CN104507537A - 用于调节car t细胞的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供CAR T细胞治疗期间抑制健康组织消耗的方法，所述方法包括给予接受CAR T细胞治疗的对象包含药物和分子的药物-分子结合物，其中所述分子结合在T细胞表面上表达的CAR。本发明涉及结合物结合CAR导致结合物内化进细胞中以及药物介导的细胞死亡。

Description

用于调节CAR T细胞的组合物和方法

相关申请的交叉引用

该申请要求2012年7月13日提交的美国临时申请61/671,518的优先权，其内容在此以其全部通过引用被并入。

发明背景

正常的T细胞可通过用针对特定的细胞表面靶标的嵌合抗原受体(CAR)转导而重定向以攻击肿瘤。在一个实例中，CAR在患有慢性白血病的患者中显示显著的抗肿瘤效应(Porter et al.,2011,New Engl J Med,365(8)：725-733；Kalos et al,2011,Sci Tr Med,3(95)：95ra73)。

在那个模型中，T细胞被基因改造以表达针对CD19——在B细胞恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病(CLL)的表面上表达的抗原——的抗体片段(称作“scFv”)。然而，相同的分子也在正常的B淋巴细胞上表达。B淋巴细胞的正常功能是产生抗体和辅助T细胞控制感染。虽然迄今为止，在用遗传修饰的抗CD19T细胞(“CART-19细胞”)治疗的患者中已没有与B细胞消耗特别相关的感染并发症，但是延长的完全的B细胞消耗的后果迄今未知。此外，多种具有新的特异性的其它CAR T细胞产物当前发展不足。这些新的CAR T细胞产物可能与独特毒性——与研究中的特定癌症类型的共有靶向抗原表达的旁观者细胞的选择性消耗有关——相关。

因此，本领域存在发展这样的组合物和方法的需要，其在CAR T细胞治疗期间可特异地和根据需要地靶向在其表面上表达CAR的细胞，以防止健康的旁观者细胞不必要的消耗。本发明满足该未得到满足的需要。

发明概述

本发明提供药物-分子结合物，其包括药物和结合细胞表面上表达的CAR的分子。

在一个实施方式中，结合物结合CAR导致结合物内化进细胞。

在一个实施方式中，结合物结合CAR导致药物介导的细胞死亡。

在一个实施方式中，细胞是T细胞，并且其中结合物结合CAR导致药物介导的T细胞活化的抑制。

在一个实施方式中，分子选自抗体、蛋白质、肽、核苷酸、小分子和其片段。

本发明提供在CAR T细胞治疗期间抑制健康组织消耗的方法，包括施用包括药物和分子的药物-分子结合物给接受CAR T细胞治疗的对象，其中分子结合T细胞表面上表达的CAR。.

在一个实施方式中，结合物结合CAR导致结合物内化进细胞。

在一个实施方式中，结合物结合CAR导致药物介导的细胞死亡。

在一个实施方式中，结合物结合CAR导致药物介导的T细胞活化的抑制。

在一个实施方式中，分子选自抗体、蛋白质、肽、核苷酸、小分子和其片段。

附图简述

当结合附图阅读时，将更好地理解下列的本发明优选的实施方式的详细描述。为了阐述本发明的目的，目前优选的实施方式示于附图中。但是，应理解，本发明不限于示于附图中的实施方式的精确安排和手段。

图1是描述显示与表达靶标的CD19(K562-CD19和Nalm6)温育之后抗CD19嵌合抗原受体表面表达丧失的实验结果的一组图。

图2是描述显示在暴露于抗原靶标之后CAR的表面和细胞内染色的实验结果的一组图。上排：抗CD19嵌合抗原转导的T细胞暴露于无关靶标(左)或表达靶标的CD19(右)显示受体的表面表达在遇到同源靶标之后丧失。下排：细胞内染色显示受体可在细胞内部发现。

详细描述

本发明提供组合物和方法来调节经修饰表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的活性。已被基因修饰表达CAR的T细胞已用于癌症的治疗，其中CAR重定向修饰的T细胞来识别肿瘤抗原。在一些实例中，有效地控制和调节CAR T细胞以便它们杀死肿瘤细胞而不影响正常的旁观者细胞可以是有利的。因此，在一个实施方式中，本发明还提供杀死癌细胞同时最小化正常的非癌细胞消耗的方法。

在一个实施方式中，本发明提供细胞上表达的多种类型的CAR，其中多种类型的CAR与它们的靶抗原的结合是CAR T细胞活化需要的。在一个实施方式中，本发明的方法包括基因修饰T细胞以表达多种类型的CAR，其中T细胞活化依赖多种类型的CAR与它们的靶抗原的结合。例如，在一个实施方式中，T细胞可表达靶向第一期望抗原的第一CAR和靶向第二期望抗原的第二CAR。在一个实施方式中，修饰的T细胞的活化只发生在第一CAR结合第一期望抗原和第二CAR结合第二期望抗原时。在一个实施方式中，对多种不同CAR结合的依赖提高CAR T细胞治疗的特异性。

在一个实施方式中，本发明提供抑制性CAR，其中抑制性CAR与正常细胞的结合导致CAR T细胞活性的抑制。在一个实施方式中，抑制性CAR在同一T细胞中共表达作为治疗性肿瘤定向CAR。在一个实施方式中，抑制性CAR包括抗原结合结构域，其识别与正常的非癌细胞和细胞质结构域相关的抗原。在一个实施方式中，方法包括基因修饰T细胞以表达至少一种抑制性CAR和至少一种治疗性肿瘤定向CAR。在一个实施方式中，抑制性CAR与同非癌细胞相关的抗原的结合导致CAR T细胞死亡。在一个实施方式中，治疗性肿瘤定向CAR与癌细胞上的肿瘤抗原的结合导致T细胞活化和T细胞介导的癌细胞死亡。

在一个实施方式中，本发明提供药物-分子结合物，其结合细胞表面上表达的CAR。在一个实施方式中，结合物与CAR的结合引起结合物内化，这允许药物杀死CAR T细胞。本发明还提供这样的方法：通过施用药物-分子结合物而调节CART细胞活性，其中药物-分子结合物导致CAR内化和CAR T细胞死亡。

定义

除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和物质，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。

也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。

本文使用冠词“一(a)”和“一(an)”，指的是该冠词语法对象的一个或多个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一元件”表示一个元件或多个元件。

如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括给定值±20％或±10％的变化，在一些实例中±5％，在一些实例中±1％，以及在一些实例中±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。

“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应器功能相关。术语“活化的T细胞”指的是经历细胞分裂的T细胞等。

术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然存在构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。

“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然存在构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。

如本文所用的，术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。

如本文所用的，术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫反应的分子。该免疫反应可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可充当抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必唯一地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于，一个或多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫反应。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是，抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。

如本文所用的，术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、寿命预期的增加或与癌性状况相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。

根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统识别为如同是外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

如本文所用的，术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫反应产生的病症。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。

如本文所用的，术语“自体”指源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。

“同种异基因(allogeneic)”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。

“异种(xenogeneic)”指的是源自不同物种的动物的移植物。

如本文所用的，术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞反应的信号，所述T细胞反应包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，和与CD83特异性结合的配体，所述共刺激分子诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。

“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体。

如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“病症”是这样的健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该病症相比不太有利。保持不治疗，病症不必定引起动物健康状态的进一步降低。

如本文所用的，“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。

“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板以合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

