CN104558033A - 一种l-草铵膦-n-羧酸酐及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L-草铵膦-N-羧酸酐及其制备和应用，所述方法以嗜烟碱节杆菌WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为酶源，以DL-草铵膦-N-羧酸酐为底物，以pH7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得L-草铵膦-N-羧酸酐，再经水解开环脱羧反应制得L-草铵膦，本发明提供的菌体的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产；L-草铵膦-N-羧酸酐经简单的加热水解脱羧便可得光学纯的L-草铵膦。

Description

一种L-草铵膦-N-羧酸酐及其制备和应用

(一)技术领域

本发明涉及一种L-草铵膦-N-羧酸酐及其制备和应用，特别涉及在嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO：M 2014054)酯水解酶作用下进行立体选择性水解制备新型光学纯L-草铵膦-N-羧酸酐，再应用L-草铵膦-N-羧酸酐经水解开环反应制得L-草铵膦的应用。

(二)背景技术

草铵膦，又名草丁膦，是德国Hoechst公司研制的除草剂，通用名为glufosinate。草铵膦低毒、高效、广谱的特点，广泛应用于果园、葡萄园、橡胶及棕榈园、观赏性灌木、非耕地防除一年生和多年生的双子叶禾本科杂草，并用于马铃薯田、森林和高山牧场等经济型作物。近年来，由于转基因抗除草剂作物取的重大进展，特别是抗草甘膦和抗草铵膦类经济作物，其种植面积最大，市场需求量也在增大。与草甘膦相比，草铵膦对多年生恶性杂草有较好的防治效果同时对耐受草甘膦的部分恶性杂草也有较好效果，因此草铵膦在除草剂市场中有较强的优势。

草铵膦具有两种不同的对映体，但只有L-草铵膦(S-草铵膦)具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。因此，制备光学纯的L-草铵膦对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

目前，文献报道的化学法合成L-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，收率低，且手性拆分试剂昂贵。相比之下，本发明所利用生物法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化的优点。

(三)发明内容

本发明为了解决上述方法的不足，提供一种可以制备L-草铵膦的中间体L-草铵膦-N-羧酸酐，以及L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，利用嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO:M 2014054)作为生物催化剂，立体选择性催化水解拆分外消旋DL-草铵膦-N-羧酸酐，制备L-草铵膦-N-羧酸酐。

本发明的另一目的是应用L-草铵膦-N-羧酸酐再经水解开环脱羧反应制得L-草铵膦。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种如式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐，

本发明还提供一种式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，具体所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为酶源，以DL-草铵膦-N-羧酸酐为底物，以pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行反应(优选反应1-30h)，反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐；所述嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为3～150/L，优选10-100g/L，更优选10-30g/L，所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～50g/L，优选5-30g/L，，更优选10-30g/L，所述底物的初始浓度为1～50g/L缓冲液，优选5-35g/L。

本发明所述酶源的制备方法为：(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；121℃灭菌20min。

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖8-12g/L，酵母膏12g/L，NaCl10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥，得到干菌体。

本发明所述的反应是在在20～50℃、200rpm条件下反应1～30h，更优选反应温度为25～35℃。

本发明所述产酶培养基组成优选为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。

本发明所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液过滤，滤液用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0后用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层用水洗涤后减压蒸馏至干，获得L-草铵膦-N-羧酸酐。

本发明还涉及一种所述的L-草铵膦-N-羧酸酐在制备L-草铵膦中的应用，所述的应用为：将所述的L-草铵膦-N-羧酸酐与质量浓度36-38％浓盐酸混合，加热回流1.5-3.0小时(优选2h)，蒸干溶剂，向浓缩物中加入体积浓度95％的乙醇水溶液a，加热回流，在回流状态下，再每次加入2mL体积浓度95％的乙醇水溶液b，直到固体物质完全溶解，将反应液用冰水混合物冷却到30℃，加入环氧乙烷，5-10℃静置12小时，待结晶完全后，过滤，滤饼室温真空干燥，得L-草铵膦；所述L-草铵膦-N-羧酸酐与环氧乙烷投料物质的量之比为1:(2-4)(优选1:3)，所述浓盐酸体积用量以L-草铵膦-N-羧酸酐物质的量计为6L/mol，所述95％的乙醇水溶液a的体积用量以L-草铵膦-N-羧酸酐物质的量计为1-3mL/mmol。所述乙醇水溶液b和乙醇水溶液a均为乙醇水溶液，为了便于区分加入量不同而命名，字母本身没有含义。

