CN104470506A - 温度稳定性疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供在经历冷冻和解冻条件之后保持稳定的疫苗抗原，如炭疽保护性抗原的制剂。还提供使用所述制剂来制备疫苗的方法。包含所述制剂的疫苗适用于例如预防、抑制或减轻如与炭疽感染有关的疾病或感染。

Description

温度稳定性疫苗制剂

政府权利

本发明是部分地在政府扶持下依据许可HHSO100201000059C完成的。政府可以对本发明具有某些权利。

以电子方式递交的序列表的参考

与本申请一起提交的以电子方式递交的在ASCII文本文件(名称“2479115PC02_sequencelisting.txt”；大小：12,954字节；以及创建日期：2013年6月25日)中的序列表的内容以引用的方式整体并入本文中。

发明领域

本发明涉及含有吸附于铝佐剂的抗原的温度稳定性疫苗制剂以及制备这些制剂的方法。本发明包括冻干和冷冻的疫苗制剂。本发明包括温度稳定性疫苗、制造温度稳定性疫苗的方法和使用方法。

发明背景

炭疽是一种熟知的由革兰氏阳性细菌炭疽杆菌(Bacillus anthracis；B.anthracis)引起的传染病。在三种类型的炭疽感染(皮肤感染、胃肠感染和吸入性感染)中，皮肤炭疽最常见并且可用多种抗生素相对容易地治疗。另两种类型的炭疽感染是罕见的，但是即便在用积极的抗微生物疗法下通常也是致命的。

主要的毒力因子炭疽毒素由以下三种蛋白质组成：保护性抗原(PA，83千道尔顿，kDa)、水肿因子(EF，89kDa)和致死因子(LF，90kDa)。毒素组分以PA+EF(水肿毒素)和PA+LF(致死毒素)的双重组合起作用。PA是一种细胞受体结合蛋白并且将另两种蛋白质(EF和LF)递送到受感染细胞的细胞溶质中。

最有效的预防炭疽的已知方法是接种。美国目前唯一的经FDA批准的炭疽疫苗(由Emergent BioSolutions Inc.以商标(炭疽吸附疫苗)制造)是从来自无毒力炭疽杆菌V770-NP1-R菌株的无不育细胞的滤液制得。得到许可的炭疽疫苗也称为炭疽吸附疫苗(或AVA)。所述疫苗主要由PA组成，并且将氢氧化铝用作佐剂。所述疫苗是在20世纪50和60年代期间开发出并且由FDA向EmergentBioSolutions Inc颁发许可。所述疫苗示出小于0.06％的全身性反应。关于疫苗在人体内引发免疫反应的能力有较多的文献记录。目前许可AVA疫苗在18个月内用五剂，接着每年进行加强。

虽然AVA疫苗有效且安全，但是正在开发用于制备使用重组技术来保护受试者免受致命性炭疽杆菌感染的疫苗的新型免疫原性组合物。因为保护性抗原(PA)是LF和EF起作用都需要的常见因子，所以其经常用于制备炭疽用疫苗。处于开发中的PA疫苗的实例包括美国专利6,316,006和6,387,665以及专利申请US 2010/0183675、US2011/0229507和WO2010/053610中所公开的那些。

诸如AVA和PA的疫苗典型地含有至少一种佐剂以增强受试者的免疫反应。经常称为明矾的铝盐佐剂是目前最广泛使用的人用佐剂。明矾通常是氢氧化铝(也作为(氢氧化铝)或磷酸铝销售)。用结合抗原的ALHYDROGEL配制AVA和“下一代”炭疽疫苗(如重组型PA)。

目前，含有明矾的疫苗需要冷链。全世界已经建立了冷链以将疫苗在存放和配送期间保持在2-8℃下。维持冷链是昂贵且困难的。在冷链发生故障的情况下，疫苗可能暴露于高于或低于预期温度的温度。如果含有明矾的疫苗在货运和存放期间经历冷冻/解冻处理，那么通常建议将其丢弃。工业化国家和发展中国家都会发生冷链故障，并且冷链故障有许多原因，例如设备故障、资源缺乏或顺应性差。在许多发展中国家如印度尼西亚，在75％的基线货运中记录到冷冻温度并且具有冷冻敏感性的冷冻是广泛的。参见Hepatitis B vaccine freezing inthe Indonesian cold chain：evidence and solutions，Bulletin of the WorldHealth Organization 2004；82：99-105。

将依赖于冷链的疫苗以及时的方式配送到有需要者也可能花费更长的时间。在生物恐怖事件或其它公共健康紧急事件的情况下，快速递送疫苗和其它医学对策的能力是重要的。消除对配送冷链的依赖使医学对策的递送在多种气候下更迅速和有效。

