CN104561377A - 呼吸系统常见病原体的实时荧光多重pcr快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒。本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测多种引起呼吸系统感染的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是我国的常见病、多发病，感染的病原有细菌、病毒、支原体等，感染者从感冒到肺炎，可呈现不同的症状，引发严重的合并症甚至死亡。
呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，前者表现为急性鼻炎、咽炎和喉炎，后者表现为急性气管炎、支气管炎和肺炎。上呼吸道感染的感染原因可以是细菌或真菌。90%左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。下呼吸感染的病因主要是细菌和真菌。由于病毒的类型较多，人体对各种病毒感染后产生的免疫力较弱且短暂，并无交叉免疫，同时在健康人群中有病毒携带者，故一个人一年内可有多次发病。据某省中医院急诊科统计，以发热就诊的病人占急诊门诊总数的40%左右，其中急性病毒性上呼吸道感染发热患者约就占其中的80%以上。因此，对呼吸道病原体的快速、准确的诊断十分必要。在成年人和儿童中，急性呼吸道感染是最普遍的急性传染病，并且病原体种类繁多，这就给诊断带来巨大挑战。
目前，临床上最准确的呼吸道病原体检测方法为病毒培养，具有特异性高的特点，是临床诊断的“金标准”。但培养法耗时、敏感性低、对实验操作要求高。此外还有细菌培养和药敏法，可以监测耐药情况，但样本易污染，对结果影响大；病毒抗原的测定可作为感染证据，检测快速，但敏感性低，且不能区分污染和定植菌；特异性抗体检测，可作早期诊断，特异性及敏感性高，但受到抗体动力学的影响。荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。
要成功实施多重PCR，需要解决几个技术问题： 由于每一种扩增子的最佳扩增条件都不一样，需要协调每个单独反应的条件以保证在单一扩增条件下各扩增子都能进行成功扩增。由于需要使用多组引物/探针组合，不同引物/探针之间互相产生交联的可能性很大，因此在设计时需要考虑消除这一可能性。每组引物/探针不能对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性的结果，影响对疾病的诊断。需要有一定的方法来排除来自于核酸提取方面的问题，这就要求有内对照作为参考。
发明内容
本发明的目的是解决不同引物/探针之间互相产生交联的问题，提供呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，能够快速、精确、有效的进行测定。
本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有用于检测流感A病毒、H1N1亚型病毒、流感B病毒、鼻病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原体、腺病毒、肠病毒、双埃可病毒和呼吸道合胞病毒中一种或多种病原体的多种引物及探针的混合物，其中，用于流感A病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：1 和 SEQ ID NO ：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：3，荧光标记为FAM；用于H1N1亚型病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：6，荧光标记为Cy5；用于流感B病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：7和 SEQ ID NO ：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为ROX；用于鼻病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO ：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：12，荧光标记为VIC；用于冠状病毒229E检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：13 和 SEQ ID NO ：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：15，荧光标记为FAM；用于冠状病毒HKU1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：16 和 SEQ ID NO ：17 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：18，荧光标记为ROX；用于冠状病毒NL63检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：19 和 SEQ ID NO ：20 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：21，荧光标记为VIC；用于冠状病毒OC43检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：22和 SEQ ID NO ：23 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：24，荧光标记为Cy5；用于副流感病毒2检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：25和 SEQ ID NO ：26 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：27，荧光标记为VIC；用于副流感病毒3检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：28和 SEQ ID NO ：29，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：30，荧光标记为FAM；用于副流感病毒4检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：31 和 SEQ ID NO ：32 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：33，荧光标记为ROX；用于人博卡病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：34 和 SEQ ID NO ：35，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：36，荧光标记为ROX；用于人偏肺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：37和 SEQ ID NO ：38，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：39，荧光标记为VIC；用于副流感病毒1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：40和 SEQ ID NO ：41 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：42，荧光标记为FAM；用于肺炎支原体检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：43 和 SEQ ID NO ：44 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：45，荧光标记为Cy5；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：46 和 SEQ ID NO ：47 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：48，荧光标记为Cy5；用于肠病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：49 和 SEQ ID NO ：50，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：51，荧光标记为ROX；用于双埃可病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：52和 SEQ ID NO ：53，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：54，荧光标记为VIC；用于呼吸道合胞病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：55 和 SEQ ID NO ：56，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：57，荧光标记为FAM；所述的内对照为马动脉炎病毒，用于马动脉炎病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：58 和 SEQ ID NO ：59 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：60，荧光标记为Cy5。