如本文所用的，“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。

如本文所用的，术语“外源的”指的是引入有机体、细胞、组织或系统的任何物质，其在有机体、细胞、组织或系统外产生。

如本文所用的，术语“表达”被定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。

如本文所用的，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集反应、补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。

如本文所用的，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的说明材料可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，说明材料可与容器分开地运送，目的是说明材料和化合物由接受者配合使用。

“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。

在本发明的内容中，对于通常存在的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷和“U”指的是尿苷。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。

如本文所用的，“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，所以它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。

如本文所用的，术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的反应水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的反应水平相比，介导对象中反应水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或反应，由此介导对象优选人的有益的治疗性反应。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲表明相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原异常的水平表达。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或输注技术。

术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。

如本文所用的，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的，核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCR等等克隆核酸序列，和合成手段。

如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，并对可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用的，术语“启动子”被定义为起始多核苷酸序列的特异性转录所需要的，由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。

如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子为这样的核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。

“诱导型”启动子为这样的核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，才在细胞中产生基因产物。

“组织-特异性”启动子为这样的核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。

如本文所用的，关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可参考抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。

术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级反应。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。

“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。

如本文所用的，“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级反应，其包括但不限于，活化、免疫反应的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。

术语“患者”、“对象”、“个体”在本文中可交换使用，并意欲包括活的有机体，其中可引出免疫应答(例如，哺乳动物)。对象的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

如本文所用的，“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与以其天然发生状态与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与以其天然状态与其天然相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。

如本文所用的，术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾状况态的抑制、缓和或根除获得。

术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学反应的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以防止治疗的病症或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的病症或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。

“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或病症的至少一种迹象或症状的频率或严重性。

如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移到或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。

如本文所用的，短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。

“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于递送分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。

范围：在该公开中，本发明的多个方面可以以范围形式中示出。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为已具体公开了所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从1至6的描述应被考虑为已具体公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。

描述

本发明提供限制CAR T细胞治疗导致的非癌细胞消耗的组合物和方法。如本文所公开的，治疗性CAR T细胞在于其靶标结合时显示抗肿瘤性质，而当抑制性CAR结合其靶标时，抑制性CAR导致CAR T细胞活性的抑制。

不管CAR的类型，将CAR被改造成包括细胞外结构域，该细胞外结构域具有融合到细胞质结构域的抗原结合结构域。在一个实施方式中，当在T细胞中表达时，CAR能基于抗原特异性重定向抗原识别。示例的抗原是CD19，因为该抗原在B细胞淋巴瘤上表达。然而，CD19还在正常的B细胞上表达，因此包括抗CD19结构域的CAR可导致正常B细胞的消耗。正常B细胞的消耗可使治疗的对象易于感染，因为B细胞通常在感染控制中辅助T细胞。本发明提供限制CAR T细胞治疗期间正常组织消耗的组合物和方法。在一个实施方式中，本发明提供利用CAR T细胞治疗来治疗癌症和其它病症同时限制健康的旁观者细胞消耗的方法。

在一个实施方式中，本发明包括控制或调节CAR T细胞活性。在一个实施方式中，本发明包括涉及基因修饰T细胞以表达多种类型CAR的组合物和方法，其中CAR T细胞活化依赖多种类型的CAR与它们的靶受体的结合。多种类型CAR的结合的依赖性提高CAR T细胞溶解活性的特异性，从而减少消耗正常的健康组织的可能性。

在另一个实施方式中，本发明包括涉及基因修饰具有抑制性CAR的T细胞的组合物和方法。在一个实施方式中，抑制性CAR包括细胞外抗原结合结构域，其识别与正常的非癌细胞和抑制性细胞质结构域相关的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供双重CAR，其中T细胞被基因修饰以表达抑制性CAR和治疗性肿瘤定向CAR。在一个实施方式中，抑制性CAR与正常的非癌细胞的结合导致CAR T细胞的抑制。例如，在一个实施方式中，抑制性CAR的结合导致CAR T细胞死亡。在另一个实施方式中，抑制性CAR的结合导致治疗性肿瘤定向CAR信号转导的抑制。在再一个实施方式中，抑制性CAR的结合导致阻止修饰的T细胞显示其抗肿瘤活性的信号转导信号的诱导。因此，本发明的双重CAR提供调节CAR T细胞活性的机制。

在一个实施方式中，本发明包括涉及结合治疗性肿瘤定向CAR的药物-分子结合物的组合物和方法。在一个实施方式中，结合物与治疗性肿瘤定向CAR的结合导致CAR和药物-分子结合物的内化。在一个实施方式中，结合物与CAR的结合导致CAR T细胞死亡。在另一个实施方式中，结合物与CAR的结合导致治疗性肿瘤定向CAR的信号转导的抑制。在再一个实施方式中，结合物与CAR的结合导致阻止修饰的T细胞显示其抗肿瘤活性的信号转导信号的诱导。因此，本发明提供调节CAR T细胞活性的机制。

在一个实施方式中，本发明提供利用CAR T细胞治疗来治疗癌症和其它病症同时最小化正常健康组织消耗的方法。癌症可以是恶性血液病、实体瘤、原发或转移性肿瘤。利用本发明的组合物和方法可治疗的其它疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫性疾病。

1.多重CAR策略

在一个实施方式中，本发明提供这样的组合物和方法，其通过基因修饰T细胞以表达多种类型的CAR而增加CAR T细胞治疗特异性和限制正常的健康组织消耗，其中T细胞的活化依赖多种类型的CAR的结合。多种类型的CAR结合的依赖性增加治疗的特异性，因此限制正常的健康组织的消耗量。如本文其它地方所描述的，被修饰以表达多种类型CAR的T细胞可通过施用慢病毒载体、体外转录的RNA或其组合给细胞而产生。

嵌合抗原受体

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外和细胞内结构域。组合物和制备CAR的方法已在PCT/US11/64191中描述，其以其全部通过引用被并入本文。

细胞外结构域包含另外被称为抗原结合结构域的靶特异性结合元件。在一些实施方式中，细胞外结构域还包括铰链结构域。在一个实施方式中，细胞内结构域或另外地细胞质结构域包含共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效反应所需的除抗原受体或它们的配体外的细胞表面分子。

CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可整合间隔物结构域。如在此使用的，术语“间隔物结构域”通常指任何寡肽或多肽，其在多肽链中起到连接跨膜结构域与细胞外结构域或细胞质结构域的作用。间隔物结构域可包含高达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，且最优选25至50个氨基酸。

本发明包括表达可直接转导到细胞中的CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体。本发明还包括可直接转染到细胞中的RNA构建体。一种产生用于转染中的mRNA的方法包括用专门设计的引物的模板的体外转录(IVT)，随后通过聚腺苷酸的加入，以产生这样的构建体，其含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的基因和聚腺苷酸尾部，长度通常为50-2000个碱基。如此生产的RNA可有效地转染不同类型的细胞。在一个实施方式中，模板包括CAR的序列。

优选，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。细胞外结构域和跨膜结构域可衍生自这样的结构域的任何需要的来源。在一些实例中，本发明的CAR的铰链结构域包括CD8α铰链结构域。

在一个实施方式中，本发明的CAR包含另外被称为抗原结合结构域的靶特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，抗原结合结构域可选择以识别配体，该配体充当在与特定疾状况态相关联的靶细胞上的细胞表面标记物。因此，可充当本发明CAR中抗原部分结构域的配体的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌症细胞相关的那些。

