[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN104704128A - 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法 - Google Patents

预测乳腺癌结果的nano46基因和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104704128A
CN104704128A CN201380038875.4A CN201380038875A CN104704128A CN 104704128 A CN104704128 A CN 104704128A CN 201380038875 A CN201380038875 A CN 201380038875A CN 104704128 A CN104704128 A CN 104704128A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
inherent
expression
probe
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380038875.4A
Other languages
English (en)
Inventor
S.M.费里
J.J.斯托尔霍夫
J.S.帕克
C.M.佩罗
M.J.艾利斯
P.S.伯纳德
T.O.尼尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
British Columbia Cancer Agency BCCA
University of Washington
University of North Carolina at Chapel Hill
University of Utah Research Foundation UURF
Nanostring Technologies Inc
Original Assignee
British Columbia Cancer Agency BCCA
University of Washington
University of North Carolina at Chapel Hill
University of Utah Research Foundation UURF
Nanostring Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by British Columbia Cancer Agency BCCA, University of Washington, University of North Carolina at Chapel Hill, University of Utah Research Foundation UURF, Nanostring Technologies Inc filed Critical British Columbia Cancer Agency BCCA
Priority to CN201911216650.9A priority Critical patent/CN111500718A/zh
Publication of CN104704128A publication Critical patent/CN104704128A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118Prognosis of disease development
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供用于分类和用于评价患有乳腺癌的主体的预后的方法。该方法包括使用经过训练以在乳腺癌内在亚型的基础上对主体分型的监督算法预测乳腺癌亚型。预测模型是基于表1所列内在基因的基因表达概况。进一步提供了用于预测被诊断为或者怀疑患有乳腺癌的主体的结果或对治疗的反应的组合物和方法。这些方法可用于指导或确定患有乳腺癌的主体的治疗选择。本发明的方法进一步包括用于评价基因表达概况的手段,包括微阵列和定量聚合酶链式反应测定,以及包含用于实施本发明方法的试剂的试剂盒。

Description

预测乳腺癌结果的NANO46基因和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年5月22日提交的美国临时申请No. 61/650,209和2013年1月17日提交的美国临时申请No. 61/753,673的利益。这些申请的每一个的内容通过引用将其全文合并入本文。
发明领域
本公开一般性地涉及癌症生物学领域,并且具体涉及特定癌症细胞表型的检测和鉴别以及与适当治疗的相关性领域。
发明背景
目前的治疗早期乳腺癌的方法,包括辅助治疗,确实已改善了生存并减少复发。但是,在某些患者中复发的风险可能被低估,但是在其他患者中却被高估了。
虽然随着时间经过,复发的风险的确有所减少,但在许多研究中观察到持续的风险,其中一些风险涉及数以万计的患有乳腺癌的患者。事实上,在这些研究中,一些五年后经历复发的患者先前被认为是“低风险的” - 例如,在他们的最初诊断时,他们的癌症还没有扩散到淋巴结,或者他们的雌激素受体状态是阳性的。在这些研究中的一个研究中,有大量的复发发生在治疗后五年以上。因此,在本领域中需要确定复发的风险并确定减少该风险并改善总体生存的治疗。
发明内容
本发明提供预测患有乳腺癌的主体的结果(outcome)的方法,包括:提供来自主体的肿瘤样品;确定肿瘤样品中表1的NANO46内在基因列表中的基因的表达;基于NANO46内在基因列表中的基因的表达测量肿瘤样品与内在亚型的相似性,其中内在亚型至少由基底样型(Basal-like)、管腔A型(Luminal A)、管腔B型(Luminal B)或HER2-富集型(HER2-enriched)组成;基于NANO46内在基因列表中的增殖基因子集的表达确定增殖得分;确定肿瘤大小,使用所述内在亚型,增殖得分和肿瘤大小的加权和来计算复发风险得分; 并基于复发得分确定主体是否具有低或高的复发风险。在一个实施方案中,低的得分指示更有利的结果,高的得分表示较不利的结果。
本发明的方法可以包括确定表1所述NANO46内在基因的至少一种、组合或每一个的表达。在一些实施方案中,本发明的方法可以包括确定选自ANLN、CCNE1、CDC20、CDC6、CDCA1、CENPF、CEP55、EXO1、KIF2C、KNTC2、MELK、MKI67、ORC6L、PTTG1、RRM2、TYMS、UBE2C和/或UBE2T的NANO46内在基因的至少一种、组合或每一个的表达。可以使用nanoreporter编码系统(nCounter®分析系统(nCounter® Analysis system))确定NANO46内在基因列表的成员的表达。
本发明的方法可以包括确定下列的至少一种、组合或每一个:肿瘤大小、肿瘤分级、淋巴结状况、内在亚型、雌激素受体表达、孕激素受体表达和HER2/ERBB2表达。
样品可以是细胞或组织取样。样品可以是肿瘤。可以从活组织检查获得组织。样品可以是体液取样。体液可以是血液、淋巴液、尿液、唾液或乳头抽吸液。
虽然结合其详细描述对本公开进行描述,前述描述意在举例说明,并非要限制由所附权利要求的范围定义的本公开的范围。其它方面、优点、和变形在下述权利要求的范围内。
本文提及的专利和科学文献确立了所属领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和公开的或未公开的美国专利申请通过引用合并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请通过引用合并入本文。由本文引用的登录号表示的Genbank和NCBI提交内容通过引用合并入本文。本文引用的所有其它的公开的参考文献、文档、手稿和科技文献通过引用合并入本文。
虽然参照其优选实施方案对本公开进行具体显示和描述,但所属领域技术人员会理解,可以在其中在形式和细节上进行各种改变,而不背离由所附权利要求包含的本公开的范围。
附图简述
图1是表1的乳腺癌内在亚型和内在基因的热点图。
图2显示来自未治疗的乳腺癌患者群组(cohort)的Kaplan Meier生存曲线。
图3显示来自用他莫昔芬治疗的淋巴结阴性、ER+乳腺癌患者的Kaplan Meier生存曲线。
图4显示在用他莫昔芬治疗的ER+、淋巴结阴性乳腺癌患者中作为ROR得分的函数的10年事件概率。该图显示在该人群中子人群亚型分型为管腔A型或B型。RFS = 无复发生存;DSS = 疾病特异性生存。
图5是乳腺癌内在亚型分型测定的原理图。
图6是算法过程的原理图。
图7是显示CodeSet与mRNA杂交的图示。
图8是显示除去过量报告探针(excess reporters)的图示。
图9是显示报告探针与盒(cartridge)表面结合的图示。
图10是显示报告探针固定和比对的图示。
图11是数据收集的图示。
图12是nCounter分析系统乳腺癌测试测定过程的图示。
图13是nCounter Prep 工作站的图示。
图14是nCounter数字分析仪(nCounter Digital Analyzer)的图示。
发明详述
本公开提出了预测患有乳腺癌的主体的结果的方法,包括:提供来自主体的肿瘤样品;确定肿瘤样品中表1的NANO46内在基因列表中的基因的表达;基于NANO46内在基因列表中的基因的表达确定肿瘤样品的内在亚型,其中内在亚型由至少基底样型(Basal-like)、管腔A型(Luminal A)、管腔B型(Luminal B)或HER2-富集型(HER2-enriched)组成;根据NANO46内在基因列表中的增殖基因子集的表达确定增殖得分;确定肿瘤大小,使用所述内在亚型,增殖得分和肿瘤大小的加权和来计算复发风险得分; 并基于复发得分确定主体是否具有低或高的复发风险。在一个实施方案中,低得分表示更有利的结果,而高得分表示较不利的结果。
统计选择内在基因使其在来自相同个体的生物样品重复之间的表达上具有低变异性,而在来自不同个体的样品之间的表达上具有高变异性。因此,内在基因被用作乳腺癌分类的分类器基因。虽然未使用临床信息获得乳腺癌内在亚型,但这种分类被证明具有预后意义。内在基因筛查可用于将乳腺癌分为五种分子上不同的内在亚型,管腔A型(LumA)、管腔B型(LumB)、HER2-富集型(Her-2-e)、基底样型、和正常样型(Normal-like) (Perou Nature, 406(6797):747-52 (2000); Sorlie PNAS, 98(19):10869-74 (2001))。
本文所述的NANO46基因表达测定,可以从生物样品,例如标准福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织,鉴别内在亚型。该方法根据乳腺癌内在亚型使用监督算法对主体样品进行分类。这种算法,本文中被称为NANO46分类模型,是基于内在基因的定义子集的基因表达概况,所述子集在本文中已被鉴别为用于对乳腺癌内在亚型进行分类是优越的。表1中提供了基因子集,以及用于它们的检测的引物靶-特异性序列。表1A提供了用于检测表1中使用的每一个基因的靶特异性探针序列的序列。表1A中提供的序列仅仅是代表性的,并非是意图限制本发明。技术人员可以利用任何靶序列-特异性探针检测任何表1中的基因(或这些基因中的每一个)。
表1
表1a. 用于检测NANO46基因的探针
表2提供了表1的NANO46基因的选择序列。
表2
在本发明的方法中可以使用表1中的至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少46个或全部46个基因。优选地,在生物样品中确定46个基因的每一个的表达。利用基因表达数据的系统聚类分析从FFPE乳腺肿瘤样品的训练集预定义四个内在亚型的原型基因表达概况(即重心(centroids))。这四个亚型的原型基因表达概况(即重心)的热点图显示于图1中,其中表达的水平由热点图说明。表3显示了实际值。
表3.
