CN104651394A - 用于转染原生质体的改进技术 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于转染原生质体的改进技术。具体地，本发明提供用于向植物细胞原生质体中引入一种或多种感兴趣的分子的方法，其包含如下步骤：通过酶降解和/或从植物细胞中移除细胞壁来提供植物细胞原生质体；用能够诱导DNA双链断裂的组合物进行植物细胞原生质体的第一转染；采用一种或多种感兴趣的分子进行植物细胞原生质体的第二转染；允许细胞壁形成；其中第二转染在第一转染之后进行，以及其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是至少1、2、4、6、8、10、12、16或24小时。本发明的方法能够更加有效地并且以更加可控的方式控制和转染原生质体和细胞周期。
Description
本发明是申请号为201080057861.3，申请日为2010年12月20日，发明名称为“用于转染原生质体的改进技术”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于向植物细胞原生质体中引入感兴趣的外来分子的方法。发明还涉及转染的植物细胞原生质体和用于实施所述方法的试剂盒。
背景技术
遗传改造是刻意创造活细胞遗传物质变化的方法，所述方法目的在于改造那种细胞或者由细胞构成其一部分的器官或由细胞再生的器官的一种或多种遗传编码的生物学属性。这些变化可以采取删除部分遗传物质、加入外源性遗传物质或者像遗传物质中现有核苷酸序列的替换的变化的形式。
用于真核生物遗传改造的方法为人们所知已超过20年，并且已发现其广泛应用于植物和动物细胞和微生物以改善农业、人类健康、食品质量和环境保护领域。
遗传改造的常见方法由向细胞基因组中加入外源性DNA片段组成，然后这将赋予那种细胞或其有机体除了通过已经现有的基因编码的属性以外的新的属性(包括其中现有基因的表达将因此被抑制的应用)。尽管很多这样的实例可以有效地获得所需的属性，但是这些方法不是非常准确，因为无法控制外源性DNA片段插入其中的基因组位置(并因此无法控制最终的表达水平)，并且因为所需的效果将其自身体现在由原始的且均衡的基因组编码的自然属性之上。遇到的一个常见问题是，由于外源性DNA片段在宿主基因组DNA中的随机整合，必要或有利的基因被失活或修饰，造成宿主所需特征的不必要的损失。
相反，将导致预定义的基因组基因座中核苷酸的加入、删除或转化的遗传改造的方法将允许现有基因的精确改造。
随着过去十年里基因组学的出现，现在有可能迅速且成本有效地地破译动物、植物和细菌的基因组。这已经导致大量的能够与如动物的疾病易感性或植物的产量特征的表型有关的基因和调节序列。这将允许迅速建立序列的假定功能，但是一个基因对一种观察到的表型负责的最终证明必须通过创建显示预期的改变的表型的突变系来获得。
不同于动物细胞，植物细胞由多糖和蛋白质的混合物组成的厚厚的细胞壁包围，而动物细胞可以轻易地服从外来分子的引入，植物细胞更加顽固并且需要稍微更加侵略性的方法。为了向植物细胞中引入外来分子的现有技术程序可以分为2种类别。
第一类重组了采用通过刺穿植物细胞壁向植物细胞中机械引入感兴趣的分子的所有方法。这能够通过生物弹道递送(biolistics delivery)来完成，其中将感兴趣的分子包被在金属珠(金或钨)上，使用气体加压装置将其推进到细胞中。然而，这种方法的效率相当低并且因为不是所有的细胞都被转化，选择是必须的，其限制了目标的数目。另一种方法使用了连接到一个微型操纵器上的微-或纳-针将化合物穿过细胞壁直接注射到植物细胞中。然而，微注射需要特殊设备和大量技巧。该方法同样是单调的和费时的并且相较于生物弹道递送几乎没有提供优势。但另一种方法使用了碳纳米管，其含有感兴趣的分子并且其末端包被有细胞壁消化酶。据说，纳米管将局部地降解细胞壁并刺穿质膜允许其内容物递送进入宿主细胞。虽然与微注射或生物弹道轰击(biolistics bombardment)相比侵略性较低，上述限制也适用于此。
第二类重组了其中在引入感兴趣的分子之前用酶将整个植物细胞壁移除的所有方法。细胞壁的完全移除破坏了细胞之间的联系，产生了个体化细胞的均匀混悬物，其允许更均匀和更大规模的转染实验。这包括，但不仅限于，原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的转染和聚乙二醇介导的转染。因此，原生质体的制备是一种产生数百万细胞的非常可靠和廉价的方法，并且由于其灵活性、效率和产量，通常比其它方法优选。
几乎能够从每一种植物组织中分离原生质体。原生质体的主要来源是叶肉组织，其每克鲜重产生大量的原生质体。其它组织类型的使用主要取决于现有程序对于所考虑的系统和实验最终目标的可用性。
许多生物学过程，若非全部，是空间上和时间上调节的。一个细胞都有其自己的生物钟，细胞周期是其最明显的表现。每一个细胞将经历一系列发展阶段如生长(G0、G2)、DNA复制(S)、分裂(M)和静止(G0)。因此，当设计意图与特异性通路相互作用的实验时，其与处理所考虑的系统状态有关。感兴趣的分子的引入必须要仔细地定时以便匹配研究的方法。感兴趣的分子或者必须在很长一段时间里在细胞环境中保持稳定直至它可以执行其活性或者必须在所研究的方法开始之前不久被递送。例如，在通过向细胞中引入标记的微管蛋白早前期带(pre-prophase band)形成期间的微管动力学研究中，必须确定的一点是微管蛋白在早前期带的形成之前不久被递送，除非标记的微管蛋白足够稳定以抵挡酶降解直至早前期带形成开始。对于特定的实例，另一个考虑是向结构中而非早前期带中并入荧光微管蛋白，并因此需要在所需的时间递送探针。
不幸的是，除了细胞混悬培养物的极少数情况以外，原生质体能够从中衍生出来的叶肉细胞处于静止状态(G0)，并且只有当采用一个适当的激素平衡触发原生质体时，它们将重新进入细胞周期并积极地开始流动。一个静止原生质体经过一轮细胞周期所需的时间在系统之间有很大不同，并且能够从几个小时到几天。此外，一旦用于生成原生质体的酶混合物被清洗掉，原生质体就开始再形成其细胞壁，如果不采取预防措施来减缓或阻止细胞壁再形成，这将降低甚至完全阻止外来分子的引入。因此，当要递送感兴趣的分子时原生质体不能置之不理直至它们达到适当的阶段，必须积极地预防细胞壁的再形成同时应该保留原生质体的流动能力。
发明内容
本发明已经着手克服本领域的这些缺点并且已经发明一种方法，在所述方法中能够更加有效地并且以更加可控的方式控制和转染原生质体和细胞周期。
本发明人目前已经发现，两个转染步骤的组合允许原生质体中几个生物学过程的详细控制。两个转染步骤的组合可以与细胞壁抑制剂的使用，和/或细胞时相(phase)同步步骤组合。发明人已经发现，在第一转染步骤中与某些通路相互作用和/或导致双链DNA断裂并且在第二转染步骤中采用外来分子进行转染的各种组合物的引入允许转染过程改进的效率和控制。本发明人进一步发现，通过向原生质体中加入一种或多种非酶化学化合物，所述化学化合物干扰细胞壁的形成如通过抑制纤维素合成酶、纤维素沉积或捕捉新兴的纤维素微纤丝，通过外来分子的递送在时间上更加接近细胞周期中所需时相的可能性，外来分子引入的时机和效率能够被增强和优化。本发明人还发现，通过在特定的细胞时相同步细胞，可以实现增加的转染。
从更广泛的方面讲，错配修复系统和/或NHEJ通路和/或DNA双链断裂的引入的(瞬时)抑制以及(ii)采用感兴趣的外来分子如致突变的寡核苷酸的原生质体的转染，任选地与原生质体系统中细胞壁再形成的瞬时抑制和/或细胞周期时相的同步结合是非常有价值的，当细胞系统必须在细胞周期的特殊阶段被转染时，当细胞在特定生物/生化过程中变得熟练时，所述过程在时间上远离原生质体分离的时间点。此外，原生质体系统中细胞壁再形成的瞬时抑制允许瞬时表达的质粒的顺序引入，其组合作用导致所需的结果。例如，如果某时引入ZFN构建体，例如，在引入供体构建体之前的4、6、12、18或24小时，基因靶向是更有效的。这允许ZFNs被表达并且诱导对于适当的基因靶向事件所必需的DSBs的发生。
发明详述
在第一个方面中，本发明涉及用于向植物细胞原生质体中引入一种或多种感兴趣的分子的方法，所述方法包含下列步骤
-通过酶降解和/或从植物细胞中移除细胞壁来提供植物细胞原生质体；
-进行植物细胞原生质体的第一转染，所述转染采用
i.能够改变选自错配修复系统、非同源性末端连接(non-homologous endjoining)的一种或多种通路的调节的第一组合物；和/或
ii.能够诱导DNA双链断裂的第二组合物
-采用一种或多种感兴趣的分子进行植物细胞原生质体的第二转染；
-允许细胞壁形成；
其中第二转染在第一转染之后进行。
本领域技术人员将会理解的是，术语“和/或”在本发明的范围中意味着可以进行采用第一组合物的转染、或者采用第二组合物的转染、或者采用二者的转染。所以根据本发明的第一转染，及其实施方案可以包含第一组合物或第二组合物或二者。
