CN104606085A - 一种新型高效抗菌的醋酸洗必泰纳米乳漱口液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效抗菌醋酸洗必泰纳米乳漱口液及其制备方法。本发明纳米乳漱口液，由如下重量份的原辅料制成：醋酸洗必泰0.2～1.5份，表面活性剂8～30份、助表面活性剂4～15份，油相3～20份，口腔清新剂0.05～1份，蒸馏水34.45～69.0份。本发明纳米乳漱口液能显著提高其溶解度，质量极其稳定，尤其通过细胞膜的破坏对口腔致病菌为代表的变形链球菌等具有明显增强体内外抗菌效果。本发明产品使用方便，成本低廉，疗效显著，不含酒精、安全无毒、无刺激，无副作用，不产生抗药性，是一种新型口腔杀菌、消毒保洁用品。它可广泛应用于牙周炎、牙龈炎、口腔溃疡、牙菌斑、牙出血、口臭等口腔疾病。

Description

一种新型高效抗菌的醋酸洗必泰纳米乳漱口液及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种能够高效治疗口腔疾病的纳米乳漱口液，特别涉及一种新型高效抗菌的醋酸洗必泰纳米乳漱口液及其制备方法。

背景技术

由于口腔内环境(湿度、温度及营养状况)特别适合微生物生长繁殖，所以口腔是人体内微生物数目存在最多的部位。有研究表明：正常健康人的每一克牙垢(牙锈)中存在100亿个细菌，口腔中细菌比皮肤表面的数量多得多。因此，口腔清洁不及时，会造成口臭、牙龈发炎、口腔溃疡、蛀牙、牙周病多种疾病，从而严重危害人们的健康。口腔的清洁成为人们健康卫生的第一步和日常生活的重要组成部分。目前，通常对口腔的清洁，虽多数采用刷牙、使用牙线、牙签、牙间刷、口腔冲洗器、口腔清新剂等外力达到清洁作用，但对于口腔中滋生的细菌，特别是异味严重、牙周发炎的人们，不能达到有效的祛除。而刷牙只局限于早晨起床后和晚上睡觉前，使用也不方便，清理不及时、不彻底、对牙齿有磨损等弊端，难以满足人们的口腔清洁要求。漱口液作为一种新型的口腔清洁护理产品，已逐渐进入平常人的生活中，它不仅可利用液体在口内流动的冲击力来清除滞留的食物残渣，还能利用漱口水中加入的有效成分来清除口腔中的致病细菌。它包装在便携的包装瓶中，可随时进行使用，能彻底克服了口腔护理不及时、牙膏使用不方便、清洁不彻底等弊端，从而能起到清洁牙齿、美白牙齿、去除牙斑、杀灭口腔有害细菌、预防龋齿、清新口气等作用。它尤其对如牙龈发炎等一些口腔疾病的治疗起到一定的积极作用，具有清洁口腔、预防龋齿和牙周炎等作用。因此，近年它深受消费者欢迎和广泛使用。目前，市场上漱口液品种很多，主要有氟化物、三氯生(2,4,4-三氯-2-羟基二苯醚)、洗必泰(双氯苯双胍己烷)、甲硝唑、硝酸银等化学制剂及中草药的复方制剂。而应用最广泛的氟化物和硝酸银。目前，应用最广泛的氟化物虽能在牙釉质表面形成氟磷灰石保护层(CaF2)，增强牙齿抗酸性，但其使用后可能会引起氟中毒、氟骨病、氟斑牙，还能导致大量耐氟菌株的产生，减低疗效；硝酸银能使牙本质小管中的神经纤维细胞发生凝固而形成保护层，降低神经反射，减缓疼痛等症状，但却能对软组织 有腐蚀性和刺激性，同时Ag+过量会对人体有害，有时Ag+与口腔内的还原性物质反应生成Ag导致牙齿变黑。而其他抗生素直接抑制或杀灭口腔内细菌，但抗生素的滥用容易引起广泛的细菌耐药，从而降低疗效。现有漱口液中常用的中药复方制剂有千里光、土茯苓、叶下珠、麻柳叶、蛇麻子等，但由于传统水提取法、溶剂提取法制得的中草药提取物不可避免的会存在活性物含量低、含量难以确定、溶剂成分难以去除、所得成分过于复杂等问题，非常容易影响其使用口感。如果添加更多的香精来改善产品的口感，过多的使用香精又可能会对人体的健康有潜在的威胁。

因此，目前虽有不少的各种漱口水，但追其最终疗效都不甚理想，最多只是起到暂缓疼痛或者清洁牙齿的效果。许多牙病患者难以食用冷热酸甜硬等食物，特别是龋齿病患者，常常疼痛难忍，严重的只好将牙齿拔掉，还有一些患者，因存在遗传及病理因素，而得不到有效的治疗和控制，致使牙齿出现过早的松动或脱落。从医疗角度来讲，目前没有理想快捷的治疗放大和药物，口腔科一般多采用氯化钠水溶液漱口，临时解决疼痛的问题，但达不到治愈的目的，从保健角度上来说，目前市场上售有各种漱口水及药物牙膏，时间上只起到一般保健作用，对一般的口腔疾病疗效甚微。且市场上的漱口水大都含有酒精成分，有些漱口水中的酒精含量高达26％，英国纽卡斯尔大学恢复性牙科的罗宾·西摩教授表示，酒精本身会破坏保持口腔湿润的私膜，使口腔干燥，进而导致口臭，还会使口腔产生不适的针刺感。

国内外研究表明，一种广谱抗菌非抗生素类、被目前广泛用于各种器械及手术的消毒药物醋酸洗必泰对对口腔疾病有治疗作用。现研究表明，其是通过与脂多糖中的磷酸盐和醋酸洗必泰中的羧基结合，从而干扰细胞膜转运，使小分子物质溢出胞外机制，从而导致细菌死亡。但醋酸洗必泰是低效消毒剂，并由于其在水中溶解度低(0.2g/100g)，必须与其他制剂复配才能起到应有的效果。目前仅仅少量在通过乙醇溶解后，和其他中药、化学药物(最常用的氟化物和苯扎溴铵)配伍来提高其抗菌活性。但是配伍联合使用，如氟化物会对细菌一定极大的耐药性，产生大量耐氟菌株，也还会伴有氟中毒、氟骨病、氟斑牙等严重的副作用；苯扎溴铵是一种季铵盐类阳离子表面消毒剂，目前广泛用于手术、器具及场地等外用消毒。其气味臭芳香，味极苦，水溶液呈碱性反应，振摇时产生多量泡沫，不能用于口腔消毒，且会引起变态反应性结膜炎、视力减退、接触性皮炎，用3％溶液灌肠数分钟后引起恶心、冷汗终致死亡。在用作阴道冲洗还会引起死亡的严重副作用。因此，制备出使用非抗生素类、单一醋酸洗必泰成分，不加乙醇，就能显著提高抗菌增效作用的一种新型高效抗菌的纳米乳漱口液尤其显得重要和尤为迫切。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供了一种新型高效抗菌的纳米乳漱口液。本纳米乳漱口液，利用纳米技术提高药物溶解度，使用非抗生素类、单一醋酸洗必泰成分，并且不加乙醇，所述纳米乳漱口液能显著提高抗菌增效作用，尤其适用于龋齿及其他口腔疾病患者。

一种高效抗菌龋齿醋酸洗必泰纳米乳漱口液，其特征在于，由如下重量份的原料制成：醋酸洗必泰0.2～1.5份，表面活性剂8～30份、助表面活性剂4～15份，油相3～20份，口腔清新剂0.05～1份，蒸馏水34.45～69.0份。

