CN104611368A - 重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。该方法包含以下步骤:1)使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及带有胰腺ela-荧光筛选标签和Cas9靶标片段的供体载体，2)在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；4)G0代胚胎通过胰腺ela-荧光标签进行筛选，并对F1进行southern blot鉴定。本发明为利用爪蛙为模式动物研究遗传学和研究人类疾病奠定基础。

Description

重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。

背景技术

非洲爪蛙(Xenopus laevis)是一种早期胚胎学研究的经典模式动物。有胚胎个体大，产卵量多等优点。热带爪蛙(Xenopus tropicalis)具备非洲爪蛙的全部优点，另外该物种个体较小，繁殖周期短(4-5个月)，并且是二倍体品种，适合做遗传学研究。

热带爪蛙全基因组测序已完成，其基因组有约17亿个碱基对，包含2万至2.1万个基因，其中约1700个基因与人类相应的基因非常相似，所有人类基因中近80％的与遗传性疾病有关的基因都可在热带爪蟾的基因中找到对应处(Hellsten et al.，2010)。而这些基因与癌症、哮喘、心脏病等疾病的发病有关。所以，热带爪蛙是一个很好的研究基因功能，寻找疾病相关因子，建立遗传疾病，建立大规模药物筛选的理想模型。

以前，爪蛙通过mRNA注射达到基因过表达的目的，用morpholino注射达到基因敲降的目的。但是这两种方法都具有时效性，不能长期做遗传学研究。

20世纪末期，科学家用基因同源重组技术完成了基因敲除与定点修饰，这种方法由于效率极低(Thomaset al.，1987)，对生命科学的研究帮助仅局限于有胚胎干细胞与体细胞核移植技术成熟的物种。随着人们对生物学的进一步了解，发现DNA双链断裂可以有效的提高基因定点修饰的效率(Jasin.，1996)，基于此，近年来，随着能造成基因组定点双链断裂的工具，如ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9等的不断兴起，目前已成功地在多种物种的胚胎水平进行基因敲除与基因定点修饰。

利用基因打靶技术(ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9)在热带爪蛙和非洲爪蛙中，通过基因双链断裂后的非同源末端修复，造成移码突变，达到特定基因功能缺失的目的，实现了基因的定点破坏(Young et al.，2011；Lei et al.，2012；Ishibashi et al.，2012；Nakayama et al.，2013；Blitz et al.，2013；Guo et al.，2014)，使得爪蛙在探索生物机制与生物医药中的作用大大增加。但是，在研究中，仅仅特定基因功能缺失存在很大的局限性，在大多数研究中，我们需要进行基因的时空表达调节与标记，定点突变相关因子建立人类疾病模型等。这时，我们需要对内源基因的某些位点进行精确的定点修饰与编辑。所以，在爪蛙中实现基于重组的基因定点修饰是非常重要的。

目前，在基因定点敲入修饰中，出现的各种技术主要可以分为两类。

1.由同源重组机制介导的基因定点修饰。这种技术通过模板的不同主要分为双链质粒模板，线性化质粒模板，单链模板介导的同源重组介导的基因定点修饰。

其缺点是：对同源臂要求高，效率低，并且繁琐。

2.由非同源末端连接机制介导的基因定点修饰。这种技术最近兴起，分别在细胞水平，模式动物斑马鱼中完成了基因定点修饰。但在斑马鱼中存在不在读码框内的现象(Auer et al.，2014)，使得效率降低2/3。

最近，在非洲爪蛙中利用非同源末端连接机制介导的基因定点修饰技术实现了基因定点修饰(Nakadeet al.，2014)。但是，该文章数据显示，这种修饰没有经过生殖腺进行传递的信息，并且局限于表达强度高的基因。对于表达弱的基因或lncRNA是无法进行插入筛选。

所以，在热带爪蛙中实现高效、精确、可筛选、可遗传的基因定点敲入技术是非常重要的。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用、一种在发生重组后不产生移码突变的载体及应用、和一种用于在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的试剂盒。

第一方面，本发明提供了一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，所述方法包含以下步骤：1)使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；

其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。

如本发明所述的，″向导RNA″与″gRNA″互用。

如本发明所述的，″供体载体″与″donor载体″互用。

如本发明所述的，如现有文献记载的，所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA，所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合，所述Cas9核酸酶带有核定位信号肽，本发明中，所述骨架RNA片段、Cas9核酸酶均为行业内常用序列。