在方法的第一步中，从植物细胞中提供原生质体。使用用于产生植物细胞原生质体的常用程序(例如，使用软化霉素)能够提供原生质体。迄今为止，植物细胞原生质体系统已被描述用于番茄(番茄(Solanum Lycopersicon))、烟草(烟草(Nicotiana tabaccum))和许多其他(油菜(Brassica napus)、胡萝卜(Daucuscarota)、生菜(Lactucca sativa)、玉米(Zea mays)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、矮牵牛(Petunia hybrida)、马铃薯(Solanum tuberosum)、亚洲水稻(Oryza sativa))。本发明通常适用于任何原生质体系统，包括但不限于文中所列的那些。
原生质体可以源自(不活跃分裂的)叶肉细胞、从(活跃分裂的)分生组织培养物中和从(活跃分裂的)细胞混悬物。
采用能够改变一种或多种通路的调节的第一组合物能够转染原生质体，所述通路选自错配修复系统、非同源性末端连接通路。优选地，转染是瞬时的。优选地，错配修复系统、非同源性末端连接通路是下调的。
优选地，通过能够调节这些通路的dsRNAs来完成通路的调节。用于适当组合物的选择和设计的实例和指导在下文中提供。在一个实施方案中，第一组合物能够改变MutS、MutL、MutH、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、MLH2、MLH3、PMS1、DNA-PK复合物Ku70、Ku80、Ku86、Mre11、Rad50、RAD51、XRCC4、Nbs1中一种或多种的调节。
错配修复系统
许多损伤通过所谓的错配修复系统(MMR)得到修复。在大肠杆菌中，MMR由3种主要复合物组成，MutS、MutL和MutH。MutS参与错配的识别和向第二复合物MutL(其募集MutH)发送信号。MutH具有切口(nick)活性，所述切口活性将在包含错配的新合成的DNA链中引入切口。在新合成的链中的切口的存在给外切核酸酶发送信号，待降解的DNA延伸片段，包括错配核苷酸。然后DNA聚合物将填充子链中的缺口。除了其功能通过MutL实现的MutH以外，在所有真核细胞中能够发现大肠杆菌MMR基因的直系同源(为了回顾，参见Kolodner&Marsishky 1999,Curr.Opin.Genet.Dev.9:89-96)。在植物中，存在有四种MutS直系同源(MSH2、MSH3、MSH6和MSH7)和四种MutL直系同源(MLH1、MLH2、MLH3和PMS1)。由MutSα(MSH2::MSH6异二聚体)完成碱基-碱基错配对或单一超螺旋核苷酸的错配识别，然而由MutSβ(MSH2::MSH3异二聚体)识别更大的超螺旋环出。MSH7基因已经在植物中得到鉴定，但是迄今为止未在动物中得到鉴定。MSH7与MSH6最相似并且同样与MSH2形成异二聚体(MutSγ)(Culligan&Hays,2000,Plant Cell12:991-1002)。MMR通路在图1中阐明，来自于Li,2008Cell Research 18:85-98。
目前，已经提出用于植物原生质体中特异性mRNA的瞬时抑制的方法(An等人2003Biosci.Biotechnol.Biochem..67:2674-2677)并且现在已经发现，对于植物中(内源性)MMR基因的瞬时抑制而言，这是一种有价值的工具。
可用于用来改变通路(比如dsRNA的产生)的调节的组合物的来自于与MMR通路有关的基因的序列(如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、MLH2、MLH3和PMS1)从公共数据库中可得到，如对于AtMSH2GenBank登录号AF002706.1以及文中其它部分所描述的。通过设计基于例如可得到的拟南芥序列并随后鉴定所需的直系同源的引物能够鉴定所需植物的特异性序列。
毒性最强的损伤是DNA双链断裂(DSB)。DSB能够来自于内源性或外源性基因毒性药物的作用，如活性氧种类-尤其是羟自由基-电离辐射或化学品(包括用于治疗癌症的化疗药物)。细胞过程如其它DNA损伤类型的修复，或DNA复制也引起DSB。例如，通过核苷酸-或碱基-切补修复的DNA修复涉及内切核酸酶，其引入单链切口。两条DNA链上单链切口或缺口的同时出现导致DSB的形成。在一个类似的方式中，复制叉上游的单链切口或缺口能够通过DNA双螺旋的解旋加工成DSB(Bleuyard等人,2006,DNA repair 5:1-12)。存在两个竞争性通路(图2，来自于Branzei和Foiani,2008-8(9):1038-46)来修复DSBs，即非同源性末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。优选通过在G1时相过程中的非同源性末端连接(NHEJ)修复双链断裂(DSBs)并且通过在细胞周期的S和G2时相过程中的同源重组(HR)修复双链断裂(DSBs)。将Ku异二聚体结合到DSBs上触发了DNA-PK催化亚基的募集和通过NHEJ的DSBs的封闭。相比之下，在S和G2时相过程中发生的DSBs优选通过MRE111-RAD50-NBS1复合物激活ATM。特异于细胞周期S和G2时相的较高周期素依赖性激酶(CDK)活性促进DSB切除，暴露出的单链DNA(ssDNA)的3'突出。当ssDNA的3'突出包被有复制蛋白A(RPA)时，它激活ATR；在介导蛋白如RAD52的帮助下RPA能够被RAD51移除并替换。这导致RAD51突触前丝的形成，其通过入侵双链体中同源区域以形成称作D环的DNA连接(joint)来引发HR，所述D环能够通过DNA合成进一步延伸。通过DNA解旋酶的这种中间体的链置换将反应引向合成依赖性链退火(SDSA)。或者，第二DSB末端能够被捕获，引起双Holliday交叉中间体，其能够通过内切核酸酶来解决或者通过解旋酶(BLM)和拓扑异构酶(TOP3)的联合作用来溶解。
非同源性末端连接通路
NHEJ是DSB修复的主要通路，并且涉及重新结合平末端或具有短突出的末端，并且以断裂末端的识别和并置(juxtaposition)作为开始。这是通过由KU异二聚体(Ku70和Ku80[或Ku86])和DNA-PK催化亚基(DNA-PKcs)组成的DNA-PK复合物促进的。DSB末端的成熟由Artemis实现的(图3，来自于Goodarzi等人，2006)并由Xrcc4/DNA连接酶IV复合物重新封闭。NHEJ是一个相对不精确的过程并且经常伴随着DNA序列的插入和删除(Bleuyard等人,2006,Goodarzi等人,2006The EMBO journal 25:3880-3889)。几个基因已知在NHEJ中发挥作用，所述基因包括KU70、KU80和PARP-1。
可用于用来改变通路(比如dsRNA的产生)的调节的组合物的来自于与NHEJ通路有关的基因的序列从公共数据库中可得到，如对于AtKU70的GenBank登录号AF283759.1以及文中其它部分所描述的。通过设计基于例如可得到的拟南芥序列并随后鉴定所需的直系同源的引物能够鉴定所需植物的特异性序列。
同源重组通路
HR是一种准确的修复过程，其使用姐妹染色单体作为模板并因此保证了修复的保真度。通向HR修复的第一步是DSBs的切除以形成单链3'突出。通过由Mre11、Rad50和Nbs1蛋白质组成的MRN复合物来实现末端加工。在辅助蛋白质的帮助下，Rad51在单链末端上被募集并且促进了同源双链体的入侵(图4,来自于Sugiyama等人,2006The EMBO journal,1-10)。
然后通过DNA合成和捕获的第二DSB末端来延伸捕获的链，导致由内切核酸酶来消除的双-Holliday的形成，导致可通过解旋酶和拓扑异构酶的组合作用来消除的交叉的形成(Bleuyard等人,2006；Branzei和Foiani,2008)。