使用测试乳腺癌肿瘤样品和作为测试试剂盒的一部分提供的参考样品进行乳腺癌内在亚型分型(Breast Cancer Intrinsic Subtyping)测试之后,基于皮尔森相关性(Pearson’s correlation)的计算算法将测试样品的NANO46内在基因集的标准化(normalized)和定比(scaled)基因表达概况与四个乳腺癌内在亚型的原型表达特征进行比较。通过确定NANO50基因集的表达(其是确定NANO46基因集的表达并进一步包括确定MYBL2, BIRC5, GRB7和CCNB1的表达)来确定内在亚型分析,并使用NANO46基因集确定复发风险(“ROR”) 。具体地,通过将生物样品中NANO50基因集的表达与四个内在亚型的预期表达概况进行比较来鉴别内在亚型。将具有最相似表达概况的亚型分配到生物样品。ROR得分是0-100范围的整数值,对于定义的预期使用人群来说,其与个体患者10年内远端复发的概率相关。通过如上述将生物样品中NANO46基因的表达概况与上述的四个内在亚型的预期概况进行比较,以计算四个不同的相关值,从而计算ROR得分。这些相关性值然后与增殖得分(以及任选地一种或多种临床病理变量,例如肿瘤大小)结合以计算ROR得分。优选地,通过仅比较NANO46基因的表达概况来计算ROR得分。
图6提供了具体算法变换(specific algorithm transformations)的原理图。将与样品具有最大正相关性的亚型分配到肿瘤样品。由未治疗的乳腺癌患者的训练集生成的Kaplan Meier生存曲线证明在该测试人群中,内在亚型是无复发生存(RFS)的预后指标,所述人群包括雌激素受体阳性/阴性和HER2阳性/阴性患者两者,图2。
对一群用他莫昔芬治疗的淋巴结阴性,雌激素受体阳性患者的独立测试显示主要是管腔A型和B型亚型的患者,其中管腔A型患者比管腔B型患者表现出更好的结果,图3。使用采用更现代的治疗方案(即芳香化酶抑制剂)并更好地坚持治疗的临床试验样本预期更进一步改善管腔A型患者的结果。
FFPE乳腺肿瘤样品的训练集,其具有明确定义的临床特征和临床结果数据,被用于确定连续复发风险(Risk of Recurrence (ROR))得分。使用来自包括与每个内在亚型的相关性、增殖得分(46个基因中的18个的子集的平均基因表达)和肿瘤大小的Cox模型的系数计算得分,表4。
表4中的测试变量乘以相应的系数并求和得到风险得分(“ROR-PT”)。
ROR-PT公式 = -0.0067*A + 0.4317*B + -0.3172*C + 0.4894*D + 0.1981*E + 0.1133*F
在先前的研究中,ROR得分提供对用他莫昔芬治疗5年的ER-阳性、淋巴结-阴性患者的复发风险的连续估算(Nielsen Clin. Cancer Res., 16(21):5222-5232 (2009))。该结果在来自相同群组的ER-阳性、淋巴结-阴性的患者上得到证实,图4。基于在该测试人群中确定RFS,ROR得分还展示对于临床模型来统计学上显著的改善,这为该决策工具与传统的临床病理措施相比时准确率的提高提供了进一步的证据(Nielsen Clin. Cancer Res., 16(21):5222-5232 (2009))。
基因集包含已知作为增殖标记的许多基因。本发明的方法提供用于确定提供增殖特征的基因的子集。本发明的方法可以包括确定选自ANLN、CCNE1、CDC20、CDC6、CDCA1、CENPF、CEP55、EXO1、KIF2C、KNTC2、MELK、MKI67、ORC6L、PTTG1、RRM2、TYMS、UBE2C和/或UBE2T的NANO46内在基因的18-基因子集的至少一种、组合或每一个的表达。优选地,确定NANO46基因集的18-基因子集的每一个的表达以提供增殖得分。可以确定样品中这些基因的一个或多个的表达,并对样品中这些基因的一个或多个的标准化表达估计值求平均来产生增殖特征指数。可以对样品分配高增殖特征、适度/中等增殖特征,低增殖特征或超低增殖特征。确定生物样品的增殖特征的方法在Nielsen Clin. Cancer Res., 16(21):5222-5232 (2009)和网上补充材料(这些文档通过引用将其全文合并入本文)中描述。
内在亚型生物学的描述
管腔亚型:乳腺癌最常见的亚型是管腔亚型,管腔A型和管腔B型。先前的研究表明管腔A型占所有乳腺癌的大约30% 至40%,而管腔B型占大约20%,但是它们代表超过90 %的激素受体阳性乳腺癌(Nielsen Clin. Cancer Res., 16(21):5222-5232 (2009))。这些亚型的基因表达模式类似于乳腺的管腔上皮组分。这些肿瘤的特征在于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、和与ER活化相关的基因,例如LIV1、GATA3、和细胞周期蛋白D1的高表达,以及管腔细胞角蛋白8和18的表达(Lisa Carey & Charles Perou (2009). Gene Arrays, Prognosis, and Therapeutic Interventions. Jay R. Harris 等 (4th ed.), Diseases of the breast (pp. 458-472). Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins)。
管腔A型:管腔A型(LumA)乳腺癌表现出与细胞周期激活和ERBB2簇相关的基因的低表达,这导致与管腔B型相比更好的预后。管腔A型亚类在所有亚型中具有最有利的预后,并且在内分泌治疗-响应的肿瘤中是较丰富的。
管腔B型:管腔B型(LumB)乳腺癌也表达ER和ER-相关基因。与细胞周期激活相关的基因高表达,并且这种肿瘤类型可以是HER2(+) (~20%)或HER2(-)。与LumA相比预后不良(尽管表达ER),而且内分泌治疗的响应性通常减小。
HER2-富集型:HER2-富集亚型通常是ER-阴性的并且在大部分高表达ERBB2簇,包括ERBB2和GRB7的病例中是HER2-阳性的。与细胞周期激活相关的基因高表达,并且这些肿瘤具有不利的结果。
基底样型:基底样亚型通常是ER-阴性的,在临床上几乎总是HER2-阴性的,并且表达一系列“基底”生物标志物,包括基底上皮细胞角蛋白(CK)和表皮生长因子受体(EGFR)。与细胞周期激活相关的基因高表达。
临床变量
本文描述的NANO46分类模型可以进一步与临床变量的信息结合以生成连续的复发风险(ROR)的预测器。如本文所述的,本领域中已知许多临床和预后乳腺癌因素,并且它们被用于预测治疗结果和疾病复发的可能性。这种因素包括,例如淋巴结转移、肿瘤大小、病理分级、雌激素和孕激素受体状态,HER-2水平和肿瘤倍性。在一个实施方案中,为被诊断或疑似患有乳腺癌的主体提供复发风险(ROR)得分。该得分使用NANO46分类模型结合淋巴结状态(N)和肿瘤大小(T)的临床因素。临床变量的评价是基于美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer (AJCC))的乳腺癌分期标准化系统。在该系统中,原发肿瘤大小按照0-4的范围分类(TO:无原发肿瘤的证据;Tl : < 2 cm;T2: > 2 cm - < 5 cm;T3 : > 5 cm;T4:直接扩散到胸壁或皮肤的任意大小的肿瘤)。淋巴结状态分类为N0-N3 (NO:局部淋巴结没有转移;Nl:转移至可移动的、同侧的一个或多个腋窝淋巴结;N2:转移至彼此固定或固定在其它结构的同侧一个或多个淋巴结;N3:转移至胸骨下方的同侧淋巴结)。鉴别乳腺癌患者和对疾病进行分期的方法是熟知的,并可以包括手工检查、活组织检查、检查患者病史和/或家族史、以及成像技术,例如乳房X光检查、磁共振成像(MRI)、和正电子发射断层摄影术(PET)。
样品来源
在本公开的一个实施方案中,通过评价一个或多个主体样品中表1所列的内在基因的表达模式或表达概况来评估乳腺癌亚型。为了讨论的目的,术语主体,或主体样品,指个体,不管其健康和/或疾病状态。主体可以是受试者、研究参与者、对照主体、筛选主体、或任何由其获得样品的并在本公开的背景下被评估的其他类别的个体。相应地,主体可以被诊断为患有乳腺癌,可以呈现出乳腺癌的一种或几种症状,或者对于乳腺癌的诱发因素,例如家族(遗传)或医疗史(医疗)因素,可以正在接受乳腺癌的治疗(treatment)或疗法(therapy),等等。或者,就任何上述因素或标准而言,主体可以是健康的。应当理解本文使用的术语“健康”是相对于乳腺癌状态而言的,因为术语“健康”不能定义为相应于任何绝对的评价或状态。因此,对于任何特定疾病或疾病标准来说,被定义为健康的个体可以实际上被诊断为患有任何其它一种或多种疾病,或者表现出任何其它一种或多种疾病标准,包括一种或多种除乳腺癌以外的癌症。但是,健康对照优选没有任何癌症。
在特定的实施方案中,预测乳腺癌内在亚型的方法包括收集包含癌细胞或组织的生物样品,例如乳腺组织样品或原发乳腺肿瘤组织样品。“生物样品”意指任何在其中可以检测内在基因表达的细胞、组织、或体液的取样。这种生物样品的实例包括,但不限于活组织检查和涂片。可用于本公开的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液、乳头抽吸液、妇科液体、或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。在一些实施方案中,生物样品包括乳腺细胞,特别是来自活组织检查的乳腺组织,例如乳腺肿瘤组织样品。可以通过多种技术从主体获得生物样品,包括,例如通过刮擦(scraping)或擦抹(swabbing)一个区域、通过使用针抽吸细胞或体液、或者通过移除组织样品(即活组织检查)。收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中,通过,例如,细针抽吸活检,穿刺活检,或切除活检获得乳腺组织样品。可以对细胞或组织应用固定剂和染色液以保存样本并便于检查。生物样品,特别是乳腺组织样品,可以转移至载玻片以进行放大观察。在一个实施方案中,生物样品是福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺组织样品,特别是原发乳腺肿瘤样品。在不同的实施方案中,从病理学家指导的组织核心样品(pathologist-guided tissue core sample)获得组织样品。
表达概况分析
在不同的实施方案中,本公开提供分类、预测、或监测主体中乳腺癌的方法。在该实施方案中,使用一种或多种模式识别算法评价从内在基因表达分析获得的数据。这种分析方法可用于构建预测模型,其可用于对测试数据进行分类。例如,一种方便且特别有效的分类方法利用多变量统计分析建模,首先使用来自已知亚型的样品(例如来自已知具有特定乳腺癌内在亚型:LumA、LumB、基底样型、HER2-富集型、或正常样型的主体)的数据(“建模数据”)构建模型(“预测数学模型”),其次根据亚型对未知样品(例如“测试样品”)进行分类。模式识别方法已广泛用于表征许多不同类型的问题,包括,例如,语言学、指纹识别、化学和心理学。在本文所述的方法的情况中,模式识别是使用多变量统计,参数的和非参数的,以分析数据,并由此对样品进行分类以及基于一系列观察到的测量值预测一些因变量的值。有两种主要的方法。一套方法叫做“非监督式”,这些方法简单地以合理的方式降低数据复杂性,并且还产生人眼可解读的展示图。但是,这类方法可能不适合于开发临床测定,所述临床测定可用于分类来自独立于用于训练预测算法的初始样品群体的主体的样品。
另一种方法叫做“监督式”,其中使用具有已知分类或结果的样品的训练集产生数学模型,随后用独立的验证数据集对所述数学模型进行评价。这里,内在基因表达数据的“训练集”被用于构建正确预测每一个样品的“亚型”的统计模型。然后用独立数据(被称为测试或验证集)测试该训练集以确定基于计算机的模型(computer-based model)的稳健性。这些模型有时被称为“专家系统”,但可以基于一系列不同的数学方法。监督式方法可以使用降低维数(例如开始的几个主要分量(principal components))的数据集,但是典型地使用未降低的,具有所有维数的数据。在所有的情况中,该方法允许对多变量边界进行定量描述,所述多变量边界根据其内在基因表达概况表征和分离每一个亚型。还有可能获得任何预测上的置信区间,例如,放置在拟合优度上的概率水平。还可以使用交叉验证,通过从分析中忽略选定样品来检查预测模型的稳健性。
本文描述的NANO46分类模型基于多个主体样品的基因表达概况,使用表1中所列的内在基因。多个样品包括足够数量的来自属于每一个亚型类别的主体的样品。本文中的“足够的样品”或“代表数量”指来自足以构建能可靠地将每一个亚型与该组中所有其它亚型区分开的分类模型的每个亚型的样品的数量。基于用于“训练”算法的客观选择的原型样品概况开发了监督式预测算法。根据国际专利公开号WO 2007/061876 和美国专利公开号2009/0299640公开的方法,使用扩大的内在基因集选择样品并进行亚型分型,通过引用将上述两篇文献的全文合并入本文。或者,可以根据任何已知的用于分类乳腺癌亚型的测定对样品进行亚型分型。在根据亚型对训练样品进行分层之后,使用基于重心的预测算法,基于表1中所述内在基因集的表达概况构建重心。
在一个实施方案中,预测算法是与Narashiman and Chu (2002) PNAS 99:6567-6572中所述的相关的最近重心方法,通过引用将其全文合并入本文。在本公开中,所用方法计算每个亚型的标准化重心。该重心是每一个亚型(或“类”)中的每一个基因的平均基因表达除以该基因在该类中的标准偏差。最近重心分类法取新样品的基因表达概况,并将其与这些类的重心的每一个相比较。通过计算每个测试例与五个重心的斯皮尔曼秩相关性,并基于最近重心对样品分配某个亚型,来完成亚型的预测。
内在基因表达的检测