在本发明一实施例中，所述骨架RNA片段为由SEQUENCE NO.1所示核苷酸所示DNA转录出来的。

在本发明一实施例中，所述向导RNA中，能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为如SEQUENCENO.2(ets1：GGTTCAGAGAATTCAGAGGG)；SEQUENCE NO.3(ets2：GGTCTGGACTCTTACTCTCA)；或SEQUENCE NO.4(tyr：GGGGTCCCTAACTTCCTCTA)所示DNA转录出来的。

在本发明一实施例中，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因核苷酸序列如SEQUENCENO.5所示。

如本发明所述的，如现有文献记载的，所述双链Cas9靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-N_x-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，18≤X≤22，但不限于此。

在本发明一优选实施例中，所述5’-GG-N_x-NGG-3’中，X＝18。

在本发明一实施例中，所述步骤1)中，所述使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为：向爪蛙受精卯中直接注射所述向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体。

在本发明另一实施例中，所述步骤1)中，所述使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为：向爪蛙受精卯中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体以及供体载体，所述向导RNA的表达盒在爪蛙受精卯中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在爪蛙受精卯中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。

在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，向爪蛙受精卯中进行注射时，采用显微注射，并且在受精卯未卯裂之前，注射于受精卯动物极区域。

在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述供体载体还包括荧光报告基因表达盒，所述荧光报告基因表达盒采用胰腺启动子。

在该实施方式中，本发明第一方面所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，所述方法优选为包含以下步骤：1)使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及具有胰腺启动子ela-荧光筛选标签的供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入，4)G0代胚胎通过胰腺启动子ela-荧光筛选标签进行筛选(优选地，筛选之后对F1再进行southern blot鉴定)；

其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。

在该实施方式中，所述荧光报告基因表达盒中的荧光报告基因优选为独立于待敲入的基因及Cas9靶标片段表达。

在该实施方式中，所述荧光报告基因表达盒中的荧光报告基因优选为GFP报告基因。在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述供体载体还包括爪蛙基因组的内含子序列和外显子序列，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段位于所述内含子序列中，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因依次连接。

如本发明所述的，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因″依次连接″为使得Cas9靶标片段被CRISPR/Cas系统识别，并能使得待敲入基因发生重组，整合到爪蛙基因组中去的连接顺序。

在该实施方式中，在发生重组后，依赖内源的内含子剪切机制，达到不移码突变的效果。所述内含子序列(含有Cas9靶标片段)和外显子序列优选均来源于爪蛙基因组，是本发明在爪蛙基因组中筛选所得，具体设计为：在需要进行操作的基因的某个较长的内含子选择Cas9靶位点。当选择的靶位点，破坏效率较高时，利用PCR将含有该靶点的内含子和下游临近的外显子扩增出，克隆到载体(比如pBS-ela-GFP)中，将需要表达的元件(待敲入基因)克隆到该序列之后，并且确认在该基因的编码框内。在发生重组后，依赖内源的内含子剪切机制，达到不移码突变的效果。

在该实施方式中，需要表达的元件(待敲入基因)可包括任何想要研究、敲入的目标基因，如外源基因、标签序列等，该目标基因优选设置于上述的外显子序列下游或中间。

在该实施方式中，本发明采用的含有Cas9靶标片段的内含子序列优选为来源于爪蛙基因组，进一步优选为热带爪蛙tyrosinase基因、ndrg1基因或tubb2b基因的内含子，其中，tyrosinase基因的靶标序列为序列为SEQUENCE NO.6所示；ndrg1基因的靶标序列为SEQUENCE NO.7所示；tubb2b基因的靶标序列为SEQUENCE NO.8所示。

在该实施方式中，本发明筛选的、来源于爪蛙基因组的内含子序列(含有Cas9靶标片段)和外显子序列总长度优选为如SEQUENCE NO.9、SEQUENCE NO.10或SEQUENCE NO.11所示的核苷酸序列。

在该实施方式中，所述供体载体优选为质粒载体。

在本发明另一实施例中，所述步骤(1)中，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段和待敲入的基因依次连接。如本发明所述的，所述Cas9靶标片段和待敲入的基因″依次连接″为使得Cas9靶标片段被CRISPR/Cas系统识别，并能使得待敲入基因发生重组，整合到爪蛙基因组中去的连接顺序。