在一个实施方案中，可以采用能够诱导双链DNA断裂的第二组合物进行第一转染。实例是锌指核酸酶和大范围核酸酶(Cellectis，法国)，和TAL效应子核酸酶(Bosch等人(2009)Science 326:1509-1512；Moscou等人(2009)Science Vol326:1501)。使用已知的技术将锌指核酸酶如此设计以便它们优选在所需的位置诱导双链断裂，其中第二转染在与靶向突变有关的某些实施方案中旨在从致突变的寡核苷酸中引入突变。锌指核酸酶是通常设计成用于切断特定DNA序列的蛋白质。锌指结构域包括当通过锌离子稳定时折叠成特征性结构的大约30个氨基酸。锌指结构域通过插入到DNA螺旋的大沟中能够结合到DNA上。每一个锌指结构域通过锌指α螺旋区域上的关键的氨基酸残基能够结合到具体的DNA三联体(3bps)上。因此，通过改变这些关键的氨基酸，有可能改变锌指对特定三联体的识别特异性并从而创造锌指构建体，专门针对感兴趣的序列。系统的灵活性来自于锌指结构域可以串联到一起以结合到长的DNA序列上的事实。例如，串联的6个锌指结构域识别了特异的18bps序列，序列在复杂的真核细胞基因组中足够长以至于是独特的。锌指核酸酶(ZFN)由一系列融合至核酸酶Fokl的锌指组成。ZFN被引入到细胞中，并且将识别并结合到特异的基因组序列上。因为Fokl核酸酶以二聚体的形式切割，所以需要第二ZFN，其在切割位点对面的DNA链上识别特异的序列。然后在两条靶向DNA序列之间进行DNA切割或双链断裂(DSB)(Miller等人,2007Nature Biotech 25(7):778-785；Cathomen和Joung,2008Mol Ther16(7):1200-1207；Foley等人,2009PLoS ONE 4(2):e4348)。在同源序列(其可以是姐妹染色单体或者是供体DNA构建体)存在的情况下，DSB能够通过HR来修复。不是姐妹染色单体被用于修复，而是信息从引入细胞的供体构建体中被拷贝，借此这是基因靶向过程的基础。供体构建体包含与原来染色体基因座相比的改变，因此HR的过程中将这些改变并入基因组。
第一转染可能包含同时地或相继地(一个接着一个)采用第一和第二组合物二者的转染。
在根据本发明的方法中，进行第二转染以引入一种或多种感兴趣的分子。
感兴趣的分子能够选自化学品、DNA、RNA、蛋白质、寡核苷酸和肽。在某些实施方案中，感兴趣的分子选自dsRNA、miRNA、siRNA、质粒、致突变的寡核苷酸，更优选致突变的寡核苷酸。
在某些实施方案中，可以使用编码ZFN构建体的质粒作为感兴趣的分子。然后，第二转染步骤引入ZFN构建体，其通过表达能够诱导可用于足迹法(footprinting)的DSBs。
在某些实施方案中，致突变的寡核苷酸能够被用作感兴趣的分子。一旦转染到原生质体中，致突变的寡核苷酸能够提供原生质体DNA的改变。优选地，针对致突变的寡核苷酸的靶DNA来自于核DNA。或者，能够使用叶绿体或线粒体DNA。原则上，能够使用迄今为止本领域中描述的任何致突变的寡核苷酸，如RNA/DNA嵌合寡核苷酸、包括那些含有LNAs、硫代磷酸酯/盐、丙炔替代物等的寡核苷酸。
因此，致突变寡核苷酸作为感兴趣的分子的使用提供了寡核苷酸介导的靶向核苷酸交换(ODTNE)。
寡核苷酸介导的靶向核苷酸交换(ODTNE)
寡核苷酸介导的靶向核苷酸交换(ODTNE)是指通过引入突变(如单点突变或删除/插入)利用单链寡核苷酸来改正或改变基因组基因座，从而恢复原有的基因功能。这个概念是基因治疗和个性化用药的基础并且在全球得到广泛研究(Parekh-Olmedo等人,2002,Neuron 33:495-498；Madsen等人,2008PNAS 105:10,3909-3914；Leclerc等人,2009BMC Biotechnology 9:35,1-16)。影响ODTNE的有效性和效率的几个参数已被鉴定，然而一些仍然需要验证，目前十分确定的是，功能MMR系统抵消了ODTNE(Igoucheva等人,2008Oligonucleotides 18:111-122；Kennedy Maguire和Kmiec,2007Gene 386:107-114；Papaioannou等人,2009J.GeneMed.11:267-274)。在该技术中起作用的ODTNE的使用以及寡核苷酸的结构和设计得到很好地描述，尤其在WO98/54330、WO99/25853、WO01/24615、WO01/25460、WO2007/084294、WO2007073149、WO2007073166、WO2007073170、WO2009002150中。基于文中所公开的致突变的寡核苷酸的结构特征和来自于靶序列(待改变的基因)的序列信息，本领域技术人员能够设计出在第二转染步骤中使用的所需的致突变的寡核苷酸。在本发明中使用的致突变的寡核苷酸具有与本领域中使用的其它致突变的寡核苷酸一致的长度，即典型地介于10-60个核苷酸之间，优选20-55个核苷酸，更优选25-50个核苷酸。
使用致突变的寡核苷酸的本发明能够用于例如改变细胞、通过恢复到野生型来改正突变、诱导突变、通过破坏编码区使酶失活、通过改变编码区来改造酶的生物活性、通过破坏编码区来改造蛋白质、改造miRNA靶、改造前体基因和很多更多的目的。
在某些实施方案中，感兴趣的分子是DNA构建体。DNA构建体是含有期望要被引入到细胞中(基因靶向)的序列信息的DNA序列。DNA构建体可以是ZFN构建体。
转染(第一和第二转染二者)能够使用本领域中描述的方法如电穿孔、生物弹道技术、PEG-介导的转染等来完成。优选PEG介导的转染。使用当前水平的本领域方法可以实现常规的转染如PEG-介导的转染(优选的)或生物弹道技术(Sporlein等人(1991)Theor.Appl.Genet.82,712-722；Mathur和Koncz.Methods inMolecular Biology.Vol.82:Arabidopsis protocols.J.Marinez-Zapater和J.Salinas编辑Humana Press Inc.Totowa NJ.；Golds等人(1993)Bio/Technology 11,95-100)。
基因靶向是一个非常强大的技术，其在医药和农业中有许多应用。它允许基因组的精确操纵，使生物学家能够研究并开发基因功能。然而，HR在几乎所有细胞类型中的效率都是低的，因为它依赖于染色体基因座上DSB的存在。因此，ZFN的有用性是其在任何染色体基因座诱导DSB的能力，并且已被用于改善基因靶向效率100倍。一旦产生DSB，它可以通过NHEJ或者HR通路来修复。可以通过抑制NHEJ通路来增强HR的效率，并从而增强基因靶向的效率，从而DSB可以通过HR来修复。确实，这已被证明是在人类和真菌细胞的情况(Fattah等人2008Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:8703-8708；Meyer等人2007J.Biotechnology128:770-775；Bertolini等人，2009Mol.Biotechnol.41:106-114)。NHEJ和HR之间的选择也可能依赖于细胞周期时相，在G1中，由于同源模板的缺失，NHEJ占主导地位，而HR在G2/M中更加活跃，在G2/M中存在有同源姐妹染色单体(Branzei和Foiani,2008,Nature综述了分子生物学)。
植物育种中的ODTNE和ZFN
植物育种通过常规杂交采用自然遗传变异来改善植物性能。然而，自然的变异是有限的并且对于育种计划而言需要很多年才能产生一个有价值的新品种。可以人工地和传统地创造遗传变异，这通过向宿主植物的基因组中引入许多突变的化学突变完成。少数突变将最终提供感兴趣的表型并且能够用于育种计划。然而，这些方法具有缺点如需要许多回交以消除残余的突变和由此类化学品引入的突变的有限的范围。因此，如ODTNE和ZFN的技术代表了以定向且清晰的方式向植物中引入遗传变异的有吸引力的解决方案。然而，将动物系统转化为植物系统代表了相当大的挑战，尤其是复制已知用于促进靶向基因改变的生理条件。
功能MMR系统抵消了ODTNE并且在使用siRNA敲除MSH2之后已经观察到基因修复的大量增加。然而，这些方法使用稳定整合的siRNA构建体，并且因此MSH2从本质上被抑制，这是不利的，因为从长远来看，所得的突变表型将会导致植物死亡。ODTNE也已被显示在细胞周期S时相中的细胞积累中被促进。
用于植物原生质体中特异性mRNA的瞬间抑制的方法已被描述(An等人2003Biosci.Biotechnol.Biochem..67:2674-2677)并且已经发现对于植物中(内源性)MMR基因的瞬时抑制而言这可能是有价值的工具。使用化学品如羟基脲或艾菲地可宁很容易实现S时相中的细胞积累。发明人已经发现，这些各种参数与寡核苷酸递送的协调可能掌控每个单独参数的作用。为了实现这一目标，本发明提供了MMR抑制，而细胞在细胞周期的S时相中积累，随后是寡核苷酸的引入以推动感兴趣的基因的改正。
在引入供体构建体之前，对于基因靶向采用相同的控制，在细胞周期的S/G2/M时相中增加的细胞比例是值得想望的，NHEJ被抑制、ZFN被表达且DSB被产生。
在植物细胞中，外来分子在细胞中的引入并不像是在动物细胞中那么直接，因为存在有一个非常厚的细胞，为了感兴趣的分子到达原生质体需要将其移除。这通过采用纤维素酶和果胶酶的细胞壁酶消化来完成，但是一旦酶混合物被清洗掉，细胞将开始再形成细胞壁。因此，如果想要长时间保留原生质体的转换性，例如至少10、30、60分钟，或1、2、4、6、8、10、12、16或24小时，或以上；例如从10分钟到24小时，关键在于避免细胞壁的再形成。方便地，存在有化学品，其影响细胞壁的合成并且能够用于保持原生质体裸露直至采用各种感兴趣的分子转染。在本申请中，我们提供的证据表明，使用这样的细胞壁抑制剂允许向植物原生质体中相继引入外来分子，导致寡核苷酸介导的靶向基因改变和使用ZFN的基因靶向的效率改善。