在一个实施方式中，本发明的CAR可通过改造特异地结合肿瘤细胞上抗原的期望抗原结构域而被改造以靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本发明的背景中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”指与特定过度增生性病症如癌症共有的抗原。本文讨论的抗原只通过实例方式而被包括。名单不意欲是排他的，进一步实例对于本领域技术人员将是显而易见的。

肿瘤抗原为蛋白质，其通过引起免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应的肿瘤细胞产生。本发明抗原结合结构域的选择将取决于特定类型的待治疗的癌症。本领域熟知肿瘤抗原，且其包括，例如，神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、植物血凝素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53和prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-1、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

在一个实施方式中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关联的一个或多个抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多蛋白质，其可作为免疫攻击的靶抗原。这些分子包括但不限于组织特异性抗原例如MART-1、在黑色素瘤中的酪氨酸酶和GP100以及在前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化有关的分子的组，如致癌基因HER-2/neu/ErbB-2。另一组靶抗原为癌胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白的抗原，其为个体肿瘤独有的。B细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37为在B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选。这些抗原的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20，独特型)已被用作具有有限成功的单克隆抗体的被动免疫疗法的靶标。

在本发明中所称作的肿瘤抗原的类型也可为肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为肿瘤细胞独有的且不会在体内其它细胞上存在。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，且相反在不能诱导对抗原免疫耐受状态的条件下，也在正常细胞上表达。在使免疫系统能够对抗原反应的条件下，可发生抗原在肿瘤上的表达。当免疫系统不成熟并且无法反应时，在胚胎发育的过程中，TAA可为在正常细胞上表达的抗原，或者它们可为通常在正常细胞上以非常低的水平存在，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性实例包括下列：分化抗原如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(PmeI 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、P15；过表达的胚胎抗原如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因如p53、RAS、HER-2/neu；染色体易位产生的独有的肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK，MYL-RAR；和病毒抗原，如EB病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA-125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

在优选的实施方式中，CAR的抗原结合结构域部分靶向抗原，其包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等。

根据待靶向的所需的抗原，本发明的CAR可经改造包含适当的对所需抗原靶标特异的抗原结合部分。

抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体和其片段。在一些实例中，抗原结构域衍生自CAR将最后被利用的同一物种是有利的。例如，为了用于人，CAR的抗原结构域包括人抗体或其片段可以是有利的。因此，在一个实施方式中，抗原结合结构域部分包括人抗体或其片段。可选地，在一些实施方式中，非人抗体被人源化，其中抗体的特定的序列或区域被修饰以增加与人类中天然产生的抗体的相似性。

在本发明的一个实施方式中，多种类型的CAR在T细胞表面上表达。不同类型的CAR，它们的抗原结合结构域可以不同。即，在一个实施方式中，不同类型的CAR每个结合不同的抗原。在一个实施方式中，不同的抗原是针对特定肿瘤的标记物。例如，在一个实施方式中，不同类型的CAR每个结合不同的抗原，其中每个抗原在特定类型的肿瘤上表达。这样的抗原的实例在本文别处讨论。

关于跨膜结构域，CAR可以设计为包括被融合到CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。在一实施方式中，采用自然与CAR中的一个结构域相关联的跨膜结构域。在一些情况中，跨膜结构域可被选择或通过氨基酸取代修饰，以避免这样的结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合体的其它成员的相互作用。

跨膜结构域可由天然的或合成的来源衍生。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何的膜结合或跨膜蛋白质。本发明中特定用途的跨膜结构域可衍生自(即，包含至少下列跨膜区(一个或多个))：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS。可选地，跨膜结构域也可为合成的，在这种情况下，其将包括主要疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选，在合成跨膜结构域的各端可以发现苯丙氨酸，色氨酸和缬氨酸三联体。任选地，短寡肽或多肽接头，优选长度在2和10个氨基酸之间，可CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供特别合适的接头。

本发明的CAR的细胞质结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应器功能的活化的原因。术语“效应器功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应器功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应器功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应器功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应器功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

在本发明的一个实施方式中，细胞的效应器功能依赖多种类型的CAR与它们的靶向抗原的结合。例如，在一个实施方式中，一种类型的CAR与其靶标的结合不足以诱导细胞的效应器功能。

用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。

已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可认为由两个不同类的细胞质信号传导序列介导：通过TCR开始抗原-依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。

初级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。

包含在本发明中具有具体用途的初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括衍生于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的细胞质信号传导分子包括衍生于CD3-ζ的细胞质信号传导序列。

在一个实施方式中，CAR的细胞质结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的细胞质结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的细胞质结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效反应所需的除抗原受体或它们的配体外的细胞表面分子。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。

本发明的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

在一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域。在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在本发明的一个实施方式中，多种类型的CAR在细胞上表达，其中不同类型的CAR，它们的细胞质结构域可不同。在一个实施方式中，至少一种类型的CAR包括CD3ζ结构域，同时至少一种类型的CAR包括共刺激结构域，例如4-1BB结构域。然而，不同类型的CAR不受任何细胞质结构域的限制。例如，每种类型的CAR可包括任何含有ITAM的序列、共刺激结构域或其组合，以至于每个单个类型的CAR的结合不足以诱导效应器功能，但是多种类型的CAR的结合能诱导效应器功能。即，每种类型的CAR结构域一起起作用来诱导效应器功能。

2.抑制性CAR策略

本发明提供这样的组合物和方法，其通过基因修饰T细胞以表达抑制性CAR而限制正常的健康组织消耗。在一个实施方式中，本发明的抑制性CAR包括细胞外结构域和细胞内结构域。细胞外结构域包括称作抗原结合结构域的靶特异性结合元件。在一个实施方式中，抑制性CAR包括抗原结合结构域，其结合与正常的、健康组织相关的抗原。例如，在一个实施方式中，抑制性CAR的抗原结合结构域结合非癌细胞中特异地发现的抗原。如本文别处所描述的，抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体和其片段。

本发明的抑制性CAR可包括跨膜结构域。如本文别处所描述的，跨膜结构域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。可选地，跨膜结构域可以是合成的。

本发明的抑制性CAR包括负责CAR T细胞活性的抑制性细胞质结构域。在本发明的一个实施方式中，抑制性CAR作为一个或多个本文别处描述的治疗的、抗肿瘤CAR在相同的T细胞上表达。在一个实施方式中，抑制性CAR的细胞质结构域阻止T细胞活化，抑制T细胞的细胞溶解活性或抑制T细胞的辅助活性。

本发明的抑制性CAR不限于抑制CAR T细胞活性的任何特定的功能。例如，抑制性CAR可包括细胞质结构域，其在与靶抗原结合之后诱导治疗性CAR的内化，阻止CAR T细胞活化或诱导CAR T细胞死亡。

在一个实施方式中，抑制性CAR的细胞质结构域包括含有抑制性ITAM的序列。

在一个实施方式中，抑制性CAR的细胞质结构域包括死亡结构域(DD)。如本文所用，DD指与DD蛋白如TNFR1、Fas、DR3、DR4/TrailR1、DR5/TrailR2、DR6、FADD、MyD88、Raidd、IRAK、IRAK-2、IRAK-M、p75NTR、Tradd、DAP激酶、RIP、NMP84和锚蛋白的DD结构域共有序列同源性的区域，并已在本文被发现具有与已知的DD蛋白相似的结合性质。

肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的凋亡诱导成员通过它们的细胞内死亡结构域(DDs)与衔接蛋白质的相互作用招募胱天蛋白酶家族细胞死亡蛋白酶的前形式(proform)到配体化的(liganded)受体复合物(Ashkenazi and Dixit,Science281:1305-1308(1998)；Wallach et al.,Annu.Rev.Immunol.17:331-367(1999))。几种胱天蛋白酶家族成员是已知的，例如，胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13和胱天蛋白酶-14(Grutter,Curr.Opin.Struct.Biol.10:649-655(2000))。

死亡受体如TNF-R1和Fas寡聚化以通过它们的细胞内DDs发信号。信号通过胞质连接体传送到胱天蛋白酶。针对Fas的死亡诱导信号传导复合物(DISC)已显示最低限度地包括Fas三聚体、Fadd和胱天蛋白酶-8。已发现针对DR4和DR5的相似的DISC复合物。在TRAIL受体的情况中，混合的复合物，例如，两个DR4加一个DR5形成三聚体，表现出有功能的。诱饵受体，例如，DcR1、DcR2和DcR3，其不具有或具有不完全的死亡结构域，可通过干扰DISC形成而抑制凋亡。

几种TNFR-家族成员(TNFR1；p75NTR，神经营养蛋白受体，也称作p75NGFR、神经生长因子受体；Fas；DR3；DR4/TrailR1；DR5/TrailR2；DR6)的细胞内区域含有称作“死亡结构域”(DD)的结构，并且当与配体结合时诱导凋亡(Ashkenazi and Dixit,Science 281:1305-1308(1998),Wallach et al.,Annu.Rev.Immunol.17:331-367(1999))。这样的“死亡受体”引起的凋亡诱导的机制包括衔接蛋白质的受体复合物的募集，衔接蛋白质结合某些胱天蛋白酶-家族细胞死亡蛋白酶的前结构域。胱天蛋白酶作为酶原存在于活细胞，通常需要蛋白水解加工用于它们的活化。因为胱天蛋白酶的前形式具有弱的蛋白酶活性，然而，它们的受体介导的聚集通过“诱导的近似”机制导致跨蛋白水解(Salvesen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:10964-10967(1999))。

在一个实施方式中，抑制性CAR包括细胞外抗原结构域——其结合与正常的、非癌细胞相关的抗原——和细胞质结构域，其包括死亡结构域或其部分。在一个实施方式中，抑制性CAR与其靶抗原的结合导致CAR T细胞的凋亡死亡，从而阻止CAR T细胞活化和减少正常的、健康组织的消耗。在一个实施方式中，T细胞被基因修饰以表达抑制性CAR和一个或多个治疗的、肿瘤靶向的CAR，如本文别处所描述的。结合肿瘤抗原的CAR T细胞导致CAR T细胞的活化和肿瘤的消除，而结合与非癌组织相关的抗原的CAR T细胞导致CAR T细胞活性的抑制(例如活化的抑制、凋亡的细胞死亡等)。如本文别处所描述的，被修饰以表达抑制性CAR和至少一个肿瘤重定向的CAR的T细胞可通过施用慢病毒载体、体外转录的RNA或其组合给细胞而产生。

3.药物-分子结合物

本发明提供组合物和方法以通过施用药物-分子结合物给接受CAR T细胞治疗的对象来调节CAR T细胞治疗，从而限制正常的健康组织的消耗。在一个实施方式中，药物-分子结合物结合CAR，导致CAR和药物-分子结合物内化。本发明基于这样的发现：靶向识别之后，CAR被瞬时地内化。该行为因此可被利用在方法中以积极地和可控地调节CAR T细胞活性。进一步，CAR T细胞活性通过施用如本文所描述的药物-分子结合物进行的调节不需要CAR T细胞的进一步基因修饰，从而消除了对过度的技术复杂性的需要和另外的细胞基因操作需要的增加的成本。

分子

在一个实施方式中，药物-分子结合物的分子包括结合基因修饰的细胞上表达的CAR的分子。分子可结合CAR的任何部分。例如，分子可结合CAR的抗原结合结合区或连接体区。分子可以是可结合CAR的区域的任何类型。例如，分子可以是肽、核苷酸、抗体、小分子等。

在一个实施方式中，分子包括抗体或其片段，其靶向结合CAR的细胞外结构域。在一个实施方式中，抗体结合抗原，其中抗原是CAR或CAR的区域。制备和利用抗体的方法在本领域众所周知。例如，用于本发明的多克隆抗体根据本领域熟知的标准免疫学技术通过免疫兔子而产生(参见，例如，Harlow et al.,1988,In:Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

然而，本发明不应被解释为仅限于包括这些抗体的方法和组合物或限于这些抗原部分。相反地，本发明应被解释为包括其它抗体，如该术语在本文别处所被定义的，抗原或其部分。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，抗体可特异地结合CAR的任何部分，并且CAR全长或任何部分可用于产生对其特异的抗体。然而，本发明不限于利用全长蛋白作为免疫原。相反，本发明包括利用蛋白质的免疫原性部分来产生特异地结合特异抗原的抗体。即，本发明包括利用抗原的免疫原性部分或抗原决定簇来免疫动物。

进一步，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，利用非保守的免疫原性部分可产生对非保守区特异的抗体，从而产生不与可共有一个或多个保守部分的其它蛋白交叉反应的抗体。因此，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，感兴趣的抗原的非保守区可用于产生仅对该抗原特异的抗体，并且不与包括其它类型CAR在内的其它蛋白非特异地交叉反应。

基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，本发明包括识别单个抗原表位单个抗体的应用，但是本发明不限于单个抗体的应用。相反，本发明包括至少一种抗体的应用，其中抗体可定向相同或不同的抗原蛋白表位。

多克隆抗体的产生通过如下来实现：用抗原接种期望的动物和利用标准的抗体产生方法如，例如，Harlow et al.(1988,In:Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,N.Y.)中描述的那些方法来分离特异地结合来自其的抗原的抗体。

针对蛋白质或肽的全长或肽片段的单克隆抗体可利用任何熟知的单克隆抗体制备程序来制备，如，例如，Harlow et al.(1988,In:Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.)和Tuszynski et al.(1988,Blood,72:109-115)中描述的那些制备程序。大量期望的肽可还利用化学合成技术来合成。可选地，编码期望的肽的DNA可被克隆和在适合大量产生肽的细胞中由适当的启动子序列表达。定向肽的单克隆抗体利用本文引用的标准程序从用肽免疫的小鼠产生。

利用本文描述的程序获得的编码单克隆抗体的核酸可利用本领域可获得的和例如，Wright et al.(1992,Critical Rev.Immunol.12:125-168)和其中引用的参考文献中描述的技术进行克隆和测序。进一步，利用，例如，Wright et al.和其中引用的参考以及Gu et al.(1997,Thrombosis and Hematocyst 77:755-759)中描述的技术和本领域熟知或将被发展的人源化抗体的其它方法，本发明的抗体可被“人源化”。