在该实施方式中，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段优选为位于所述待敲入的基因的上游或中间。

在该实施方式中，所述Cas9靶标片段的序列优选为如SEQUENCE NO.12、SEQUENCE NO.13或SEQUENCE NO.14所示的核苷酸序列。

在该实施方式中，所述Cas9靶标片段优选为包含在外显子中，所述外显子和所述待敲入的基因依次连接，所述外显子为来源于爪蛙基因组中的外显子。

在该实施方式中，所述供体载体优选为质粒载体。

本发明第一方面提供的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，可获得稳定遗传的、基因定点插入的突变的热带爪蛙。

第二方面，本发明提供了一种在发生重组后不产生移码突变的载体，所述载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因，所述载体还包括爪蛙基因组的内含子序列和外显子序列，其中，所述Cas9靶标片段位于所述内含子序列中，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因依次连接。

在该实施方式中，在发生重组后，依赖内源的内含子剪切机制，达到不移码突变的效果。所述内含子序列(含有Cas9靶标片段)和外显子序列优选均来源于爪蛙基因组，是本发明在爪蛙基因组中筛选所得，具体设计为：在需要进行操作的基因的某个较长的内含子选择Cas9靶位点。当选择的靶位点，破坏效率较高时，利用PCR将含有该靶点的内含子和下游临近的外显子扩增出，克隆到载体(比如pBS-ela-GFP)中，将需要表达的元件(待敲入基因)克隆到该序列之后，并且确认在该基因的编码框内。在发生重组后，依赖内源的内含子剪切机制，达到不移码突变的效果。

在该实施方式中，需要表达的元件(待敲入基因)可包括任何想要研究、敲入的目标基因，如外源基因、标签序列等，该目标基因优选设置于上述的外显子序列下游或中间。

在该实施方式中，本发明采用的含有Cas9靶标片段的内含子序列优选为来源于爪蛙基因组，进一步优选为热带爪蛙tyrosinase基因、ndrg1基因或tubb2b基因的内含子，其中，tyrosinase基因的靶标序列为序列为SEQUENCE NO.6所示；ndrg1基因的靶标序列为SEQUENCE NO.7所示；tubb2b基因的靶标序列为SEQUENCE NO.8所示。

在该实施方式中，本发明筛选的、来源于爪蛙基因组的内含子序列(含有Cas9靶标片段)和外显子序列总长度优选为如SEQUENCE NO.9、SEQUENCE NO.10或SEQUENCE NO.11所示的核苷酸序列。

在该实施方式中，所述供体载体优选为质粒载体。

在本发明一实施例中，所述在发生重组后不产生移码突变的载体还包括荧光报告基因表达盒，所述荧光报告基因表达盒采用胰腺启动子。

在该实施方式中，所述荧光报告基因表达盒中的荧光报告基因优选为独立于待敲入的基因及Cas9靶标片段表达。

在该实施方式中，所述荧光报告基因表达盒中的荧光报告基因优选为GFP报告基因。

第三方面，一种用于在爪蛙基因组中进行基因定点敲入试剂盒，包括如下(1)或(2)：

(1)向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体；

(2)向爪蛙受精卯中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体以及供体载体，所述向导RNA的表达盒在爪蛙受精卯中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在爪蛙受精卯中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶，

所述(1)或(2)中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。

优选地，所述向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体均如第一方面所述。

优选地，使用所述用于在爪蛙基因组中进行基因定点敲入试剂盒的方法包括如第一方面所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法步骤。

第四方面，本发明提供了如第一方面所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，或者如第二方面所述的在发生重组后不产生移码突变的载体，在制备爪蛙基因组中的基因定点敲入试剂中的应用。