为了避免或最小化冷链要求，将许多得到许可的疫苗配制成可在施用之前立即复原的干粉组合物。到目前为止，所有在美国许可使用的干粉疫苗都是通过冻干工艺制造的。冻干也称为冷冻干燥，是一种提高疫苗的长期稳定性的工艺。所述工艺涉及冷冻所述液体疫苗制剂并在真空下升华所述冷冻制剂。已经开发了其它技术如喷雾干燥和泡沫干燥以达到制造稳定的干粉疫苗的目的。这些较新的技术在不需要冷冻的情况下制得干粉疫苗物质并且可用于含明矾的疫苗。参见例如Chen等，2010，Vaccine 28：5093-5099。然而，这些较新的技术仍在起步阶段并且有待在美国用于制造得到许可的疫苗。

含明矾的疫苗组合物的冷冻(作为冻干工艺的部分或者用以制造冷冻疫苗)通常诱导铝粒子聚集并且引起吸附到明矾佐剂上的抗原降解，导致效力损失。另外，冷冻致使沉降的铝凝胶的高度降低(通常称为凝胶塌缩)。参见例如“The effect of freezing on the appearance，potency and toxicity of adsorbed and unadsorbed DPT vaccines，”1980，WHO Weekly Epidemiological Record 55：385-92；“TemperatureSensitivity of Vaccines，”2006年8月，WHO出版物WHO/IVB/06.10；Diminsky等，1999，Vaccine，18(1-2)：3-17；Maa等，2003，J Pharm Sci92(2)：319-332。

因此，需要制造能耐冻的含明矾的疫苗。可以将这种疫苗冷冻，作为制造工艺(例如冻干或冷冻的疫苗)、货运过程或在存放期间的部分。本发明公开了用于制造含有明矾的温度稳定性疫苗的新型制剂。

发明概述

本发明提供含有明矾并且能够在效力极少降低至不降低的情况下冷冻的疫苗制剂。在一个实施方案中，冷冻疫苗组合物显示极少至无的冷冻所致的明矾凝胶塌缩。

在一个实施方案中，疫苗或组合物包含至少20％充当稳定剂的糖。在一个实施方案中，疫苗或组合物包含大于15％、大于20％、大于25％或大于30％的糖。在一些实施方案中，如果添加其它稳定剂如氨基酸和/或表面活性剂，那么可减少糖量而不削弱效力。对于冷冻和冻干的疫苗制剂，也可通过增大冷冻速率和通过冷冻悬浮粒子(如与沉降粒子相反)来提高效力。

本发明包括冷冻疫苗组合物、冻干疫苗组合物(其经历冷冻，作为冻干工艺的部分)以及在货运和存放期间对冷冻/解冻条件不敏感的其它疫苗制剂。

本发明的一些实施方案包括用于制备冻干疫苗的组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原和至少20％(w/v)的非还原糖。另一实施方案包括一种温度稳定性液体疫苗组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原和至少20％(w/v)的糖。另一实施方案包括组合物，其在冻干之前包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原和至少20％(w/v)的非还原糖，其中在复原之后，所述非还原糖是至少6％(w/v)。本发明的组合物可以进一步包含表面活性剂。在一些实施方案中，本发明的组合物包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂和至少15％(w/v)的糖，其可用于制备冻干疫苗。

本发明还包括温度稳定性液体疫苗组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂和至少15％(w/v)的糖。在一些实施方案中，组合物进一步包含氨基酸。还包括稳定的液体疫苗组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂、氨基酸和至少10％(w/v)的糖。

本发明进一步提供用于制备冻干疫苗的组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂、氨基酸和至少10％(w/v)的糖。

本发明可应用于众多含有吸附于铝佐剂的抗原的疫苗。在一个实施方案中，疫苗是炭疽疫苗如rPA或炭疽吸附疫苗。

可以改变保护性抗原的来源。因此，在一些实施方案中，从不产孢子的炭疽杆菌细菌制造炭疽杆菌保护性抗原蛋白。在一些实施方案中，不产孢子的炭疽杆菌细菌是细菌的ΔSterne-1(pPA102)CR4菌株。在一些实施方案中，PA蛋白在其它生物体如大肠杆菌(E.coli)中表达。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含佐剂(例如，除铝以外)。

本发明包括预防和治疗炭疽感染的方法，其包括向受试者施用药学上有效量的本发明的疫苗之一。在另一实施方案中，本发明包括在受试者体内诱导免疫反应的方法，其包括向受试者施用本发明的疫苗。