有益效果
本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测多种引起呼吸系统感染的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。
具体实施方式
呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有用于检测流感A病毒、H1N1亚型病毒、流感B病毒、鼻病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原体、腺病毒、肠病毒、双埃可病毒和呼吸道合胞病毒中一种或多种病原体的多种引物及探针的混合物，其中，用于流感A病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：1 和 SEQ ID NO ：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：3，荧光标记为FAM；用于H1N1亚型病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：6，荧光标记为Cy5；用于流感B病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：7和 SEQ ID NO ：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为ROX；用于鼻病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO ：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：12，荧光标记为VIC；用于冠状病毒229E检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：13 和 SEQ ID NO ：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：15，荧光标记为FAM；用于冠状病毒HKU1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：16 和 SEQ ID NO ：17 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：18，荧光标记为ROX；用于冠状病毒NL63检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：19 和 SEQ ID NO ：20 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：21，荧光标记为VIC；用于冠状病毒OC43检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：22和 SEQ ID NO ：23 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：24，荧光标记为Cy5；用于副流感病毒2检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：25和 SEQ ID NO ：26 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：27，荧光标记为VIC；用于副流感病毒3检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：28和 SEQ ID NO ：29，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：30，荧光标记为FAM；用于副流感病毒4检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：31 和 SEQ ID NO ：32 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：33，荧光标记为ROX；用于人博卡病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：34 和 SEQ ID NO ：35，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：36，荧光标记为ROX；用于人偏肺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：37和 SEQ ID NO ：38，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：39，荧光标记为VIC；用于副流感病毒1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：40和 SEQ ID NO ：41 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：42，荧光标记为FAM；用于肺炎支原体检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：43 和 SEQ ID NO ：44 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：45，荧光标记为Cy5；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：46 和 SEQ ID NO ：47 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：48，荧光标记为Cy5；用于肠病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：49 和 SEQ ID NO ：50，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：51，荧光标记为ROX；用于双埃可病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：52和 SEQ ID NO ：53，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：54，荧光标记为VIC；用于呼吸道合胞病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：55 和 SEQ ID NO ：56，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：57，荧光标记为FAM；所述的内对照为马动脉炎病毒，用于马动脉炎病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：58 和 SEQ ID NO ：59 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：60，荧光标记为Cy5。
实施例一：检测流感A病毒：使用流感A病毒阳性对照作为样本。相应引物/探针组合及阳性对照的获得见实施例二。在提取之前先向样本和阴性对照(双蒸水)加入2μl内对照(5μM)。使用MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit(Invitrogen)从样本中提取核酸。然后向TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Invitrogen, 13.5μl)中分别加入各引物/探针组合(1.5μl)以及从样本或阴性对照提取的核酸(10μl)。样本最终浓度为5μM，引物/探针浓度为0.4μM。随后将各反应管按照以下程序在合适的实时荧光PCR仪(如ABI 7500，Applied Biosystems)上进行PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。结果可检测到流感A病毒存在。其余各病原体的检测与实施例1相同。
实施例二：一次检测呼吸系统各种病原体的检测试剂盒
1）设计引物/探针组合：根据各个病原体的核酸序列，进行同种间的序列比对以寻找保守区域，并使用Beacon Designer 软件对这些保守区域进行多重PCR的引物和Taqman探针设计。将所得到的各引物/探针组合在NCBI网站上进行BLAST分析以确保与样本中可能存在的其他微生物不发生交叉反应。最后通过实验验证其性能。内对照的设计采用同样的方法。
所设计的各组引物/探针如下：
反应一：含流感A及H1N1亚型病毒，流感B病毒，鼻病毒
反应二：含冠状病毒229E，NL63，OC43和HKU1
反应三：含副流感病毒2，3，4和马动脉炎病毒（内对照）
反应四：含副流感病毒1，人偏肺病毒，肺炎支原体，人博卡病毒
反应五：含呼吸道合胞病毒，腺病毒，肠病毒，双埃可病毒