与现有L-草铵膦的制备技术相比，本发明有益效果主要体现在：一方面，本发明提供的菌体的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产；另一方面，L-草铵膦-N-羧酸酐经简单的加热水解脱羧便可得光学纯的L-草铵膦。

(四)附图说明

图1为DL-草铵膦-N-羧酸酐(Ⅲ)对照品高效液相色谱图，峰a为D-草铵膦-N-羧酸酐，保留时间为16.49292s，峰面积3581801，峰b为L-草铵膦-N-羧酸酐，保留时间为17.52215s，峰面积3581805；

图2为L-草铵膦-N-羧酸酐(Ⅳ)标准品的高效液相色谱图，峰b为L-草铵膦-N-羧酸酐，保留时间为17.52213s，峰面积7171802；

图3为微生物催化产物L-草铵膦-N-羧酸酐(Ⅳ)和D-N-甲酸草铵膦(Ⅴ)高效液相色谱图，峰b为L-草铵膦-N-羧酸酐，保留时间为17.52214s，峰面积3590105，峰c为D-N-甲酸草铵膦，保留时间为30.09531s，峰面积3576019。

图4为本发明L-草铵膦制备的流程图。

图5为菌株WYG001的菌落形态图。

图6为菌株WYG001在100倍下的光学显微照片。

图7为菌株WYG001的16SrDNA电泳图，A为菌株WYG001的电泳图，左侧泳道为菌株WYG001，右侧泳道为标准分子量，B为A的放大图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、微生物的筛选

本发明涉及到的微生物通过以下程序筛选分离得到：称取湿土样1～2g(从全国不同环境条件下土壤中取得)混悬于10mL 0.5％无菌生理盐水中，振荡混匀；接1～2mL混悬液于30mL液体富集培养基中，在30℃、200r/min下培养2～3d后，无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集3次。富集培养基中，以N-BOC-DL-高丝氨酸内酯为唯一碳源，配方如下：NaNO₃4.0g/L，KH₂PO₄2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCl 1.0g/L，ZnSO₄0.05g/L，溶剂为水，pH 7.0。第一轮富集的N-BOC-DL-高丝氨酸内酯的浓度1g/L，第二轮的浓度为3g/L，第三轮的浓度为5g/L，pH 7.0。将第三轮富集后菌液经梯度稀释，涂布分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。分离平板培养基组成为：富集培养基加入琼脂终浓度20g/L，底物N-BOC-DL-高丝氨酸内酯终浓度为5g/L，pH 7.0。

挑取分离得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养1-2天，获得斜面菌体。从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至50mL的种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液。在无菌条件下，取3mL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液。每升斜面培养基组成牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；产酶培养基组成为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。取15mL发酵液于50mL离心管中12000rpm离心10min，弃上清液，加入5mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，再加入终浓度8g/L底物DL-草铵膦-N-羧酸酐，在30℃、200r/min下，转化反应24h。取出离心管，取1mL的反应液，加入2mL乙酸乙酯，充分振荡，6000rpm离心5min。取上层有机相1mL，用少量无水硫酸钠干燥除水，以高效液相色谱(HPLC)检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值(e.e.)、反应转化率C，筛选对映体过量值(e.e.)大于90％，反应转化率C为(45％-56％)的微生物菌株，最终筛选得到一株高效菌株，记为菌株WYG001。

2、微生物菌株的鉴定

生理生化特征：菌株WYG001为革兰氏阴性菌，专性好氧，生长对pH变化较敏感，最适pH为7.0，菌落形态见图5和图6所示。利用无机氮源的能力较差，生长和产酶受到Cu²⁺、Fe²⁺、Al³⁺、Zn²⁺等的抑制，受到Mg²⁺、K⁺、Na⁺等的促进。