因此，在本发明的某些实施方案中，为了避免细胞壁的再形成，将非酶组合物加入到原生质体培养物中。通过破坏、阻止、降低和/或延迟细胞壁的再形成直至细胞达到细胞周期的适当阶段；更多的外来分子可以被递送至细胞中，并且能够实现转染效率的提高。非酶组合物的移除，例如通过清洗或采用不含抑制细胞壁再形成的化合物的培养基替换培养基来允许细胞壁形成并使细胞继续细胞周期。
取决于所需转染的具体情况，可以向植物细胞原生质体中加入非酶组合物。可以：
-在第一转染之前或与其同时；
-介于第一和第二转染之间，
-在第二转染之前或与其同时，或
-在第二转染之后
加入组合物。
可以：
-在第一转染之前或与其同时，
-介于第一和第二转染之间，
-在第二转染之前或与其同时，或
-在第二转染之后并且在允许细胞壁形成之前
移除抑制或避免细胞壁形成的非酶组合物。
以这种方式，考虑到所需的转染，可以抑制细胞壁的再形成。例如，对于如图5所示的在番茄ALS基因座的足迹形成而言，在第一转染步骤之前加入组合物。在另一个实施例中(参见图6和图7)，(几乎)与第一转染同时加入组合物。同样可能的是，允许在短暂的时间段(1-24小时)内再形成细胞壁，然后在第一转染之前停止细胞壁的进一步形成。
介于第一转染和第二转染之间的时间段能够从至少10、30、60分钟，或1、2、4、6、8、10、12、16、24小时，至数天，例如至96小时，或者甚至更多来变化。典型地，时间段是从1小时到72小时，优选从2到48小时，更优选从4至42小时，甚至更优选介于12和36小时之间。
通过向原生质体培养基中加入一种或多种化学(即非酶的)化合物来完成干扰细胞壁的(再)形成(通过抑制、破坏、延迟和/或降低)，例如，化学化合物抑制纤维素沉积或捕捉新生的纤维素微丝从而阻止其并入到有组织的细胞壁中(Parekh-Olmedo等人(2003)Ann.NY Acad.Sci.1002,43-56；Anderson等人(2002)J.Plant Physiol.159,61-67；Meyer和Herth(1978)Chemical inhibition of cell wallformation and cytokinesis,but not of nuclear division,in protoplasts of Nicotianatabacum L.cultivated in vitro.Plant 142(3),253-262)。
在本发明中使用化学化合物在本申请中是指“细胞壁形成抑制剂”。这些化学化合物能够阻止、破坏、抑制和/或延迟纤维素细胞壁的形成，在文中表示“抑制细胞壁的形成”。
只有在不存在细胞壁形成或者至少存在细胞壁形成降低的情况下，可以允许原生质体培养物经历其正常的发展周期。由于原生质体已经经历其发展周期并且已经到达这样一种时相，在该时相时期望的是DNA的合成开始，细胞壁形成抑制剂基本上能够从原生质体培养物中移除，例如通过清洗或者通过培养基的替换。
因此，从抑制剂被加入的时刻开始，采用细胞壁形成抑制剂处理原生质体禁止了细胞壁的形成，例如，至少12-60小时，或24-48小时。因此，在足够的时间里抑制细胞壁的形成允许在细胞周期的某一时间使用常规转染技术，当处于这一时间时细胞通常是不接受转染的。典型地，抑制剂的使用不会影响细胞周期的进程。
优选地，在考虑之中的化学品应该避免细胞壁的再形成而不显著地干扰细胞周期的进程或者在所使用的浓度下对原生质体有害。在本文中，“不显著地干扰”意味着化学品允许以至少50％、至少75％、优选85％、更优选95％的其正常速度(即在不存在化学品的情况下)继续细胞周期的进程。在本文中，“有害”意味着至少50％、至少75％、优选85％、更优选95％的原生质体没有受到化学品以不同于尤其是此处所描述的抑制细胞壁再形成的任何其它方式产生的影响。
各种化学品干扰细胞壁的形成。那些化学品中有许多通常用作除草剂。例如，2,6-二氯苯腈(DCB)(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338；Anderson等人(2002)J.Plant Physiol.159,61-67)是一种众所周知的除草剂，其通过抑制纤维素合成酶因此破坏细胞板的形成(Vaughn等人(1996)Protoplasma 194,117-132)。DCB已被证明抑制纤维素合成酶复合物的运动性而不影响其递送到质膜(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338)。此外，优选的细胞壁形成抑制剂不影响细胞周期的进程(Galbraith和Shields(1982)The effect of inhibitors ofcell wall synthesis on tobacco protoplast development.Physiologia Plantarum 55(1),25-30；Meyer和Herth(1978)Chemical inhibition of cell wall formation andcytokinesis,but not of nuclear division,in protoplasts of Nicotiana tabacum L.cultivated in vitro.Plant 142(3),253-262)，或者仅在有限程度内，因为细胞周期的进程对于本技术而言当然是重要的。DCB不限制细胞周期的进程，因此是优选的细胞壁形成抑制剂。
其它的化学品包括除草剂异噁草胺(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338)，其抑制质膜中纤维素合成酶复合物的整合并且破坏现有的那些。因此，在一个优选的实施方案中，纤维素合成抑制剂是一种纤维素合成酶抑制剂。在另一个实施方案中，化学品干扰了负责纤维素合成的基因，如CESA基因。卡尔科弗卢尔白(也称为荧光增白剂)与纤维素微丝竞争以阻止其整合到配位网络(coordinated network)中(Roncero和Duran(1985)Journal of Bacteriology 163(3),1180-1185,Haigler等人(1980)Science 210(4472),903-906)。
其它的细胞壁形成抑制剂是例如纤维素生物合成酶抑制剂，如腈、苯甲酰胺和/或三唑羧基酰胺除草剂、微管装配抑制剂如二硝基苯胺、氨基磷酸盐/酯、吡啶、苯甲酰胺和/或苯基二甲酸除草剂和/或纤维素沉积抑制剂。
在某些实施方案中，纤维素生物合成抑制剂选自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺(triazofenamide)、多沙唑啉A(phtoxazolin A)、多拉霉素(Phtoramycin)、沙司多素A(thaxtomin A)、布雷菲德菌素A。
在某些实施方案中，微管装配抑制剂选自柯多素(cobtorin)、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、安磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺DCPA(氯酞酸二甲酯)。
在某些实施方案中，纤维素沉积抑制剂是二氯喹啉酸。
在某些实施方案中，细胞壁形成抑制剂选自莫林(morlin)(7-乙氧基-4-甲基色满-2-酮)、异噁草胺(CAS 82558-50-7,N-[3-(1-乙基-1-甲基丙基)-1,2-噁唑-5-基]-2,6-二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944(N2-(1-乙基-3-苯丙基)-6-(1-氟-1-甲基乙基)-1,3,5,-三嗪-2,4-二胺)、二氯苯腈(二氯苄腈)、卡尔科弗卢尔和/或卡尔科弗卢尔白(4,4'-双((4-苯胺基-6-双(2-羟乙基)氨基-s-三嗪-2-基)氨基)-,2,2'-茋二磺酸及其盐)、安磺灵(CASRN—19044-88-3,4-(二丙氨基)-3,5-二硝基苯磺酰胺)、5-叔丁基-氨基甲酰氧基-3-(3-三氟甲基)苯基-4-噻唑烷酮、香豆素、3,4脱氢脯氨酸、
柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺、DCPA(氯酞酸二甲酯)、二氯喹啉酸。
在某些实施方案中，能够使用两种或多种上列化学品的混合物。这些能够同时或相继加入到原生质体样品中。
非酶组合物的数量和浓度在各种化学品(或其混合物)与原生质体系统之间会有所不同，但是基于文中所引用的可得到的文献，连同一些最初的基础实验，可以很容易地由本领域技术人员确定。
植物细胞可以是双子叶植物或单子叶植物的细胞。
在这个方面，优选的双子叶植物选自木兰科、毛茛科、仙人掌科、菊科、壳斗科、茄科、十字花科、唇形科、蔷薇科、木犀科、葫芦科和伞形科。
在这个方面，优选的单子叶植物选自禾本科、兰科、鸢尾科、浮萍科、百合科和葱科。
优选的作物是马铃薯、玉米、番茄、烟草、棉花、大豆、油菜籽。