本发明还包括与感兴趣的抗原的表位特异反应的人源化抗体的应用。本发明的人源化抗体具有人的框架和具有一个或多个来自与感兴趣的抗原特异反应的抗体通常是小鼠抗体的互补决定区(CDRs)。当用于本发明的抗体被人源化时，抗体可如Queen,et al.(U.S.Pat.No.6,180,370)、Wright et al.,(同上)和其中引用的参考文献、或Gu et al.(1997,Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759)中所描述产生。Queen et al.中公开的方法部分涉及设计人源化免疫球蛋白，其通过表达连接编码受体人框架区的DNA节段的重组DNA节段产生，该重组DNA节段编码来自能结合期望的抗原如感兴趣的抗原上的表位的供体免疫球蛋白的重链和轻链互补决定区(CDRs)。一般而言，Queen专利中的发明具有针对基本上任何人源化免疫球蛋白的设计的适用性。Queen解释DNA节段将通常包括表达对照DNA序列，其可操作地连接人源化免疫球蛋白编码序列，包括天然结合的或异源的启动子区。表达对照序列可以是能转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，或表达对照序列可以是能转化或转染原核宿主细胞的载体中的原核启动子系统。一旦载体已并入适当的宿主，宿主就在适合引入的核苷酸序列高水平表达条件下维持，并且如所期望的，之后可采集和纯化人源化轻链、重链、轻/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式(Beychok,Cells of ImmunoglobulinSynthesis,Academic Press,New York,(1979)，其通过引用并入本文)。

在本发明的一个实施方式中，可产生噬菌体抗体文库，如本文别处所详细描述的。为了产生噬菌体抗体文库，cDNA文库首先从分离自细胞，例如，外周血淋巴细胞——其表达将在噬菌体表面上表达的期望的蛋白质，例如，期望的抗体——的mRNA获得。mRNA的cDNA拷贝利用逆转录酶产生。规定免疫球蛋白片段的cDNA通过PCR获得，并将得到的DNA克隆进合适的噬菌体载体以产生包括规定免疫球蛋白基因的DNA的噬菌体DNA文库。制备包括异源DNA的噬菌体文库的程序在本领域熟知和在例如，Sambrook et al.，同上中描述。

编码期望的抗体的噬菌体可被改造以便蛋白质显示在其表面上，以至于它可用于结合其相应的结合蛋白，例如，抗体所针对的抗原，如感兴趣的抗原。因此，当表达特异抗体的噬菌体在存在相应抗原的情况下温育时，噬菌体将结合抗原。不表达抗体的噬菌体将不结合抗原。这样的淘选技术在本领域熟知并在例如，Wright et al.(同上)中被描述。

已发展如上所述的那些方法，用于利用M13噬菌体展示的人抗体的产生(Burton et al.,1994,Adv.Immunol.57:191-280)。必要地，cDNA文库从获自产生抗体的细胞群的mRNA产生。mRNA编码重排的免疫球蛋白基因，因此，cDNA编码重排的免疫球蛋白基因。将扩增的cDNA克隆进产生在其表面上表达人Fab片段的噬菌体文库的M13表达载体。显示感兴趣的抗体的噬菌体通过抗原结合来选择并在细菌中增殖以产生可溶的人Fab免疫球蛋白。因此，与常规单克隆抗体合成相比，该程序使编码人免疫球蛋白的DNA而不是表达人免疫球蛋白的细胞永久化。

目前描述的程序描述编码抗体分子Fab部分的噬菌体的产生。然而，本发明不应被解释为仅限于编码Fab抗体的噬菌体的产生。相反，编码单链抗体的噬菌体(scFv/噬菌体抗体文库)也包括在本发明内。包括全部Ig轻链的Fab分子，即，它们包括轻链的可变区和恒定区，但是只包括重链的可变区和第一恒定区结构域(CH1)。单链抗体分子包括包含Ig Fv片段的单链蛋白。Ig Fv片段只包括抗体的重链和轻链可变区，没有其中包含的恒定区。包括scFv DNA的噬菌体文库可遵循Marks et al.(1991,J.Mol.Biol.222:581-597)中描述的程序产生。这样产生的用于分离期望抗体的噬菌体的淘选以与针对包括Fab DNA的噬菌体文库的描述相似的方式进行。

本发明还应被解释为包括合成的噬菌体展示文库，其中重链和轻链可变区可被合成，以便它们包括几乎所有可能的特异性(Barbas,1995,Nature Medicine1:837-839；de Kruif et al.1995,J.Mol.Biol.248:97-105)。

在本发明的另一个实施方式中，来自免疫的动物的噬菌体克隆的抗体可通过已知技术人源化。

在一个实施方式中，本发明的药物-分子结合物的分子包括来自CAR靶向的抗原表位的肽。例如，如果CAR针对CD19，那么本发明的分子可包括衍生自结合CAR的CD19的表位的肽。像这样，肽可包括全长蛋白或其部分。肽因此模拟CAR的抗原结合区靶向的抗原。

本发明的肽可利用化学方法制备。例如，肽可通过固相技术合成(Roberge J Yet al(1995)Science 269:202-204)，从树脂分裂，和通过制备型高效液相色谱法纯化。自动化合成可通过，例如，根据制造者提供的说明书利用ABI 431 A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现。

药物

本发明的药物-分子结合物包括药物，在一个实施方式中，药物被内化进CART细胞。如本文别处所描述地，结合物结合CAR之后，CAR连同结合物被内化。在一个实施方式中，药物调节CAR T细胞的活性。用于本发明的药物类型不限于任何特定的类型。相反，可利用调节CAR T细胞活性的任何药物。例如，在一个实施方式中，药物引起CAR T细胞死亡。

结合物产生

本发明的药物-分子结合物可以以本领域可获得的任何合适的方式产生，虽然在具体的实施方式中，结合物作为融合多肽产生或被以化学方法结合，如通过连接体的应用。

在药物-分子结合物通过结合，如以化学方法结合或通过应用连接体而产生的实施方式中，单个组分被提供或获得，并然后通过以化学方法结合或连接方法来结合。

例如，结合物组分可通过生物学上可释放的键，如选择性地可切割的连接体或氨基酸序列连接。例如，考虑这样的肽连接体，其包括优选位于肿瘤环境内或在肿瘤环境内有活性的酶的切割位点。这样的肽连接体的示例的形式是由尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶如胶原酶、明胶酶或基质溶素(stromelysin)切割的那些。可选地，肽或多肽可连接到佐剂。

另外，本领域技术人员已知的任何其它连接/偶联剂和/或机制可用于组合本发明的组分，如，例如，抗体-抗原相互作用、抗生物素蛋白生物素连接、酰胺键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、磷酸酯键、磷酰胺键、酸酐键、二硫键、离子和疏水相互作用、双特异抗体和抗体片段、或其组合。

考虑将利用在血中具有合理的稳定性的交联剂。许多种类型的含有二硫键的连接体已知可成功地用于结合物靶向和治疗/预防剂。含有空间受阻的二硫键的连接体可证明给出了更大的体内稳定性，在到达作用部位之前防止靶向肽的释放。这些连接体因此是一组连接剂。

另一种交联剂是4-琥伯酰亚胺氧羰基(succinimdyloxycarbonyl)-甲基-x-[2-吡啶基二硫代(pyridyldithio)]-甲苯(SMPT)，其是含有由邻近的苯环和甲基“空间阻碍”的二硫键的双功能交联剂。据认为，二硫键的位阻起到保护键避免受到硫醇盐阴离子如可存在于组织和血液中的谷胱甘肽攻击的作用，从而辅助防止在连接的药剂递送到靶部位之前结合物的解耦。

SMPT交联试剂，与许多其它已知的交联试剂一样，促进官能团如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)的交联。另一种类型的交联剂包括含有可切割的二硫键的杂-双功能光反应性叠氮苯如硫代琥伯酰亚胺-2-(p-叠氮基水杨氨基(azido salicylamido))乙基-1,3'-二硫代丙酸盐。N-羟基-琥伯酰亚胺基与伯氨基反应，叠氮苯(光解之后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。