本文包括任何本领域可用的用于检测表1中所列内在基因表达的方法。“检测表达”是指确定内在基因的RNA转录物或其表达产物的量或存在。检测本公开的内在基因表达,即基因表达概况分析的方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、免疫组化方法、和基于蛋白质组学的方法。这些方法通常检测表1中所列内在基因的表达产物(例如mRNA)。在优选的实施方案中,使用基于PCR的方法,例如逆转录PCR(RT-PCR) (Weis, TIG 8:263- 64, 1992),和基于阵列的方法例如微阵列(Schena, Science 270:467- 70, 1995)。“微阵列”指可杂交阵列元件,如,例如,多核苷酸探针,在基质上的有序排列。术语“探针”指能与特别预期的靶生物分子,例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成,或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括,但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。
许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品,例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系,以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤,则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取RNA(例如mRNA)。
RNA提取的一般方法是本领域熟知的,和在分子生物学的标准教科书,包括Ausubel , ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999中公开的。从石蜡包埋组织提取RNA的方法在例如Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67, (1987);和De Andres Biotechniques 18:42-44, (1995)中公开。特别地,可以使用来自商业制造商,例如Qiagen (Valencia, CA)的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行RNA分离,按照制造商的说明进行。例如,可以使用Qiagen RNeasy 微型柱从培养细胞分离总RNA。其它可商购的RNA分离试剂盒包括MASTERPURE™ Complete DNA和RNA 纯化试剂盒 (Epicentre, Madison, Wis.)和Paraffin Block RNA分离试剂盒 (Ambion, Austin, TX)。例如,可以使用RNA Stat-60 (Tel-Test, Friendswood, TX)从组织样品中分离总RNA。例如,可以使用高纯FFPE RNA Microkit, 货号04823125001 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)从FFPE中分离总RNA。例如,可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。此外,可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品,如,例如Chomczynski (美国专利No. 4,843,155)的单步RNA分离工艺。
分离的RNA可用于杂交或扩增测定中,包括,但不限于PCR分析和探针阵列。用于检测RNA水平的一种方法包括使分离的RNA与能与由被检测基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是,例如,全长cDNA,或其部分,例如长度为至少7, 15, 30, 60, 100, 250或500个核苷酸并且在严谨条件下足以与本公开的内在基因,或任何衍生的DNA或RNA特异性杂交的寡核苷酸。mRNA与探针的杂交表示所述的内在基因正在表达。
在一个实施方案中,mRNA被固定在固体表面上并与探针接触,例如通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上运行,并将mRNA从胶上转移至膜,例如硝酸纤维素膜。在替代的实施方案中,探针被固定在固体表面上,mRNA例如在Agilent的基因芯片阵列中与探针接触。技术人员可以容易地改变已知的mRNA检测方法以适用于检测本公开的内在基因的表达水平。
确定样品中内在基因表达产物水平的替代方法包括这样的核酸扩增方法:例如通过RT-PCR(美国专利No. 4,683,202)、连接酶链式反应(Barany, PNAS USA 88: 189-93, (1991))、自我持续序列复制(Guatelli , Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 1874-78, (1990))、转录扩增系统(Kwoh , Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 1173-77, (1989))、Q-Beta 复制酶 (Lizardi , Bio/Technology 6:1197, (1988))、滚环扩增(美国专利No. 5,854,033),或任何其它核酸扩增方法,然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。这些检测方法特别可用于检测核酸分子,如果这种分子以非常低的数量存在的话。
在本公开的特定方面,通过定量RT-PCR评价内在基因表达。许多不同的PCR或QPCR方案是本领域已知的并在下文中例举,并可以直接应用它们或者对其进行改变以适用于使用当前所述的组合物来检测和/或定量表1中所列的内在基因。通常,在PCR中,用至少一种寡核苷酸引物或一对寡核苷酸引物进行反应扩增靶核苷酸序列。一个或多个引物与靶核酸的互补区域杂交,并且DNA聚合酶延伸一个或多个引物以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下,单一大小的核酸片段在反应产物(靶多核苷酸序列,其是扩增产物)中占优势。重复扩增循环以增加单个靶多核苷酸序列的浓度。可以在任何通常用于PCR的热循环仪中进行反应。但是,优选的是具有实时荧光测量能力的循环仪,例如, SMARTCYCLER® (Cepheid, Sunnyvale, CA)、ABI PRISM 7700® (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)、ROTOR- GENE™ (Corbett Research, Sydney, Australia)、LIGHTCYCLER® (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, Ind.)、ICYCLER® (Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)和MX4000® (Stratagene, La Jolla, Calif.)。
在本公开的另一个实施方案中,使用微阵列进行表达概况分析。由于不同实验之间的再现性,微阵列特别适合于该目的。DNA微阵列为大量基因表达的水平的同时测量提供了一种方法。每一个阵列由与固体支持物相连的可重现模式的捕获探针组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交,然后通过激光扫描进行检测。确定阵列上每一个探针的杂交强度并将其转换为代表相对基因表达水平的定量数值。参见,例如,美国专利Nos. 6,040,138, 5,800,992和6,020,135, 6,033,860, 和6,344,316。高密度寡核苷酸阵列特别可用于确定样品中大量RNA的基因表达概况。
在优选的实施方案中,使用nCounter®分析系统检测内在基因表达。nCounter®分析系统的基础是分配给要测定的每一个核酸靶的唯一编码 (国际专利申请公开号WO 08/124847、美国专利号8,415,102和Geiss Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325;通过引用将它们每一个的内容整体合并入本文)。编码由有序的彩色荧光斑点系列构成,所述彩色荧光斑点为每一个要测定的靶创建了唯一的条形码。为每一个DNA或RNA靶设计一对探针,生物素化的捕获探针和携带荧光条形码的报告探针。在文本中该系统也被称为nanoreporter编码系统。
为每一个靶合成特定的报告和捕获探针。简单来说,序列特异性DNA寡核苷酸探针与编码-特异性报告分子相连。优选地,每一个序列特异性报告探针包含能与不超过一个的表1的NANO46基因杂交的靶特异性序列,并任选地包含至少两个、至少三个、或至少四个标记连接区域,所述连接区域包含发光的一种或多种标记单体。通过将每一个靶的第二序列特异性DNA寡核苷酸与含有生物素的通用寡核苷酸连接来制备捕获探针。报告和捕获探针都合并在一个杂交混合物,“探针文库”中。优选地,探针文库包含表1中NANO46基因的每一个的探针对(捕获探针和报告探针)。
在一次多重杂交(multiplexed hybridization)反应中测量每一个靶的相对丰度。该方法包括使生物样品与探针文库接触,所述文库包含表1中NANO46基因的探针对,以使得样品中靶的存在产生探针对-靶复合物。然后纯化复合物。更具体地,样品与探针文库结合,并在溶液中发生杂交。杂交之后,使用与互补于捕获和报告探针上存在的通用序列的寡核苷酸连接的磁珠在两步操作中纯化三重杂交复合物(探针对和靶)。该双重纯化过程允许用大量过量的靶特异性探针驱动完成杂交反应,因为它们最终会被除去,并因此不会干扰样品的结合和成像。所有杂交后步骤在定制的液体操作机器人(Prep 工作站(Station), NanoString Technologies)上机械操作。
纯化反应由Prep 工作站置于样品盒的单个流动池中,通过捕获探针与链霉亲和素包被的表面结合,进行电泳以使报告探针延伸,并固定。这些程序之后,样品盒被转移至完全自动化的成像和数据收集设备(数字分析仪, NanoString Technologies)中。通过使每一个样品成像并对检测该靶编码的次数进行计数,来测量靶的表达水平。数据以简单的电子表格格式输出,其中列出每个靶、每个样品计数的数字。
该系统可以与nanoreporters一起使用。有关nanoreporters的其它公开内容可以在国际公开号WO 07/076129和WO 07/076132、和美国专利公开号2010/0015607和2010/0261026中找到,其通过引用整体并入本文。进一步,术语核酸探针和nanoreporters可以包括国际公开号WO 2010/019826和美国专利公开号2010/0047924中描述的合理设计的序列(例如合成序列),通过引用将其全文合并入本文。
数据处理
预处理基因表达数据,例如,通过处理缺失数据、转换、定比、标准化、加权等,通常是有用的。多变量投影法,例如主分量分析(principal component analysis ,PCA)和偏最小二乘法(partial least squares analysis,PLS),是所谓的定比敏感方法(scaling sensitive methods)。通过利用先前的有关研究数据类型的知识和经验,可以通过定比和/或加权增加多变量建模之前的数据质量。适当的定比和/或加权能够揭示隐藏在数据中的重要的和有趣的变化,并因此使得后续的多变量建模更有效。基于所研究系统的知识和经验,可以使用定比和加权使数据置于正确的度量中,并因此揭示已经固有地存在于数据中的模式。
如果可能的话,应当避免缺失的数据,例如列值中的缺口。但是,如果必要的话,这种缺失的数据可以由,例如,列平均值(“平均填补”);随机值(“随机填补”);或基于主分量分析的值(“主分量填补”)来替换或“填补”。
描述符坐标轴的“转换”可以是有用的。这种转换的实例包括标准化和均值中心化。“标准化”可用于除去样品与样品之间的变化。对于微阵列数据,标准化过程的目的在于通过平衡两个标记染料的荧光强度除去系统误差。染料的偏差可能来自于不同来源,包括染料标记效率的差异、热敏性和光敏性,以及用于扫描双通道的扫描仪设置。一些常用的用于计算标准化因子的方法包括:(i)使用阵列上所有基因的整体标准化;(ii)使用恒定表达的看家/不变基因的看家基因标准化;和(iii)使用杂交过程中加入的已知量的外源对照基因的内部对照标准化(Quackenbush Nat. Genet. 32 (Suppl.), 496-501 (2002))。在一个实施方案中,本文公开的内在基因可以被标准化以对照看家基因。例如,美国专利公开号2008/0032293(通过合并将其全文合并入本文)中描述的看家基因可用于标准化。示例性的看家基因包括MRPL19、PSMC4、SF3A1、PUMl、ACTB、GAPD、GUSB、RPLPO和TFRC。本领域技术人员应当理解,本文公开的方法不限于标准化到任何特定的看家基因,可以使用本领域已知的任何适合的一个或多个看家基因。
许多标准化方法是可能的,且它们通常可以在分析中的任何几个点应用。在一个实施方案中,使用LOWESS方法对微阵列数据进行标准化,LOWESS方法是整体局部加权散点平滑标准化函数(global locally weighted scatter plot smoothing normalization function)。在另一个实施方案中,qPCR数据被标准化到多个看家基因集的几何平均数。
