测样品中BDDE残留值。
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 对照 | |
| BDDE残留（ppm） | 2.14 | 2.00 | 1.99 | 1.55 | 3.1 |
实施例六
由实施例一、二、三、四得到的样品及对照品经蒸汽灭菌，(121℃、20min) 后。取凝胶0.32g，加入透明质酸酶液8ml (240UI)；同样取对照样品0.32g，加入透明质酸酶液8ml(240UI) , 37℃水浴2、4、6、16、24h，离心取透过液测定糖醛酸含量，绘制降解曲线。所得曲线见附图1。
Claims (6)
1.一种结构不对称的交联透明质酸钠的制备方法，其主要特征为微观结构不对称，即凝胶表面致密，内部疏松；其制备过程在于配制一定浓度的含有一定比例交联剂的透明质酸钠碱性溶液，置于恒温恒湿培养箱内进行浓度的梯度浓缩，控制一定的脱水率，浓缩完成后取出凝胶进行透析，透析至终点后进行制粒，得到结构不对称的交联透明质酸钠凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种结构不对称的交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于：所述的一定比例是指交联剂与加入的透明质酸钠干粉的质量比，其范围为1/100～1/1000。
3.根据权利要求1所述的一种结构不对称的交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于：所述的恒温恒湿是指恒定的温度和湿度，温度范围为2-10℃，湿度范围为40-80％。
4.根据权利要求1所述的一种结构不对称的交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于：所述的脱水率是指蒸发的水分占交联反应前加入溶剂的比例，其范围为40-60％。
5.根据权利要求1所述的一种结构不对称的交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于：所述的浓缩完成是指反应溶液的质量体积浓度范围达40-60％时结束浓缩。
6.根据权利要求1所述的一种结构不对称的交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于：所述的透析至终点是指凝胶透析至凝胶不再膨胀，重量不再增加。
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