所述的药物醋酸洗必泰，所述物浓度范围：0.2～1.5份。

所述表面活性剂为聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯中的一种或多种；所述聚山梨酯为吐温-80、吐温-85、吐温20中的一种或几种，所述聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯蓖麻油40中的一种或其组合；所述组份的有效量分别为吐温-80：10～30份、吐温-85：10～30份、吐温20：8～20份、聚氧乙烯氢化蓖麻油40(RH40)：10～30份、聚氧乙烯蓖麻油40(EL40)：10～30份。

所述助表面活性剂为：失水山梨醇脂肪酸酯或/和C2～C4的一元醇或多元醇；所述失水山梨醇脂肪酸酯为司盘85、司盘80中的一种及一种以上组合；所述C2～C4的一元醇或多元醇为正丁醇、甘油、1，3-丁二醇、1，3-丙二醇中的任一种；所述助表面活性剂的有效量分别为司盘-85:4～15份、司盘80：5～15份；甘油：5～10份；丙二醇：4.8～15份；1，3-丁二醇：5～10份，正丁醇：5～10份。

所述的油相是IPM、GTCC、液体石蜡、菜油和豆油中的任一种，其中所述油相的有效量分别为IPM：3～20份、液体石蜡：5～15份、GTCC：3～15份、食用菜油：4～15％份、食用豆油：5～15％。

所述口腔清新剂为：天然薄荷、天然冰片、薄荷油、薄荷脑中的中任一种或其组合；其有效量分别为天然薄荷：0.05～1份、天然冰片：0.05～1份、薄荷油：0.05～1份、薄荷脑：0.05～1份。

所述纳米乳漱口液用水无限稀释后其粒径为1～100nm。

上述的纳米乳漱口液的制备方法，具体包括步骤如下：

(1)按配比量称取原料配方中的各物质；

(2)将表面活性剂、助表面活性剂、醋酸洗必泰搅拌充分溶解，得澄清的溶液1；

(3)再向澄清的溶液1中加入配比量的油相，搅拌下缓慢加入70％的配比量的水相， 得到澄清的溶液2；

(4)将配比量的口腔清新剂溶于溶剂后加入澄清的溶液2中。

(5)将澄清的溶液2于20℃～25℃缓慢加至剩余配比量的水相，充分搅拌，直至形成澄清透明、粘度小的纳米乳漱口液；

(6)然后过滤除菌，灌装、密封成不同规格的醋酸洗必泰漱口液。

当所述口腔清新剂为天然薄荷或天然冰片时，所述溶剂为水；当所述口腔清新剂为薄荷油或薄荷脑时，所述溶剂为丙二醇。

表面活性剂是纳米乳形成所必需的物质，其主要作用是降低界面张力形成界面膜，促使纳米乳形成；增加主药的溶解性，确保制剂的稳定性。表面活性剂分为非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、嵌段共聚物、两性离子表面活性剂、氟化表面活性剂等六大类。由于非离子型表面活性剂具有无毒、良好生物相容性，在溶液中比较稳定，不易受强电解质、无机盐类、酸碱的影响，且与其他表面活性剂的相容性好，溶血作用较小等众多的优点而被受到应应用。同时，纳米乳的形成过程中，当表面活性剂的亲水亲油平衡(HLB)值与油所需的HLB值相等或相近时，容易形成性质非常稳定的纳米乳。HLB值在4～7的表面活性剂可制备W/O型纳米乳，HLB值在8～18内的表面活性剂可制备O/W型纳米乳。因此，本发明采用高HLB值的表面活性剂吐温类和聚氧乙烯脂肪酸酯类，这些表面活性剂，无毒无刺激，生物相容性好，有一定的营养作用，是制备各种纳米乳的较好辅料。优选：吐温80、吐温85、聚氧乙烯蓖麻油(EL40)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40)。

纳米乳的形成还要求有短暂的负表面张力。而助表面活性剂能够通过调整表面活性剂的亲水亲油值(HLB)使表面活性剂在油-水界面有较大的吸附,协助表面活性剂降低界面张力，降低表面活性剂分子间的排斥力；增加界面流动性，减少纳米乳形成时的界面弯曲能力，插到界面膜中，促进曲率半径很小的膜的形成，扩大纳米乳形成区域，有利于制备出质量稳定的纳米乳。本发明用目前最常用的司盘类(85、80)为其主要的助表面活性剂，同时也还选择具有增强助表面活性剂的作用的低链醇类溶剂(甘油、1，3-丁醇、正丁醇，丙二醇)，可以让纳米乳中所使用的油相与界面膜上表面活性剂分子之间保持渗透和联系，并易于与表面活性剂形成界面膜，从而更有利于纳米乳的形成和稳定。

纳米乳形成过程中，油是配合表面活性剂参与形成稳定纳米乳，它们的分子量小，小分子油相的作用与助表面活性剂类似，易嵌入到表面活性剂中，与之共同形成界面膜，从而促使纳米乳的形成。本发明根据油相所需的表面活性剂的HLB与表面活性剂相近时，所形成的乳状液稳定的原则,选用液体石蜡、食用菜油、GTCC、食用豆油、肉豆蔻酸异丙酯等， 这些油相材料均可食用，无毒无刺激，生物相容性好，有一定的营养作用，是制备各种纳米乳的主要医药辅料。

本发明中，还针对性加入口腔清新剂：天然薄荷、薄荷油、薄荷脑、天然冰片，使其的口感更好。

本发明采用的醋酸洗必泰是一种广谱非抗生素类抗菌药，它能与唾液糖蛋白结合，使牙面吸附蛋白减少，干扰菌斑形成；另外，洗必泰还可与细菌细胞外多糖结合，使细菌不易吸附到获得膜上，达到预防和减少牙周病和龋齿疾病的目的。醋酸洗必泰吸附在细菌胞浆膜的渗透屏障，改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内容物漏出，从而抑制和杀灭细菌。研究报道，它对某些葡萄球菌、变形链球菌、唾液链球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、厌氧丙酸菌呈高度敏感；嗜血链球菌中等度敏感。目前，由于醋酸洗必泰在水中溶解度极低(0.2g/100g)，目前其仅仅少量在通过乙醇溶解后，和其他中药、化学药物配伍后有限用于口腔疾病中。本发明漱口液为易于推广的、经济、实用、安全、高效的非抗生素药物或者制剂，可有效预防龋齿。

本发明漱口液尤其能通过抑制致龋形成的关键环节：产酸、难溶性胞外多糖、生物膜的形成使得其具有龋齿良好治疗和预防效果，本发明漱口液中不含酒精，不会对口腔及人身带来副作用。

本发明的醋酸洗必泰纳米乳漱口液的制备方法，具体包括步骤如下：

(1)表面活性剂相的配制按配方比例称取表面活性剂，与助表面活性按比例复配，计算出该体系的HLB值，充分搅拌均匀。常见乳化剂的HLB值能在一些化工手册中查到，比如化工出版社的《化学产品手册》。由于表面活性剂的亲水亲油平衡(HLB)值具有加合性，可用质量平均法求出表面活性剂的HLB值。例如，两种表面活性剂A、B混合后，其混合表面活性剂的亲水亲油平衡HLBAB值为HLBAB＝(WAHLBA+WBHLBB)/(WA+WB)