本发明提供将疫苗冻干的方法，其包括(i)冷冻本发明的组合物和(ii)使冷冻的组合物升华。

附图简述

图1.与在-80℃下冷冻并且解冻的相同组合物相比，在2-8℃下的没有糖稳定剂的rPA疫苗的照片。

图2.与在-80℃下冷冻并且解冻的相同组合物相比，在2-8℃下的具有20％海藻糖和2％精氨酸的rPA疫苗的照片。

图3.在2-8℃下和在-80℃下接着解冻的有和无蔗糖的rPA疫苗的照片。

图4.示出无糖rPA制剂在冷冻前后的NF50几何平均值的图以及示出明矾凝胶塌缩的照片。

图5.示出未冷冻的有和无糖的冻干样本的NF50几何平均值反应的图。

图6.示出含有20％海藻糖的rPA组合物在冷冻/解冻前后NF50几何平均值的图。

图7.示出与液体对照物相比，所有冻干样本的NF50几何平均值的图。

图8A-B.示出冻干rPA在(A)5℃和50℃下与以线性NF50标度所示的AVA相比以及在(B)5℃和50℃下与以对数NF50标度所示的AVA相比随时间变化的NF50的图，每一疫苗处于1∶4的稀释度下。

图9A-B.示出冻干rPA在(A)5℃和50℃下与以线性NF50标度所示的AVA相比以及在(B)5℃和50℃下与以对数NF50标度所示的AVA相比随时间变化的NF50的图，每一疫苗处于1∶16的稀释度下。

图10A-B.示出冻干rPA在(A)5℃和50℃下与以线性NF50标度所示的AVA相比以及在(B)5℃和50℃下与以对数NF50标度所示的AVA相比随时间变化的NF50的图，每一疫苗处于1∶64的稀释度下。

图11A-B.示出在5℃和50℃下的冻干rPA和AVA在(A)第35天和(B)第42天时的NF50的比较的图，每一疫苗处于1∶4的稀释度下。

图12A-B.示出在5℃和50℃下的冻干rPA和AVA在(A)第35天和(B)第42天时的NF50的比较的图，每一疫苗处于1∶16的稀释度下。

图13A-B.示出在5℃和50℃下的冻干rPA和AVA在(A)第35天和(B)第42天时的NF50的比较的图，每一疫苗处于1∶64的稀释度下。

图14.示出存放一个月的rPA液体疫苗(液体rPA F1)相对于存放四个月的冻干疫苗(LyoA、LyoB和LyoC)随温度变化的MLA(小噬细胞溶解分析)％值的比较的图。

图15A-B.(A)相对于参考对照物，三种存放四个月的rPA冻干制剂(LyoA、LyoB和LyoC)与存放一个月的液体rPA相比随存放温度变化的SEC纯度％的相对下降的图。(B)示出了rPA BDS参考标准的典型尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)色谱图。

图16A-B.(A)相对于参考对照物，三种存放四个月的rPA冻干制剂(LyoA、LyoB和LyoC)与存放一个月的液体rPA相比随存放温度变化的AEX纯度％的相对下降的图。(B)示出了rPA BDS参考标准的阴离子交换色谱(AEX-HPLC)色谱图。

图17A-D.示出在5℃、25℃和40℃下存放一个月的LyoA在剂量水平0.25(A图)、0.125(B图)、0.0625(C图)和0.03125(D图)下的NF50的比较的图。

图18A-D.示出在5℃、25℃和40℃下存放一个月的LyoB在剂量水平0.25(A图)、0.125(B图)、0.0625(C图)和0.03125(D图)下的NF50的比较的图。

图19A-D.示出在5℃、25℃和40℃下存放一个月的LyoC在剂量水平0.25(A图)、0.125(B图)、0.0625(C图)和0.03125(D图)下的NF50的比较的图。

图20A-D.示出在5℃、25℃和40℃下存放一个月的液体rPA在剂量水平0.25(A图)、0.125(B图)、0.0625(C图)和0.03125(D图)下的NF50的比较的图。

图21.示出12种如实施例8中所述的制剂的NF50值和平均数标准差的图。

详述

多年来，一直认为含明矾的疫苗不能冷冻。因此，不将含明矾的疫苗冷冻或冻干(需要冷冻)，并且如果冷链中断引起冷冻，那么典型地将含明矾的液体疫苗丢弃。本发明的发明人得到激动人心的发现：当诸如海藻糖或蔗糖的糖构成炭疽疫苗组合物的约20％(w/v)或更多时，组合物中的明矾不会因冷冻或解冻而塌缩。明矾塌缩是容易鉴别的并且与疫苗效力损失和粒子聚集相关。

本发明人还鉴别了有助于防止和减少明矾凝胶塌缩的其它稳定化成分和工艺参数。例如通过向制剂中添加氨基酸，可减少防止明矾凝胶塌缩所需的糖量，例如减至约10％(w/v)。对明矾凝胶高度具有积极作用的工艺变化包括冷冻悬浮粒子(而非沉降粒子)和增大冷冻速率。