新鲜分离的原生质体通常在G0被自然地同步(Galbraith和Shields(1982).Physiologia Plantarum 55(1),25-30)。取决于所需的转染和所需的细胞时相(S时相，M时相，G1和/或G2时相)，对于额外的原生质体的同步的需要在某些实施方案中可有利于进一步增强整体过程或转染步骤的效率。不同的原生质体(如来自于叶肉、分生组织或细胞混悬物)可以是或可以不是活跃地分裂的并且细胞时相的同步可以是想要的以完成足够的转染。
因此，在某些实施方案中，方法进一步包含同步植物细胞或植物细胞原生质体的细胞时相的步骤。
细胞时相的同步能够通过营养剥夺如磷酸盐饥饿、硝酸盐饥饿、离子饥饿、血清饥饿、蔗糖饥饿、植物生长素饥饿来完成。同步也能够通过向原生质体样品中加入同步化剂来完成。
同步能够发生：
-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前；或
-在第一转染之前；或
-在第二转染之前；或
-介于第一和第二转染之间；
同步步骤还可以含有移除同步化剂的步骤，例如通过清洗或替换培养基。
-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前；或
-在第一转染之前；或
-在第二转染之前；或
-介于第一和第二转染之间；或
-在第二转染之后或与其同时。
同步步骤可以与采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体的步骤独立地(如在其之前、在其之后或与其同时)进行。
因此，在某些实施方案中，同步化剂能够加入到原生质体样品中。同步化剂如艾菲地可宁(优选)、羟基脲(优选)、胸苷、秋水仙碱、柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、安磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺DCPA(氯酞酸二甲酯)、含羞草碱、茴香霉素、α鹅膏蕈碱、洛伐他汀、茉莉酸、脱落酸、甲萘醌、隐地蛋白、热、过氧化氢、高锰酸钠、吲哚美辛、环氧霉素(epoxomycin)、乳胞素、icrf 193、奥罗莫星、洛克韦汀(roscovitine)、波荷明(bohemine)、星孢菌素、K252a、冈田酸、草藻灭、咖啡因、MG132、周期素依赖性激酶和周期素依赖性激酶抑制剂以及它们的靶向机理、数量和浓度及其相关的细胞周期时相描述于例如“Flow Cytometry with plant cells”,J.Dolezel c.s.编辑.Wiley-VCH Verlag2007pp 327ff中。优选艾菲地可宁和/或羟基脲。
在本发明的方法的优选实施方案中，针对在选定基因座上的足迹形成，方法包含消化细胞壁以产生原生质体，通过包含细胞壁形成抑制剂的组合物(优选DCB)抑制细胞壁，(与第一转染同时或在其之前)加入同步化剂(优选羟基脲)，加入抗KU70(第一组合物)的dsRNA，(例如，优选在大约6、12、18或24小时的时间段之后)加入ZFN构建体(第二组合物或第二转染)，与第二转染同时或恰好在其之前移除同步化剂的步骤。
在优选的实施方案中，目的在于基因靶向事件，根据本发明的方法包含形成植物细胞原生质体，加入细胞壁形成抑制剂，加入同步化剂、ZFN构建体和/或针对例如但不仅限于KU70(NHEJ)的dsRNA(第一转染)以及在例如6、12、18或24小时的同步时期之后，采用移除同步化剂的供体构建体的第二转染。
在目的在于原生质体中ODTNE的优选实施方案中，在原生质体形成之前，为植物细胞提供同步化剂长达48小时。在细胞壁消化之后，连同针对MMR(MSH2或其它MMR有关基因)的dsRNA加入细胞壁抑制剂(第一转染)。在所需的细胞周期时相，细胞壁抑制被提升，除去同步化剂，对于第二转染加入致突变寡核苷酸并允许细胞继续细胞周期。
本发明还涉及用于转染植物细胞原生质体的试剂盒，其包含选自第一组合物、第二组合物、抑制或阻止细胞壁形成的非酶组合物、同步化剂中的两种或多种以及感兴趣的外来分子中的一种或多种。
附图说明
图1：在错配识别之后，给下游MMR发信号的图解示意图。
图2：取自于Branzei和Foiani,2008-8(9):1038-46的NHEJ和HR的图解示意图。
图3：DSB末端成熟的图解示意图。
图4：同源重组的图解示意图。
图5：用于植物原生质体中足迹形成的实验设计。
图6：用于基因靶向事件的实验设计。
图7：用于BY-2原生质体中meGFP恢复的实验设计。
图8：通过dsRNA的加入烟草和马铃薯原生质体中MSH2的水平。
具体实施方式
通过下列非限制性条款能够概括本发明
1、用于向植物细胞原生质体中引入一种或多种感兴趣的分子的方法，其包含如下步骤
-通过酶降解和/或从植物细胞中移除细胞壁来提供植物细胞原生质体；
-进行植物细胞原生质体的第一转染，所述转染采用
i.能够改变选自错配修复系统、非同源性末端连接的一种或多种通路的调节的第一组合物；和/或
ii.能够诱导DNA双链断裂的第二组合物
-采用一种或多种感兴趣的分子进行植物细胞原生质体的第二转染；
-允许细胞壁形成；
其中第二转染在第一转染之后进行。
2、根据条款1所述的方法，其中能够诱导DNA双链断裂的第二组合物选自锌指核酸酶、大范围核酸酶和编码锌指核酸酶或大范围核酸酶的DNA构建体。
3、根据条款1所述的方法，其中第一组合物和第二组合物基本上同时提供给植物细胞原生质体。
4、根据条款1所述的方法，其中第一组合物在第二组合物之前加入。
5、根据条款1所述的方法，其中第二组合物在第一组合物之前加入。
6、根据条款1所述的方法，其中调节的改变是一种或多种通路的下调，优选通路的瞬时下调。
7、根据条款1所述的方法，其中所述方法进一步包含采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体
-在第一转染之前或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间，或
-在第二转染之前或与其同时；或
-在第二转染之后，
并且所述方法进一步包含移除抑制或阻止细胞壁形成的非酶组合物的步骤
-在第一转染之前或与其同时，或
-介于第一和第二转染之间，或
-在第二转染之前或与其同时，或
-在第二转染之后，
并且在允许细胞壁形成之前。
8、根据条款1所述的方法，其进一步包含同步植物细胞或植物细胞原生质体的细胞周期时相的步骤。
9、根据条款8所述的方法，其中同步通过采用同步化剂接触植物细胞或植物细胞原生质体来完成，优选
-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前或与其同时；或
-在第一转染之前或与其同时；或
-在第二转染之前或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间。
10、根据条款9所述的方法，其中所述方法进一步包含移除同步化剂的步骤
-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前；或
-在第一转染之前或与其同时；或
-在第二转染之前或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间。
11、根据条款8所述的方法，其中同步步骤与采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体的步骤独立地(如在其之前、在其之后或与其同时)进行。
12、根据条款7所述的方法，其中抑制细胞壁形成的非酶组合物含有一种或多种细胞壁形成抑制剂，所述细胞壁形成抑制剂选自
a.纤维素生物合成抑制剂；
b.微管装配抑制剂；
c.纤维素沉积抑制剂；
d.其它细胞壁形成抑制剂。
13、根据条款12所述的方法，其中纤维素生物合成抑制剂选自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺、多沙唑啉A、多拉霉素、沙司多素A、布雷菲德菌素A。
14、根据条款12所述的方法，其中微管装配抑制剂选自柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、安磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺DCPA(氯酞酸二甲酯)。
15、根据条款12所述的方法，其中纤维素沉积抑制剂是二氯喹啉酸。