式中WA，WB——混合物表面活性剂A、B的质量；

HLBA，HLBB——表面活性剂A、B的HLB值。

(2)将所述量的表面活性剂与助表面活性剂、醋酸洗必泰搅拌完全溶解，得到澄清的溶液；

(3)油相的配制根据表面活性剂相的HLB值，选择油，调其比例，使其乳化所需的HLB值与表面活性剂相的HLB相近。加入所述量的油相，搅拌下缓慢加入处方量70％的水相，得到澄清的溶液；

(4)将所述量的口腔清新剂天然薄荷或天然冰片溶解于水，或薄荷油和薄荷脑溶于丙二醇后加入处方中。

(5)在20℃～25℃缓慢加至处方量蒸馏水充分搅拌，直至形成澄清透明、粘度小的纳米乳漱口液。

(6)然后用高速离心、透射及粒度分析检测质量合格后，过滤除菌，灌装、密封成不同规格的醋酸洗必泰漱口液。

本发明所述的一种高效抗菌醋酸洗必泰纳米乳漱口液外观为无色透明液体，具有很好的稳定性。经时稳定性是指纳米乳口服液在室温自然变化条件放置一年，外观、含量、粒度、电位及pH随时间延长而不发生明显变化。该醋酸洗必泰纳米乳漱口液持久透明，未发现浑浊或沉淀，则说明经时稳定性好。将该漱口液置于试管，密封，在13000r/min的转速下离心30min澄清透明，不发生明显的分层和药物析出、絮凝等不稳定现象，通过粒度分析仪和透射电镜检测出粒径在1～100nm范围。

MIC实验表明，见图6。醋酸洗必泰纳米乳漱口液的MIC为0.4ug/ml,醋酸洗必泰水溶液的MIC为0.8ug/ml，复方醋酸洗必泰溶液的MIC为1.0ug/ml。醋酸洗必泰纳米乳对抗变形链球菌药效是其水溶液的2倍，是复方醋酸洗必泰的2.5倍。本发明取得比较好的抗菌效果在于本发明采用合适的组方和配比，加入适宜的清洗剂，采用纳米技术和工艺制备出新型高效的抗菌漱口液。这些效果也许是采用合适表面活性剂、助表面活性剂、油相、清新剂的共同协同作用。

醋酸洗必泰纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌、乳酸杆菌的MIC的检测结果图8。结果看出，本发明的纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌的MIC分别为0.8ug/ml、3.2ug/ml、0.4ug/ml、3.2ug/ml。醋酸氯己定单方和复方的微乳消毒剂对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌的分别是3.2ug/ml和1.6ug/ml、6.4ug/ml和4.8ug/ml、1.6ug/ml和0.8ug/ml、6.4ug/ml和3.2ug/ml。本发明的纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌抗菌效果分别是醋酸氯己定单方和复方微乳的4倍和2倍，2倍和1.5倍，4倍和2倍，2倍和1倍。本发明专利在大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌、乳酸杆菌的抗菌活性明显高于醋酸氯己定单方和复方微乳。本发明专利取得理想的抗菌效果在于本发明采用合适的组方和配比(仅仅组方中，醋酸氯己定单方和复方微乳选择了毒性大，易挥发的乙酸乙酯，而本发明选择了不具有挥发性，更为安全可以食用(药用)的油相)，加入适宜的清洗剂，采用纳米技术和工艺制备出新型高效的抗菌漱口液。这些效果也许是采用合适表面活性剂、助表面活性剂、油相、清新剂的共同 协同作用来提高新型高效漱口液的抗菌效果。

本发明与其它现有技术相比，具有以下的有益效果：

1.解决醋酸洗必泰难溶性问题，制备醋酸洗必泰纳米乳漱口液可极大提高醋酸洗必泰溶解度，具有良好的增溶作用。

2.制备的醋酸洗必泰纳米乳漱口液具有粘度低、稳定性好、分散性强、吸收迅速等特点，药物被包裹在内核油相，还具有缓释和靶向作用，并可提高药物的生物利用度、延长药物在体内的半衰期、增强疗效、降低毒副作用。

3.本发明的醋酸洗必泰纳米乳漱口液的药物粒径在1～100nm之间,平均粒径为63.13nm，是将醋酸洗必泰溶于表面活性剂和助表面活性剂中，用蒸馏水滴定到均匀、透明的纳米乳。

4.本发明采用的配方和方法简单可行、成本低廉，可以便于大规模工业化生产。本发明产品使用方便，疗效显著，不含酒精，不会对口腔及人身带来副作用，适口性好。

5.本发明其能彻底穿透口腔菌斑细胞核，将有效成分直接作用于其内核，杀灭引起各种口腔疾病的厌氧菌、白色念珠菌、金黄色葡萄糖球菌、化脓性球菌、变形链球菌等致病菌并控制其滋生，减少医源性感染与口腔术后感染，杀菌护齿，消除口腔异味。通过杀菌动力学结果表明，其对变形链球菌作用5分钟后，就能杀死95％的细菌；

6.本发明能快速杀灭引起牙周炎、牙龈炎、口腔溃疡、牙菌斑、牙出血、口臭的致病菌，安全无毒、无刺激，无副作用，不产生抗药性，是新型口腔杀菌、消毒保洁用品，还可用于假牙浸泡和杀菌消毒。

附图说明：

图1为醋酸洗必泰纳米乳漱口液处方筛选图；

图2为醋酸洗必泰纳米乳漱口液伪三元相图的绘制；

图3为醋酸洗必泰纳米乳漱口液鉴定结果图；

图4为醋酸洗必泰纳米乳漱口液HPLC含量检测图；

图5为醋酸洗必泰纳米乳漱口液稳定性试验结果；

图6为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌MIC结果图；

图7为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌抑菌和杀菌动力学结果图；

图8为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对不同细菌MIC检测对比结果图；

图9为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌产酸和葡聚糖影响结果图；

图10为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌生物膜形成的影响；

图11为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌生物膜表面形态原子力显微镜观察结果图；

图12为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌的体内药效学评价；

图13为醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌的细胞膜破坏评价。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例：

实施例1：醋酸洗必泰纳米乳漱口液(100g)

1)称取醋酸洗必泰0.5g、丙二醇4.8g、吐温-8019.6g、IPM6g、天然薄荷0.1g、蒸馏水69g。

2)将所述量的表面活性剂、助表面活性剂与醋酸洗必泰混匀，并在转速为50～100r/m恒温磁力搅拌器搅拌，让醋酸洗必泰完全溶解；

3)再加入所述量的油相25℃恒温水浴，并在转速为100～200r/m恒温磁力搅拌器搅拌，缓慢加入约70％处方量蒸馏水，得到澄清的溶液；

4)将所述量的口腔清新剂天然薄荷溶解于水，或薄荷油和薄荷脑溶于丙二醇后加入处方中。

5)在20℃～25℃缓慢加至处方量蒸馏水充分搅拌，直至形成澄清透明、粘度小的纳米乳漱口液。

6)然后用高速离心、透射及粒度分析检测质量合格后，过滤除菌，灌装、密封成不同规格的醋酸洗必泰漱口液。

制备的醋酸洗必泰的纳米乳漱口制剂外观无色、澄清透明、粒径在1～100nm间，13000rpm，10min高速离心后不分层，载药量为0.5％，包封率为90％，室温放置1年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。

