CN104597195B - 一种鉴别冬虫夏草存储时间的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别冬虫夏草存储时间的方法。本发明使用有机溶液提取冬虫夏草粉末，过滤或离心后，浓缩，将所得溶液和麦角甾醇对照品进行薄层层析，取出薄层板，加热，紫外光灯下检视进行判断。通过薄层板上样品斑点的位置及亮度比对，就能知晓冬虫夏草的大致采集年限。该方法实验简单，无需使用昂贵的检测仪器，在冬虫夏草市场交易中具有实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及中草药分析领域，具体涉及一种冬虫夏草存储时间的鉴别方法。
技术背景
冬虫夏草系麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。由于冬虫夏草具有免疫调节、抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老等功能，被视为珍贵的中药材，闻名世界。近年来，虽然冬虫夏草资源稀缺，价格昂贵，但其仍以其多种药用功效而备受关注。
虫草的储藏要点是防潮、防蛀和防虫。虫草常用的储藏方式是用密封容器放在阴凉干燥处，还可以向容器内添加干燥剂。有文献报道，在一般的贮藏条件下，冬虫夏草的保质期为2-3年。理论上来说，采用相同的保存方法，冬虫夏草保存的时间越久，里面所含各种有效成分流失的可能性与流失的量就越大，其药用价值就越低。冬虫夏草的交易市场上，两年以上的旧虫草明显比新虫草价格低。
目前市场上辨别冬虫夏草存储时间的方法主要为经验鉴别，通过观察其外表色泽来辨别，这些方法依赖于经验，准确度不好把握。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于利用现代分析手段，建立快速鉴别冬虫夏草存储时间的方法。
麦角甾醇为冬虫夏草的特征成分，其本身在365nm紫外灯下检视无特征荧光斑点，当冬虫夏草在室温下放置一定时间后，麦角甾醇会发生转化，转化物质在紫外灯下检视为黄绿色荧光斑点。因此，利用这一性质，结合本发明人长期实验统计经验，本发明提供一种简易廉价的方法，可以快速地大致判断冬虫夏草的存在年限。
本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种鉴别冬虫夏草存储时间的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)有机溶液提取冬虫夏草粉末，过滤或离心后，浓缩；
2)将1)中所得溶液和麦角甾醇对照品溶液进行薄层层析；
3)取出薄层板，加热，紫外光灯下检视，根据斑点的位置和亮度进行判断。
在一些实施方案中，本发明所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙腈或其组合。
在另一些实施方案中，本发明所述有机溶剂为甲醇。
在一些实施方案中，本发明步骤2)中所述薄层层析方法的展开剂为弱极性溶剂-中等极性溶剂-酸的组合，其中弱极性溶剂选自石油醚、正己烷，中等极性溶剂选自甲酸乙酯，酸选自甲酸。
在一些实施方案中，本发明步骤2)中所述薄层层析方法的展开剂弱极性溶剂-中等极性溶剂-酸的体积比为15:5:1。
在一些实施方案中，本发明步骤3)中所述紫外光灯的波长为365nm。
在一些实施方案中，本发明所述判断的依据为：以麦角甾醇对照品的斑点为参照，若供试品图谱中与麦角甾醇对照品斑点平行位置出现的斑点Ⅱ与此斑点上方的斑点Ⅲ相比，a.斑点Ⅱ比斑点Ⅲ亮度强，则为6个月以内冬虫夏草；b.斑点Ⅱ亮度与斑点Ⅲ亮度相当，则为6个月至13个月以内冬虫夏草；c.斑点Ⅱ亮度比斑点Ⅲ亮度弱，则为13个月至24个月以内冬虫夏草；d.无斑点Ⅱ，只有斑点Ⅲ，则为24个月以上冬虫夏草。
本发明的优点是：
首次提出了一种鉴别冬虫夏草存储时间的方法，鉴别手段无需使用贵重的分析仪器，利用薄层色谱就能快速评判冬虫夏草的已存在月份。
本发明的详细说明
定义和一般术语
本发明使用的定义“展开剂”的作用是使被分析物质可以在薄层板上得以分离，常用组合是石油醚(或正己烷)：甲酸乙酯：甲酸，一般取上层溶液，各种溶剂也可以用各极性相似的溶剂来替代。展开剂组合的常用比例是15:5:1，此比例有较宽的耐用范围，在本领域技术人员公知的范围内，使用相似溶剂以耐用范围内的比例组合作为展开剂都是可行的。
本发明所述“麦角甾醇对照品”，本发明使用甲醇溶解麦角甾醇对照品制得，其麦角甾醇使用量也有一定的耐用范围，相对而言，使用0.3-0.4mg/mL浓度的麦角甾醇溶液作为对照品，有利于斑点Ⅱ和斑点Ⅲ之间的亮度差异的肉眼判断。
本发明“判断依据”中使用的定义“上方”，指的是靠近前沿一端为“上方”，如，附图1中7指示的位置为前沿。