本文使用的章节标题仅用于组织目的并且不将其视为限制所述的主题。所有在本文中引用的文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、条款、书和论文)都以引用的方式整体明确并入本文中以达到任何目的。在一个或多个所并入的文献或文献的部分对术语的定义与本申请中对所述术语的定义相矛盾的情况下，以本申请中出现的定义为准。

除非另外具体规定，否则使用单数包括复数。除非另外具体规定，否则措词“一种(个)(a或an)”意指“至少一种(个)”。除非另有说明，否则使用“或者”意指“和/或”。词语“至少一种(个)”的含义等效于词语“一种(个)或多种(个)”的含义。此外，使用术语“包括(including)”以及其它形式，如“包括(includes)”和“包括(included)”是没有限制性的。此外，除非另外具体规定，否则术语如“要素”或者“组分”涵盖包含一个单位的要素或组分和包含大于一个单位的要素或组分二者。措词“约”意指在约1个单位内。

本文所用的保护性抗原(PA)或重组型保护性抗原(rPA)是含有受体结合和移位结构域的炭疽毒素的组分(约83kDa)。全长PA胺基酸序列的一个实例是：

EVKQENRLLNESESSSQGLLGYYFSDLNFQAPMVVTSSTTGDLSIPSSEL ENIPSENQYFQSAIWSGFIKVKKSDEYTFATSADNHVTMWVDDQEVINKA SNSNKIRLEKGRLYQIKIQYQRENPTEKGLDFKLYWTDSQNKKEVISSDN LQLPELKQKSSNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPDSLEVEGYTVDVKNKR TFLSPWISNIHEKKGLTKYKSSPEKWSTASDPYSDFEKVTGRIDKNVSPE ARHPLVAAYPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHT SEVHGNAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTWAETM GLNTADTARLNANIRYVNTGTAPIYNVLPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQ LSQILAPNNYYPSKNLAPIALNAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRL DTDQVYGNIATYNFENGRVRVDTGSNWSEVLPQIQETTARIIFNGKDLNL VERRIAAVNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPNGNLQYQGKDITEF DFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKRFHYDR NNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE GLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYA VTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG

(SEQ ID NO：1)。

SEQ ID NO：1是rPA102的氨基酸序列，其从质粒pPA102表达。在rPA102从炭疽杆菌ΔSterne-1(pPA102)CR4分泌到细胞外间隙内的期间，前29个氨基酸(信号肽)被除去，得到735个氨基酸的成熟rPA蛋白(82,674Da)。对成熟rPA序列加下划线(SEQ ID NO：2)。

rPA102氨基酸序列只是在本发明的范围内的一种具体炭疽蛋白的一个实例。来自多种炭疽菌株的PA蛋白(包括天然蛋白质)的其它氨基酸序列为本领域中已知的并且包括例如以下GenBank登记号：NP_652920.1、ZP_02937261.1、ZP_02900013.1、ZP_02880951.1，将其以引用的方式并入。还已知PA中用于降低其毒性或改善其表达特征的多种片段、突变和修饰，如在本说明书中别处所述的那些，多种融合蛋白也是如此。除非上下文或文本中明确表明排除那些形式，否则那些片段、突变体和融合蛋白包括于术语“PA”中。当有指示时，PA片段、突变体和融合蛋白(无论具有全长PA或PA片段)是在毒素中和分析(TNA)中活性的引发抗血清的那些。

本文所用的“温度稳定性”、“稳定”或“稳定性”是指在冷冻/解冻循环之后明矾凝胶的稳定性和疫苗的效力。本文所用的稳定疫苗是与保持在2-8℃之间的相当的液体疫苗相比，在冷冻/解冻循环之后显示活性和/或效力和/或明矾凝胶塌缩和/或粒子聚集不降低或者降低极少的疫苗。可使用本文所述的分析中的任一种或多种来测量稳定性，包括工作实施例，以及在本领域中已知的用于测量活性、效力和/或肽降解的分析。

在某些实施方案中，可通过计算50％中和因子(NF50)来测量抗原或疫苗例如保护性抗原的免疫原性。可基于来自给定数目的数据点的NF50值来计算疫苗制剂的NF50的几何平均数(几何平均值或<NF50>gm)。在某些实施方案中，通过使用来自标准毒素中和分析(TNA)(Hering等，Biologicals 32(2004)17-27；Omland等，Clinical andVaccine Immunology(2008)946-953；和Li等，Journal of ImmunologicalMethods(2008)333：89-106)的血清样本，例如来自免疫小鼠或兔的血清测定NF50和/或几何平均值。使得毒素50％中和的血清稀释度是“ED50”。由参考血清的ED50和测试血清的ED50的商计算每一测试血清相对于参考血清的中和能力(50％中和因子或者NF50，也称作中和比率)，即如下计算中和因子NF50：