实施例2

称取醋酸洗必泰0.5g、丙二醇15g、吐温-8030g、药用IPM20g、天然薄荷0.05g、蒸馏水34.45g。

实施例3

称取醋酸洗必泰0.5g、甘油5g、吐温-8530g、司盘-804g、药用IPM10g、天然冰片0.05g、蒸馏水50.45g。制备方法同实施例1。

实施例4

称取醋酸洗必泰1.0g、甘油5g、吐温-8020g、司盘-8010g、药用GTCC15g、天然薄荷1.0g、蒸馏水48g。制备方法同实施例1。

实施例5

称取醋酸洗必泰1.0g、甘油10g、吐温-858g、吐温8020g、药用IPM3g、薄荷脑1.0g、蒸馏水57g。制备方法同实施例1。

实施例6

称取醋酸洗必泰1.5g、丙二醇5g、吐温-8010g、吐温-2020g、药用液体石蜡15g、薄荷油1.0g、蒸馏水47.5g。制备方法同实施例1。

实施例7

称取醋酸洗必泰1.0g、正丁醇5g、RH-4030g、司盘-854g、药用石蜡10g、薄荷油0.05g、蒸馏水49.95g。制备方法同实施例1。

实施例8

称取醋酸洗必泰1.0g、1，3丁二醇15g、吐温-8520g、药用IPM10g、薄荷脑0.05g、蒸馏水53.95g。制备方法同实施例1。

实施例9

称取醋酸洗必泰0.2g、丙二醇10g、吐温8020g、吐温-8510g、药用IPM10g、天然冰片1g、蒸馏水48.8g。制备方法同实施例1。

实施例10

称取醋酸洗必泰0.2g、丙二醇15g、EL-4030g、药用IPM15g、蒸馏水39.8g。制备方法同实施例1。

实施例11

称取醋酸洗必泰1g、EL-4010g、RH-4010g、司盘-8510g、药用液体石蜡5g、薄荷油0.5g、蒸馏水63.5g。制备方法同实施例1。

实施例12

称取醋酸洗必泰0.5g、EL-4020g、药用GTCC10g、薄荷油1.0g、蒸馏水68.5g。制备方法同实施例1。

实施例13

称取醋酸洗必泰1.0g、甘油5g、EL-4030g、司盘-8515g、豆油10g、天然冰片1.0g、蒸馏水38g。制备方法同实施例1。

实施例14

称取醋酸洗必泰1.0g、甘油5g、RH-4030g、司盘-8015g、菜油10g、薄荷油0.1g、蒸馏水38.9g。制备方法同实施例1。

实施例15

称取醋酸洗必泰1.0g、RH-4015g、EL4015g、司盘-8015g、菜油4g、薄荷油1g、蒸馏水49g。制备方法同实施例1。

实施例16

称取醋酸洗必泰1.0g、RH-4015g、吐温8015g、甘油-8015g、菜油15g、天然薄荷1.0g、蒸馏水38g。制备方法同实施例1。

实施例17

称取醋酸洗必泰1.0g、吐温8520g、吐温8015g、1，3丁二醇-8015g、GTCC4g、薄荷脑-0.5g、蒸馏水44.5g。制备方法同实施例1。

实施例18

称取醋酸洗必泰1.0g、EL-4010g、RH-4010g、1，3丁二醇5g、豆油15g、天然薄荷1.0g、蒸馏水57g。制备方法同实施例1。

实施例19

称取醋酸洗必泰1.0g、吐温208g、吐温-8525g、正丁醇5g、GTCC4g、天然冰片1.0g、蒸馏水56g。制备方法同实施例1。

实施例20

称取醋酸洗必泰1.0g、吐温-2015g、吐温-8015g、正丁醇10g、豆油3g、天然冰片0.5g、蒸馏水55.5g。制备方法同实施例1。

实验例

试验材料：醋酸洗必泰(含量98.3％，辽宁锦州九泰医药有限公司)；醋酸洗必泰对照品(中国药品生物制品检定所)；聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(EL40)，德国BASF公司生产，购至北京凤礼精求商贸有限责任公司；GTCC英国CRODA公司生产，购至北京凤礼精求商贸有限责任公司；豆油、花生油均购至山东鲁花有限公司；吐温80、吐温85、司盘80、司盘85、吐温20、甘油、丙二醇、液体石蜡、1,3丁二醇、正丁醇购至中国上海国药集团。脑心浸液培养基(Brain heart infusion,BHI)(BD,New Jersey,USA)；24孔细胞培养板(Costar3524,USA)；Coverslips(Thermo,Rochester,USA)。菌种：变形链球菌UA159(ATCC700610)(ATCC,Virginia,USA)，大肠杆菌(ATCC8099)、白色念珠球菌(ATCC10231)均ATCC购买，实验室保存提供；乳酸杆菌从西南医院临床分离，实验室保存提供。SD大鼠，SPF，雌性，3周龄，购至重庆市中药研究院。

仪器设备：透射电镜(荷兰PHILIPS公司)；电位及粒度分析仪(NanoZS90，英国马尔文公司)；HPLC(Waters-E2695,美国)；ND-1000紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)；酶标仪(Biorad6.0，日本)、微需氧培养箱(Thermo Scitinfic)、菌落计数仪(Shineso Science & Technology Co.,Ltd.,浙江杭州)；扫描电镜(AMRAY1000B,USA)；原子力学显微镜((IPC-208B,重庆大学)等国家免疫制剂技术工程研究中心现有仪器。

1.醋酸洗必泰的纳米乳漱口液最优处方的筛选

(1)表面活性剂和助表面活性剂的筛选：

用筛选醋酸洗必泰纳米乳油相的方法对表面活性剂吐温80、吐温85、吐温20、聚氧乙烯蓖麻油(EL40)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)和助表面活性剂(CoSF)，即司盘80、司盘85、以及乙醇、甘油、丙二醇的同样方法筛选醋酸洗必泰的饱和浓度。

对上述表面活性剂、表面活性剂、油相的筛选结果，见图1a到图1c。对上述表面活性剂的溶解度测定结果是：溶解度大小依次是吐温80(16.16±0.82mg/g)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)(13.23±0.56mg/g)、聚氧乙烯蓖麻油(EL40)(10.28±0.17mg/g)、吐温85(8.45±0.08mg/g)、吐温20(4.23±0.06mg/g),图1a。上述助表面活性剂的溶解度测定结果从大到小以此为：乙醇(9.60±0.31mg/g)、丙二醇(7.73±0.30mg/g)、司盘85(4.35±0.11mg/g)、 司盘80(3.95±0.03mg/g)、正丁醇(2.56±0.09mg/g)、1,3丁二醇(2.09±0.46mg/g),见图1b。

(2)油相的筛选： 

选择IPM(C14)、GTCC(C18)、液体石蜡(C16～C20)、豆油、菜籽油等5种不同碳链长短的油，20℃黏度大小依次为液体石蜡(110～230mPas)、GTCC(25.0～33.0mPas)、豆油(8.5mPas)、IPM(5～6mPas)、菜油(8.5mPas)。分别取上述5种油适量，分别置具塞锥形瓶中，加入过量的醋酸洗必泰，25℃水浴，震摇24h到达平衡。用HPLC法测定醋酸洗必泰在各种油相中的溶解度。

图1c结果表明：IPM(C14)、液体石蜡、GTCC、豆油、菜籽油分别为3.08±0.15mg/g、2.27±0.09mg/g、1.53±0.08mg/g、0.89±0.06mg/g、0.52±0.05mg/g，在IPM的溶解度最大，为3.08mg/g。这可能与IPM的碳链长短与黏度有关，有利于药物在油相中的分布和溶解。因此，选择IPM作为醋酸洗必泰纳米乳的最优的油相。所有的油相、表面活性剂和助表面活性剂有较大的溶解度(大于0.2mg/ml)，符合可以制备纳米乳要求。但是由于乙醇具有挥发性和对口腔粘膜有强烈的刺激性，选择除他以为的所有的油相、表面活性剂和助表面活性剂，但是根据其最大的伪三元相图区域，最终确定其表面活性剂与助表面活性剂互配较优组合为：吐温80/司盘80、吐温85/司盘85、RH40/丙二醇、EL40/丙二醇。