2）制备各个阳性对照：首先分离各种病原体的核酸，并制备PCR反应体系，然后将各种病原体核酸分别加入反应体系中进行PCR反应。反应产物进行回收并用电泳鉴定。接着使用合适的TA克隆试剂盒（如TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with TOP10 E. Coli，Invitrogen)和质粒纯化试剂盒(如PureLink 96 Plasmid Purification System，Invitrogen)获得连接有各目标病原体序列的质粒载体，用来作为PCR反应的阳性对照。
3）制备内对照：使用细胞培养法分离EAV毒株。
4）准备反应主混合物：使用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Invitrogen），含有预混的Taq DNA聚合酶，反转录酶，dNTP，RNase抑制剂等组分的主混合物。
5）进行PCR扩增反应：在提取之前先向样本和阴性对照(双蒸水)加入2μl内对照(5μM)。使用适当的RNA/DNA提取技术(如MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit，Invitrogen)从样本中提取核酸。然后向反应主混合物(13.5μl)中分别加入各引物/探针组合(1.5μl)以及从样本或阴性对照提取的核酸(10μl)。以相同的比例对阳性对照进行混合操作。最终浓度阳性对照为5μM，引物/探针浓度为0.4μM。随后将各反应管按照以下程序在合适的实时荧光PCR仪(如ABI 7500，Applied Biosystems)上进行PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。
结果判定：所有阴性对照的信号值都应低于阈值。所有阳性对照信号都应有指数上升且Ct值必须小于33。内对照信号应有指数上升且Ct值必须小于33。否则说明扩增不成功。如某种病原体相应的荧光信号产生指数上升，则为阳性，否则为阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 华美生物工程有限公司
<120> 呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒
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Claims (1)
1.呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，其特征在于：该试剂盒内还设有用于检测流感A病毒、H1N1亚型病毒、流感B病毒、鼻病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原体、腺病毒、肠病毒、双埃可病毒和呼吸道合胞病毒中一种或多种病原体的多种引物及探针的混合物，其中，用于流感A病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：1 和 SEQ ID NO ：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：3，荧光标记为FAM；用于H1N1亚型病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：6，荧光标记为Cy5；用于流感B病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：7和 SEQ ID NO ：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为ROX；用于鼻病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO ：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：12，荧光标记为VIC；用于冠状病毒229E检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：13 和 SEQ ID NO ：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：15，荧光标记为FAM；用于冠状病毒HKU1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：16 和 SEQ ID NO ：17 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：18，荧光标记为ROX；用于冠状病毒NL63检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：19 和 SEQ ID NO ：20 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：21，荧光标记为VIC；用于冠状病毒OC43检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：22和 SEQ ID NO ：23 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：24，荧光标记为Cy5；用于副流感病毒2检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：25和 SEQ ID NO ：26 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：27，荧光标记为VIC；用于副流感病毒3检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：28和 SEQ ID NO ：29，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：30，荧光标记为FAM；用于副流感病毒4检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：31 和 SEQ ID NO ：32 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：33，荧光标记为ROX；用于人博卡病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：34 和 SEQ ID NO ：35，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：36，荧光标记为ROX；用于人偏肺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：37和 SEQ ID NO ：38，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：39，荧光标记为VIC；用于副流感病毒1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：40和 SEQ ID NO ：41 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：42，荧光标记为FAM；用于肺炎支原体检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：43 和 SEQ ID NO ：44 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：45，荧光标记为Cy5；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：46 和 SEQ ID NO ：47 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：48，荧光标记为Cy5；用于肠病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：49 和 SEQ ID NO ：50，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：51，荧光标记为ROX；用于双埃可病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：52和 SEQ ID NO ：53，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：54，荧光标记为VIC；用于呼吸道合胞病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：55 和 SEQ ID NO ：56，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：57，荧光标记为FAM；所述的内对照为马动脉炎病毒，用于马动脉炎病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：58 和 SEQ ID NO ：59 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：60，荧光标记为Cy5。
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