“均值中心化”也可以用于简化解释。通常,对于每一个描述符,减去所有样品的该描述符的平均值。通过这种方法,描述符的平均值与起始点一致,且所有的描述符进行“中心化”到零。在“单位方差定比”中,数据可以定比至等于方差(equal variance)。通常,每个描述符的值按1/StDev进行定比,其中StDev是所有样品的该描述符的标准差。“Pareto定比”,在某种意义上,介于均值中心化和单位方差定比之间。在pareto定比中,每一个描述符的值乘以l/sqrt(StDev)定比,其中StDev是所有样品的该描述符的标准差。通过这种方式,每一个描述符的方差与其初始标准差在数字上相同。pareto定比可以在,例如,原始数据或均值中心化数据上进行。
当数据具有正偏态和/或当数据涵盖大范围,例如几个数量级时,“对数定比”可用于辅助解释。通常,对于每一个描述符,用该值的对数替换该值。在“等同范围定比(equal range scaling)”中,每一个描述符除以所有样品的该描述符的范围。通过这种方式,所有描述符具有相同的范围,即1。但是,这种方法对于离群点敏感。在“自动定比(autoscaling)”中,每一个数据向量被均值中心化并被单位方差定比。该技术是非常有用的,因为随后对每一个描述符进行相同的加权,并且大的值和小的值并重处理。这对于以非常低,但是仍然可检测的水平表达的基因可以是重要的。
在一个实施方案中,收集一个或多个测试样品的数据并使用本文所述的NANO46分类模型分类。当比较来自多个分析的数据时(例如将一个或多个测试样品的表达概况与从在独立研究中收集并分析的样品构建的重心进行比较),有必要对这些数据集的数据进行标准化。在一个实施方案中,使用距离加权判别(Distance Weighted Discrimination (DWD))将这些数据集组合在一起(Benito (2004) Bioinformatics 20(1): 105-114,通过引用将其全文合并入文本)。DWD是多变量分析工具,其能够鉴别单独数据集中存在的系统性偏差,并随后进行整体调整以补偿这些偏差;实质上,每一个单独的集是数据点的多维云(multi-dimensional cloud),而DWD取两个点云并移动一个使之更佳地与另一个重叠。
可以使用任何能够实施该方法和/或记录该结果的设备实施本文描述的方法和/或记录结果。可以使用的设备的实例包括但不限于电子计算设备,包括所有类型的计算机。当本文描述的方法在计算机上实施和/或记录时,可用于配置计算机以实施该方法的步骤的计算机程序可以包含在能够包含该计算机程序的任何计算机可读介质中。可以使用的计算机可读介质的实例包括但不限于磁盘、CD- ROM、DVD、ROM、RAM和其它存储器和计算机存储设备。可用于配置计算机以实施该方法的步骤和/或记录该结果的计算机程序还可以在电子网络上,例如在互联网、内部网或其它网络上提供。
复发风险的计算
本文提供了在内在亚型和任选地其它临床变量的背景下预测乳腺癌结果的方法。结果可以指总的或疾病特异的生存、无事件生存、或对特定治疗(treatment)或疗法(therapy)应答的结果。特别地,该方法可用于预测长期的、无病生存的可能性。“预测乳腺癌患者生存的可能性”指评估患者因潜在的乳腺癌而死亡的风险。“长期的、无病生存”意指患者在首次诊断或治疗之后的至少五年,或至少十年或更多年的时间段中不死于潜在乳腺癌的复发或不遭受乳腺癌的复发。
在一个实施方案中,基于根据亚型对主体的分类预测结果。除了提供亚型分配之外,NANO46生物信息学模型提供对测试样品与所有四个亚型的相似性的测量,其被转换成复发风险(Risk of Recurrence (ROR))得分,该得分可用于任何患者群体,而不管其疾病状态和治疗选择。内在亚型和ROR在用,例如,新辅助紫杉烷和蒽环类药物化疗(Rouzier , J Clin Oncol 23:8331-9 (2005),通过引用将其全文合并入本文)治疗的女性中在对病理完全缓解的预测中也是有价值的。因此,在本公开的不同实施方案中,复发风险(ROR)模型被用于预测结果。使用这些风险模型,主体可以分为低、中和高复发风险组。ROR的计算还提供了预后信息以指导治疗决策和/或监测对治疗的反应。
在本文所述的一些实施方案中,使用Cox比例风险模型分析(Cox Proportional Hazards Model Analysis)对NANO46-定义的内在亚型和/或其它临床参数的预后性能进行评估,所述Cox比例风险模型分析是用于生存数据的回归方法,其提供对危险比和其置信区间的估计。Cox模型是公认的用于探索患者生存和特定变量之间关系的统计技术。这种统计方法允许对给出其预后变量(例如内在基因表达概况,包括或不包括其它临床因素,如本文所述)的个体的危险(即风险)进行估计。“危险比”是对于显示出特定预后变量的患者来说在任何给定时间点的死亡风险。一般地参见Spruance , Antimicrob. Agents & Chemo. 48:2787-92 (2004)。
可以单独使用亚型距离(或相关性),或使用亚型距离和如上所讨论的临床变量对本文所述的NANO46分类模型对于复发风险进行训练。在一个实施方案中,使用单独的内在基因亚型距离使用下述公式计算测试样品的风险得分:
ROR = 0.05*基底 + 0.1 l*Her2 + -0.25*LumA + 0.07*LumB + -0.1 l*正常,其中变量“基底”、“Her2”、“LumA”、“LumB”和“正常”是当测试样品的表达概况与使用存放在基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus (GEO))的基因表达数据构建的重心相比较时,每一个各自的分类与重心的距离。
还可以使用乳腺癌亚型和临床变量肿瘤大小(T) 和淋巴结状态(N)的组合使用下述公式计算风险得分:ROR (完全) = 0.05*基底 + 0.1*Her2 + -0.19*LumA + 0.05*LumB + - 0.09*正常 + 0.16*T + 0.08*N,也是当测试表达概况与使用存放在GEO的登录号为GSE2845的基因表达数据构建的重心相比较时。
在另一个实施方案中,单独用内在亚型距离通过下述公式计算测试样品的风险得分:
ROR-S = 0.05*基底 + 0.12*Her2 + -0.34*LumA + 0.0.23*LumB,其中变量“基底”、“Her2”、“LumA”、“LumB”如上所述,且测试表达概况与使用存放在GEO的登录号为GSE2845的基因表达数据构建的重心相比较。在另一个实施方案中,使用乳腺癌亚型和临床变量肿瘤大小(T) 使用下述公式计算风险得分(其中变量如上所述):ROR-C = 0.05*基底 + 0.1 l*Her2 + -0.23*LumA + 0.09*LumB + 0.17*T。
在另一个实施方案中,使用内在亚型距离结合增殖特征(“Prolif”)使用下述公式计算测试样品的风险得分:
ROR-P = -0.001*基底 + 0.7*Her2 + -0.95*LumA + 0.49*LumB + 0.34*Prolif,其中变量“基底”、“Her2”、“LumA”、“LumB”和“Prolif”如上所述,且测试表达概况与使用存放在GEO的登录号为GSE2845的基因表达数据构建的重心相比较。
在另一个实施方案中,还可以使用乳腺癌亚型、增殖特征和临床变量肿瘤大小(T) 的组合使用上述表3中所述的ROR-PT计算风险得分。
亚型检测
在连续切片上用标准链霉亲和素-生物素复合物方法,使用3,3'-二氨基联苯胺作为发色团同时进行雌激素(ER)、孕激素(PgR)、HER2和Ki67的免疫组化。ER、PgR和HER2判读的染色可以如前所述进行(Cheang , Clin Cancer Res. 2008;14(5):1368–1376.),但是也可以使用本领域已知的任何方法。
例如,可以应用1:200稀释的Ki67抗体(克隆SP6; ThermoScientific, Fremont, CA)32分钟,然后在98°C进行Ventana Benchmark自动免疫染色器(Ventana, Tucson AZ)标准细胞调节剂1(Cell Conditioner 1, CC1, 一种专有缓冲剂)方案30分钟。可以使用1:250稀释的ER抗体(克隆SP1; ThermoFisher Scientific, Fremont CA),在10 mM柠檬酸钠(pH 6.0)中进行8分钟微波抗原修复后,温育10分钟。可以按照上述的CC1方案使用即用型PR抗体(克隆1E2; Ventana)。可以在0.05 M Tris缓冲液(pH 10.0)中进行抗原修复并在蒸汽发生器中加热至95°C 30分钟后,用1:100稀释的SP3抗体(ThermoFisher Scientific)进行HER2染色。对于HER2荧光原位杂交(FISH)测定,载玻片可以使用PathVysion HER-2 DNA探针试剂盒(Abbott Molecular, Abbott Park, IL)与LSI (位点特异性标识) HER2/neu的探针和着丝粒17的探针杂交,按照制造商的说明进行,如前所述对预处理和杂交进行更改(Brown LA, Irving J, Parker R, Amplification of EMSY, a novel oncogene on 11q13, in high grade ovarian surface epithelial carcinomas. Gynecol Oncol. 2006;100(2):264–270)。然后用4′,6-双脒基-2-苯基吲哚对载玻片进行复染,染色物质在Zeiss Axioplan落射荧光显微镜下可见,并使用Metafer图像采集系统(Metasystems, Altlussheim, Germany)分析信号。然后可以由两个病理学家对免疫组化测定的生物标志物表达进行评分,所述病理学家对临床病理学特征和结果设盲,并且使用先前建立和发表的在其它乳腺癌群组上开发的生物标志物表达水平标准。
如果在超过1%的肿瘤细胞核中观察到免疫染色,则认为肿瘤是ER或PR阳性的,如先前所述。如果根据HercepTest 标准,免疫染色的得分为3+,并且2.0或更高的荧光原位杂交的扩增比是用于隔离免疫组化疑似肿瘤的截断点(得分为2+),则认为肿瘤是HER2阳性的(Yaziji, , JAMA, 291(16):1972–1977 (2004))。由两个病理学家对于背景水平上的具有阳性免疫染色的肿瘤细胞核的百分比对Ki67进行目测评分,。
也可以使用其它方法检测亚型。这些技术包括ELISA、Western印迹、Northern印迹或FACS分析。
试剂盒
本公开还描述了可用于对乳腺癌内在亚型进行分类和/或提供预后信息以鉴别复发风险的试剂盒。这些试剂盒包含一组捕获探针和/或对表1中所列内在基因特异性的引物。试剂盒还可以包含计算机可读介质。
在本公开的一个实施方案中,捕获探针固定在阵列上。“阵列”指固体支持物或基质,具有肽或核酸探针与该支持物或基质相连。阵列典型地包含与基质表面在不同的、已知的部位偶联的多个不同的捕获探针。本公开的阵列包含具有多个捕获探针的基质,所述捕获探针可以与内在基因表达产物特异性结合。基质上捕获探针的数量随阵列的预期目的而不同。阵列可以是低密度阵列或高密度阵列,并可以含有4个或更多个、8个或更多个、12个或更多个、16个或更多个、32个或更多个编址(addresses),但是最低限度包含表1中所列46个内在基因的捕获探针。
使用机械合成方法合成这些阵列的技术在例如美国专利号5,384,261中描述,为所有目的通过引用将其全文合并入本文。阵列可以装配在几乎任何形状的表面或者甚至多个表面上。阵列可以是珠子、凝胶、聚合物表面、纤维如光纤、玻璃或任何其它适合基质上的探针(例如核酸结合探针),参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992,为所有目的通过引用将这些专利的每一个的全文合并入本文。阵列可以以这样的方式包装,以允许在设备上进行诊断或其它操作。参见,例如,美国专利号5,856,174和5,922,591,通过引用将其合并入本文。
在另一个实施方案中,试剂盒包含一组寡核苷酸引物,所述引物足以检测和/或定量表1所列内在基因的每一个。寡核苷酸引物可以以冻干或重构(reconstituted)的形式提供,或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中,以微孔板(microplate)的形式提供引物,其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔,如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增表1所列基因的表达产物的试剂和说明。
为了便于快速访问,例如为进行比较、检查、恢复、和/或修改,分子特征/表达概况典型地记录在数据库中。最典型地,数据库是可由计算机设备访问的关系数据库,虽然可以使用其它形式,例如作为照片、模拟或数字成像读数、电子表格等的表达概况的手动访问索引文件。无论最初记录的表达模式本质上是模拟的或数字的,表达模式、表达概况(集合的表达模式)和分子特征(相关表达模式)以数字形式储存并通过数据库访问。典型地,数据库在中央设备编辑并维持,可以在本地和/或远程访问。
设备和测试
通用 - NanoString nCounter分析系统通过对数百个mRNA转录物的相对丰度的数字读数提供对基因表达的直接地、多重地测量。nCounter分析系统使用混合在一起形成叫做CodeSet的单个试剂的基因特异性探针对(图7)。探针对与mRNA样品在溶液中直接杂交,排除了任何可能给结果带来偏差的酶反应。
杂交之后,所有样品处理步骤在nCounter Prep 工作站上自动进行。首先,除去过量的捕获和报告探针(图8),然后使探针-靶复合物与nCounter盒表面上的随机部位通过链霉亲和素-生物素连接结合(图9)。
最终,探针/靶复合物排列并固定(图10)在nCounter盒中。报告探针携带荧光信号;捕获探针允许固定复合物以进行数据收集。可以将多达800对探针,其中每一对特异性针对一个特定的基因,与一系列内部对照组合以形成CodeSet。
完成样品处理后,将盒置于nCounter数字分析仪中进行数据收集。通过报告探针上存在的六个有序荧光斑点产生的“色码”鉴别每一个目的靶分子。然后对盒表面上的报告探针进行计数并为每一个靶分子制成表格(图11)。