(3)伪三元相图的绘制

用筛选出表面活性剂和助表面活性剂，全面设计实验组，按9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9(SF和CoSF的质量比)，称取SF-CoSF，加入所选择的油相，涡旋震荡，滴加水，观察各组的变化，以离心(13,000rpm，30min)稳定性和粒径为主要的评价标准，从而确定出形成纳米乳的SF和CoSF。以表面活性剂/助表面活性剂(混合表面活性剂)、油相和去离子水作为等边三角形的3个顶点，绘制伪三元相图，相图每条边上的点分别表示相应两组分之间的比例关系，相图任意一点表示相应体系中各组分的质量百分含量。根据油、水、混合表面活性剂在临界点的质量分数，绘制伪三元相图，确定最大的纳米乳区。纳米乳的评价标准评价标准为：制备的液体呈澄清透明或半透明；有蓝色乳光；高速离心(13000r/m，30min)离心后，稳定不分层；平行光入射后有丁达尔现象；通过透射电子显微镜和激光粒度仪，检测出乳滴在1～100nm之间。若制备的混合液体呈乳白色，平行光入射后有散射现象，则为乳剂；若澄清透明、稠厚，则为凝胶。同时在相转变过程还会产生液晶。利用液晶有折光存在，在偏光显微镜检测中，会出现明暗变化，所以往往用其来区分液晶和凝胶，如发亮为液晶，不发亮的凝胶。

伪三元相图的绘制的结果，见图2a至图2d。从图2a至图2d可以看出，当表面活性剂与助表面活性剂的比例(Km)值增加时，纳米乳的区域先增加后减少。当其比例为4:1，其纳米乳的区域最大，当其比例为2：1，其纳米乳区域最小。根据伪三元相图的结果，从而确定最最佳的比例为4:1。

2.醋酸洗必泰纳米乳漱口液制备

根据序贯设计思想，以水、油、SF/CoSF为三相，采用滴定法绘制伪三元相图。选择离心(13,000rpm，30min)稳定，直径在1～100nm的纳米乳区为处方候选区。精确称取处方量的醋酸洗必泰，处方量的表面活性剂与助表面活性剂(表面活性剂与助表面活性剂为上述筛选出来的4种较优互配组合)，处方量的油相，先加入大约70％的水溶液或缓冲液，搅拌均匀，最后逐步加入水或缓冲液，即得澄清透明的纳米乳液。从图3a可看出，制备的醋酸洗必泰纳米乳外观淡黄色澄清透明液体。根据绘制伪三元相图的最终表明制备的醋酸洗必泰纳米乳的优化处方为：吐温80：丙二醇：IPM(19.2％:4.8％:6％),醋酸洗必泰浓度0.5％和水56.5％，薄荷油5％。以下性能检测如表明均采用的该最优化处方。

3.醋酸纳米乳漱口液的形态、粒度及电位检测

少量纳米乳适量，用水稀释100倍后，滴在覆有支持膜的铜网上，静止10min后用滤纸片吸干，再滴加2％磷钨酸(pH为7.4)溶液于铜网上负染3min，自然挥干，用透射电子显微镜观察并摄制照片，结果见图3b。取醋酸洗必泰纳米乳漱口液适量，用适量蒸馏水稀释后用激光粒度测定仪进行测定，纳米乳的粒径与粒度分布见图3c和图3d。

图3a结果表明，在电镜下均呈圆球形，内部为油相，见图3b从电镜下，随机选取不少于500个液滴测量粒径，得纳米乳液滴粒径范围在1～100nm，平均粒径为63.0nm。图3b结果表明，实验制备的醋酸洗必泰纳米乳平均粒径63.13nm。小于70nm的粒子占70％；小于90nm的粒子占95％，可见制得的纳米乳漱口液的粒径分布范围窄，粒径比较均匀。图3d结果表明，实验制备的醋酸洗必泰纳米乳平均电位-67.13nm，属于稳定体系范围。

4.醋酸洗必泰纳米乳漱口液的质量检测及稳定性检测

醋酸洗必泰HPLC检测方法建立：色谱条件：HPLC:Waters(E2695,USA)；色谱柱：ZORABX SB-C18(5um,4.6mm×250mm)：进样量：10ul；流动相：乙腈：0.02M-K2HPO4(pH＝2.0)(70/30,v/v)；检测波长：275nm；柱温：20℃。将醋酸洗必泰对照品用甲醇溶解成0、25、50、75、100、200ng/mL。在上述色谱条件下，检测出不同浓度其峰面积，根据不同浓度和峰面积，绘制的标准曲线方程。取醋酸洗必泰纳米乳漱口液0.2mL， 13000r/m，30min，后沉淀加入10ml乙醇，0.22um微孔滤膜过滤HPLC测定其未包裹的量；上清加入两倍体积的无水乙醇，摇匀破乳后，13000r/m，30min，取上清和沉淀分别加入10ml乙醇，0.22um微孔滤膜过滤HPLC测定未包裹的量。用公式计算其包封率和载药量。

载药量＝(破乳后的上清+破乳后的沉淀量)×100％/样品总质量。

包封率＝(实际药物载药量/理论药物载药量)×100％

醋酸洗必泰对照品、醋酸洗必泰纳米乳漱口液的HPLC图的出峰时间基本一致，在4.87min附近。绘制的标准曲线，见图4，线性关系良好，标准曲线方程为Y＝14782X-17189(R²＝0.9963，线性方程范围25-1000ug/mL)，具有较高的相关性和较宽的检测范围，空白纳米乳在该处未产生明显的峰，说明其分离效果较好。因该检测方法此可用于HPLC检测醋酸洗必泰的包封率和载药量。根据标准曲线，测得醋酸洗必泰纳米乳漱口液的载药量为5mg/ml，其包封率大于90％。

取醋酸洗必泰纳米乳漱口液3批，每批3份，25℃相对湿度60±5％条件下放置12个月。每3个月取样一次，分别于0、30、60、90、120、180、360天，先观察高速离心(13，000rpm,10min)前后外观变化；以及对其含量用HPLC检测，电位和粒度用Nano ZS90电位及粒度分析仪检测，用pH计测其pH值。

稳定性实验结果表明，醋酸洗必泰纳米乳漱口液在上述所有时间内，在高速离心前后的外观都发生明显的改变，也无产生发生明显的絮凝、分层和药物析出现象。对其含量、粒度和电位、pH测得结果见图5。从图5可看出，其含量、粒度和电位、pH都没有发生明显改变。上述结果充分证实，其制备的醋酸洗必泰纳米乳质量非常稳定。

由于口腔的致病菌众多，而变形链球菌是口腔主要的公认的致病菌，以下的研究就以变形链球菌为代表进行研究。

5.醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌的抗菌增效作用

实验材料及分组：0.2％醋酸洗必泰水溶液组(简写CHX,称取0.2g醋酸洗必泰加入到100g蒸馏水，搅拌溶解完全)、0.5％醋酸洗必泰纳米乳漱口液组(简写CNE,采用本发明的制备工艺，的最优化处方为：吐温80：丙二醇：IPM(19.2％:4.8％:6％，即具体的实施例1)，醋酸洗必泰浓度0.5％和水56.5％，薄荷油5％)。空白组(简写，MNE)、复方醋酸洗必泰漱口液组(简写，FCHX,参照中国专利96115216.3主要药物成分：0.2％氟化钠，0.02％醋酸洗必泰，0.01％天然甜味剂及0.075％香精，制备方法为按照申请号为96115261.3的发明专利申请所公开的配方各组分及其用量，并按照其公开的方法制备的龋齿净剂)。