本发明使用的定义“斑点Ⅱ”和“斑点Ⅲ”，其中“斑点Ⅱ”表示使用本发明方法，有机溶剂提取样品进行薄层层析后，与麦角甾醇对照品斑点平行位置出现的斑点，由于和麦角甾醇对照品出现的位置一样，因此判断该斑点的主要物质为麦角甾醇，它们通过加热或长时间放置，麦角甾醇发生转化，在紫外灯下检视到黄绿色的荧光斑点。若不通过长时间置放或加热，麦角甾醇在紫外灯下检视无特征斑点。“斑点Ⅲ”属于冬虫夏草内麦角甾醇转化的产物，薄层层析后，在紫外灯下检视为黄绿色的荧光斑点，位于斑点Ⅱ的上方，且与斑点Ⅱ相邻。
本发明“判断的依据”，是通过发明人长期的实验经验得出的，采收后6-13个月的虫草，通过本发明的方法检测，“斑点Ⅱ”和“斑点Ⅲ”的亮度应该是接近的。
本发明所述“有机溶液提取冬虫夏草粉末”，可以用有机溶剂提取后直接浓缩至所需要的体积，也可以提取后将有机溶剂挥发干后直接用相同或相似极性的溶剂复溶，目的都是为了浓缩；提取用冬虫夏草粉末和供试品溶液的最终体积的常用比例为0.1g:0.1mL，该比例具有一定的耐用范围，并可通过调节点样量使供试品待测斑点达到预期亮度。提取的有机溶液在进行薄层层析之前需要离心或者过滤，静置一段时间也能达到澄清溶液的目的，属于技术领域公知。本发明对薄层板“加热”的目的是使麦角甾醇转化成为在紫外灯下检视呈黄绿色荧光斑点的物质，一般情况下，室温下放置6h以上或80℃加热30min以上或100℃加热15min以上即可，温度越高所需加热时间越短，若加热时间不够，会因为麦角甾醇转化不充分而导致误判。
下面通过具体实施例阐述本发明的技术方案。
附图说明
图1是不同存储时间冬虫夏草样本及麦角甾醇高温破坏样本薄层层析图，其中1为空白溶液，2为室温放置2个月冬虫夏草，3为室温放置22个月冬虫夏草，4为麦角甾醇对照品，5为麦角甾醇高温破坏样品，6为斑点Ⅲ化合物，7为前沿，8为斑点Ⅲ，9为斑点Ⅱ，10为基线。
图2是不同存储时间的冬虫夏草薄层色谱鉴别图，其中1为空白溶液，2为麦角甾醇对照品，3为斑点Ⅲ化合物，4为室温放置1个月样本，5为室温放置7个月样本，6为室温放置12个月样本，7为室温放置27个月样本，8为室温放置22个月冬虫夏草，9为青海冬虫夏草(当年)，10为前沿，11为斑点Ⅲ，12为斑点Ⅱ，13为基线。
图3未知储存时期的冬虫夏草薄层色谱鉴别图，其中1为空白溶液，2为麦角甾醇对照品，3为斑点Ⅲ化合物，4为市售冬虫夏草，5为青海样本，6为西藏那曲样本，7为四川甘孜样本，8为冬虫夏草对照药材，9为前沿，10为斑点Ⅲ，11为斑点Ⅱ，12为基线。
图4不同溶剂提取冬虫夏草样本薄层色谱鉴别图，其中1为甲醇溶解的麦角甾醇对照品，2为乙醇提取冬虫夏草样本，3为甲醇提取冬虫夏草样本，4丙酮提取冬虫夏草样本，5为乙酸乙酯提取冬虫夏草样本，6为前沿，7为斑点Ⅲ，8为斑点Ⅱ，9为基线。
具体实施方式
实施例1
不同冬虫夏草的薄层层析(TLC)鉴别以及麦角甾醇高温破坏样品的观察
取室温放置2个月冬虫夏草，室温放置22个月冬虫夏草，粉碎后，各取约0.1g，加甲醇3ml，超声提取30min后，过滤浓缩至0.1ml，离心取上清液作为供试品溶液；将麦角甾醇对照品约50mg放在105℃条件下烘8个小时后，加入甲醇1ml震荡摇匀，过滤，取续滤液为麦角甾醇高温破坏样品溶液。同时制备麦角甾醇对照品溶液，空白溶液，以及斑点Ⅲ的溶液，展开剂为石油醚：甲酸乙酯:甲酸＝15:5:1，105℃烘15min，于365nm紫外灯下检测得层析图如图1。
从图1可看出，室温放置不同时间的冬虫夏草斑点Ⅱ与斑点Ⅲ的相对荧光强度是不一样的，室温放置2个月的冬虫夏草，斑点Ⅱ的荧光强度明显比斑点Ⅲ强很多，而室温放置24个月的冬虫夏草，斑点Ⅱ的荧光强度与斑点Ⅲ相比则基本上消失。通过观察麦角甾醇高温破坏样品可看出高温条件下麦角甾醇会转化生成斑点Ⅲ。
实施例2
鉴别已知存放日期的冬虫夏草
分别取室温放置1个月冬虫夏草，室温放置7个月冬虫夏草，室温放置12个月冬虫夏草，室温放置22个月冬虫夏草，室温放置27个月冬虫夏草，青海冬虫夏草(当年)，粉碎后各取约0.1g，加甲醇3ml，超声提取30min后，高速离心后，取上清蒸干，残渣加甲醇0.1ml使溶解，离心取上清液作为供试品溶液，同时制备空白溶液，麦角甾醇对照品溶液，以及斑点Ⅲ的溶液。展开剂为石油醚：甲酸乙酯：甲酸＝15:5:1，80℃烘30min于365nm紫外灯下检测，得层析图如图2。
从图2可以看出：随着室温放置时间的延长，斑点Ⅱ的相对荧光强度越来越弱，而斑点Ⅲ的相对荧光强度越来越强。室温放置1个月冬虫夏草斑点Ⅱ强度最亮，斑点Ⅲ很微弱，几乎看不到，室温放置7月和室温放置12个月斑点Ⅱ与斑点Ⅲ荧光强度几乎一样；室温放置22个月斑点Ⅱ非常微弱，而斑点Ⅲ则相对强度较亮；而室温放置27个月，斑点Ⅱ消失，只有斑点Ⅲ。因此用该法可以很好的分辨虫草的存放时间，图2可看出青海冬虫夏草(当年)室温放置时间在6个月以内。