试剂和测试组分 - 乳腺癌测试使用特别针对这些基因设计的nCounter CodeSet在一次杂交反应中同时测量NANO46加上八个看家基因的表达水平。每一个测定还包括由线性滴定的体外转录RNA转录物和相应探针组成的阳性测定对照、和用作阴性对照的一组与人RNA序列没有序列同源性的探针。每一个测定运行还包括由靶的体外转录RNA和用于标准化目的的看家基因组成的参考样品。乳腺肿瘤样品的标准化基因表达概况与由乳腺肿瘤训练集鉴别的四个乳腺癌内在亚型(管腔A型、管腔B型、HER-富集型、或基底样型)的原型基因表达概况相关。基因表达概况结合所选的临床变量,被用作训练算法的一部分,作为乳腺癌远端复发风险的预后指标。
图12给出了与nCounter分析系统乳腺癌测试相关的测定过程。
FFPE 组织提取 - 乳腺癌测试将会使用从福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)被诊断为乳腺浸润癌的组织中提取的RNA。病理学家首先对固定在载玻片上的肿瘤切片进行H & E染色,以鉴别含有高于最小阈值的肿瘤内容物的存活的浸润乳腺癌区域。病理学家在H & E载玻片上圈出该区域。病理学家然后将未染色的组织切片固定在载玻片上,并标记出含有浸润肿瘤的载玻片区域。对于较大的肿瘤(H & E载玻片上的>100mm2的存活的浸润癌),测试仅仅需要单个的10μm的切片。对于较小的肿瘤(<100mm2),测试需要3个切片。在RNA提取之前,对载玻片上所鉴别的含有足够肿瘤内容物的存活的浸润乳腺癌区域进行宏观切割(macro-dissected)。从收集地点将FFPE组织载玻片送至测试地点的步骤将被定义为该方法的一部分。
提取总RNA并除去基因组DNA之后,在260 nm和280 nm的波长测量光密度,以确定产量和纯度。测定方法要求输入范围为125-500ng的总RNA以进行后续的杂交步骤。NanoString计划验证该RNA的输入范围足以可重现地在nCounter分析系统上进行测定。此外,使用OD260/280读数测量RNA质量,目标比例是不小于1.7,上限为2.5。储存RNA的方法将会被提供给使用者,以便需要时可以在较后的时间点进行下游处理。
RNA 提取后用分光光度计测量产量和纯度的要求 - 从FFPE样品分离RNA得到30 μL的最终样品体积。该体积对于通过在样品池类型的UV-Vis分光光度计中使用吸收测量的核酸丰度定量来说太少,因此NanoString的方案包括使用低体积分光光度计如NanoDrop™分光光度计定量总RNA的步骤。NanoString将会为分光光度计定义性能规范,以使得推荐用于测试的RNA输入的范围高于低体积分光光度计的检测限,并且是可重复测量的。
杂交 - 对于多达10个RNA样品的每一组来说,使用者吸取特定量的RNA至12反应带管(12 reaction strip tube)中的单独试管中,并加入CodeSet和杂交缓冲液。吸取参考样品至剩下的两个含有CodeSet和杂交缓冲液的管中。CodeSet由用于每一个被靶向的基因的探针、额外的用于内源“看家”标准化基因的探针和阳性和阴性对照组成。CodeSet中与这四组基因(靶基因、看家基因、和阳性和阴性对照)的每一个有关的探针每个都分配了一个唯一的编码,因此在每次运行中都可以单独辨认。参考样品由靶基因和看家基因的体外转录RNA组成。一旦向各个试管中加入杂交试剂,使用者将带管转移至热盖加热模块中,在设定的温度保持规定的时限。
用于杂交步骤的具有热盖的加热模块的要求 - nCounter测定包括在等温条件下过夜杂交。因为在升高的温度下进行小体积过夜杂交,必须小心以避免蒸发。许多市售PCR热循环仪配备有热盖以防止小量液体蒸发。
由于测定不需要任何对温度缓升的精细控制,任何具有可编程热盖和尺寸适合于NanoString 管的模块的加热模块都可以用于NanoString测定。NanoString计划提供用于满足测定要求的加热模块的技术指标。
Prep 工作站上的纯化和结合 - 完成杂交后,使用者随后将含有10个测定组和2个参考样品的带管连同表1所述的所需的预装试剂和一次性用品转移至nCounterPrep 工作站。Prep 板含有用于纯化过量探针和与盒结合的必要的试剂(参见下述第IIIC部分关于纯化过程的详细描述)。在放置于Prep 工作站搁板上之前在摆斗式离心机中离心prep 板板。然后自动纯化过程通过两个连续的杂交驱动的磁珠捕获步骤除去过量捕获和报告探针。随后nCounterPrep 工作站将纯化的靶/探针复合物转移至nCounter盒中以捕获到玻璃载玻片上。运行完成之后,使用者从Prep 工作站 取下盒并用粘性膜密封。
在数字分析仪上进行成像和分析 - 然后将密封的盒插入到nCounter 数字分析仪中,nCounter数字分析仪对载玻片上捕获的每一个基因的探针的数目进行计数,其相应于溶液中靶的数量。然后自动化软件检查看家基因、参考样品、和阳性和阴性对照的阈值,以确定每一个测定是否合格并确保正确执行了程序。看家基因提供对RNA完整性的测量,阈值表示此时由于不正确的操作或组织或RNA的不正确储存(例如不正确的肿瘤固定、FFPE单元储存、RNA储存、RNA操作引入RNase)而导致测试的RNA样品降解过度,不能由测试进行分析。阳性和阴性测定对照指示测定过程的失败(例如,测定设置中的误差,所述测定设置例如样品与CodeSet混合,或样品处理诸如温度)。接下来使用看家基因对每一个样品的信号进行标准化以控制输入样品质量。该信号然后被标准化到每一次运行中的参考样品,以控制批次之间的差异。在乳腺癌内在亚型分型(Breast Cancer Intrinsic Subtyping)算法中输入得到的标准化数据,以确定肿瘤内在亚型、复发风险得分、和风险分类。
仪器- nCounter分析系统由两个仪器构成,用于杂交后处理的nCounter Prep 工作站,和用于数据收集和分析的数字分析仪。
nCounter Prep 工作站 - nCounter Prep 工作站 (图13)是处理杂交后样品以为nCounter数字分析仪上进行数据收集做准备的自动液体操作机器人。在Prep 工作站上进行处理之前,根据上述的nCounter方案,从FFPE(福尔马林固定的、石蜡包埋的)组织样品提取的总RNA与NanoString报告探针和捕获探针杂交。
与靶RNA的杂交是由过量NanoString探针驱动的。为了准确分析这些杂交分子,首先从杂交反应中剩余的过量探针中纯化它们。Prep 工作站通过两个连续的磁珠纯化步骤,从过量的报告和捕获探针分离杂交的mRNA分子。这些亲和纯化利用定制的寡核苷酸修饰的磁珠,该磁珠仅保持住与捕获探针和报告探针二者结合的mRNA分子的三重复合物。
接下来,该三重复合物的溶液冲洗通过在NanoString样品盒中的流动池。该流动池的一个表面,包被有充满着稠密的共价结合的链霉亲和素的聚乙二醇(PEG)水凝胶。当溶液通过流动池时,三重复合物通过掺入到每一个捕获探针中的生物素分子与水凝胶中的链霉亲和素结合。PEG水凝胶的作用不仅仅是提供三重复合物可以与之特异性结合的具有稠密链霉亲和素的表面,而且还抑制任何剩余过量报告探针的非特异性结合。
复合物与流动池表面结合之后,沿着每个样品盒流动池的长度方向施加电场以促进对组成每一个报告探针的荧光斑点的光学鉴别和有序排列。因为报告探针是带电荷的核酸,施加电压对它们施加了力,使它们一致沿着电场的方向拉伸和定向。施加电压的同时,Prep 工作站加入固定化试剂,使得除去电场后将报告探针锁定为拉长的构型。一旦报告探针被固定,可以将盒转移至nCounter数字分析仪进行数据收集。在Prep 工作站 上进行样品处理所需的所有消耗性组分和试剂在nCounter Master Kit中提供。这些试剂可即时加载到nCounter Prep 工作站的隔板上,nCounter Prep 工作站每次运行在大约2.5小时中可以处理多达10个样品和2个参考样品。
nCounter 数字分析仪 - nCounter数字分析仪(图14)通过用CCD照相机通过显微镜物镜镜头拍摄样品盒中固定化荧光报告探针的图像,来收集数据。因为荧光报告探针是具有小于可见光波长特征的小的单个分子条形码,数字分析仪使用高放大率的、衍射限成像来解析荧光条形码中的斑点序列。
数字分析仪捕获数百个连续的视场(fields-of-view (FOV)),每一个视场可以含有数百或数千个不连续的报告探针。每一个FOV是在不同波长抓取的四个单色图像的组合。所得到的叠加可被认为是蓝、绿、黄和红的四色图像。实时处理每一个4色FOV以提供对样品中每一个荧光条形码的“计数”。因为每一个条形码特异性鉴别单个mRNA分子,从数字分析仪得到的数据是对生物样品中每一个目的mRNA的相对丰度的精确测量。
软件 - Prep 工作站和数字分析仪是独立单元,无需与外部PC相连,但是必须使用局域网(LAN)相互联网。nCounter 系统软件通过用户账号和权限安全管理操作。两个仪器使用嵌入式触摸屏用户界面上的设置和流程向导指导使用者进行测定的样品处理和数据收集步骤。使用者由Prep 工作站和数字分析仪上的逐步说明引导经过该过程。仪器触摸屏使用压敏方法控制操作,并使使用者通过触摸屏幕上的选项来与系统交互。因为触摸屏为数据输入提供有限的人机界面,该系统还为用户账号管理、样品批定义、和样品状态跟踪提供基于网络的应用。
当处理样品时,系统软件在集中式数据储存库中跟踪用户账号和每一个样品的试剂批次。在数字分析仪获得样品的表达数据之后,首先进行分析以确保符合所有预先规定的质量控制标准。然后通过锁定PAM50算法处理合格的数据以产生包含内在亚型和复发风险(ROR)得分的报告。样品报告被传送到中央储存库,在那儿它可以被有正确权限的用户安全地访问并下载。
乳腺癌内在亚型分型算法 - 将使用最初被称为PAM50的50个基因的分类器算法(Parker J.S., 等 Supervised Risk Predictor of Breast Cancer Based on Intrinsic Subtypes. Journal of Clinical Oncology, 27: 1160-1167 (2009)),使用nCounter系统鉴别切除的乳腺浸润癌的内在亚型。基因表达概况将会对乳腺癌分配四个分子类别或内在亚型之一:基底样型、管腔A型、管腔B型、和HER2富集型。每一个亚型的简要描述在下面提供。
管腔亚型:在激素受体阳性的人群中,乳腺癌的最常见的亚型是管腔亚型,管腔A型和管腔B型。先前的研究表明管腔A型占乳腺癌的大约30%至40%而管腔B型占大约20% 2,并且包含超过90 %的激素受体阳性乳腺癌。这些亚型的基因表达模式类似于乳腺的管腔上皮组分(Nielsen, TO 等 A comparison of PAM50 intrinsic subtyping with immunohistochemistry and clinical prognostic factors in tamoxifen-treated estrogen receptor positive breast cancer. Clinical Cancer Research, 16:5222-5232 (2010))。这些肿瘤的特征在于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、和与ER活化相关的基因2例如LIV1、GATA3、和细胞周期蛋白D1的高表达,以及管腔细胞角蛋白8和18的表达。
管腔A型:管腔A型(LumA)乳腺癌表现出与细胞周期激活和ERBB2簇相关的基因的低表达,这导致与管腔B型相比更好的预后。管腔A型亚类在所有亚型中具有最有利的预后,并且在内分泌治疗-响应的肿瘤中是较多的。
管腔B型:管腔B型(LumB)乳腺癌表达ER和ER-相关基因,但与LumA相比程度较低。与细胞周期激活相关的基因高表达,并且这种肿瘤类型可以是HER2(+)或HER2(-)。预后不良(尽管表达ER),而且与LumA相比内分泌治疗的响应性通常减小。
基底样型:基底样亚型通常是ER-阴性的,在临床上几乎总是HER2-阴性的,并且表达一系列“基底”生物标志物,包括基底上皮细胞角蛋白(CK)和表皮生长因子受体(EGFR)。与细胞周期激活相关的基因高表达。
HER2-富集型:HER2-富集亚型通常是ER-阴性的并且是在大部分高表达ERBB2簇,包括ERBB2和GRB7的病例中是HER2-阳性的。与细胞周期激活相关的基因高表达,并且这些肿瘤结果较差。
内在亚型分型算法的截断点是根据训练集预定义的,训练集对下述内容进行了定义:1) 内在亚型重心(即每一个亚型的原型基因表达概况),2) 复发风险(ROR)得分系数,和3) 风险分类(低/中/高)。使用所保存的从多个地点收集的FFPE乳腺肿瘤样本的临床代表集训练内在亚型重心(管腔A型、管腔B型、Her2富集型、基底样型)。将来自FFPE乳腺肿瘤样品的基因表达数据的系统聚类分析与乳腺肿瘤生物学(即先前定义的内在亚型的基因表达)结合,以定义每一个亚型的原型表达概况(即重心)。计算算法使标准化的未知乳腺癌肿瘤样品的50个基因的表达概况与四个乳腺癌内在亚型的原型表达特征的每一个相关联。对肿瘤样品分配与样品具有最大正相关性的亚型。
304个具有明确定义的临床特征和临床结果数据的独特肿瘤样品被用于建立ROR得分。使用来自Cox模型的系数计算ROR得分,所述系数包括与每一个内在亚型的皮尔森相关性(R)、增殖得分(P)、和肿瘤大小(T),如下述公式中所显示的。
ROR = aRLumA + bRLumB + cRHer2e + dR基底 + eP + fT
为了基于它们计算的ROR得分将肿瘤样品分类为特定的风险组(低风险/中风险/高风险),基于患者群体中的无复发生存的概率设定截断点,所述患者群体由单独用内分泌疗法治疗的激素受体阳性、绝经后患者组成。
NanoString 乳腺癌测试在临床实践中的预期应用 - 肿瘤医生目前使用一系列测试来研究乳腺癌患者的治疗方案。其中包括IHC / FISH测试例如ER/PR IHC和HER2 IHC / FISH,以及Agendia MammaPrint®测定和Genomic Health Oncotype Dx®测试。这些测试为肿瘤医生提供了有关患者预后和推荐的治疗方案的额外信息。