在某些实施方案中，可使用T检验或者单因素ANOVA以比较在95％置信水平下来自不同制剂的NF50的几何平均数。在一个实施方案中，如果NF50几何平均值的p值大于0.05，那么在制剂间，NF50没有显著差异。在另一实施方案中，如果p值小于0.05，那么在制剂间几何平均数NF50相互显著不同。

由小鼠效力分析实验进行的中和因子(NF50)计算显示，NF50值且因此效力与明矾凝胶塌缩相关。因此，可通过观察和测量已经在-80℃下冷冻过夜，接着允许在室温下解冻的疫苗的明矾凝胶来评估稳定性。与对照疫苗(仅存放在2-8℃下的相同组合物)相比，稳定的疫苗显示极少至无的明矾凝胶塌缩。可测量明矾凝胶高度并且可测定在冷冻/解冻样本和2-8℃对照物之间的差异％。在一个实施方案中，约小于1％、2％、3％、5％、8％、10％或12％的差异表明疫苗稳定。

也可通过在冷冻之后分析组合物的完整蛋白质(例如与明矾一起完整的rPA)或相反地解吸附的蛋白质(例如从明矾解吸附的rPA)来评估稳定性。例如，可通过ELISA通过分析和表征游离rPA102(释放)来测定稳定性；通过例如差示扫描量热法和固有荧光来测定蛋白质结构；通过A₂₈₀来测定解吸附的游离蛋白质；通过SDS-PAGE、SEC和或RP-HPLC来测定纯度和骨架降解；通过IEX或等电位聚焦来测定电荷变化；并且通过小噬细胞溶解分析(MLA)来测定生化活性。

在一个实施方案中，温度稳定性疫苗是在暴露于冷冻/解冻条件之后的疫苗(例如冷冻疫苗或冻干疫苗)，显示与存放在约2-8℃下的相当的液体疫苗相同，或者至少约98％、至少约95％、至少约93％、至少约90％、至少约88％或至少约85％相同的效力。在一个实施方案中，将炭疽小鼠效力分析用于测定冷冻或冻干的疫苗是否是强效的。

在一些实施方案中，组合物在以冻干形式在40℃下存放至少1个月之后保持至少80％、至少90％或至少95％免疫原性。

本发明的疫苗是温度稳定性疫苗。本发明的制剂稳定所在的温度通常低于约30℃，但是可以高于30℃、35℃、40℃、45℃或50℃。在一些实施方案中，制剂的稳定性与低于约25℃、约20℃、约15℃、约10℃、约8℃、约5℃、约4℃或约2℃的温度有关。因此，在一些实施方案中，温度在25℃至约-10℃、约20℃至约-10℃、约15℃至约-10℃、约10℃至约-10℃、约8℃至约-10℃、约5℃至约-10℃、约15℃至约-5℃、约10℃至约-5℃、约8℃至约-5℃和约5℃至约-5℃的范围内。

实施例章节描述多种用于测定稳定性的方法。在一些实施方案中，与仅新鲜和/或5℃存放的相同样本相比，本发明的疫苗在冷冻解冻之后没有示出稳定性有统计上显著的降低。在一些实施方案中，与在5℃下存放1、2、3、4、5、6、912、18、24、30、36、42、48、54或60个月相比，本发明的疫苗在-80℃、-20℃、25℃、40℃和/或50℃下存放相同时间段之后没有示出稳定性、免疫原性、效力或其任何组合有统计上显著的降低。

在一些实施方案中，通过小噬细胞溶解分析(MLA)、尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)和/或阴离子交换色谱(AEX-HPLC)测量组合物的稳定性。

在一些实施方案中，组合物在以冻干形式在50℃下存放至少4个月之后保持至少80％、至少90％或至少95％的纯度。

本发明的疫苗组合物含有吸附于铝佐剂(明矾)的抗原和稳定化所述制剂必要量的糖。例如，当与已经维持在2-8℃之间和/或显示极少至无明矾凝胶塌缩的类似液体疫苗相比时，本文所公开的疫苗制剂在暴露于冷冻/解冻条件之后显示极少至无效力降低。

铝佐剂(明矾)可为例如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。在一个实施方案中，佐剂是氢氧化铝(例如ALHYDROGEL)。铝的量可改变相当多，而对明矾凝胶的稳定性没有明显影响(换句话说，增大组合物中明矾的量不会提高明矾凝胶塌缩的可能性)。在本发明的一个实施方案中，疫苗组合物包含约1-10mg/ml氢氧化铝。在另一实施方案中，组合物包含约1.5至5mg/ml氢氧化铝。在另一实施方案中，疫苗组合物包含约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5mg/ml氢氧化铝。

据信本发明的稳定疫苗组合物可用以稳定化与明矾一起配制的任何抗原。例如，抗原可为炭疽杆菌重组型保护性抗原(rPA)或来自无毒力炭疽杆菌菌株如V770-NP1-R(例如炭疽吸附疫苗)的无细胞滤液。