实施例3
鉴别未知存放日期的冬虫夏草
分别取市售冬虫夏草样本，青海野生样本，西藏那曲样本，四川甘孜样品，冬虫夏草对照药材，粉碎后各取约0.1g，加丙酮3ml，超声提取30min后，高速离心后，取上清蒸干，残渣加丙酮0.1ml使溶解，离心5min(10000rpm)，取上清液作为供试品溶液，同时制备空白溶液，麦角甾醇对照品溶液，以及斑点Ⅲ溶液，同时点板，展开剂为正己烷：甲酸乙酯：甲酸＝15:5:1，105℃烘15min，于365nm紫外灯下检测得层析图如图3。
从图3中可以看出市售虫草为最新，西藏那曲次之，青海野生第三，四川甘孜第四，这四个样本室温放置时间应在6个月以内，对照药材放置时间最长，室温放置24个月左右。
实施例4
不同溶剂用于已知存放日期的冬虫夏草
室温放置9个月冬虫夏草样本粉碎后，取约0.1g，平行取4份，分别加甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯3ml，超声提取30min后，过滤，滤液浓缩至0.1ml，离心取上清液作为供试品溶液，同时制备甲醇溶解的麦角甾醇对照品溶液，展开剂为石油醚：甲酸乙酯：甲酸＝15:5:1，薄层层析完毕后，室温放置6h，置于365nm紫外灯下检视，所得层析图如图4。
从图4中可以看出，甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯均可以作为提取溶剂来进行冬虫夏草存放时间，各溶剂提取样本的斑点Ⅱ强度和斑点Ⅲ相当，其存放时间应在6-12月，这与其实际存放时间9个月相符合。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，分析方法具有一定的耐用性是公知，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种鉴别冬虫夏草存储时间的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)用有机溶剂提取冬虫夏草粉末，过滤或离心后，浓缩；
2)将1)中所得溶液和麦角甾醇对照品溶液进行薄层层析；
3)取出薄层板，加热，紫外光灯下检视，根据斑点的位置和亮度进行判断；
其特征在于，步骤2)所述薄层层析的展开剂为石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸或者正己烷∶甲酸乙酯∶甲酸；
步骤3)所述判断的依据为：以麦角甾醇对照品的斑点为参照，若供试品图谱中与麦角甾醇对照品斑点平行位置出现的斑点Ⅱ与此斑点上方的斑点Ⅲ相比，
a.斑点Ⅱ比斑点Ⅲ亮度强，则为6个月以内冬虫夏草；
b.斑点Ⅱ亮度与斑点Ⅲ亮度相当，则为6个月至13个月以内冬虫夏草；
c.斑点Ⅱ亮度比斑点Ⅲ亮度弱，则为13个月至24个月以内冬虫夏草；
d.无斑点Ⅱ，只有斑点Ⅲ，则为24个月以上冬虫夏草；
其中所述斑点Ⅲ属于冬虫夏草内麦角甾醇转化的产物，薄层层析后，在紫外灯下检视为黄绿色的荧光斑点，位于斑点Ⅱ的上方，且与斑点Ⅱ相邻。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙腈或其组合。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述有机溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中所述展开剂的体积比为15:5:1。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)中所述紫外光灯的波长为365nm。
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Denomination of invention: A method for identifying the storage time of Cordyceps sinensis Effective date of registration: 20220426 Granted publication date: 20170315 Pledgee: Minmetals International Trust Ltd. Pledgor: YICHANG SHANCHENGSHUIDU CORDYCEPS Co.,Ltd. Registration number: Y2022980004813 |
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