本发明提供了的技术方案具有如下有益效果：

1)本发明首次在热带爪蛙中实现了基因定点插入，并稳定遗传至下一代。

2)本发明提供的技术方案，无需考虑基因组多态性，只需考虑CRISPR/Cas9系统识别的序列不存在多态性。

3)高效。相比其他报告基因，本发明采用独立的ela-GFP报告基因，只需筛选出少量G0代个体，即可有效的通过生殖系传代建系，大大缩减了研发人员的工作强度。

4)简单。采用本发明的方法，只需要构建gRNA载体和donor载体。donor载体无需构建复杂的同源臂。

5)应用广泛。采用本发明的方法，可以广泛应用于爪蛙等动物的细胞谱系追踪，条件性敲除，lncRNA敲除，人类疾病模型建立，大规模药物筛选模型建立等。

附图说明

图1为本发明所运用的技术路线图；

将Cas9，gRNA，donor共注射于1细胞期胚胎动物极；通过Cas9/gRNA共同破坏基因组与donor载体，通过非同源末端修复机制进行重组，将donor DNA插入到基因组破坏位点处，达到重组的效果。

图2为本发明所用中间载体(a)及donor载体(b，c)结构示意图。

图3为本发明所用Cas9表达载体(a)和gRNA表达载体(b)的结构示意图；

Cas9表达载体包含5′和3′两个核定位信号(NLS)，使得Cas9能集中到细胞核中，产生的破坏效果更强，并通过EcoRI和XhoI将其亚克隆到pCS2载体中，通过上游的SP6启动子进行mRNA转录；gRNA质粒制备后，通过上游的T7启动子进行转录。

图4为本发明显微注射后爪蛙G0代胰腺GFP+图；图中所示为胰腺嵌合不同程度ela-GFP的G0代42-44期蝌蚪。

图5为本发明G0代与野生型杂交后F1代GFP+图(a)及PCR引物位置(b)和Southern blot探针位置(b)示意图；

a.图中所示为G0代胰腺GFP+成蛙与野生型杂交后F1代均匀的GFP；b.重组示意图，如图所示，用引物P1/P2对重组后的5′接头进行PCR扩增，用引物P3/P4对重组后的3′接头进行PCR扩增，Southem blot探针分别如图所示。

图6为本发明实例一中ets1重组示意图(a)及F1代Southem blot结果；

a.在ets1外显子5(e5)的位点发生重组，运用核酸内切酶BamHI(B)，SacI(S)，and XbaI(X)做Southemblot分析；b.根据理论示意图通过常规Southem blot实验得到结果，显示除野生型对照组由于基因组多态性原因在3′probe杂交是造成一条4.1kb的DNA带外，其余均与理论结果一致，达到重组的效果。(wt：野生型，M：DNA marker.)

图7为本发明实例二中ets2重组示意图(a)及F1代Southem blot结果；

a.在ets2外显子3(e3)的位点发生重组，运用核酸内切酶ApaI(A)，BamHI(B)，EcoRI(E)，PstI(P)做Southern blot分析；b.根据理论示意图通过常规Southern blot实验得到结果，显示结果与理论结果一致，达到重组的效果(wt：野生型，M：DNAmarker.)。

图8为本发明实例三中tyr重组示意图；

在tyr内含子1的位点发生重组，运用核酸内切酶ApaI(A)，BamHI(B)，EcoRV(EV)，XbaI(X)，EcoRI(EI)，PstI(P)做Southern blot分析(e1：外显子1，e2：外显子2)；重组后的理论mRNA为T mRNA。

图9为本发明实例三中tyr重组后F1代RT-PCR与测序结果；

a.重组后GFP+/PCR+F1个体进过RNA提取，RT-PCR后，琼脂糖凝胶电泳结构显示大小与理论值相当，其中ODC为内参对照，wt为野生型对照。b.经过RT-PCR鉴定后，将PCR产物克隆至常规T载体中，进行测序验证；结果如图所示，在外显子1与外显子2结合处，达到了完美的内源剪切。

图10为本发明实例三中tyr重组后F1代Southem blot结果；

根据理论示意图通过常规Southern blot实验得到结果，显示结果与理论结果一致，达到重组的效果(wt：野生型，M：DNAmarker.)。

图11为本发明实例4中igsf3-3’位点的破坏效率；

单下划线序列为靶序列，″-″代表缺失碱基，小字母序列代表插入碱基。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

若无特殊说明，本发明实施例中：

所述骨架RNA片段为由SEQUENCE NO.1所示核苷酸所示DNA转录出来的。

所述向导RNA中，能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为如SEQUENCE NO.2(ets1：GGTTCAGAGAATTCAGAGGG)；SEQUENCE NO.3(ets2：GGTCTGGACTCTTACTCTCA)；或SEQUENCENO.4(tyr：GGGGTCCCTAACTTCCTCTA)所示DNA转录出来的。注：Cas9识别基因组是通过PAM(3个NGG碱基)，gRNA上没有这3个NGG的碱基，但构建的供体质粒载体，以及基因组上的DNA双链，均具有这3个NGG的碱基。