MIC的测定：结合前期预实验，将醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液、复方醋酸洗必泰漱口液分别稀释成含醋酸洗必泰1、2、4、6、8、10ug/ml。将UA159(Streptococcus mutans ATCC700610)培养的菌液调节至OD＝1.0。吸取用BHI稀释1:10000倍的菌液1.8ml，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml，放入37℃微需氧培养箱，培养24h，每孔取除200ul液体，用酶标仪在595nm波长处检测其吸光度数值。

MIC实验表明，见图6。醋酸洗必泰纳米乳漱口液的MIC为0.4ug/ml,醋酸洗必泰水溶液的MIC为0.8ug/ml，复方醋酸洗必泰溶液的MIC为1.0ug/ml。醋酸洗必泰纳米乳对抗变形链球菌药效是其水溶液的2倍，是复方醋酸洗必泰的2.5倍。

MBC的测定：吸取上述MIC培养的菌液5ul，滴入BHI固体培养板，L棒涂布，放入37℃微需氧培养箱，培养24h，观察细菌的生长情况。

MBC结果表明，0.4ug/ml的醋酸洗必泰纳米乳漱口液的BHI平板没有生长细菌；0.8ug/ml的醋酸洗必泰水溶液的BHI平板没有生长细菌；1ug/ml的复方洗必泰漱口液的BHI平板没有生长细菌。因此，醋酸洗必泰纳米乳的MBC为0.4ug/ml，醋酸洗必泰水溶液的MBC为0.8ug/ml，复方醋酸洗必泰溶液的MBC为1.0ug/ml。MIC和MBC的结果证实，醋酸洗必泰纳米乳可显著提高对抗变形链球菌活性。

杀菌动力学：将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝0.6。吸取ATCC700610菌液1.8ml，将2、4、8ug/ml醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组，放入37℃微需氧培养箱，培养0，5，10，15，30，60，120，240，480和720min。孵育不同时间后，用BHI稀释0，10¹，10²，10³和10⁴倍，取5μL稀释溶液到BHI平板，放在37℃24h，用自动菌落计数仪计数。

杀菌动力学图7a结果表明，我们观察到的纳米乳漱口液具有比CHX更快和更强大的杀菌活性。杀菌动力学结果显示，抗菌效果与醋酸洗必泰有显著剂量依赖效应。研究结果表明，0.8μg/mL的浓度CNE比CHX(73.33％)具有快速(5min)杀菌效果对变形链球菌(95.07％细菌死亡)。而当0.8μg/mL的醋酸洗必泰纳米乳漱口液可在480min内将细菌全部杀死。醋酸洗必泰纳米乳漱口液作用5min后，杀菌动力学曲线明显降低，而醋酸洗必泰水溶液在15min才发生明显改变。结果证实，醋酸洗必泰纳米乳漱口液比其水溶液显著缩短其对抗变形链球菌作用。

抑菌动力学：将醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液、空白组分别稀释成含醋酸洗必泰2、4、6、8、10ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1。吸取ATCC700610 用BHI液体培养基稀释1000倍的菌液1.8ml，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml，放入37℃微需氧培养箱，培养0、10、20、30、60、120、240、360、480min，每孔取除200ul液体，用酶标仪在595nm波长处检测其吸光度数值。

抑菌动力学结果，见图7b。从图7b，随着时间的延长，其OD逐渐升高，当培养60min时，细菌的OD未发生明显变化，而当醋酸洗必泰纳米乳在240min也和60min未发生明显的变化，而醋酸洗必泰水溶液在240min明显高于其纳米乳。这些表明，醋酸洗必泰纳米乳比其水溶液显著延长其抑菌作时间。

上述的MIC、MBC其MIC、MBC、杀菌和抑菌动力学试验结果证实，醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌具有显著的抗菌活性，明显缩短对变形链球菌的杀菌时间，延长其对变形链球菌的抑制生长。

6.醋酸洗必泰纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌的MIC的检测

实验材料及分组：0.5％醋酸洗必泰纳米乳漱口液组(简写CNE,采用本发明的制备工艺，的最优化处方为：吐温80：丙二醇：IPM(19.2％:4.8％:6％，即具体的实施例1)，醋酸洗必泰浓度0.5％和水56.5％，薄荷油5％)。复方醋酸氯己定微乳消毒剂组(简写，FCHME,参照中国专利CN103081940A实施例1,主要药物成分：0.5％醋酸己定，0.5％苯扎溴铵，25％RH40、8.3％丙二醇、2.7％乙酸乙酯)；醋酸氯己定微乳消毒剂组(简写，CHME,参照中国专利CN103081940A实施例1,主要药物成分：0.5％醋酸己定25％RH40、8.3％丙二醇、2.7％乙酸乙酯；制备方法为按照申请号为96115261.3的发明专利申请所公开的配方各组分及其用量，并按照其公开的方法制备的醋酸氯己定微乳消毒剂)

在结合前期预实验摸索，将醋酸洗必泰纳米乳漱口液、醋酸氯己定微乳消毒剂组、醋酸氯己定微乳消毒剂组分别稀释成含醋酸洗必泰1、2、4、8、16、32、48、64ug/ml。将大肠杆菌(ATCC8099)、白色念珠球菌(ATCC10231)、变形链球菌(ATCC700610)、乳酸杆菌培养的菌液调节至OD＝1.0。吸取用BHI稀释1:10000倍的菌液1.8ml，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml，放入37℃微需氧培养箱，培养24h，每孔取除200ul液体，用酶标仪在595nm波长处检测其吸光度数值。

醋酸洗必泰纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌、乳酸杆菌的MIC的检测结果图8。图8结果看出，本发明的纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌的MIC分别为0.8ug/ml、3.2ug/ml、0.4ug/ml、3.2ug/ml。醋酸氯己定单方 和复方的微乳消毒剂对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌的分别是3.2ug/ml和1.6ug/ml、6.4ug/ml和4.8ug/ml、1.6ug/ml和0.8ug/ml、6.4ug/ml和3.2ug/ml。本发明的纳米乳漱口液对大肠杆菌、白色念珠球菌、变形链球菌和乳酸杆菌抗菌效果分别是醋酸氯己定单方和复方微乳的4倍和2倍，2倍和1.5倍，4倍和2倍，2倍和1倍。

7.醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌的抑制产酸影响

将醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组分别稀释成含醋酸洗必泰2、4、6、8ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1.0。将ATCC700610菌液用BHI液体培养基稀释1000倍后吸取1.8ml放入24孔细胞培养板中，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml，放入37℃微需氧培养箱，培养24h，每孔取除1ml液体，用精密数显酸度计测量pH值。

醋酸洗必泰纳米乳，对变形链球菌产酸作用影响的结果，见图9a。从图9a可看出，醋酸洗必泰纳米乳和其水溶液为0.2ug/ml，对变形链球菌产酸的无显著性差异。当浓度增加至4ug/ml，醋酸洗必泰纳米乳的抑制产酸作用明显，而醋酸洗必泰水溶液当浓度增加至8ug/ml才能明显抑制变形链球菌就的产酸，而空白的纳米乳对照，对变形链球菌产酸无任何显著抑制作用。