16、根据条款12所述的方法，其中其它细胞壁形成抑制剂选自莫林(7-乙氧基-4-甲基色满-2-酮)、异噁草胺(CAS 82558-50-7,N-[3-(1-乙基-1-甲基丙基)-1,2-噁唑-5-基]-2,6-二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944(N2-(1-乙基-3-苯丙基)-6-(1-氟-1-甲基乙基)-1,3,5,-三嗪-2,4-二胺)、二氯苯腈(二氯苄腈)、卡尔科弗卢尔和/或卡尔科弗卢尔白(4,4'-双((4-苯胺基-6-双(2-羟乙基)氨基-s-三嗪-2-基)氨基)-,2,2'-茋二磺酸及其盐)、安磺灵(CASRN—19044-88-3,4-(二丙氨基)-3,5-二硝基苯磺酰胺)、5-叔丁基-氨基甲酰氧基-3-(3-三氟甲基)苯基-4-噻唑烷酮、香豆素、3,4脱氢脯氨酸、
柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶、炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺、DCPA(氯酞酸二甲酯)、二氯喹啉酸。
17、根据条款1所述的方法，其中第一组合物能够改变MutS、MutL、MutH、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、MLH2、MLH3、PMS1、DNA-PK复合物Ku70、Ku80、Ku86、Mre11、Rad50、RAD51、XRCC4、Nbs1、PARP-1中一种或多种的调节。
18、根据条款1所述的方法，其中第一组合物包含dsRNA。
19、根据条款1所述的方法，其中第二转染中的一种或多种分子选自化学品、DNA、RNA、蛋白质、寡核苷酸、mRNA、siRNA、miRNA、肽、质粒、脂质体、致突变的寡核苷酸。
20、根据条款8所述的方法，其中细胞周期时相的同步在细胞周期的S时相、M时相、G1和/或G2时相中同步原生质体。
21、根据条款8所述的方法，其中细胞周期时相的同步通过营养剥夺如磷酸盐饥饿、硝酸盐饥饿、离子饥饿、血清饥饿、蔗糖饥饿、植物生长素饥饿来完成。
22、根据条款9所述的方法，其中同步化剂选自艾菲地可宁、羟基脲、胸苷、秋水仙碱、柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、安磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺DCPA(氯酞酸二甲酯)、含羞草碱、茴香霉素、α鹅膏蕈碱、洛伐他汀、茉莉酸、脱落酸、甲萘醌、隐地蛋白、热、过氧化氢、高锰酸钠、吲哚美辛、环氧霉素、乳胞素、icrf 193、奥罗莫星、洛克韦汀、波荷明、星孢菌素、K252a、冈田酸、草藻灭、咖啡因、MG132、周期素依赖性激酶和周期素依赖性激酶抑制剂中的一种或多种。
23、植物细胞原生质体，其采用如条款19所定义的外来分子转染。
24、用于转染植物细胞原生质体的试剂盒，其包含选自第一组合物、第二组合物、抑制或阻止细胞壁形成的非酶组合物、同步化剂中的两种或多种以及感兴趣的外来分子中的一种或多种。
植物错配修复基因和非同源性末端连接基因
从公共数据库中筛选出分享与参与MMR通路(MSH2)和NHEJ通路(Ku70)的基因同源性的烟草和番茄EST。用于生产dsRNA的区域用下划线表示。根据本领域中熟知的操作生产dsRNA。此外，非特异性dsRNA种类产生自质粒，其显示与任何感兴趣的基因都没有显著的同源性。这被用来作为对照，以证明dsRNA的存在本身不负责特异性mRNA的抑制。
番茄Ku70
GGAAGATCTGAACGACCAGCTTAGGAAACGCATGTTTAAGAAGCGCAGAGTTCGAAGACTTCGACTTGTAATTTTTAATGGATTATCTATCGAACTTAACACCTATGCTTTGATCCGTCCAACTAATCCAGGGACAATTACTTGGCTTGATTCGATGACTAATCTTCCTTTGAAGACTGAGAGAACCTTCATATGTGCTGATACTGGTGCTATAGTTCAGGAGCCTCTAAAACGCTTTCAGTCTTACAAAAATGAGAATGTC ATCTTTTCTGCGGATGAGCTTTCAGAAGTCAAAAGAGTTTCAACTGGACATC TTCGTCTGTTGGGCTTCAAGCCTTTGAGCTGCTTAAAAGACTATCATAACCTG AAGCCAGCAACTTTTGTCTTTCCCAGTGATGAGGAAGTGGTTGGAAGCACTT GTCTTTTCGTTGCTCTCCAAAGATCAATGTTGCGGCTTAAGCGTTTTGCAGTT GCTTTCTATGGGAATTTAAGTCATCCTCAATTGGTTGCTCTTGTTGCACAAGATGAAGTAATGACTCCTAGTGGTCAAGTCGAGCCACCAGGGATGCATCTGATTTATCTTCCATATTCTGATGATATCAGACATGTTGAAGAGCTTCATACTGATCCTAATTCCGTGCCTCATGCCACTGATGACCAGATAAAGAAGGCCTCCGCTTTAGTGAGACGTATTGACCTCAAAGATTTTTCTGTGTGGCAATTTGCTAATCCTGCATTGCAGAGACATTATGCAGTATTACAAGCTCTTGCACTTG[SEQ ID NO 1]。
烟草MSH2
GGAGCTACTGATAGATCATTGATTATAATTGATGAGTTGGGCCGTGGTACATCAACCTATGATGGCTTTGGTTTAGCTTGGGCTATTTGTGAGCACATTGTTGAAGAAATTAAGGCACCAACATTGTTTGCCACTCACTTTCATGAGCTGACTGCATTGGCCAACAAGAATGGTAACAATGGACATAAGCAAAATGCTGGGATAGCAAATTTTCATGTTTTTGCACACATTGACCCTTCTAATCGCAAGCTAACTATGCTTTACAAGGTTCAACCAGGTGCTTGTGATCAGAGTTTTGGTATTCATGTTGCTGAATTTGCAAATTTTCCACCGAGTGTTGTGGCCCTGGCCAGAGAAAAGGCATCTGAGTTGGAGGATTTCTCTCCTATTGCCATAATTCCAAATGACATTAAAGAGGCAG CTTCAAAACGGAAGAGAGAATTTGACCCTCATGACGTGTCTAGAGGTACTGC CAGAGCTCGGCAATTCTTACAGGATTTCTCTCAGTTGCCACTGGATAAGATGG ATCCAAGCGAGGTCAGGCAACAGTTGAGCAAAATGAAAACCGACCTGGAGA GGGATGCAGTTGACTCTCACTGGTTTCAGCAATTCTTTTAGTTCTTCAGATTAGAACTATATCTTCTATTCTGTGAAGCTTGGGGGAATGATAGTGATGGGTTTTGTGGATATAACTTAGCCTAAGTGTAAAGTTTCGTTTAAATCCTTACCCCAAACATGATTCTCTGTAATCAGGGGACTTTTGTATGCATCCTGTGTTAAATAGTAAACGTTATCTTATGGTCAGCTAACATTGGTAGTAGTCTATTGAATTATTCCTTCACAACGACTAAACAACCTTCCCTTCTCTTAAAACACCCTAAACT[SEQ ID NO 2]。
NtMSH2和LeKu70的下调的评价
采用针对LeKu70的dsRNA或MilliQ水转染原生质体之后的二十四小时，使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用Quantitect RT试剂盒(Qiagen)进行cDNA合成。使用Light Cycler设备(Roche)测量内源性LeKu70的水平。用于mRNA定量的引物如下所列。
番茄原生质体分离
在25℃和60-70％RH下，采用16/8小时的2000lux的光周期将番茄M82栽培品种的体外茎尖培养物保持在补充有0.8％微琼脂的MS20培养基上。将一克嫩叶在CPW9M中轻轻地切片并转移至酶溶液中(CPW9M含有2％纤维素onozukaRS、0.4％离析酶onozuka R10、2.4-D(2mg/ml)、NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)pH5.8)和羟基脲(2mM))。允许消化在黑暗中于25℃过夜进行。第二天清晨，将平皿轻轻旋动一小时以释放原生质体。将原生质体混悬物通过50μM目不锈钢筛网过滤并且通过在室温于85×g离心5分钟收获原生质体。将原生质体沉淀物在补充有2mM羟基脲的CPW9M中重新混悬并且将3毫升的CPW18S加入到每个管的底部。收集离心(10分钟，室温，85×g)过程中在两层之间的界面处积累的活原生质体并且使用血球计数器评价它们的密度。通过在室温下于85×g离心5分钟收获原生质体并且在补充有2mM羟基脲的MaMg培养基中重新混悬至每毫升106的最终密度。
番茄原生质体转染
足迹形成(实施例1)
