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CN104714027B - 一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于钯三脚架对双氧水有良好的电化学催化能力和电子转移能力，显著提高了生物传感器的灵敏度，检测限可达到1.5fg/mL，对心肌损伤的早期诊断具有重要的意义。

Description

一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好电催化性能的钯三脚架，制备一种检测肌红蛋白的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
心肌蛋白是一种氧结合蛋白，广泛存在于骨骼肌、心肌、平滑肌，约占肌肉中所有蛋白的2%。心肌蛋白的分子量小且位于细胞质内，从病理生理学角度讲，心脏标志物出现早晚与分子大小及在细胞中存在部位有关。标志物分子量越小，越容易透过细胞间隙至血液，细胞质内高浓度物质比核内或线粒体内物质及结构蛋白更早在血中出现。因此心肌蛋白在心肌损伤时，出现较早，到目前为止，肌红蛋白是急性心梗发生后最早的可测心肌损伤标志物。
目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，因为电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记电化学免疫传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。
本发明将钯三脚架修饰到玻碳电极表面，构建无标记电化学免疫传感器。一方面，钯三脚架具有立体结构和良好的生物相容性，能够有效地固定抗体；另一方面，钯三脚架具有良好的电子转移能力和电化学催化活性，能够提高传感器的灵敏度。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于心肌蛋白的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测心肌蛋白提供了新途径。
发明内容
本发明的目的之一是基于钯三脚架，构建了一种无电子媒介体、无标记的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该无标记电化学传感器应用于心肌蛋白的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下
1.一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1~2mg/mL的钯三脚架水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为8~12μg/mL的肌红蛋白检测抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为5~15mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.000003~3ng/mL的一系列不同浓度的肌红蛋白抗原用于和检测抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
钯三脚架的制备
制备方法，所述钯三脚架的制备，其特征在于，包括以下步骤：
在50~100mL超纯水中溶解0.0355g氯化钯和0.876g氯化钠，得到浓度为2~4mmol/L的氯化钯溶液，将0.0546~0.1092g十六烷基三甲基溴化铵溶解在装有9.475~18.95mL超纯水的试剂瓶中，随后，向其中加入1.25~2.5mL制备的氯化钯溶液和25~50μL浓度为4mmol/L乙酸铜，震荡5s，将该试剂瓶至于30℃的水浴中，然后加入250~500μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸，继续在水浴中静置3h，最后溶液变为深灰色，离心洗涤后，得到钯三脚架。
肌红蛋白抗原的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对肌红蛋白抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替肌红蛋白抗原标准溶液进行检测。
所述肌红蛋白抗原是一种是心肌梗死的标志物。
本发明的有益成果
（1）本发明采用钯三脚架通过形成钯氮键化学键合至玻碳电极表面，增强了电子的传递效率，放大了电化学信号。
（2）本发明采用的钯三脚架具有立体结构，能够有效固定大量的抗体，使传感器的稳定性加强。
（3）本发明采用的钯三脚架较普通的钯纳米颗粒对双氧水具有更强的电化学催化性能，提高了免疫传感器的灵敏度，比通常的功能材料至少提高1~2个数量级，检测限可达到1.5fg/mL。
（4）本发明将制备的无标记电化学免疫传感器用于心肌蛋白的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1mg/mL的钯三脚架水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为8μg/mL的肌红蛋白检测抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.000003~3ng/mL的一系列不同浓度的肌红蛋白抗原用于和检测抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例2一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1.5mg/mL的钯三脚架水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为10μg/mL的肌红蛋白检测抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.000003~3ng/mL的一系列不同浓度的肌红蛋白抗原用于和检测抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例3一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为2mg/mL的钯三脚架水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为12μg/mL的肌红蛋白检测抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为15mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.000003~3ng/mL的一系列不同浓度的肌红蛋白抗原用于和检测抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例4钯三脚架的制备
制备方法，所述钯三脚架的制备，其特征在于，包括以下步骤：
在50mL超纯水中溶解0.0355g氯化钯和0.876g氯化钠，得到浓度为2mmol/L的氯化钯溶液，将0.0546g十六烷基三甲基溴化铵溶解在装有9.475mL超纯水的试剂瓶中，随后，向其中加入1.25mL制备的氯化钯溶液和25μL浓度为4mmol/L乙酸铜，震荡5s，将该试剂瓶至于30℃的水浴中，然后加入250μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸，继续在水浴中静置3h，最后溶液变为深灰色，离心洗涤后，得到钯三脚架。
实施例5钯三脚架的制备
制备方法，所述钯三脚架的制备，其特征在于，包括以下步骤：
在75mL超纯水中溶解0.0355g氯化钯和0.876g氯化钠，得到浓度为3mmol/L的氯化钯溶液，将0.0819g十六烷基三甲基溴化铵溶解在装有14.21mL超纯水的试剂瓶中，随后，向其中加入1.875mL制备的氯化钯溶液和37.5μL浓度为4mmol/L乙酸铜，震荡5s，将该试剂瓶至于30℃的水浴中，然后加入375μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸，继续在水浴中静置3h，最后溶液变为深灰色，离心洗涤后，得到钯三脚架。
实施例6钯三脚架的制备
制备方法，所述钯三脚架的制备，其特征在于，包括以下步骤：
在100mL超纯水中溶解0.0355g氯化钯和0.876g氯化钠，得到浓度为4mmol/L的氯化钯溶液，将0.1092g十六烷基三甲基溴化铵溶解在装有18.95mL超纯水的试剂瓶中，随后，向其中加入2.5mL制备的氯化钯溶液和50μL浓度为4mmol/L乙酸铜，震荡5s，将该试剂瓶至于30℃的水浴中，然后加入500μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸，继续在水浴中静置3h，最后溶液变为深灰色，离心洗涤后，得到钯三脚架。
实施例7肌红蛋白抗原的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对肌红蛋白抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替肌红蛋白抗原标准溶液进行检测。
（5）该电化学免疫传感器对癌胚抗原检测线性范围为0.000003~3ng/mL，检测限1.5fg/mL。

Claims (2)

1.一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）钯三脚架的制备
在50~100mL超纯水中溶解0.0355g氯化钯和0.876g氯化钠，得到浓度为2~4mmol/L的氯化钯溶液，将0.0546~0.1092g十六烷基三甲基溴化铵溶解在装有9.475~18.95mL超纯水的试剂瓶中，随后，向其中加入1.25~2.5mL制备的氯化钯溶液和25~50μL浓度为4mmol/L乙酸铜，震荡5s，将该试剂瓶至于30℃的水浴中，然后加入250~500μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸，继续在水浴中静置3h，最后溶液变为深灰色，离心洗涤后，得到钯三脚架；
（2）生物传感器的制备
1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
2）在电极表面滴加6μL浓度为1~2mg/mL的钯三脚架水溶液，干燥；
3）继续将6μL浓度为8~12μg/mL的肌红蛋白检测抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
4）用3μL浓度为5~15mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
5）将6μL浓度为0.000003~3ng/mL的一系列不同浓度的肌红蛋白抗原用于和检测抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于钯三脚架构建的肌红蛋白生物传感器对肌红蛋白抗原的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对肌红蛋白抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替肌红蛋白抗原标准溶液进行检测。
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