所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因核苷酸序列如SEQUENCE NO.5所示。

结合图1，本发明提供如下实施例，图1中，有正向重组和反向重组之分，正向重组概率最大，对于敲除lncRNA或者做定点转基因等，正向重组和反向重组均适用。

实例1在热带爪蛙ets1基因外显子5中进行基因定点插入

一.Cas9靶位点

ets1靶点为文献(Guo et al.，2014)中表1的ets1-T2对应的靶位点(序列如SEQUENCE NO.15所示，即5-GGTTCAGAGAATTCAGAGGGCGG-3)

二.Cas9mRNA与gRNA制备

按照如下方案合成Cas9mRNA和gRNA：

1)Cas9mRNA制备

内切酶NotI将10ug pCS2-3×FLAG-NLS-SpCas9-NLS(addgene ID：51307；载体结构如图3a所示)质粒线性化，利用SP6体外转录制备Cas9mRNA。

2)gRNA制备

a.载体制备

参照文献(Guo et al.，2014)的方法，利用BbsI的酶切作用，将如SEQUENCE NO.15所示的Cas9靶位点克隆到骨架载体上，骨架载体为pUC57-T7-gRNA质粒(addgene ID：51306；载体结构如图3b所示)，从而获得对ets1特异的gRNA。

b.gRNA转录合成

利用PCR方法直接扩增出转录模板，T7RNA转录酶转录合成gRNA并纯化。

PCR引物为：S：5-GAAATTAATACGACTCACTATA-3(SEQUENCE NO.16)；

A：5-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3(SEQUENCE NO.17)。

三.donor制备

1)PCR扩增

采用PCR技术扩增(模板为热带爪蛙基因组)出含有ets1-T2的基因组序列(819bp)，序列如SEQUENCENO.18所示。

引物为：ets1-S(XhoI)：gcaCTCGAGGAATCTGCTTGTTCTTCAGGAAC(SEQUENCE NO.19)

ets 1-A(ClaI)：gcaATCGATGCAGTAATGAGATGGTCACGG(SEQUENCE NO.20)

2)donor质粒制备

2-1)构建-个爪蛙中带有可筛选标签的中间载体pBS-ela-GFP

该中间载体pBS-ela-GFP(载体结构如图2a所示)含有：胰腺特异性启动子elastase promoter，并带有GFP报告基因，该筛选标签命名为ela-GFP(序列如SEQUENCE NO.21所示(包括ela启动子，GFP，和SV40pA)，通过NotI单酶切放入pBS载体中(GenBank：DQ836146.1)。

用XhoI和ClaI双酶切pBS-ela-GFP和819bp PCR所得est1片段，并连接。转化，提取质粒，经过测序验证后，阳性质粒命名为pBS-ets1-ela-GFP。

四.热带爪蛙显微注射

1)注射样品配置

总体积为6ul的注射液，其中每2nl包含300pg Cas9mRNA，100pg gRNA，20pg donor质粒。

2)胚胎准备

对热带爪蛙胚胎进行常规人工体外受精后，在pH7.9的3％半胱氨酸盐酸盐水溶液中匀速搅拌2.5-3min去取浆膜。

3)显微注射

用常规皮升泵PV820进行胚胎注射。在受精卯为卯裂之前在受精卯动物极注射剂量为2nl的样品，每次注射200个受精卯，将已卯裂为2细胞期为即时注射的胚胎剔除。重复上述操作，注射数量达到600个即可。

五.GFP荧光筛选

爪蛙胚胎发育至42-44期利用胰腺GFP荧光进行胚胎筛选将不同强度GFP⁺个体挑出饲养(如图4所示)。大概筛选出60只带有GFP的蝌蚪。

六.传代鉴定

1)荧光筛选及PCR鉴定

G0代GFP+个体成熟后，与野生型个体杂交，获得F1代个体。本实例利用7只雄生G0代GFP+成蛙与野生型成蛙杂交，待F1代胚胎发育至42-44期，利用胰腺GFP荧光进行胚胎筛选(如图5a所示)。再用特异性引物(引物序列如表1所示表1中，est1对应的P1，P2，P3，P4)对GFP+个体进行PCR鉴定(如图5b所示)。结果显示，G0代成蛙传代后，有3只G0代个体具有GFP+子代，其中用1只G0代个体具有GFP+/PCR+子代，该G0代个体命名为其GFP+/PCR+子代占总GFP+子代的46.4％(结果如表2所示)。