8.醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌对难溶性胞外多糖形成影响

将醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组分别稀释成含醋酸洗必泰2、4、6、8ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1.0。将ATCC700610菌液用BHI液体培养基稀释1000倍后吸取1.8ml放入24孔细胞培养板中，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml，放入37℃微需氧培养箱，培养48h，收集上清液，在6000g条件下，离心15min，4℃，弃上清液。加0.5mol/L NaOH1ml重复混匀，6000g条件下，离心15min，洗涤2次，沉淀用2ml的0.1M NaOH溶解后用苯酚硫酸法检测其含量。每个样本重复3次。

醋酸洗必泰纳米乳，对变形链球菌的难溶性胞外多糖影响的结果，见图9b。从图9b可看出，醋酸洗必泰纳米乳和其水溶液为0.2ug/ml，对变形链球菌产酸难溶性胞外多糖的无显著性差异。当浓度增加至4ug/ml，醋酸洗必泰纳米乳的抑制作用明显，而醋酸洗必泰水溶液当浓度增加至8ug/ml才能明显抑制变形链球菌就的胞外多糖的产生，而空白的纳米乳对照，对变形链球菌产生难溶性胞外多糖无任何显著抑制作用。

通过对其产酸、难溶性胞外多糖观察结果证实，醋酸洗必泰纳米能够抑制产酸、胞外多糖的产生。

9.醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌形成生物膜形成影响

(1)变形链球菌生物膜形成量

醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组分别稀释成含醋酸洗必泰500ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1.0。将ATCC700610菌液用BHI液体培养基稀释10000倍后吸取2ml放入24孔细胞培养板，放入80％N2、20％CO2、37℃条件下微需氧培养48h取出。弃去上清液，加入0.2ml用含500ug/ml醋酸洗必泰的纳米乳漱口液和水溶液作用30min,在装有PBS标准96孔板内清洗2～3次，室温干燥30min，每孔加入0.1％的结晶紫200μl，15min染色，用PBS同样方法清洗3次，室温干燥10min。在加入95％乙醇200μl/孔于96孔板中，微量震荡器上震荡30min，用酶标仪在波长为570nm处检测其OD数值，每孔重复3次，以不含菌悬液的孔作为基数对照。

醋酸洗必泰纳米乳，对变形链球菌的生物膜形成量影响结果，见Fig.10a。从图10可看出，用相同含量醋酸洗必泰纳米乳和水溶液作用变形链球菌生物膜量明显降低，而醋酸洗必泰水溶液比空白对照组间的量明显高。且醋酸洗必泰纳米乳、醋酸洗必泰水溶液对空白对照组的生物膜形成量产生明显差异。

(2)扫描电镜观察其抑制生物膜形态学

醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组分别稀释成含醋酸洗必泰2ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1.0。将ATCC700610菌液用BHI液体培养基稀释10000倍后吸取1.8ml放入24孔细胞培养板中，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml。放入80％N2、20％CO2、37℃条件下微需氧培养24h和48h。将其塑料片小心取出，用2.5％戊二醛固定，依次用50％、70％、80％、90％酒精各脱水1次，然后用100％酒精脱水2次，醋酸异戊酯脱水2次，每次均为5min，CO2冷冻干燥5h，载体表面在真空条件下镀金粉，SEM观察。

醋酸洗必泰纳米乳漱口液对变形链球菌的生物膜形成量外观结果，见图10b-图10e。从图可看出，用相同含量醋酸洗必泰的醋酸洗必泰纳米乳漱口液和水溶液作用变形链球菌生物膜形成外观变化在2000、4000、8000倍放大后发现，纳米乳漱口液密度远远低于其水溶液，但纳米乳漱口液和水溶液对生物膜的形态间无明显差异。

(3)原子力显微镜观察对生物膜三维结构形态学

醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组分别稀释成含醋酸洗必泰2ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1.0。将ATCC700610菌液用BHI液体培养基稀释10000倍后吸取1.8ml放入24孔细胞培养板中，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml。放入80％N2、20％CO2、37℃条件下微需氧培养48h。将其塑料片小心取出，用无菌的PBS轻轻清洗 3次，自然晾干，用原子力学显微镜直接观察。所有图像均通过自动平滑处理以消除慢扫方向的低频噪音。计算其算术平均根、均方差、最高高度、偏斜度、陡度。

用高分辨率原子显微镜对醋酸洗必泰纳米乳和水溶液作用于变形链球菌生物膜观察并三维重建的结果见，图11a-图11e。从图10的二维图，可以看出，纳米乳漱口液的生物膜厚度明显低于水溶液。图11三维图则看出，纳米乳漱口液形成的生物膜的密度明显低于其水溶液。他的算术平均根、均方差、最高高度，纳米乳漱口液均低于其水溶液，而偏斜度和陡度则相反。

对其生物膜的形成量、外观和三维结构证明，醋酸洗必泰纳米乳明显抑制变形链球菌形成的量、同时抑制形成的密度和厚度，但对其生物膜形成变形链球菌形态无产生明显改变。

(10)醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌造成龋齿动物模型的体内药效学研究

实验材料及分组：实验分成：模型对照组、空白纳米乳组、2mg/ml醋酸洗必泰纳米乳漱口液组，5mg/ml醋酸洗必泰纳米乳漱口液组，2mg/ml醋酸洗必泰水溶液组，5mg/ml醋酸洗必泰混悬液组。将三周龄60只SPF雌性性大鼠(重庆市中药研究院)随机分成6组，每组10只，饲养在SPF环境下自由饮水，感染前用正常饲料，感染后用Keys2000龋齿饲料。根据中国专利(一种变形链球菌感染及致龋动物模型建立方法,ZL201210558790.6)进行，先连续3天用1％氯霉素、1％氨苄西林、1％羧苄青霉素清除杂菌。抗生素清除后，所有大鼠被麻醉后，口腔滴入0.2ml的1×109CFU/ml700610菌液。每天2次，连续3天。感染后第5天，除模型组动物外，其余每组动物被麻醉滴入0.2ml的不同溶液，每天2次，连续28天。在给药后第14天和28天，麻醉后用无菌棉签采取大鼠口腔，将其用无菌生理盐水100倍稀释5ul滴入轻唾培养基，微需氧培养条件培养3天，用菌落计数仪计数。在感染后第70天，所有动物被处死，其牙齿用Keys(1958)评分系统评价各组动物的龋齿。

在连续给药后14天和28天的，大鼠口腔菌落数结果见图图.12a。每天两次连续14天和28天给药，2mg/ml和5mg/ml CNE的口菌落数显著低于相同浓度的CHX。同时，随着给药时间的延长，口腔的菌落数减少。对所有动物的龋齿评分结果，见图12b至图12d。从图中可看出，所有药物处理组动物的釉质龋的得分显著低于空白纳米乳组与模型对照组。2mg/ml和5mg/ml CNE的釉质龋、浅龋和中龋的分数是明细低于相同浓度的CHX。此外，随着药物浓度增加，其龋齿的釉质龋、浅龋和中龋分数明显下降。其每组动物牙齿龋齿的代表图图可以看出，绿色箭头表示表面(釉质龋)病变；蓝色箭头表示轻微的牙本质(浅龋)病变；红色箭头指示中度牙本质(中龋)病变。从图12可以看出，用2mg/ml和5mg/ml CNE的龋齿程 度也明显低于相同浓度的CHX和对照组。因此，这结果证实，CNE可以改善这种药物的抗菌效果和减少龋齿程度。