但是,这些测试有局限性。ER, PgR和Her2测试由病理学家和参比实验室在本地进行,但是有许多文件可证明IHC和FISH测试的广泛标准化的挑战(Lester, J 等 Assessment of Tissue Estrogen and Progesterone Receptor Levels: A Survey of Current Practice, Techniques, and Quantitation Methods. The Breast Journal, 6:189-196 (2000); Wolff, A 等 American Society of Clinical Oncology / College of American Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine, 131:18-43 (2007))。MammaPrint测试是FDA准许仅可使用冷冻的或新鲜保存的组织样品,但是在美国,大部分收集的肿瘤样品是FFPE而不是新鲜冷冻的。该测试也不是随处可得的,只能通过Agendia参考实验室获得。Oncotype Dx测试可用于预测接受辅助他莫昔芬治疗以及对环磷酰胺/甲氨蝶呤/5-氟尿嘧啶(CMF)化疗有反应的I/II期、淋巴结阴性、雌激素受体阳性患者的复发风险。但是该测试仅仅作为实验室开发的测试(lab-developed test (LDT))通过Genomic Health’s CLIA实验室提供,而且不是FDA准许用于预后应用,或FDA批准用于预测化疗反应的。
NanoString设想了一种模型,该模型将具有与肿瘤医生目前可获得的用于在选定的患者部分中乳腺癌预后的其它临床数据来源结合使用的乳腺癌测试。乳腺癌测试将是预后信息的额外来源,其在管理患有乳腺癌的患者方面为已建立的肿瘤医生使用的临床参数(即肿瘤大小,淋巴结状态)增加了重要的价值。
方法、测定和试剂盒
本发明的方法、测定和试剂盒包括一系列在分析过程中自动应用于每一个样品的质量控制标准。这些标准对测定的效能进行评价,以确定结果是否落入预期值。在这些质量控制标准成功分析后,测定给出下述结果:
内在亚型
乳腺癌肿瘤的内在亚型已证明与早期乳腺癌的预后相关。平均来说,具有管腔A型肿瘤的患者比具有管腔B型、HER2-富集型或基底样型肿瘤的患者具有显著更好的结果。
通过将未知样品中的50个基因的基因表达概况与四个内在亚型的预期表达概况相比较来鉴别内在亚型。将具有最相似概况的亚型分配到未知样品。
乳腺癌最常见的亚型是管腔亚型,管腔A型(LumA)和管腔B型(LumB)。先前的研究表明管腔A型占所有乳腺癌的大约30% 至40%而管腔B型占大约20%。但是超过90%的激素受体阳性患者具有管腔型肿瘤。这些亚型的基因表达模式类似于乳腺组织的管腔上皮组分。这些肿瘤的特征在于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、和与ER活化相关的基因,例如LIV1、GATA3、和细胞周期蛋白D1的高表达,以及管腔细胞角蛋白8和18的表达。管腔A型乳腺癌与管腔B型乳腺癌相比表现出与细胞周期激活相关的基因的低表达,这导致更好的预后。
先前的研究表明HER2‐富集型亚型(Her2E)占乳腺癌的大约20%。但是,HER2-富集亚型通常是ER-阴性的,因此,只有5%的测试的ER-阳性患者人群被发现具有HER2-富集型乳腺癌。无论其ER-状态,在大部分高表达ERBB2簇,包括ERBB2和GRB7的病例中HER2-富集型肿瘤是HER2-阳性的。与细胞周期激活相关的基因也高表达。
已发布的数据表明基底样亚型占乳腺癌的大约20%。但是,基底样亚型通常是ER-阴性的,因此,只有1%的测试的激素受体阳性患者具有基底样型乳腺癌。基底样亚型在临床上几乎总是HER2-阴性的,并且表达一系列“基底”生物标志物,包括基底上皮细胞角蛋白(CK)和表皮生长因子受体(EGFR)。与细胞周期激活相关的基因高表达。
ROR 得分
ROR得分是0-100范围内的整数值,在确定的预期应用人群中,其与单个患者在10年内远端复发概率相关。通过将未知样品中46个基因的表达概况与如上所述的四个内在亚型的预期概况相比较,计算四个不同的相关值,来计算ROR得分。这些相关值然后与增殖得分和肿瘤大小相结合以计算ROR得分。
10 ‐年远端复发的概率
将患有激素受体阳性的早期乳腺癌的绝经后女性群组的ROR得分与手术和进行5年的辅助内分泌治疗然后观察5年的无远端复发生存相比较。该研究获得将该测试患者人群中的ROR得分与远端复发概率相关联的模型,包括95%的置信区间。
风险分类
还提供风险分类以允许在测试患者人群中通过使用与临床结果相关的截断点解读ROR得分。
通过ROR范围和淋巴结状态进行的风险分类
质量控制
使用预定的技术指标测试每一批测定组分。按批跟踪所有的试剂盒水平项目,每一个试剂盒内包含的重要组分一起测试,并发布为主批次(Master Lot)。
测定试剂盒包括一系列用于评价每一个运行组作为整体和每一个单独的样品的质量的内部对照。这些对照在下面列出。
批次对照组:体外转录的 RNA 参考样品
合成的RNA参考样品被包括在测定试剂盒内作为对照。参考样品包括来自50个算法和8个看家基因的体外转录的RNA靶。在每一个测定运行中,在12个反应带管中处理一式两份的参考样品连同一组多达10个未知乳腺肿瘤RNA样品。相对于预定的阈值分析来自参考样品的信号,以证明运行合格。
来自乳腺肿瘤RNA样品的50个算法基因的每一个的信号被标准化到参考样品的相应基因。
阳性对照组:体外转录 RNA 靶和相应 的捕获和报告探针
合成RNA靶被用作测定的阳性对照(PC)。PC靶序列来自于外部RNA对照集合体(External RNA Control Consortium (ERCC))DNA序列文库。RNA靶是从DNA质粒体外转录的。在4倍滴定系列(杂交反应中终浓度为128 – 0.125 fM)中,测定试剂盒内包括六个RNA靶和相应的捕获和报告探针。向用Prosigna测定来测试的每一个乳腺肿瘤RNA样品和参考RNA样品加入PC。如果来自PC的信号强度不符合预先定义的阈值,则判定样品不合格进行进一步的分析。
阴性对照组:不含靶的外源探针
阴性对照(NC)靶序列来自于ERCC DNA序列文库。测定试剂盒包括被设计用于检测这些靶序列的探针作为其一部分,而不包括相应的靶序列。向用Prosigna测定来测试的每一个乳腺肿瘤RNA样品和参考RNA样品加入阴性对照(NC)作为质量控制措施。如果来自NC的信号强度不符合预先定义的阈值,则判定样品不合格进行进一步的分析。
RNA 完整性对照组:看家基因
设计用于检测8个看家基因和50个算法基因的捕获和报告探针被包括在试剂盒中作为其一部分。分析8个看家基因的表达水平以确定从FFPE组织样品提取的RNA的质量,并将其输入到测定中。如果看家基因的表达水平低于预先定义的阈值,则判定样品不合格进行进一步的分析。
看家基因还可用于在参考样品标准化之前对样品中完整RNA的量上的任何差异标准化。
定义
为本公开的目的,“乳腺癌”包括,例如,那些由活组织检查或组织学分类为恶性病理的状况。乳腺癌诊断的临床描述在医学领域是熟知的。本领域技术人员将知道乳腺癌指乳腺组织的任何恶性肿瘤,包括,例如,癌和肉瘤。乳腺癌的特定实施方案包括原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、或粘液癌。乳腺癌还指浸润导管癌(IDC)或浸润小叶癌(ILC)。在本公开的大部分实施方案中,目的主体是怀疑患有或者实际诊断为乳腺癌的人类患者。
本文使用的冠词“一(a)”和“一(an)”指该冠词的语法受词为一个或多于一个(即至少一个)。举个例子,“一要素”指一个或多个要素。
在整个说明书中,用词“包含(comprising)”,或者其变形例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”,应当被理解为意味着包含所述的要素、整数或步骤、或一群要素、整数或步骤,但不排除任何其它要素、整数或步骤、或一群要素、整数或步骤。
实施例
实施例 1. NANO46 亚型分型测试
图5给出了乳腺癌内在亚型分型测试的相关测定过程。RNA分离之后,该测试使用特别为那些基因设计的nCounter CodeSet,在一次杂交反应中同时测量46个靶基因加上八个看家基因的表达水平。例如,美国专利公开号2008/0032293中描述的看家基因可用于进行标准化,通过引用将该文献的全文合并入本文。示例性的看家基因包括MRPL19、PSMC4、SF3A1、PUM1、ACTB、GAPD、GUSB、RPLP0和TFRC。使用看家基因对肿瘤样品的表达进行标准化。为标准化的目的,每一次测定运行还包括由58个靶的体外转录RNA组成的参考样品。
FFPE组织的检查/获得和RNA提取:乳腺癌内在亚型分型测试将使用从福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)已被诊断为乳腺浸润癌的组织提取的RNA。病理学家检查H & E染色的载玻片以鉴别含有足够的用于测试的肿瘤组织内容物的组织区域。通过在每一个载玻片上宏观切割被鉴别的肿瘤区域以除去邻近的正常组织,对未染色的固定在载玻片上的组织切片进行处理。然后从肿瘤组织分离RNA,并从样品除去DNA。
测定设置和杂交的起始:对于每一批从乳腺肿瘤分离的多达10个RNA样品,使用者可以使用nCounter分析x5系统软件对运行进行设置,其跟踪样品处理,试剂批号,和每一个样品的结果。为了开始实施测定,使用者将特定量的RNA吸取到12反应带管中的单独的管中,并加入CodeSet和杂交缓冲液。参考样品被吸取到剩余的两个含有CodeSet和杂交缓冲液的管中。CodeSet由用于每一个被靶向的基因的探针、用于内源“看家”标准化基因的额外探针和掺入到测定中的阳性和阴性对照组成。参考样品由靶定基因和看家基因的体外转录RNA组成。一旦向各个管子加入杂交试剂,使用者将带管转移至具有热盖的加热模块中,在设定的温度进行规定的时段。
在Prep 工作站上的纯化和结合:完成杂交之后,使用者将含有10个测定和2个参考样品集合的带管和所需的预装试剂和一次性物品转移至nCounterPrep 工作站。然后自动纯化过程通过两个连续的杂交驱动的磁珠捕获步骤除去过量的捕获和报告探针。然后nCounterPrep 工作站将纯化的靶/探针复合物转移至nCounter盒中以捕获至玻璃载玻片。完成该次运行之后,使用者从Prep 工作站 取出盒并用粘性膜密封。
在数字分析仪上进行成像和分析:将盒密封并插入到nCounter数字分析仪中,nCounter数字分析仪对载玻片上捕获的每一个基因的探针的数目进行计数,其相应于溶液中靶的数量。然后自动化软件检查看家基因、参考样品、和阳性和阴性对照的阈值,以确定每一个测定是否合格并确保正确执行了程序。接下来使用看家基因对每一个样品的信号进行标准化以控制输入样品质量。该信号然后被标准化到每一次运行中的参考样品,以控制批次之间的差异。在乳腺癌内在亚型分型(Breast Cancer Intrinsic Subtyping)算法中输入得到的标准化数据,以确定肿瘤内在亚型和复发风险得分。
实施例 2 :对 NANO46 复发风险 (ROR) 得分进行临床验证以预测在患有 HR+ 早期乳腺癌 (EBC) 的绝经后女性中进行内分泌治疗之后远端复发( DR )的剩余风险: ABSCSG 研究。
本研究的目的是评估当在常规医院病理学实验室进行NANO46测试时,ROR得分在预测用他莫昔芬治疗或用他莫昔芬然后用阿纳托唑治疗的患有激素受体阳性早期乳腺癌的(HR+ EBC)绝经后患者远端复发中的效能。ROR得分是否在所有患者中增加了超出临床治疗得分(Clinical Treatment Score)的预后信息(远端RFS)吗(CTS包括:淋巴结、分级、肿瘤大小、年龄、治疗)?基于ROR的风险组在所有患者中给超出临床治疗得分(Clinical Treatment Score)的预后信息(远端RFS)分类了吗?
研究综述:3,714名患者参与了ABCSG8。患者是患有HR+ EBC(淋巴结阴性且note阳性)的绝经后女性,一级或二级,先前未进行治疗。1,671名患者再次同意长期的随访或死亡。中位数随访期为11年。收集了1,620个FFPE块。25个块中的癌在路径检查(path review)上不足,73个包括的RNA不足,44个QC规格不适合用于NanoString设备。1,478名患者(91.2%)通过NANO46分析。
方法:每一个患者的三个未染色的10微米切片和1个H&E载玻片被送至BCCA的单独的学术病理学实验室,在那里进行组织检查、手工宏观切割和RNA提取。然后使用NanoString nCounter 分析系统对250 ng提取的RNA进行NANO46分析;计算内在亚型和ROR得分二者。
结果:ROR得分在所有患者中增加了超出CTS的统计学显著的预后信息(远端RFS) (可能性比例测试∆LRχ2 = 53.5, p < 0.0001)。基于ROR的风险组在所有患者中增加了超出CTS的统计学显著的预后信息(远端RFS) (可能性比例测试∆LRχ2 = 34.1, p < 0.0001)。管腔A型和管腔B型之间的差异在所有患者中增加了超出CTS的统计学显著的预后信息(远端RFS) (管腔B型相对于A型:HR=2.38, 95% CI; 1.69-3.35, p < 0.0001)。淋巴结阴性和淋巴结阳性的亚组中的结果与本研究中报告的所有患者的结果类似。
结论:结果表明ROR得分和基于ROR的风险组都增加了统计学显著的超出临床治疗得分的预后信息。结果证明复杂的、多基因表达的测试可以在医院病理学实验室进行,并且符合与中央参考实验室一样的质量标准。TransATAC和ABCSG8研究的结果一起为用于预测单独用内分泌疗法治疗的患有HR+ EBC的绝经后女性的远端复发风险的NANO46测试的临床有效性提供了一级证据。结果还表明在单独用内分泌疗法治疗的患有HR+ EBC的绝经后女性中,管腔A亚型具有比管腔B亚型更好的结果。