2)Southern blot鉴定

在子代蝌蚪变态完成前，针对GFP+/PCR+个体，按照两端接头处测序结果设计酶切方式与探针序列(5’和3’接头测序结果如表3所示)，包括1个内部探针，和2个外部探针(探针合成引物如表4所示，internalprobe序列如SEQUENCE NO.22，ets1-5’probe序列如SEQUENCE NO.23，ets1-3’probe序列如SEQUENCENO.24所示)。然后，对不同F1代个体进行Southern blot检测(示意图如图6a所示，结果如图6b所示)。

结果显示，的GFP+/PCR+子代为正确的基因敲入。

实例2在热带爪蛙ets2基因外显子3进行基因定点插入

一.Cas9靶位点

ets2靶点为文献(Guo et a1.，2014)中表1的ets2对应的靶位点(序列如SEQUENCE NO.25所示)，即，ggtctggact cttactctca tgg。

二、Cas9mRNA与gRNA制备

1.Cas9mRNA的制备，参见实施例1

2.gRNA的制备，参见实施例1

a.载体制备

参照文献(Guo et al.，2014)的方法，利用BbsI的酶切作用，将如SEQUENCE NO.25所示的Cas9靶位点克隆到骨架载体上，骨架载体为pUC57-T7-gRNA质粒(载体结构如图3b所示)，从而获得对ets2特异的gRNA。

b.gRNA转录合成，参见实施例1

三.donor制备

1)PCR扩增

利用PCR扩增(模板为热带爪蛙基因组)出含有ets2靶序列的基因组序列(611bp)，序列如SEQUENCENO.26所示。

引物为：ets2-S(XhoI)：gcaCTCGAGCCAAATTAGAAGGCTTCCATGTAG(SEQUENCE NO.27)

ets2-A(ClaI)：gcaATCGATCAATATTAACAGAGTTGGCACCG(SEQUENCE NO.28)

2)donor质粒制备

用XhoI和ClaI双酶切pBS-ela-GFP和611bp PCR所得est2片段，并连接。转化，提取质粒，经过测序验证后备用，阳性质粒命名为pBS-ets2-ela-GFP。

四.热带爪蛙显微注射

同实例一，将每2nl中的gRNA量调整至50pg。

五.GFP荧光筛选

同实例一。

六.传代鉴定

1)荧光筛选及PCR鉴定

方法同实例一，接头处PCR引物序列如表1所示，5’和3’接头测序结果如表3所示。结果显示，本实例通过9只(7雄2雌)G0代成蛙传代后，有5只G0代个体具有GFP+子代，其中有2只G0代个体具有GFP+/PCR+子代，这两只G0代个体命名为GFP+/PCR+子代占总GFP+子代的10.3％；GFP+/PCR+子代占总GFP+子代的100％(结果如表2所示)。

2)Southern blot鉴定

在子代蝌蚪变态完成前，针对GFP+/PCR+个体，按照两端接头处测序结果设计酶切方式与探针序列，包括1个内部探针(同实例一)，和2个外部探针(探针合成引物如表4所示，ets2-5’probe序列如SEQUENCE NO.29所示，ets2-3’probe序列如SEQUENCE NO.30所示)。然后，对不同F1代个体进行Southernblot检测(示意图如图7a所示，结果如图7b所示)。

结果显示，的GFP+/PCR+子代为正确的基因敲入。

实例3在热带爪蛙tyrosinase基因内含子1处进行基因定点插入达到不移码的效果

1.Cas9mRNA与gRNA制备

1)Cas9mRNA合成方法同实施例1

2)gRNA的制备

靶位点在内含子1内，离外显子2约600bp，命名为tyr-int1。

靶位点识别序列为5-GGGGTCCCTAACTTCCTCTATGG-3(SEQUENCE NO.31)。

两条退火单链序列如下：

tyr-int1-S：5-TAGGGGTCCCTAACTTCCTCTA-3(SEQUENCE NO.32)

tyr-int1-A：5-AAACTAGAGGAAGTTAGGGACC-3(SEQUENCE NO.33)

gRNA合成方法同实例一。

2.donor制备

1)PCR扩增

利用PCR扩增(模板为热带爪蛙基因组)出含有tyr-int1靶点的内含子和下游相邻的外显子部分序列，共906bp，命名为tyr-int1-exon2(序列如SEQUENCE NO.34所示)。