例如在颁予Park和Giri的美国专利号7,201,912、颁予Ivins等的美国专利号6,387,665、颁予Worsham等的美国专利号6,316,006和颁予Leppla等的美国专利号7,261,900(其各自以引用的方式整体并入)中描述了表达炭疽杆菌蛋白，包括PA(以及片段、突变体和融合蛋白)的方法。例如，如美国专利号7,201,912中所述，pBP103是全长野生型rPA的表达载体。来自pBP103的PA序列与野生型PA同一。

本发明的一些实施方案包括包含在炭疽杆菌中表达(包括在形成孢子或不形成孢子的炭疽杆菌菌株或该两者中表达)的PA的制剂。例如，PA可来源于不形成孢子的炭疽杆菌菌株ΔSterne-1(pPA102)CR4(即rPA102)。参见例如都颁予Ivins等的美国专利号6,316,006和美国专利号6,387,665(其各自以引用的方式整体并入本文中)。一些本发明的组合物包含来自无毒力炭疽杆菌菌株V770-NP1-R的PA。

本发明的制剂也可以包括由异源生物体表达的炭疽杆菌PA。例如，本发明包括在大肠杆菌中表达的PA。

另外，还已经描述了多种PA片段、突变体和融合蛋白并且其可用于目前的制剂中。例如，可以对PA进行修饰以使其缺乏功能性结合位点，从而防止PA结合于天然PA所结合的炭疽毒素受体(ATR)(参见Bradley，K.A.，Nature(2001)414：225-229)或者结合于天然LF。举例来说，在结构域4的氨基酸残基315-735内部或附近或氨基酸残基596-735内部或附近进行修饰可以使PA不能结合于ATR。或者(或另外)，在大多数全长PA序列中见于残基163-168处或其周围的PA弗林蛋白酶裂解位点“RKKR”(SEQ ID NO：3)可以通过在弗林蛋白酶裂解位点内部或附近进行缺失、插入或取代而失活。例如，天然PA的所有弗林蛋白酶裂解位点残基都可以缺失。其它突变PA包括二肽Phe-Phe已经修饰以使PA对糜蛋白酶具有抗性的那些。PA片段或PA融合蛋白也可以是PA突变体。

PA片段的特定实例包括美国专利号7,201,912中的那些，例如，由pBP111表达的PA64、由pBP113表达的PA47，由pBP115表达的PA27。那些片段中的一些也可以包括突变以例如消除弗林蛋白酶裂解位点RKK(SEQ ID NO：3)或通过二肽序列Phe-Phe(FF)形成的糜蛋白酶敏感位点。另外，片段可以在N端包括一或两个其它氨基酸。涉及PA的融合蛋白的实例包括美国专利号7,201,912中的那些，例如由质粒pBP107、pBP108和pBP109表达的PA-LF融合蛋白。本发明还包括包含HIS-标签PA的制剂。然而当使用片段、突变体或融合蛋白时，通常需要所述片段、突变体或融合蛋白在小鼠、豚鼠或兔中的一个或多个中引发针对用例如Ames菌株的炭疽孢子的LD₅₀产生的攻击的保护性免疫。

可使用来自重组型来源和/或非重组型来源的PA并且本发明的制剂会提高这些制备物的稳定性。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含约75至750μg/ml、100至500μg/ml、100至250μg/ml、100至750μg/ml或250至750μg/ml抗原，例如rPA。例如，本发明包括包含约150、200、250、300、350、400、450和500μg/ml抗原例如rPA的疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含约175μg抗原(例如rPA)/1500μg氢氧化铝。在一些实施方案中，疫苗包含约200μg/ml抗原(例如rPA)和约0.5mg/ml氢氧化铝。在其它实施方案中，疫苗包含约250μg抗原(例如rPA)/100至250μg氢氧化铝。在一些实施方案中，抗原是炭疽抗原，如保护性抗原。在一些实施方案中，保护性抗原与SEQ ID NO：2的多肽具有至少约80％的同一性。一些本发明的组合物包含约150-500μg/ml保护性抗原或约150、175、200、225、250、275、300、325、400、375、400、425、450、475或500μg/ml保护性抗原。

在一些实施方案中，本发明的组合物含有约0.5至1.5mg/ml氢氧化铝。在一些实施方案中，组合物含有约0.5mg/ml或约1.5mg/ml氢氧化铝。

在一些实施方案中，铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。

本发明的炭疽疫苗无论是包含rPA或来自无毒力炭疽杆菌菌株的无细胞滤液的疫苗，都可向暴露于炭疽杆菌前或暴露于炭疽杆菌后的受试者施用。当暴露后施用时，疫苗可以结合抗生素施用。