经测序鉴定，菌株WYG001的16SrDNA序列如下(SEQ ID NO.1)电泳图见图7所示：

TGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGATCCCAGCTTGCTGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGTAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGACCGGGGCTCAACTCCGGTTCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGAACCGGAAAGACCTGGAAACAGGTGCCCCGCTTGCGGTCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCGGCGATGGGACTAAGTC

根据生理生化特性和分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为嗜烟碱节杆菌菌(Arthrobacter nicotinovorans)，命名为嗜烟碱节杆菌(Arthrobacternicotinovorans)WYG001，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC NO:M 2014054，保藏日期2014年2月28日。

实施例2：

斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基组成同实施例1。

种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至100mL种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成同实施例1。

发酵培养：在无菌条件下，取10mL种子液接种于150mL的产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体。取湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥得到干菌体，干菌体产量为8.85g/L发酵液。

实施例3：DL-草铵膦-N-羧酸酐的制备

在氮气气氛下，将9.06g(50mmol)DL-草铵膦(Ⅰ)和250mL四氢呋喃加入500mL的两口瓶中，升温到50℃，在此温度下加入5.94g(20mmol)三光气(Ⅱ)。如果40分钟后反应液还没有变澄清，则每40分钟补加0.97g(1.0mmol)三光气，待反应液变澄清后，继续保温反应3.0小时反应完毕。蒸去4/5体积的溶剂，冷却至室温，加入80mL正己烷，过滤，得黄色固体，再经乙酸乙酯/正己烷(体积比2：1)重结晶，得白色固体DL-草铵膦-N-羧酸酐5.2g，收率50.0％。结构表征如下：

白色固体；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ6.83(s,1H,OH),6.60(s,1H,NH),4.56(m,NHCHCO),2.29(m,2H,P-CH ₂CH₂),2.09(m,1H,CH ₂CHNH),1.98(m,1H,CH ₂CHNH),1.48(d,3H,J＝14.0Hz,CH ₃)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ169.65,152.81,57.44,52.03(J＝16.2Hz),25.27(J＝76.2Hz),14.20(CH₃,J＝92.4Hz)；MS(ESI)m/z 208(M+H)⁺；HRMS(ESI):m/z calcd for C₆H₁₁NO₅P⁺[M+H]⁺:208.0369,found:208.0363.

实施例4：

取实施例2方法制得的湿菌体1.0g，加入0.30g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和0.1M、pH7.0磷酸缓冲溶液10mL，30℃、200rpm条件下反应7h。反应结束后，取反应液过滤除去酶，取滤液用高效液相色谱分析测定转化后的DL-草铵膦-N-羧酸酐的含量，计算酶活，发酵液中湿菌体比酶活力为88.43U/L发酵液。酶活定义：U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下，每分钟催化水解1μmol DL-草铵膦-N-羧酸酐的酯水解酶的量。

酶活计算公式：

A＝[(a₁-a)/a₁]×[C×V/(M×t)]×10⁶  公式(1)

A——样品中酶的活力(U)

a——转化反应结束后转化液中DL-草铵膦-N-羧酸酐的峰面积；

a₁——根据上述标准曲线方程计算出的与初始底物浓度相同的DL-草铵膦-N-羧酸酐标样的峰面积；

C——转化液中，底物的质量浓度，g/L；

V——转化液体积，L；

M——底物DL-草铵膦-N-羧酸酐的摩尔质量，g/mol；

t——转化时间，min。

高效液相色谱分析条件：采用Waters 1525型高效液相色谱仪，检测器:UV/Visible Detector；手性柱OD-H(4.6×250mm)；流动相：正已烷：异丙醇＝92:8(v/v)，0.1％三氟乙酸。L-草铵膦-N-羧酸酐和D-草铵膦-N-羧酸酐分别在17.522min和16.493min出峰。

DL-草铵膦-N-羧酸酐标准曲线方程的建立：

配制浓度分别为0.5％、1.0％、2.0％、4.0％、6.0％、10.0％、15.0％、20.0％、25.0％、30.0％、35.0％、40.0％的外消旋DL-草铵膦-N-羧酸酐水溶液(w/v)，利用高效液相色谱进行检测，得出外消旋DL-草铵膦-N-羧酸酐的浓度与峰面积之间的线性关系，以外消旋DL-草铵膦-N-羧酸酐的质量浓度为x变量，高效液相色谱检测所得峰面积为y变量得到标准曲线方程：y＝9702010x–597。