除了受阻的交联剂外，同此还可利用非受阻的连接体。其它有用的交联剂，不考虑含有或产生保护的二硫化物，包括琥伯酰亚胺乙酰基硫代乙酸盐(SATA)、N-琥伯酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐SPDP和2-亚氨基硫醇(iminothiolane)(Wawrzynczak&Thorpe,1987)。这样的交联剂的应用在本领域是众所周知的。

美国专利号4,680,338描述这样的双功能连接体，其用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的结合物，特别地用于与螯合剂、药物、酶、可检测的标记等形成抗体结合物。美国专利号5,141,648和5,563,250公开了可切割的结合物，其含有在许多种温和条件下可切割的易变的键。该连接体特别有用，因为感兴趣的剂可直接结合连接体，切割导致活性剂的释放。优选的应用包括将游离的氨基或游离的巯基添加到蛋白质，如抗体，或药物。

美国专利号5,856,456提供肽连接体，用于连接多肽组分以制备融合蛋白，例如，单链抗体。连接体长达约50个氨基酸，含有至少一个带电荷的氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)的出现，之后是脯氨酸，并且其特征是更大的稳定性和减少的聚集。美国专利号5,880,270公开了用于许多种免疫诊断和分离技术的含有氨基氧的连接体。

另一个实施方式包括柔性连接体的应用。

嵌合分子的施用

在一个实施方式中，本发明包括限制CAR T细胞治疗期间正常的、非癌细胞消耗的方法。如本文别处所描述地，虽然CAR T细胞治疗可有效地消除肿瘤细胞，但是它有时必需限制CAR T细胞活性以便肿瘤细胞被靶向，而正常的细胞被赦免。在一个实施方式中，该方法包括当测定CAR T细胞消耗太多的正常组织时施用药物-分子结合物到接受CAR T细胞治疗的对象。例如，可测定抗CD19CAR T细胞正消耗不安全量的正常B细胞。这样的测定可由任何受过训练的医师或医疗保健提供者作出。

在一些实施方式中，将有效量的本发明的结合物施用给细胞。在其它实施方式中，将治疗有效量的本发明的结合物施用给个体来用于疾病或状况的治疗。

术语“有效量”如本文所用被定义为导致被施用的细胞或组织生理学变化所必需的本发明的结合物的量。

术语“治疗有效量”如本文所用被定义为消除、减少、延迟或最小化状况的不良作用(即CAR T细胞治疗引起的正常组织的过度消耗)的本发明的结合物的量。技术人员容易认识到，在许多情况中结合物可不提供治愈，但是可只提供部分益处，如状况的至少一个症状的减轻或改善。在一些实施方式中，具有一些益处的生理学变化也被认为是治疗有益的。因此，在一些实施方式中，提供生理学变化的结合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。

在本发明的一些实施方式中和作为超过本领域已知方法的优势，结合物作为蛋白质而不是作为被翻译从而产生期望的多肽的核酸分子被递送。作为另外的优势，在一些实施方式中，人序列用于本发明的结合物以防止任何不期望的来自外来多肽的免疫应答发生。

本发明的结合物可本身或以药物组合物的形式施用给对象。包括本发明的蛋白质的药物组合物可通过常规的混合、溶解、成粒、制备糖衣丸、磨碎、乳化、包封、包埋或冻干工艺而制造。药物组合物可以以常规方式利用一个或多个促进蛋白质加工成可在药学上使用的制剂的生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂而配制。适合的制剂取决于选择的施用途径。

对于局部施用，本发明的结合物可被配制为溶液、凝胶、软膏、膏状物、悬浮液等，其在本领域是熟知的。

系统制剂包括针对通过注射，例如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射施用而设计的那些制剂，以及针对经皮、穿粘膜、吸入、口服或肺施用而设计的那些制剂。

对于注射，本发明的结合物可在水性溶液，优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。溶液可含有配制剂如悬浮、稳定和/或分散剂。

可选地，结合物可以粉末形式，在使用之前用合适的载体，例如，灭菌无热原水构成。

对于穿粘膜施用，适合将被渗透的屏障的渗透剂用于制剂。这样的渗透剂通常在本领域已知。

对于口服施用，通过组合结合物与本领域熟知的药学上可接受的载体，结合物可容易配制。这样的载体使本发明的结合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶糖浆、浆体、悬浮液等，用于使被治疗的患者的口服摄入。对于口服固体制剂如，例如，粉剂、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；成粒剂；和粘合剂。如期望，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

如期望，固体剂型可利用标准技术包被糖衣或包被肠溶衣。

可选地，可利用其它药物递送系统。脂质体和乳状液是可用于递送本发明结合物的递送载体熟知的例子。也可利用某些有机溶剂如二甲基亚砜，虽然通常以更大的毒性为代价。另外，结合物可利用持续释放系统来递送，如含有结合物的固体聚合物的半渗透性基质。已建立许多种形式的持续释放物质并为本领域技术人员所熟知。持续释放胶囊可，取决于它们的化学性质，释放分子持续几周，多达超过100天。取决于结合物的化学性质和生物学稳定性，可利用另外的分子稳定策略。

本发明的结合物的蛋白质实施方式可含有带电荷的侧链或末端。因此，它们可作为游离酸或碱或作为药学上可接受的盐包括在上述制剂中的任何一种中。药学上可接受的盐是基本上保持游离碱的生物学活性和通过与无机酸反应而制备的那些盐。药用盐趋于较相应的游离碱形式在水性和其它质子溶剂中更可溶。

本发明的结合物将通常以有效达到期望的目的的量而使用。为了用于治疗或预防疾病状况，本发明的结合物或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。

对于系统施用，治疗有效剂量可最初从体外测定来估计。例如，剂量可在动物模型中配制以达到包括如在细胞培养中测定的IC₅₀的循环浓度范围。这样的信息可用于更准确地测定人类中有用的剂量。

最初剂量还可利用本领域熟知的技术从体内数据例如，动物模型来估计。具有本领域普通技术的人基于动物数据可容易优化对人的施用。

剂量数量和间隔可个别地调节以提供足以保持治疗效果的分子的血浆水平。有用的患者注射施用剂量的范围是约0.001至100mg/kg/天，优选约0.5至1mg/kg/天和其间任何和所有全部或部分整数。治疗上有效的血清水平可通过每天施用多倍剂量来实现。

在局部施用或选择性摄取的情况中，蛋白质的有效局部浓度可不与血浆浓度相关。本领域技术人员将能够优化治疗上有效的局部剂量而无需过度的实验。

当然，施用的结合物的量将取决于正被治疗的对象，取决于对象的重量、痛苦的严重性、施用方式和开处方的医师的判断。

当症状可检测或甚至当它们不是可检测时，治疗可间歇地重复。治疗可单独或与其它药物组合提供。

RNA转染

在一个实施方式中，本发明基因修饰的T细胞通过引入RNA被修饰。在一个实施方式中，体外转录的RNA CAR可以瞬时转染的形式被引入细胞。在另一个实施方式中，RNA CAR连同体外编码双特异抗体的转录的RNA被引入。通过使用聚合酶链式反应(PCR)-产生的模板的体外转录产生RNA。来自任何来源感兴趣的DNA可直接使用适当的引物和RNA聚合酶通过PCR转化成用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他适当的DNA来源。用于体外转录的期望的模板是本发明的CAR。在一个实施方式中，用于RNA CAR的模板包括细胞外结构域，其包括抗肿瘤抗体的单链可变区；包括CD8a的铰链和跨膜结构域的跨膜结构域；和包括CD3-ζ的信号传导结构域的细胞质结构域。通过另一个实例，模板包括具有包括抗体或其部分——针对与正常的健康组织相关的抗原——的细胞外结构域的抑制性CAR。通过另一个实例，模板包括多种类型的CAR。在一些实例中，模板包括抑制性CAR和至少一个类型的肿瘤定向的CAR。