(11)醋酸洗必泰纳米乳对变形链球菌细胞膜的破坏作用研究

醋酸洗必泰水溶液组、醋酸洗必泰纳米乳漱口液组分别稀释成含醋酸洗必泰2ug/ml。将ATCC700610培养的菌液调节至OD＝1.0。将ATCC700610菌液用BHI液体培养基稀释10000倍后吸取1.8ml放入24孔细胞培养板中，将上述不同浓度醋酸洗必泰溶液0.2ml。放入80％N2、20％CO2、37℃条件下微需氧培养48h。将培养液6000g，10min离心后用2.5％戊二醛固定。将标本固定后用2％(w/v)锇在0.1M PBS在室温下1小时，用相同的缓冲液洗涤三次，然后脱水在一系列的乙醇溶液(即，50％，70％，80％，90％，95％和100％)。每个样品被嵌入在环氧树脂和减少使用欧尔马超薄切片机，用乙酸双氧铀染色和碱性柠檬酸铅和使用tecnai-10TEM观察。

变形链球菌细胞膜损伤，通过透射电子显微镜观察表明，在图13a至图13d。在放大3.9万倍，更明显的漏洞进行处理与CNE后对变形链球菌表面观察(图13a)比CHX(图13b)。在9.3万倍,CHX显示完整、清楚地辨别出细胞膜的均匀分布的胞浆。然而，随着CNE表现出改变和破坏细胞膜处理的细胞，如图13a所示。细胞质膜的出现成为从细胞膜局部分离。相比，与CHX观察该破损的程度是严重的(图13a和图13c)。细胞膜中断是更严重的在0.2μg/mL CNE组与CHX。这些结果表明，CNE表现出更强的破坏细胞膜结构的变形链球菌比同浓度的CHX的能力。

将ATC700610细菌菌培养(1×10⁶CFU/毫升)培养在24孔培养板4小时与CNE和CHX0.2，0.4和0.8μg/ml醋酸洗必泰含量来评估细胞膜的完整性。将培养的细菌用6000rpm离心10min，沉淀加入200ul的生理盐水溶解，取其5ul用微量紫外分光光度计在260nm和280nm测定其吸光度数值。

细胞膜的完整性结果在图13e和图13f所示。从图13e可看出，0.4和0.8μg/mL CNE的260nm吸光度数，显著高于相同浓度的CHX(P＝000，P＝0.001，P＜0.01)。由于细胞膜的破坏和损伤，0.4和0.8μg/mL CNE从细胞膜泄漏的核酸量明显高于相同浓度的CHX。从图13f可看出，0.4和0.8μg/mL CNE的280nm吸光度数，显著高于相同浓度的CHX(P＝000，P＝0.001，P＜0.01)。由于细胞膜的破坏和损伤，0.4和0.8μg/mL CNE从细胞膜泄漏的蛋白量明显高于相同浓度的CHX。由于细胞膜的破坏和损伤，0.4和0.8μg/mL的CNE在260和280nm吸光度值是其水溶液的1.75倍、1.78倍和6.25倍和4.43倍。上述研究结果表明，醋酸洗必泰纳米乳漱口液是通过破坏细胞膜结构及生物膜的形成，从而来提高对变形链球菌的抗菌活性。

本发明通过对用溶解度实验、成功筛选出的以吐温80/丙二醇/IPM为代表的醋酸洗必泰纳米乳漱口液，用透射电镜、高速离心、电位及粒度分析仪、HPLC证实，已成功制备粒径在1-100nm，包封率大于90％，载药量为0.5％的醋酸洗必泰纳米乳漱口液。同时对其室温放置一年的含量、粒度、电位、pH以及其外观研究证实，纳米乳漱口液质量极其稳定。通过体外的MIC、MBC、抑菌和杀菌动力学试验以及体内龋齿评分证实，纳米乳漱口液对变形链球菌具有显著体外抗菌的活性。对其产酸、难溶性胞外多糖以及生物膜量、外观和三维结构研究发现，纳米乳漱口液能显著抑制其产酸、难溶性胞外多糖和生物膜形成量、形成生物膜的变形链球菌密度、数量以及厚度、破坏细菌细胞膜。

在发明中提及的所有参考文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样，无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用，这些等价形式除纳米乳参考文献外的醋酸洗必泰药物制剂稳定性、药物载药量、包封率、制备工艺和药效方面均不可能同时到达本申请所附权利要求书所限定的范围。此外，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。以上所述仅是本发明的优选实施方式而非对本发明保护范围的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明技术方案进行修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高效抗菌龋齿醋酸洗必泰纳米乳漱口液，其特征在于，由如下重量份的原料制成：醋酸洗必泰0.2～1.5份，表面活性剂8～30份，助表面活性剂4～15份，油相3～20份，口腔清新剂0.05～1份，蒸馏水34.45～69.0份。

2.根据权利要求1所述的纳米乳漱口液，所述的药物醋酸洗必泰，所述物浓度范围：0.2～1.5份。

3.根据权利要求2所述的纳米乳漱口液，其特征在于，所述表面活性剂为聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯中的一种或多种；所述聚山梨酯为吐温-80、吐温-85、吐温20中的一种或几种，所述聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯蓖麻油40中的一种或其组合；所述组份的有效量分别为吐温-80：10～30份、吐温-85：10～30份、吐温20：8～20份、聚氧乙烯氢化蓖麻油40(RH40)：10～30份、聚氧乙烯蓖麻油40(EL40)：10～30份。

4.根据权利要求3所述的纳米乳漱口液，所述助表面活性剂为：失水山梨醇脂肪酸酯或/和C2～C4的一元醇或多元醇；所述失水山梨醇脂肪酸酯为司盘85、司盘80中的一种及一种以上组合；所述C2～C4的一元醇或多元醇为正丁醇、甘油、1，3-丁二醇、1，3-丙二醇中的任一种；所述助表面活性剂的有效量分别为司盘-85:4～15份、司盘80：5～15份；甘油：5～10份；丙二醇：4.8～15份；1，3-丁二醇：5～10份，正丁醇：5～10份。

5.根据权利要求4所述的纳米乳漱口液，所述的油相是IPM、GTCC、液体石蜡、菜油和豆油中的任一种，其中所述油相的有效量分别为IPM：3～20份、液体石蜡：5～15份、GTCC：3～15份、食用菜油：4～15％份、食用豆油：5～15％。

6.根据权利要求1～5任一所述的纳米乳漱口液，所述口腔清新剂为：天然薄荷、天然冰片、薄荷油、薄荷脑中的中任一种或其组合；其有效量分别为天然薄荷：0.05～1份、天然冰片：0.05～1份、薄荷油：0.05～1份、薄荷脑：0.05～1份。

7.根据权利要求1～6任一所述的纳米乳漱口液，用水无限稀释后其粒径为1～100nm。

8.权利要求1～7所述的纳米乳漱口液的制备方法，具体包括步骤如下：

(1)按配比量称取原料配方中的各物质；

(2)将表面活性剂、助表面活性剂及醋酸洗必泰，搅拌充分溶解，得澄清的溶液1；

(3)再向澄清的溶液1中加入配比量的油相，搅拌下缓慢加入70％的配比量的水相，得到澄清的溶液2；

(4)将配比量的口腔清新剂溶于溶剂后加入澄清的溶液2中。

(5)将澄清的溶液2于20℃～25℃缓慢加至剩余配比量的水相，充分搅拌，直至形成澄清透明的纳米乳漱口液；

(6)然后过滤除菌，灌装、密封成不同规格的醋酸洗必泰漱口液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述口腔清新剂为天然薄荷或天然冰片时，所述溶剂为水；当所述口腔清新剂为薄荷油或薄荷脑时，所述溶剂为丙二醇。