实施例5：

取实施例1方法制得的干菌体0.2g，加入0.05g的DL-草铵膦-N-羧酸酐浓度，0.1M、pH7.0磷酸缓冲溶液10mL，30℃、200rpm条件下反应7h。经酶活测定(测定方法同实施例4)，该干菌体比酶活力为7.47U/g。

实施例6：

取实施例2方法制得的湿菌体3.0g，加入0.5g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和0.1M、pH7.0磷酸缓冲溶液100mL，30℃、200rpm条件下反应4h，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐0.24g。用高效液相色谱分析测定产物含量(检测条件同实施例4)，经检测得L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为99.9％，转化率C为50.4％，产率为96.0％。L-草铵膦-N-羧酸酐的结构表征如下：

白色固体；[α]²⁰ _D-21.4(c 1.13,actone)；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ6.80(s,1H,OH),6.59(s,1H,NH),4.55(m,NHCHCO),2.27(m,2H,P-CH ₂CH₂),2.10(m,1H,CH ₂CHNH),1.98(m,1H,CH ₂CHNH),1.49(d,3H,J＝14.0Hz,CH ₃)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ169.64,152.81,57.45,52.03(J＝16.2Hz),25.26(J＝76.2Hz),14.21(CH₃,J＝92.4Hz)；MS(ESI)m/z 208(M+H)⁺；HRMS(ESI):m/z calcd for C₆H₁₁NO₅P⁺[M+H]⁺:208.0369,found:208.0372.

对映体过量值(enantiomeric excesses)是衡量酶选择性的重要指标，L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值简称e.e._s，其计算公式为：

${e.e.}_S(\%)=\frac{S_S-S_R}{S_S+S_R}\×100\%$

其中S表示底物，S_R和S_S分别为(D)-和(L)-构型的底物的峰面积。

反应转化率的计算公式为：

$C(\%)=1-\frac{S_R+S_S}{S_{R0}+S_{S0}}\×100\%$

L-草铵膦-N-羧酸酐的得率(Yield)的计算公式为

$\mathrm{Yield}(\%)=\frac{S_S}{S_{S0}}\×100\%$

其中，S_R0和S_S0分别为(D)-和(L)-构型的底物的初始峰面积。

实施例7：

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体3.0g，加入3.5g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和100mL磷酸缓冲溶液(pH7.0，0.1M)，30℃、200rpm条件下搅拌反应18.0h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐1.69g。经检测(检测方法同实施例4)L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为99.9％，转化率C为50.2％，产率为96.6％。

实施例8

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体5.0g，加入5.0g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液200mL中，30℃、200rpm条件下，搅拌反应12.0h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐2.42g。采用实施例4方法检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为99.9％，转化率C为51.1％，产率为95.2％。

实施例9

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体0.3g，加入0.5g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和100mL的0.1M、pH7.0磷酸缓冲液，32℃、200rpm条件下，搅拌反应12h后，反应结束后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐0.234g。采用实施例4方法检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为98.5％，转化率C为51.3％，产率为93.6％。

实施例10：

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体0.2g，加入0.5g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和100mL的0.1M、pH7.0磷酸缓冲液，30℃、200rpm条件下，搅拌反应16h后，反应结束后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐0.232g。采用实施例4方法检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为98.1％，转化率C为51.5％，产率为92.8％。

实施例11

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体0.1g，加入0.5g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和100mL的0.1M、pH7.0磷酸缓冲液，33℃、200rpm条件下，搅拌反应15.0h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐0.46g。采用实施例4方法检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为97.9％，转化率C为51.7％，产率为92.0％。

实施例12：

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体2g，加入0.5g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和100mL的0.1M、pH7.0磷酸缓冲液中，25℃、200rpm条件下，搅拌反应8.0h后，反应转化后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐0.239g。采用实施例4方法检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为99.8％，转化率C为51.0％，产率为95.4％。