在一个实施方式中，用于PCR的DNA包括开放阅读框。DNA可来自天然产生的DNA序列，所述序列来自有机体基因组。在一个施实方式中，DNA为基因的一部分的全长感兴趣基因。基因可包括一些或全部的5'和/或3'非翻译区(UTR)。基因可包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA为人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA为包括5'和3'UTR的人基因。DNA可选地为通常不在天然产生的有机体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列为包括连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA的部分可来自单一有机体或来自多个有机体。

可用作用于PCR的DNA的来源的基因包括编码多肽的基因，其对有机体提供治疗性或预防效果或可用于诊断有机体的疾病或病症。优选的基因为以下基因：其可用于短期治疗，或其中有关于剂量或所表达基因的安全性的关注。例如，对于治疗癌症、自体免疫状况、寄生虫的、病毒的、细菌的、真菌的或其他的感染，所表达的转基因(一个或多个)可编码担当用于免疫系统的细胞的配体或受体的多肽，或可起到刺激或抑制有机体免疫系统的作用。在一些实施方式中，不期望具有持久持续的免疫系统的刺激，也不必产生在成功治疗后延续的变化，因为这可随后引出新的问题。对于自体免疫状况的治疗，可期望骤然抑制或压制免疫系统，但不是长期的，其可导致患者变得对感染过度敏感。

PCR用于产生用于转染的mRNA体外转录的模板。用于进行PCR的方法是本领域广泛已知的。设计用于PCR的引物，以具有与用作用于PCR的模板的DNA的区基本上互补的区。“基本上互补的”，如本文所用，指的是在核苷酸的序列中大多数或所有的引物序列中的碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的，或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下，与预期的DNA靶标退火或杂交。引物可被设计以与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可设计引物以扩增通常在细胞中转录的基因的部分(可读框)，包括5'和3'UTR。也可设计引物以扩增编码特定感兴趣结构域的基因的部分。在一个实施方式中，设计引物以扩增包括全部或部分的5'和3'UTR的人cDNA的编码区。可用于PCR的引物通过本领域广泛已知的合成方法产生。“正向引物”为包括与在位于要扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸的区域的引物。本文使用的“上游”指的是对于相对于编码链扩增的DNA序列的位置5'。“反向引物”是包括与位于要扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指的是对于相对于编码链扩增的DNA序列的位置3'。

任何可用于PCR的DNA聚合酶可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶从很多来源商业可得。

也可使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在0和3000个核苷酸之间。添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可通过不同的方法改变，包括但不限于，设计与UTR的不同区域退火的PCR的引物。利用该方法，本领域技术人员可在转录RNA的转染后修改实现最优翻译效率所需要的5'和3'UTR长度。

5'和3'UTR可为针对感兴趣基因的天然产生的、内源性5'和3'UTR。可选地，对感兴趣基因不是内源性的UTR序列可通过将UTR序列整合入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰而添加。对感兴趣基因不是内源性的UTR序列的使用可有助于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中AU-富集的元件可降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域广泛已知的UTR性质，可选择或设计3'UTR，以增加转录RNA的稳定性。

在一个实施方式中，5'UTR可包括内源性基因的Kozak序列。可选地，当对于感兴趣基因不是内源性的5'UTR如上述通过PCR添加时，共有Kozak序列可通过添加5'UTR序列重新设计。Kozak序列可增加一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有的RNA都需要以实现有效的翻译。对于多种mRNA的Kozak序列的需要是本领域已知的。在其他实施方式中，5'UTR可源于RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，不同的核苷酸类似物可用于3'或5'UTR，以阻止mRNA的外切核酸酶降解。

为了能够实现从DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，转录的启动子应被附接至待转录序列的DNA模板上游。当充当RNA聚合酶的启动子的序列被添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子变为整合入待转录的开放阅读框的PCR产物上游。在一个优选实施方式中，启动子为T7聚合酶启动子，如本文其他地方描述的。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。

在优选的实施方式中，mRNA具有5'末端上的帽和3'聚(A)尾两者，其确定细胞中的核糖体结合、翻译开始和mRNA的稳定性。在环形DNA模板上，例如质粒DNA，RNA聚合酶产生长的多联产物，其不适于在真核细胞中表达。在3'UTR末端上线性化的质粒DNA的转录产生正常尺寸的mRNA，其在真核转染中不是有效的，即使它在转录后多聚腺苷酸化。

在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可延伸转录物的3'末端超过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。

聚A/T序列段并入DNA模板的整合的常规方法为分子克隆。然而整合入质粒DNA的聚A/T序列可引起质粒不稳定性，这是为何从细菌细胞获得的质粒DNA模板通常以缺失和其他差错被高度污染。这使克隆程序不仅是费力和耗时的，而且经常是不可靠的。这是为何允许用聚A/T 3'序列段而不进行克隆来构建DNA模板的方法是高度期望的。

转录的DNA模板的聚A/T片段可在PCR期间通过使用包括聚T尾诸如100T尾(尺寸可为50-5000T)的反向引物，或在PCR后通过任何其他方法，包括但不限于DNA连接或体外重组而产生。聚(A)尾也提供了对RNA的稳定性并减少了它们的降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA稳定性正相关。在一个实施方式中，聚(A)尾在100和5000个腺苷之间。

RNA的聚(A)尾可在通过使用聚(A)聚合酶诸如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP)在体外转录后进一步延伸。在一个实施方式中，使聚(A)尾长度从100个核苷酸增加至300和400个之间的核苷酸导致RNA的翻译效率增加大约两倍。另外，不同的化学基团附接至3'末端可增加mRNA稳定性。这样的附接可包括修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，ATP类似物可利用聚(A)聚合酶整合入聚(A)尾。ATP类似物可进一步增加RNA的稳定性。

5'帽也为RNA分子提供了稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。5'帽利用本领域已知的并在本文中描述的技术提供(Cougot等，Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等，RNA,7:1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。

通过本文公开的方法生产的RNA也可包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可为任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，其起动结合至mRNA的不依赖帽的核糖体，并便于翻译的开始。可包括任何适于细胞电穿孔的溶质，所述溶质可包括促进细胞渗透性和生存力的因素，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

RNA可利用很多不同方法中的任一种引入靶细胞，所述方法例如商业可得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)),(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.),Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)，利用脂质转染法的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物射弹粒子递送系统诸如“基因枪”(见例如，Nishikawa等，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。

基因修饰的T细胞

在一些实施方式中，CAR序列利用反转录病毒或慢病毒载体传递送入细胞。表达CAR的反转录病毒和慢病毒载体可利用作为运载体的转导的细胞或包封的、结合的或裸载体的无细胞局部或全身传递，传递入不同类型的真核细胞以及传递入组织和整个有机体。所用方法可用于其中稳定表达是需要的或充足的任何目的。

在其他实施方式中，CAR序列和双特异抗体序列利用体外转录的mRNA传递入细胞。体外转录的mRNA CAR可利用作为运载体的转染的细胞或包封的、结合的或裸mRNA的无细胞局部或全身传递，传递入不同类型的真核细胞以及传递入组织和整个有机体。所用方法可用于其中瞬时表达是需要的或充足的任何目的。