引物为：tyr-S(SalI)：gcaGTCGACGTGGACTCAGGCATTCTAAG(SEQUENCE NO.35)

tyr-A(EcoRI)：gcaGAATTCAAAGTTGGCCGACCGATCCA(SEQUENCE NO.36)

2)donor质粒制备

对pBS和906bp PCR片段进行SalI和EcoRI双酶切，插入pBS载体的SalI和EcoRI位点。经过测序验证后，正确载体命名为pBS-tyr-int1-exon2。

用NotI将pBS-tyr-int1-exon2消化后，与NotI-ela-GFP-NotI连接，将5-NotI-ela-GFP-NotI-3序列克隆到tyr-int1-exon2序列后。经过测序验证后，正确载体命名为pBS-tyr-int1-exon2-ela-GFP。

3.热带爪蛙显微注射

同实例一，将每2nl中的gRNA量调整至50pg。

4.GFP荧光筛选

同实例一。

5.传代鉴定

1)荧光筛选及PCR鉴定

方法同实例一，接头处PCR引物序列如表1所示，5’和3’接头测序结果如表3所示。结果显示，本实例通过2只雄性G0代成蛙传代后，有1只G0代个体有GFP+子代，并有GFP+/PCR+子代，这只G0代个体命名为的GFP+/PCR+子代占总GFP+子代的30％(结果见表2所示)。

2)RT-PCR

RT-PCR上游引物在第一外显子上，下游引物在基因操作后的外显子2之后的ela-GFP序列上，上下游引物跨越内含子1(1981bp)。通过这样的引物鉴定是否达到完美的内源剪切，产生不移码的效果(示意图如图8所示)。

引物扩增理论大小为557bp，命名为tyr-T，序列如序列表20所示，引物序列如下：

S：5-ACTATGCCTCCCGTGATGTCTTC-3(SEQUENCE NO.37)；

A：5-CACTCAGTTAACCCAAGTCGACC-3(SEQUENCE NO.38)。

PCR结果显示，本实例中的GFP+/PCR+子代的RT-PCR结果为阳性(结果如图9a所示)；测序结果显示，该重组操作的基因定点修饰依赖内源的剪切机制，达到了完美的修饰(结果如图9b所示)。其中，下划线处为引物，下划线到灰色箭头之间为exon1，灰色箭头到空心箭头之间为exon2，空心箭头到小黑箭头之间为ela-GFP。

3)Southem blot鉴定

在子代蝌蚪变态完成前，针对GFP+/PCR+个体，按照两端接头处测序结果设计酶切方式与探针序列，包括1个内部探针(同实例一)，和2个外部探针(探针合成引物如表4所示，tyr-5’probe序列如序列表21所示，tyr-3’probe序列如序列表22所示)。然后，对不同F1代个体进行Southem blot检测(示意图如图8所示，结果如图10所示)。

结果显示，的GFP+/PCR+子代为完美的基因修饰。

实施例4在热带爪蛙igsf3基因外显子5处进行基因定点插入达到不移码的效果

1.Cas9mRNA与gRNA制备

1)Cas9mRNA合成方法同实施例1

2)gRNA的制备

靶位点在外显子5内，命名为igsf3-3’。

靶位点识别序列为5-GGGCATGAAGTTTATCCTGAAGG-3(SEQUENCE NO.39)。

两条退火单链序列如下：

igsf3-S：5-TAGGGCATGAAGTTTATCCTGA-3(SEQUENCE NO.40)

igsf3-A：5-AAACTCAGGATAAACTTCATGC-3(SEQUENCE NO.41)

gRNA合成方法同实施例1。

2.基因破坏效率检测

每个胚胎在1细胞期于动物极注射2nl(300pg Cas9mRNA，50pg gRNA)。注射50个胚胎即可。将胚胎培养过夜后，随机选择5个胚胎混合后提取基因组，用打靶位点两端的引物将该片段扩增(扩增引物为S：5-GCACCTGTGAAGCAAGTGAAAGA-3(SEQUENCE NO.42)；