Claims (15)

1.一种在患有乳腺癌的主体中预测结果的方法,包括:
提供来自该主体的肿瘤样品;
确定所述肿瘤样品中至少表1的NANO46内在基因列表中的基因的表达;
确定所述肿瘤样品的内在亚型,其中所述内在亚型选自至少基底样型、管腔A型、管腔B型或HER2-富集型;
基于NANO46内在基因列表中增殖基因子集的表达确定增殖得分;
使用所述内在亚型、增殖得分和任选地一种或多种临床病理学变量例如肿瘤大小、淋巴结状态或组织学分级的加权和来计算复发风险得分;并
基于复发风险得分确定主体是否具有低复发风险或高复发风险。
2.权利要求1的方法,其中基于NANO46内在基因列表中增殖基因子集的表达确定增殖特征包括确定选自ANLN、CCNE1、CDC20、CDC6、CDCA1、CENPF、CEP55、EXO1、KIF2C、KNTC2、MELK、MKI67、ORC6L、PTTG1、RRM2、TYMS、UBE2C和UBE2T的NANO46内在基因的每一个的表达。
3.权利要求1的方法,进一步包括确定至少下述之一:肿瘤分级、肿瘤倍性、淋巴结状态、雌激素受体表达、孕激素受体表达、和HER2/ERBB2表达。
4.权利要求1的方法,进一步包括确定下述每一项:肿瘤分级、肿瘤倍性、淋巴结状态、雌激素受体表达、孕激素受体表达、和HER2/ERBB2表达。
5.权利要求1的方法,其中使用下述公式计算复发风险得分:
ROR-PT = -0.0067*基底 + 0.4317*Her2 + -0.3172*LumA + 0.4894*LumB + 0.1981*增值得分 + 0.1133*肿瘤大小。
6.权利要求1的方法,其中结果是乳腺癌特异性生存、无事件生存或对治疗的反应。
7.权利要求1的方法,其中使用nanoreporter编码系统(nCounter®分析系统)确定NANO46内在基因列表成员的表达。
8.包含多个探针的试剂盒,所述探针用于确定肿瘤样品中至少表1的NANO46内在基因列表中基因的表达,所述试剂盒用于在患有乳腺癌的主体中预测结果的方法中使用。
9.权利要求8的试剂盒,其中所述试剂盒包含表1A的多个探针。
10.权利要求9的试剂盒,其中所述试剂盒包含表1A的探针的每一个。
11.权利要求8的试剂盒,包含用于确定选自ANLN、CCNE1、CDC20、CDC6、CDCA1、CENPF、CEP55、EXO1、KIF2C、KNTC2、MELK、MKI67、ORC6L、PTTG1、RRM2、TYMS、UBE2C和UBE2T的NANO46内在基因的每一个的表达的探针。
12.权利要求8的试剂盒,其中所述多个探针中的每一个探针包含能与不超过一个的表1所列NANO46内在基因杂交的靶特异性序列,和任选地包含至少两个标记连接区域,所述标记连接区域包含一种或多种发光的标记单体。
13.权利要求9的试剂盒,其中所述多个探针包含探针对以检测表1中所列的NANO46内在基因,其中探针对中的每一个探针包含能与不超过一个的表1所列NANO46内在基因杂交的靶特异性序列,并且其中所述靶特异性序列与同一个NANO46内在基因的不同区域结合。
14.权利要求13的试剂盒,其中探针对的一个探针进一步包含至少两个标记连接区域,所述标记连接区域包含一种或多种发光的标记单体。
15.权利要求8的试剂盒,进一步包括用于确定肿瘤样品的一种或多种临床病理学变量例如肿瘤体积、肿瘤分级、肿瘤倍性、淋巴结状态、雌激素受体表达、孕激素受体表达、和HER2/ERBB2表达的一种或多种试剂。
CN201380038875.4A 2012-05-22 2013-05-22 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法 Pending CN104704128A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911216650.9A CN111500718A (zh) 2012-05-22 2013-05-22 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261650209P 2012-05-22 2012-05-22
US61/650209 2012-05-22
US201361753673P 2013-01-17 2013-01-17
US61/753673 2013-01-17
PCT/US2013/042157 WO2013177245A2 (en) 2012-05-22 2013-05-22 Nano46 genes and methods to predict breast cancer outcome

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911216650.9A Division CN111500718A (zh) 2012-05-22 2013-05-22 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104704128A true CN104704128A (zh) 2015-06-10

Family

ID=49624503

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038875.4A Pending CN104704128A (zh) 2012-05-22 2013-05-22 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法
CN201911216650.9A Pending CN111500718A (zh) 2012-05-22 2013-05-22 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911216650.9A Pending CN111500718A (zh) 2012-05-22 2013-05-22 预测乳腺癌结果的nano46基因和方法

Country Status (12)

Country Link
US (3) US20130337444A1 (zh)
EP (1) EP2852689B1 (zh)
JP (1) JP6325530B2 (zh)
CN (2) CN104704128A (zh)
AU (1) AU2013266419B2 (zh)
BR (1) BR112014029300A2 (zh)
CA (1) CA2874492C (zh)
ES (1) ES2763931T3 (zh)
IL (1) IL235795B (zh)
IN (1) IN2014MN02418A (zh)
MX (1) MX369628B (zh)
WO (1) WO2013177245A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107850599A (zh) * 2015-07-23 2018-03-27 新加坡国立大学 Wbp2与her2作为共预后因子对患者分层以进行治疗
CN110070915A (zh) * 2017-11-10 2019-07-30 首尔大学医院 下一代利用碱基序列分析的基于机器学习的乳腺癌预后预测方法及预测系统
CN113302313A (zh) * 2018-11-05 2021-08-24 拜恩科技诊断有限责任公司 乳腺癌的预测方法
CN117965734A (zh) * 2024-02-02 2024-05-03 奥明星程(杭州)生物科技有限公司 一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及应用

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2297359T3 (en) 2008-05-30 2014-02-24 Univ Utah Res Found Gene expression profiles to predict the outcome of breast cancer
US9066963B2 (en) 2011-03-15 2015-06-30 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods of treating breast cancer with anthracycline therapy
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
US9181588B2 (en) 2011-11-30 2015-11-10 The University Of Utah Research Foundation Methods of treating breast cancer with taxane therapy
EP3901280A1 (en) 2012-10-17 2021-10-27 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
EP2997163A4 (en) * 2013-05-13 2017-02-22 Nanostring Technologies, Inc Methods to predict risk of recurrence in node-positive early breast cancer
CN105849275B (zh) 2013-06-25 2020-03-17 普罗格诺西斯生物科学公司 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统
AU2014317843A1 (en) 2013-09-09 2016-03-24 British Columbia Cancer Agency Branch Methods and kits for predicting outcome and methods and kits for treating breast cancer with radiation therapy
EP3221469B1 (en) 2014-11-21 2020-01-15 Nanostring Technologies, Inc Enzyme- and amplification-free sequencing
SG11201704177SA (en) * 2014-11-24 2017-06-29 Nanostring Technologies Inc Methods and apparatuses for gene purification and imaging
US20160160293A1 (en) * 2014-12-09 2016-06-09 King's College London Breast cancer treatment with taxane therapy
ES2935860T3 (es) 2015-04-10 2023-03-13 Spatial Transcriptomics Ab Análisis de ácidos nucleicos múltiplex, espacialmente distinguidos de especímenes biológicos
EP3458601B1 (en) 2016-05-16 2023-07-05 Nanostring Technologies, Inc. Methods for detecting target nucleic acids in a sample
EP3472359B1 (en) 2016-06-21 2022-03-16 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
WO2018074865A2 (ko) * 2016-10-21 2018-04-26 서울대학교병원 유방암 예후 예측용 조성물 및 방법
CA3043489A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
KR101950717B1 (ko) * 2016-11-23 2019-02-21 주식회사 젠큐릭스 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법
WO2018144782A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 The Translational Genomics Research Institute Methods of detecting somatic and germline variants in impure tumors
CA3078158A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Cartana Ab Rna templated ligation
CA3099909A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
SG11202111878RA (en) 2019-05-31 2021-11-29 10X Genomics Inc Method of detecting target nucleic acid molecules
JP7352937B2 (ja) * 2019-07-19 2023-09-29 公立大学法人福島県立医科大学 乳癌のサブタイプを鑑別又は分類するための鑑別マーカー遺伝子セット、方法およびキット
EP3945136A1 (en) * 2020-07-28 2022-02-02 Hospital Clínic de Barcelona In vitro method for the prognosis of patients suffering from her2-positive breast cancer