在另一实施方案中，抗原是基于蛋白质(例如重组型)的抗原，其选自乙型肝炎保护性抗原、肉毒梭菌神经毒素蛋白、单纯疱疹病毒抗原、流感抗原、先天性巨细胞病毒抗原、结核抗原、HIV抗原、白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原、葡萄球菌肠毒素B(SEB)和鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)保护性抗原和F1-V融合蛋白。抗原可源于例如乳头状瘤病毒(例如HPV)、流感、疱疹病毒、肝炎病毒(例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)、A、B和C型脑膜炎球菌、B型嗜血杆菌属流感(HIB)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链球菌属(Streptococcus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌。

本发明的疫苗可在-80℃下耐受冷冻过夜而无效力损失或明矾凝胶塌缩。本发明包括冷冻的液体疫苗以及冻干疫苗(本文中也称为冻结干燥的疫苗)。如本文所公开，冻干工艺包括液体组合物冷冻。接着对冷冻组合物进行冷冻下升华。对于冻干疫苗，所公开的疫苗组分和量意指接着受到冷冻的液体组合物而未必是干燥冻干饼或复原疫苗中的用量。由于干燥工艺，因此最终的冻干疫苗饼(干燥组合物)可以含有不同百分比的组分。

本发明提供将疫苗冻干的方法，其包括(i)冷冻本发明的组合物和(ii)使冷冻的组合物升华。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含约20％或更多的玻璃成型剂如糖。在一个实施方案中，玻璃成型剂是还原糖，在一个实施方案中，疫苗包含非还原糖如海藻糖或蔗糖。在一个实施方案中，玻璃成型剂是海藻糖或蔗糖。如果将疫苗冻干，那么可能优选的是在冻干之前使用不超过约40％的糖，因此疫苗形成饼状组合物。例如在冻干之前，疫苗可以包含约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％或40％糖。在一个实施方案中，例如在冻干之前，疫苗组合物包含约10-40％、10-35％、10-30％、10-25％、10-20％、35-40％、30-40％、25-40％、20-40％、15-40％、20-30％、20-25％、25-30％、25-35％、21-40％、21-35％、21-30％21-25％或大于10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％或36％(w/v)糖。在一些实施方案中，例如在冻干之前，组合物含有大于约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％(w/v)糖。

如本文所公开，本发明的发明人已经鉴别出包含至少约20％海藻糖或蔗糖的明矾疫苗组合物可耐受冷冻/解冻条件。当添加某些其它稳定剂(例如表面活性剂和/或氨基酸)和/或将本文所公开的工艺改进并入(例如增大冷冻速率、冷冻悬浮粒子)时，可将糖量减至约15％(w/v)或甚至约10％(w/v)而不影响疫苗效力。

在本发明的一个实施方案中，例如在冻干之前，包含吸附于铝佐剂的抗原和糖(例如15％w/v或更多)的疫苗组合物也含有增溶剂如表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂是非离子洗涤剂如聚山梨醇酯80(80)。在一个实施方案中，疫苗组合物包含在约0.001％和约0.05％之间的表面活性剂(如聚山梨醇酯80)。在一个实施方案中，组合物包含约0.020％、约0.025％或约0.020％至0.025％(w/v)表面活性剂(如聚山梨醇酯80)。可使用的其它表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20、普洛尼克L68(pluronic L68)、聚氧乙烯9-10壬基酚(Triton^TM N-101，辛基酚9)、Triton^TM X-100和脱氧胆酸钠。在一个实施方案中，在制造过程期间除去表面活性剂，因此最终药品中不存在表面活性剂。在一个实施方案中，在例如冻干工艺的冷冻期间存在表面活性剂。在一些实施方案中，本发明的制剂不包含表面活性剂。

本发明人已经发现，如果例如在冷冻和/或冻干之前将氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和脯氨酸)添加到组合物中，那么可以将糖的百分比减至多达约10％(w/v)而对效力有极少至无影响和/或有极少至无明矾凝胶塌缩。添加到疫苗组合物中的氨基酸的量可改变。在一个实施方案中，疫苗组合物包含0.5％至约15％(w/v)的氨基酸或氨基酸组合。在一个实施方案中，疫苗组合物包含约2-10％(w/v)的氨基酸或氨基酸组合。在本发明的一个实施方案中，疫苗包含约2％精氨酸或丙氨酸。在本发明的另一实施方案中，疫苗包含约10％甘氨酸。在一些实施方案中，疫苗组合物包含约2-10％、2-8％、2-6％、2-4％、2-3％、3-10％、5-10％、7-10％、2.5-5％、3-5％、3-7％或4-6％(w/v)氨基酸或氨基酸组合。在一些实施方案中，存在两种、三种或更多种氨基酸，如选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和/或精氨酸。在一些实施方案中，组合物含有约0.5-4％、1-4％、1.5-4％、2-4％、2.5-4％、3-4％、3.5-4％、0.5-1％、0.5-1.5％、0.5-2％、0.5-2.5％、0.5-3％、0.5-3.5％、0.5-4％、1-3％、1-2％、2-3％或1.5-2.5％(w/v)丙氨酸或精氨酸。在一些实施方案中，组合物含有约2％、1.75％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％或4％(w/v)丙氨酸或精氨酸。在一些实施方案中，组合物含有约6-12％、7-12％、8-12％、9-12％、10-12％、11-12％、6-11％、6-10％、6-9％、6-8％、6-7％、7-11％、8-10％、7-10％、11-9％、7-8％、8-9％或9-10％(w/v)甘氨酸。在一些实施方案中，组合物含有约6％、7％、8％、9％、10％、11％或12％(w/v)甘氨酸，在一些实施方案中，所述氨基酸浓度是在冷冻和/或冻干之前的。