所公开的方法可在基础研究和疗法中，在癌症、干细胞、急性和慢性感染以及自体免疫疾病的领域中，用于调整T细胞活性，包括评估基因修饰的T细胞杀死靶癌症细胞的能力。

该方法也提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量，在宽范围中控制表达水平的能力，使其可能单独调节表达水平。此外，基于PCR的mRNA产生的技术大大促进具有不同结构和它们结构域的组合的嵌合受体mRNA的设计。例如，改变在相同细胞中的多嵌合受体上的不同细胞内效应器/共刺激因子结构域允许确定受体组合的结构，所述受体组合评估对抗多抗原靶标的最高水平的细胞毒性，同时对于正常细胞的最低细胞毒性。

本发明RNA转染方法的一个优点是RNA转染是基本上瞬时的和无载体的：RNA转基因可被传递至淋巴细胞并在简短的体外细胞活化之后在其中表达，作为最小表达盒，而不需要任何额外的病毒序列。在这些条件下，转基因整合入宿主细胞基因组是不可能的。细胞的克隆是不必要的，因为RNA的转染效率和它均匀修饰整个淋巴细胞群的能力。

使用体外转录的RNA(IVT-RNA)的T细胞基因修饰利用两种不同的策略，其两者已经在不同的动物模型中成功测试。细胞通过脂质转染法或电穿孔，用体外转录的RNA进行转染。优选地，期望利用不同的修饰使IVT-RNA稳定，以便实现转移的IVT-RNA的持久表达。

一些IVT载体在文献中已知，其以标准化的方式用作体外转录的模板，并且其已经以产生稳定化的RNA转录物的方式进行基因修饰。目前用于本领域的方案基于具有以下结构的质粒载体：能够实现RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，随后是未翻译区(UTR)位于3'和/或5'的侧翼的感兴趣基因，和包括50-70A核苷酸的3'多聚腺苷酸盒。在体外转录前，环形质粒通过II型限制酶在多聚腺苷酸盒下游线性化(识别序列对应于切割位点)。多腺苷酸盒因此对应于转录物中后面的聚(A)序列。作为该程序的结果，一些核苷酸作为酶切割位点的部分在线性化后保持，并延伸或掩盖3'末端上的聚(A)序列。不清楚该非生理学悬突是否影响从这样的构建体细胞内产生的蛋白质的量。

RNA具有超过更多传统质粒或病毒方法的数个优点。来自RNA来源的基因表达不需要转录，并且蛋白质产物在转染后快速产生。进一步地，因为RNA不得不仅获得接近细胞质而不是细胞核的机会，并且因此通常的转染方法导致极高的转染率。另外，基于质粒的方法要求驱动感兴趣基因表达的启动子在研究的细胞中是活性的。

在另一方面，RNA构建体可通过电穿孔传递入细胞。见例如，核酸构建体进入哺乳动物细胞的电穿孔的制剂和方法，如US 2004/0014645、US2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的。包括任何已知细胞类型的电穿孔需要的电场强度的各种参数通常在有关研究文献以及本领域很多专利和申请中已知。见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的装置是商业可得的，例如，MedPulser^TMDNA电穿孔疗法系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且在诸如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482的专利中描述；电穿孔也可用于体外转染细胞，如例如US20070128708A1中描述的。电穿孔也可用于体外传递核酸进入细胞。因此，利用本领域技术人员已知的很多可用的设备和电穿孔系统中的任一个进入包括表达构建体的核酸的细胞的电穿孔介导的给药呈现了令人兴奋的传递感兴趣RNA至靶细胞的新方法。

实验实施例

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。

没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开内容的剩余部分。

实施例1：CAR结合试剂的内化作为调节和/或除去CAR转导的T细胞的活性 的方式。

对于到目前为止已被测试的所有CAR构建物的通常观察是CAR复合物在识别靶抗原之后被瞬时地内化(图1、图2)。不希望被任何特定的理论束缚，该内化可以是最佳CAR驱动功能所需要的。CAR的该特性可与结合靶T细胞之后T细胞受体复合物的内化和结合同源抗体之后对细胞表面抗原观察到的内化相似。例如，这是一些临床上可用的用于恶性血液病治疗的药物-抗体结合物(抗CD33抗体吉妥珠单抗奥佐米星(Mylotarg)；抗CD30抗体brentuximab vedotin(Adcetris)的作用机制。肿瘤细胞结合抗体-药物结合物，内化结合物，并且药物(在Mylotarg的情况中是刺孢霉素，在Adcetris的情况中是MMAE)在细胞内释放，导致细胞死亡。

CAR分子的细胞外结构域通常由衍生自对靶细胞表面上表达的分子特异的抗体的结合结构域组成；通常该结构域利用标准的基于分子生物学的技术合成，并由单链可变片段(scFv)组成，其是识别靶分子的免疫球蛋白分子重链和轻链可变区的融合——通过短的连接体肽连接；scFv衍生自识别靶分子的抗体，在非人物种中产生，并且在一些情况中被“人源化”以最小化免疫原性。这些结构域是产生CAR特异性的原因。

CAR的scFv结构域被自身靶向和/或被其它分子，如对scFv特异的抗体、衍生自靶抗原自身的表位或呈现结合scFv的构象的其它分子结合。

本文描述发展了这样的分子，其特异地结合CAR，并且，结合之后被表达表面CAR的细胞内化。进一步，CAR靶向剂被连接到破坏细胞功能的其它分子，以便CAR结合之后使内化表达CAR的细胞无能和/或消除。该技术允许对表达表面CAR的细胞特异的、随意消除或灭活。

已显示CAR在结合细胞上的靶分子之后被内化。重要地，已显示该现象在用CAR T细胞治疗的患者体内发生。在发展内化诱导试剂中，利用连接体利用标准的生物化学程序将结合CAR的抗体连接到抗有丝分裂的药物。这允许证明，表达CAR的T细胞通过加入药物-抗体结合物而特异地裂解，而不影响残留的非改造的T细胞。

本文引用的每一和每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此都通过引用全文并入本文。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但显而易见的是可由本领域技术人员想出本发明的其他实施方式和变形，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。

Claims (10)

1.药物-分子结合物，包括药物和结合在细胞表面上表达的CAR的分子。

2.权利要求1所述的结合物，其中所述结合物结合所述CAR导致所述结合物内化进所述细胞。

3.权利要求1所述的结合物，其中所述结合物结合所述CAR导致药物介导的细胞死亡。

4.权利要求1所述的结合物，其中所述细胞是T细胞，并且其中所述结合物结合所述CAR导致药物介导的T细胞活化的抑制。

5.权利要求1所述的结合物，其中所述分子选自抗体、蛋白质、肽、核苷酸、小分子、和其片段。

6.在CAR T细胞治疗期间抑制健康组织消耗的方法，包括施用包括药物和分子的药物-分子结合物给接受CAR T细胞治疗的对象，其中所述分子结合在T细胞表面上表达的CAR。

7.权利要求6所述的方法，其中所述结合物结合所述CAR导致所述结合物内化进所述细胞。

8.权利要求6所述的方法，其中所述结合物结合所述CAR导致药物介导的细胞死亡。

9.权利要求6所述的方法，其中所述结合物结合CAR导致药物介导的T细胞活化的抑制。

10.权利要求6所述的方法，其中所述分子选自抗体、蛋白质、肽、核苷酸、小分子、和其片段。