对于每一次转染而言，将250000个原生质体与25μg的针对番茄Ku70的双链RNA和250μL的PEG溶液(40％的PEG4000(Fluka#81240)、0.1M的Ca(NO3)2、0.4M甘露醇)混合。允许转染于室温进行20分钟。逐滴加入5mL 0.275M的Ca(NO3)2并充分混合。通过在室温于85×g离心5分钟收获转染的原生质体并在CPW9M中清洗两次。最后，将原生质体重新混悬于补充有2mg.L-1的二氯苯腈和2mM的羟基脲的K8p中至每毫升250000个的最终密度并且在黑暗中于25℃孵育过夜。第二天清晨，通过在室温于85×g离心5分钟收获原生质体，在补充有2mM羟基脲的CPW9M中清洗一次并且按照上述分离活原生质体。将活原生质体重新混悬于MaMg中至每毫升106个的最终密度并且如上所述采用20μg的ZFN构建体转染(Townsend等人,2009Nature)。然后将原生质体嵌入到海藻酸盐/酯中并且在K8p培养基中培养。
基因靶向(实施例2)
对于每一转染而言，将250000个原生质体与25μg的针对番茄Ku70的双链RNA、20μg的ZFN构建体(Townsend等人,2009Nature)和250μL的PEG溶液(40％的PEG4000(Fluka#81240)、0.1MCa(NO3)2、0.4M甘露醇)混合。允许转染于室温进行20分钟。逐滴加入5mL 0.275M的Ca(NO3)2并充分混合。通过在室温下于85×g离心5分钟收获转染的原生质体并在CPW9M中清洗两次。最后，将原生质体重新混悬于补充有2mg.L-1的二氯苯腈和2mM的羟基脲的K8p中至每毫升250000个的最终密度并且在黑暗中于25℃孵育过夜。第二天清晨，通过在室温下于85×g离心5分钟收获原生质体，在补充有2mM羟基脲的CPW9M中清洗一次并且如上所述分离活原生质体。将活原生质体重新混悬于MaMg中至每毫升106个的最终密度并且如上所述采用20μg的供体构建体转染。然后将原生质体嵌入到海藻酸盐/酯中并且在K8p培养基中培养。
足迹的检测(实施例1)
在3天的培养之后，将海藻酸盐/酯的碟溶解于枸橼酸钠中，通过离心收获原生质体并在液氮中冷冻用于随后的使用DNAeasy试剂盒(Qiagen)的DNA提取。通过PCR使用校读Taq聚合酶扩增全长ALS开放阅读框，PCR产物克隆到TOPOXL PCR克隆载体(Invitrogen)并转化到大肠杆菌One Shot TOP10感受态细胞(E.Coli One Shot TOP10competent cells)中(Invitrogen)。将细菌涂覆在补充有100μg.mL-1羧苄青霉素的LB琼脂上并于37℃孵育过夜。第二天清晨，400个单独克隆被选取并用于Light Cycler设备(Roche)上的高分辨熔解曲线分析以鉴定在ALS基因座具有错配的克隆。通过测序证实阳性克隆。
基因靶向事件的检测(实施例2)
在14天的培养之后，将海藻酸盐/酯的碟切成5mm的条并且放在采用0.8％微琼脂固化并且补充有20nM氯磺隆的TM-DB培养基的表面上。来自于基因靶向事件的愈伤组织将抵抗氯磺隆并且将在6-8周内发展。将抗性愈伤组织取样，使用Qiagen植物DNA easy试剂盒提取DNA。通过PCR扩增ALS基因的全长编码序列并通过测序证实突变的存在。
实施例3
植物细胞系
通过在蛋白质的发色团区域中引入点突变(这将导致过早终止密码子的形成)来生产含有非功能性EGFP基因的烟草亮黄2细胞混悬物。该细胞系被用作报告系统来测试各种参数对通过寡核苷酸介导的靶向基因修复的EGFP基因修复的影响。
ATGGGAAGAGGATCGCATCACCACCATCATCATAAGCTTCCAAAGAAGAAGAGGAAGGTTCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCTAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA[SEQ ID NO 7]。
突变的EGFP(mEGFP)的cDNA序列，突变的位置采用下划线和粗体表示(G变成T)。
修复和对照寡核苷酸序列
GFP 7 SEQ ID NO 8 T*G*A*A*CAGCTCCTCGCCCTTGC*T*C*A*C
GFP 8 SEQ ID NO 9 T*G*A*A*CAGCTCCTAGCCCTTGC*T*C*A*C
*表示硫代磷酸酯/盐修饰
烟草原生质体分离
将在BY-2培养基(Nagata等人1999Method Cell Sci)中保持一周的5mL的7天龄烟草亮黄2(BY-2)细胞混悬培养物转移到50mL锥形瓶中，所述锥形瓶含有45mL的BY-2培养基，所述BY-2培养基补充有2mM羟基脲。允许细胞分裂24小时并通过室温下于1000rpm离心10分钟收获。向细胞压积(packed cellvolume)中加入25mL MDE(900ml总容积中的0.25g KCl、1.0g MgSO4.7H2O、0.136g KH2PO4、2.5g聚维酮(MW10000)、6mg萘乙酸和2mg 6-苄氨基嘌呤。采用山梨醇将溶液的同渗容摩调节至600mOsm.kg-1，pH调节至5.7)中的BY-2酶混合物(1％(W/V)的纤维素Onozuka RS、0.05％的果胶酶Y23、0.2％的来自担子菌(Basidiomycetes sp)的崩溃酶)。将细胞转移至TC质量级的平皿中并且允许消化于25℃在轻轻地摇动下(40rpm)进行4小时。将原生质体混悬物通过50μm目不锈钢筛网过滤并且通过在5℃下于800rpm离心5分钟收获。将原生质体重新混悬于补充有2mM羟基脲的冰冷KC清洗培养基(0.2％CaCl2.2H2O、1.7％KCl、采用KCl的540mOsm.Kg-1、pH 5.7)中并且在5℃下于800rpm离心5分钟。将原生质体重新混悬于补充有2mM羟基脲的KC清洗培养基中并且将3mL CPW18S加入到每个管的底部。活原生质体将在5℃下于800rpm离心10分钟的过程中在两种培养基的界面处积累。收获活原生质体并使用血球计数仪评价它们的密度。使用冰冷KC清洗培养基将原生质体的浓度调节至每mL106个。
烟草原生质体转染
正如对番茄原生质体一样进行烟草原生质体转染。采用针对烟草MSH2的12.5μg dsRNA转染烟草原生质体。转染的原生质体重新混悬于补充有2mM羟基脲和2mg.L-1二氯苯腈的2.5mL To培养基中。To培养基(每升，pH5.7)含有950mgKNO3、825mg NH4NO3、220mg CaCl2.2H2O、185mg MgSO4.7H2O、85mg KH2PO4、27.85mg FeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O、根据Heller培养基的微营养物(Heller,R.1953Ann Sci Nat Bot Biol Veg)、根据Morel和Wetmore培养基的维生素(Morel,G.和R.H.Wetmore 1951Amer.J.Bot.)、2％(W/V)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg 6-苄氨基嘌呤和一定量的甘露醇以带来540mOsm.kg-1的同渗容摩并且转移至35mm的平皿中。第二天，通过离心收获原生质体并采用补充有2mM羟基脲和2mg.L-1二氯苯腈的冰冷KC清洗培养基清洗。收获活原生质体并且如上所述采用1.6nmol寡核苷酸转染，所述寡核苷酸与转录链互补并且含有(GFP 7)或不含(GFP 8)一段与靶向序列错配的序列。通过在3'和5'末端二者之上结合的4硫代磷酸酯/盐保护寡核苷酸避免核酸酶的降解。最终将原生质体重新混悬在不含羟基脲或二氯苯腈的To培养基中。24小时以后，使用配备带通(band pass)GFP过滤立方体并装有CFI Super Plan Fluor ELWD 20XC物镜的Nikon Eclipse TS100-F给EGFP的恢复评分。
结果
烟草和番茄MSH2的下调
图8给出了结果。结果表明，分离之后MSH mRNA的水平增加。叶片原生质体的大部分来自于不积极地分裂的叶肉细胞。分离之后，培养基中的激素诱导细胞重新进入细胞周期和随之而来的MMR基因水平的诱导。非特异性dsRNA(没有与MSH2分享同源性)没有影响表达水平，而MSH2dsRNA有效地将MSH2mRNA水平降低至通过分离从原生质体中发现的水平的5-20％。我们对于靶向MLH1和KU70二者的dsRNA发现了类似的结果。
番茄ALS基因座的足迹形成(实施例1，图5)
所有样品均采用2mM羟基脲处理(参见材料和方法)
番茄ALS基因座处的基因靶向事件(实施例2，图6)
实施例2：用于在植物原生质体中高效的基因靶向的实验设计，参见图6。
所有样品均采用2mM羟基脲处理(参见材料和方法)
BY-2原生质体中meGFP的恢复
实施例3：用于在植物原生质体中有效的ODTNE的实验设计，参见图7。
所有样品均采用2mM羟基脲处理(参见材料和方法)