实施例13：

取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体5.0g，加入5.0g的DL-草铵膦-N-羧酸酐和100mL的0.1M、pH7.0磷酸缓冲液中，40℃、200rpm条件下，搅拌反应18.0h后，反应转化后，将反应液离心，取上清液，用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取、用水洗涤，减压蒸馏至干除去溶剂，得到L-草铵膦-N-羧酸酐2.27g。采用实施例4方法检测L-草铵膦-N-羧酸酐的对映体过量值e.e.为99.9％，转化率C为52.3.0％，产率为90.8％。

实施例14：L-草铵膦(Ⅵ)的制备

取实施例8制备的L-草铵膦-N-羧酸酐(Ⅳ)2.07g(10mmol)，投入三口烧瓶中，加入60mL浓盐酸(质量浓度36-38％)，加热回流2.0小时，蒸干溶剂。加入20mL体积浓度95％的乙醇水溶液，在回流状态下，每次加入2mL体积浓度95％的乙醇水溶液，直到固体物质恰好完全溶解。将反应液用冰水混合物冷却到30℃，加入1.74g(30mmol)环氧乙烷，溶液开始变浑浊，5-10℃静置12小时，待结晶完全，过滤，滤饼室温真空干燥，得白色固体L-草铵膦(Ⅵ)1.74g，产率96.0％，其表征如下：

白色固体；熔点：213-214℃；[α]²⁰ _D+16.8(c 1.00,H₂O)；

¹H-NMR(600MHz,D₂O溶解并标定其化学位移值为6.790ppm):δ4.14(t,1H,J＝6.1Hz,2-CH),2.18(m,2H,4-CH ₂),1.93(m,2H,3-CH ₂),1.50(d,3H,J＝14.4Hz,CH ₃)；¹³C-NMR(150MHz,D₂O):δ171.24(COOH),52.92(3-CH₂,J＝16.4Hz),25.22(4-CH₂,J＝76.4Hz),22.70(2-CH),13.60(CH₃,J＝92.3Hz)；³¹P-NMR(243MHz,D₂O):δ48.6；MS(ESI)m/z 182(M+H)⁺；IRν_max(cm^-1):1741(COOH),1511(NH⁺ ₃),1300(P-CH₃),1250(P＝O).HRMS(ESI):m/z calcd for C₅H₁₃NO₄P⁺[M+H]⁺:182.0577,found:182.0580.

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种如式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐，

2.一种制备权利要求1所述的L-草铵膦-N-羧酸酐的方法，其特征在于所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为酶源，以DL-草铵膦-N-羧酸酐为底物，以pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(Ⅳ)所示L-草铵膦-N-羧酸酐；所述嗜烟碱节杆菌WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

3.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为3～150g/L。

4.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～50g/L。

5.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述底物的初始浓度为1～50g/L缓冲液。

6.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述的反应在20～50℃、200rpm条件下反应1～30h。

7.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述酶源的制备方法为：

(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖8-12g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥，得到干菌体。

8.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液过滤，滤液用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0后用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层用水洗涤后减压蒸馏至干，获得L-草铵膦-N-羧酸酐。

9.如权利要求7所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于步骤(3)中产酶培养基组成为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。

10.一种权利要求1所述的L-草铵膦-N-羧酸酐在制备L-草铵膦中的应用，其特征在于所述的应用为：将所述的L-草铵膦-N-羧酸酐与质量浓度36-38％浓盐酸混合，加热回流，蒸干溶剂，向浓缩物中加入体积浓度95％的乙醇水溶液a，加热回流，在回流状态下，再每次加入2mL体积浓度95％的乙醇水溶液b，直到固体物质完全溶解，将反应液用冰水混合物冷却到30℃，加入环氧乙烷，5-10℃静置12小时，待结晶完全后，过滤，滤饼室温真空干燥，得L-草铵膦；所述L-草铵膦-N-羧酸酐与环氧乙烷投料物质的量之比为1:2-4，所述浓盐酸体积用量以L-草铵膦-N-羧酸酐物质的量计为6L/mol，所述95％的乙醇水溶液a的体积用量以L-草铵膦-N-羧酸酐物质的量计为1-3mL/mmol。