US12060603B2 (en) 2021-01-19 2024-08-13 10X Genomics, Inc. Methods for internally controlled in situ assays using padlock probes
AU2022419002A1 (en) * 2021-12-20 2024-08-01 Fundació De Recerca Clínic Barcelona-Institut D’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer Development and validation of an in vitro method for the prognosis of patients suffering from her2-positive breast cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101057144A (zh) * 2004-09-22 2007-10-17 三路影像公司 用于评价乳腺癌预后的方法和组合物
US20100015607A1 (en) * 2005-12-23 2010-01-21 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
US20110145176A1 (en) * 2008-05-30 2011-06-16 Perou Charles M Gene expression profiles to predict breast cancer outcomes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
EP0604552B1 (en) 1991-09-18 1997-02-12 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
ATE262374T1 (de) 1991-11-22 2004-04-15 Affymetrix Inc Kombinatorische strategien für polymersynthese
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
EP1027456B1 (en) 1997-10-31 2005-03-16 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Expression profiles in adult and fetal organs
US6020135A (en) 1998-03-27 2000-02-01 Affymetrix, Inc. P53-regulated genes
US6750015B2 (en) * 2000-06-28 2004-06-15 Kathryn B. Horwitz Progesterone receptor-regulated gene expression and methods related thereto
US20020168639A1 (en) * 2000-09-22 2002-11-14 Muraca Patrick J. Profile array substrates
EP3470535B1 (en) 2003-06-24 2020-04-01 Genomic Health, Inc. Prediction of likelihood of cancer recurrence
CA2540167A1 (en) * 2003-09-29 2005-05-12 Pathwork Informatics, Inc. Systems and methods for detecting biological features
CA2574447A1 (en) 2004-07-15 2006-01-26 University Of Utah Research Foundation Housekeeping genes and methods for identifying the same
CA2630974A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions involving intrinsic genes
WO2007076132A2 (en) 2005-12-23 2007-07-05 Nanostring Technologies, Inc. Compositions comprising oriented, immobilized macromolecules and methods for their preparation
CA2687292C (en) 2007-04-10 2017-07-04 Nanostring Technologies, Inc. Methods and computer systems for identifying target-specific sequences for use in nanoreporters
WO2008150512A2 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods for identifying an increased likelihood of recurrence of breast cancer
WO2009108215A1 (en) * 2007-09-06 2009-09-03 Aviaradx, Inc. Tumor grading and cancer prognosis
EP3162900B1 (en) 2008-08-14 2018-07-18 Nanostring Technologies, Inc Stable nanoreporters
WO2011120984A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-06 Sividon Diagnostics Gmbh Method for breast cancer recurrence prediction under endocrine treatment

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101057144A (zh) * 2004-09-22 2007-10-17 三路影像公司 用于评价乳腺癌预后的方法和组合物
US20100015607A1 (en) * 2005-12-23 2010-01-21 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
US20110145176A1 (en) * 2008-05-30 2011-06-16 Perou Charles M Gene expression profiles to predict breast cancer outcomes

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107850599A (zh) * 2015-07-23 2018-03-27 新加坡国立大学 Wbp2与her2作为共预后因子对患者分层以进行治疗
CN110070915A (zh) * 2017-11-10 2019-07-30 首尔大学医院 下一代利用碱基序列分析的基于机器学习的乳腺癌预后预测方法及预测系统
CN110070915B (zh) * 2017-11-10 2023-08-04 株式会社递希真 下一代利用碱基序列分析的基于机器学习的乳腺癌预后预测方法及预测系统
CN113302313A (zh) * 2018-11-05 2021-08-24 拜恩科技诊断有限责任公司 乳腺癌的预测方法
CN117965734A (zh) * 2024-02-02 2024-05-03 奥明星程(杭州)生物科技有限公司 一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP6325530B2 (ja) 2018-05-16
US20230272476A1 (en) 2023-08-31
US20200332368A1 (en) 2020-10-22
CA2874492A1 (en) 2013-11-28
BR112014029300A2 (pt) 2017-07-25
IL235795A0 (en) 2015-01-29
IN2014MN02418A (zh) 2015-08-14
CA2874492C (en) 2021-10-19
WO2013177245A3 (en) 2015-01-29
MX2014014275A (es) 2015-07-06
AU2013266419A1 (en) 2014-12-11
AU2013266419B2 (en) 2018-09-27
CN111500718A (zh) 2020-08-07
EP2852689A4 (en) 2016-05-11
JP2015518724A (ja) 2015-07-06
MX369628B (es) 2019-11-14
EP2852689A2 (en) 2015-04-01
US20130337444A1 (en) 2013-12-19
EP2852689B1 (en) 2019-12-11
IL235795B (en) 2020-02-27
WO2013177245A2 (en) 2013-11-28
ES2763931T3 (es) 2020-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230272476A1 (en) Nano46 genes and methods to predict breast cancer outcome
JP6908571B2 (ja) 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験
US10196687B2 (en) Molecular diagnosis and typing of lung cancer variants
JP2022169647A (ja) 癌の臨床転帰を予測する方法
Wang et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma
Dumur et al. Interlaboratory performance of a microarray-based gene expression test to determine tissue of origin in poorly differentiated and undifferentiated cancers
US20140154681A1 (en) Methods to Predict Breast Cancer Outcome
JP2015530072A (ja) ゲムシタビン療法による乳癌の治療方法
US20160115551A1 (en) Methods to predict risk of recurrence in node-positive early breast cancer
WO2013082440A2 (en) Methods of treating breast cancer with taxane therapy
KR20230011905A (ko) 파노믹 게놈 유병률 점수
Yun et al. Immunoscore is a strong predictor of survival in the prognosis of stage II/III gastric cancer patients following 5-FU-based adjuvant chemotherapy
Irwin et al. Current and emerging biomarkers: Impact on risk stratification for neuroblastoma
CN103687963A (zh) 利用与转移相关的多基因标签来确定肝细胞癌的预后的方法
Fu et al. Transcriptomic signatures in breast cancer
Ta et al. Molecular subtyping of diffuse large B-cell lymphoma using a novel quantitative RT-PCR assay
Elvin Understanding the Landscape of Clinically Available Molecular Testing
Quintana Molecular Diagnostics in Breast Cytology
Giri Gene microarrays in tumor diagnosis: opportunities and challenges
Marusina New Frontiers Open Up in Molecular Diagnostics: Personalized Tests and Treatments Are Heightened by Repertoire of Advances in DNA-Based Technologies
Das et al. Molecular Cytogenetic Analysis: Applications in Cancer
Fumagalli et al. Strategies to Incorporate Translational Research Science into Clinical Trials in Breast Cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150610