从上述实施例中可以清楚地得出，对于借助细胞壁抑制的足迹形成、基因靶向或ODTNE所需的事件序列的优化导致所有描述的方法中实质性的改进。
Claims (27)
1.一种用于向植物细胞原生质体中引入一种或多种感兴趣的分子的方法，其包含如下步骤
-通过酶降解和/或从植物细胞中移除细胞壁来提供植物细胞原生质体；
-用能够诱导DNA双链断裂的组合物进行植物细胞原生质体的第一转染；
-采用一种或多种感兴趣的分子进行植物细胞原生质体的第二转染，所述分子选自化学品、DNA、RNA、dsRNA、蛋白质、寡核苷酸、mRNA、siRNA、miRNA、肽、质粒、脂质体以及致突变的寡核苷酸；
-允许细胞壁形成；
其中第二转染在第一转染之后进行，以及其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是至少1、2、4、6、8、10、12、16或24小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中能够诱导DNA双链断裂的组合物选自锌指核酸酶、大范围核酸酶或TAL效应子核酸酶、编码锌指核酸酶的DNA构建体、编码大范围核酸酶的DNA构建体、编码TAL效应子核酸酶的DNA构建体。
3.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是96小时以下。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是从1小时至72小时。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是从2至48小时。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是从4至42小时。
7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中介于第一转染和第二转染之间的时间段是介于12和36小时之间。
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种感兴趣的分子选自DNA、寡核苷酸、质粒以及致突变的寡核苷酸。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是基因靶向和/或靶向诱变。
10.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中第一转染和/或第二转染是PEG介导的转染。
11.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体
-在第一转染之前或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间，或
-在第二转染之前或与其同时，或
-在第二转染之后。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法进一步包含移除抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物的步骤：
-在第一转染之前或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间；或
-在第二转染之前或与其同时；或
-在第二转染之后，
以及在允许细胞壁形成之前。
13.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含同步植物细胞或植物细胞原生质体的细胞周期时相的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中同步通过采用同步化剂接触植物细胞或植物细胞原生质体来完成，优选
-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前、或与其同时；或
-在第一转染之前、或与其同时；或
-在第二转染之前、或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包含移除同步化剂的步骤：
-在由植物细胞形成植物细胞原生质体之前；或
-在第一转染之前、或与其同时；或
-在第二转染之前、或与其同时；或
-介于第一和第二转染之间；或
-在第二转染之后、或与其同时。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中同步步骤与采用抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物接触植物细胞原生质体的步骤独立地，如在其之前、在其之后或与其同时进行。
17.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中抑制细胞壁形成的非酶组合物含有一种或多种细胞壁形成抑制剂，所述细胞壁形成抑制剂选自
a.纤维素生物合成抑制剂；
b.微管装配抑制剂；
c.纤维素沉积抑制剂；
d.其它细胞壁形成抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中纤维素生物合成抑制剂选自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺、多沙唑啉A、多拉霉素、沙司多素A以及布雷菲德菌素A。
19.根据权利要求17所述的方法，其中微管装配抑制剂选自柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、安磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特以及牧草胺DCPA(氯酞酸二甲酯)。
20.根据权利要求17所述的方法，其中纤维素沉积抑制剂是二氯喹啉酸。
21.根据权利要求17所述的方法，其中其它细胞壁形成抑制剂选自莫林(7-乙氧基-4-甲基色满-2-酮)、异噁草胺(CAS 82558-50-7,N-[3-(1-乙基-1-甲基丙基)-1,2-噁唑-5-基]-2,6-二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944(N2-(1-乙基-3-苯丙基)-6-(1-氟-1-甲基乙基)-1,3,5,-三嗪-2,4-二胺)、二氯苯腈(二氯苄腈)、卡尔科弗卢尔和/或卡尔科弗卢尔白(4,4'-双((4-苯胺基-6-双(2-羟乙基)氨基-s-三嗪-2-基)氨基)-,2,2'-茋二磺酸及其盐)、安磺灵(CASRN—19044-88-3,4-(二丙氨基)-3,5-二硝基苯磺酰胺)、5-叔丁基-氨基甲酰氧基-3-(3-三氟甲基)苯基-4-噻唑烷酮、香豆素、3,4脱氢脯氨酸、柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶、炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺、DCPA(氯酞酸二甲酯)以及二氯喹啉酸。
22.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中致突变的寡核苷酸具有10-60个核苷酸长。
23.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中细胞周期时相的同步在细胞周期的S时相、M时相、G1和/或G2时相中同步原生质体。
24.根据权利要求13-16或23中任一项所述的方法，其中细胞周期时相的同步通过营养剥夺、如磷酸盐饥饿、硝酸盐饥饿、离子饥饿、血清饥饿、蔗糖饥饿、植物生长素饥饿来完成。
25.根据权利要求14所述的方法，其中同步化剂选自艾菲地可宁、羟基脲、胸苷、秋水仙碱、柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟灵)、丁乐灵、敌乐胺、乙丁烯氟灵、安磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺＝拿草特、牧草胺DCPA(氯酞酸二甲酯)、含羞草碱、茴香霉素、α鹅膏蕈碱、洛伐他汀、茉莉酸、脱落酸、甲萘醌、隐地蛋白、热、过氧化氢、高锰酸钠、吲哚美辛、环氧霉素、乳胞素、icrf 193、奥罗莫星、洛克韦汀、波荷明、星孢菌素、K252a、冈田酸、草藻灭、咖啡因、MG132、周期素依赖性激酶和周期素依赖性激酶抑制剂中的一种或多种。
26.一种根据上述权利要求1-25中任一项所述的方法获得的植物细胞原生质体。
27.一种用于转染植物细胞原生质体的试剂盒，其包含选自能够诱导DNA双链断裂的组合物、抑制或阻止细胞壁(再)形成的非酶组合物、同步化剂中的两种或多种、以及感兴趣的外来分子中的一种或多种。
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