A：5-AAGAAGTGAGTGTGTAAGGGGATATG-3(SEQUENCE NO.43))，将该片段连接T载体后，随机挑选10单菌落测序，结果显示该位点的破坏效率为30％(见图11)。图中，单下划线序列为靶序列，″-″代表缺失碱基，小字母序列代表插入碱基。

3.donor制备

1)PCR扩增

利用PCR扩增出含有igsf3-3’靶点外显子部分序列共305bp命名为igsf3-3’UTR(序列如SEQUENCE NO.44。

引物为：

igsf3-3’(SalI)：5-gcaGTCGACCCCTGACGTATTATCTCATTGCAG-3(SEQUENCE NO.45)

igsf3-3’(SpeI)：5-gcaACTAGTGGGGAATGGGGAGGATATACAC-3(SEQUENCE NO.46)

2)donor质粒制备

通过SalI/SpeI双酶切将pBS和305bp igsf3-3’PCR片段进行酶切连接，命名为pBS-igsf3-3’；通过SpeI/ClaI将IRES(内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site，IRES(GenBank：KC710231.1))和pBS-igsf3-3’进行酶切连接，命名为pBS-igsf3-3’-IRES；通过ClaI/EcoRI将cre(addgene ID：11918)和pBS-igsf3-3’-IRES进行酶切连接，命名为pBS-igsf3-3’-IRES-cre；通过EcoRI/NotI将SV40pA(GenBank：DQ649431.1)和pBS-igsf3-3’IRES-cre进行酶切连接，命名为pBS-igsf3-3’-IRES-cre-pA。

用NotI将pBS-igsf3-3’-IRES-cre-pA消化后，与实施例1的NotI-ela-GFP-NotI连接。经过测序验证后，正确载体命名为pBS-igsf3-3’-IRES-cre-pA-ela-GFP。

本发明实施例采用IRES序列，是由于igsf3的靶位点在终止子附近，使用IRES序列可以增加后续标签的表达效率。

3.热带爪蛙显微注射

同实施例1，将每2nl中的gRNA量调整至50pg。

4.GFP荧光筛选

同实施例1。

5.G0代胚胎PCR鉴定

结果显示，没有通过PCR检测到阳性插入结果。

附：

表15’和3’接头处PCR引物表

表2ets1，ets2，tyr基因定点插入传代统计表

表3ets1，ets2，tyr基因定点插入F1代接头处测序统计表

表4ets1，ets2，tyr基因southem blot探针引物表

参考文献

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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于，所述方法包含以下步骤：1)使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；

其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。

2.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述双链Cas9靶标片段中的一条链具有如下结构：5′-Nx-NGG-3′，N表示A、G、C和T中的任一种，18≤X≤22。

3.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为：向爪蛙受精卯中直接注射所述向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体。

4.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为：向爪蛙受精卯中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体以及供体载体，所述向导RNA的表达盒在爪蛙受精卯中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在爪蛙受精卯中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。

5.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，向爪蛙受精卯中进行注射时，采用显微注射，并且在受精卯未卯裂之前，注射于受精卯动物极区域。

6.权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述供体载体还包括荧光报告基因表达盒，所述荧光报告基因表达盒采用胰腺启动子。

7.权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述供体载体还包括爪蛙基因组的内含子序列和外显子序列，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段位于所述内含子序列中，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因依次连接。

8.权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，所述步骤(1)中，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段和待敲入的基因依次连接。

9.一种在发生重组后不产生移码突变的载体，其特征在于，所述载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因，所述载体还包括爪蛙基因组的内含子序列和外显子序列，其中，所述Cas9靶标片段位于所述内含子序列中，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因依次连接。

10.一种用于在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的试剂盒，其特征在于，包括如下(1)或(2)：

(1)向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体；

(2)向爪蛙受精卯中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体以及供体载体，所述向导RNA的表达盒在爪蛙受精卯中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在爪蛙受精卯中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶，

所述(1)或(2)中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。

11.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，或者如权利要求9所述的在发生重组后不产生移码突变的载体，在制备爪蛙基因组中的基因定点敲入试剂中的应用。