在一些实施方案中，制剂不包含氨基酸溶液或不含有除作为多肽抗原的部分的氨基酸以外的氨基酸。

在一些实施方案中，所述制剂进一步包含一种或多种其它成分。例如，制剂可以包括一种或多种盐，如氯化钠、磷酸钠或其组合。一般来说，制剂中存在的每种盐为约10mM至约200mM。

疫苗制剂可以含有缓冲液如20mM TRIS-HCL。也可以改变制剂的pH值。一般来说，其在约pH 6.2至约pH 8.0之间。在一个实施方案中，疫苗的pH值为约7.4。

在另一实施方案中，制剂进一步包含糖醇如山梨醇。在一个实施方案中，制剂包含0.25％山梨醇。

在一些实施方案中，本发明的组合物和疫苗制剂可以含有其它佐剂，例如免疫刺激序列(ImmunoStimulatory Sequences；ISS，CpG)和磷酸钙。对于ISS，通常在最终蛋白质浓度50μg/ml下使用蛋白质样本。佐剂的其它非限制性实例包括但不限于：CGP7909(例如参见美国专利号7,223,741，其以引用的方式整体并入本文中)、CpG1018(参见例如2010/0183675，其以引用的方式整体并入本文中)、葡萄哌喃糖基脂质佐剂(GLA)、PolyI PolyC(PIPC)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为降MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19840A，称为MTP-PE)，和RIBI，其含有三种从细菌提取的组分，即含单磷酰基脂质A、海藻糖二梅菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)的2％角鯊烯/TWEEN 80乳液。

本发明包括包含以下制剂的组合物：0.15mg/mL抗原、1.5mg/mL铝、20％海藻糖、2％丙氨酸和0.025％表面活性剂；0.5mg/mL抗原、5mg/mL铝、20％海藻糖、2％丙氨酸和0.025％表面活性剂；0.5mg/mL抗原、5mg/mL铝、20％海藻糖、1％蔗糖、2％丙氨酸和0.025％表面活性剂；和0.5mg/mL抗原、5mg/mL铝、20％海藻糖、2％丙氨酸和0.025％表面活性剂。在一些实施方案中，这些制剂中的抗原和/或表面活性剂分别是PA和80。在一些实施方案中，本发明的组合物包含5mM NaPi(pH 7.0)缓冲液或20mM Tris(pH 7.4)。实施例中描述了本发明中包括的其它组合物。

可制备本发明的疫苗以用作注射剂。组合物可为温度稳定性液体制剂(例如可耐受冷冻/解冻循环)或冷冻组合物。所述组合物也可以用来制造可在施用之前例如用药学上可接受的载剂复原的冻干干粉疫苗。通常通过常规途径例如静脉内、皮下、腹膜内或经粘膜途径施用疫苗。可以通过非经肠注射，例如皮下或肌肉内注射来施用。

在一些实施方案中，对本发明的组合物进行冷冻，接着在真空下升华以制造冻干组合物。

术语“复原”是指使冻干形式恢复到液体形式，例如通过将之前为了保存和/或存放而改变的物质再水合，例如将已经存放的本申请的冻干rPA制剂恢复到液态而实现。可在产生适用于施用的稳定水溶液的任何水溶液中复原本申请的冻干组合物。这种水溶液包括但不限于无菌水、TE(Tris EDTA)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲液或生理盐水。可用比用于冻干样本更低、相同或更高的体积复原冻干样本。

应了解，可根据多种相关因素，包括待治疗病状、所选施用途径、个别患者的年龄、性别和体重以及患者症状的严重度来确定复原的本申请的冻干疫苗制剂的剂量，并且可用单次剂量、分次剂量或多次剂量施用。

以与剂量制剂相容的方式并且以将预防和/或治疗有效的量施用疫苗。施用量取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统合成抗体的能力和所需的保护程度，其通常在每剂5μg至500μg抗原的范围内。在一个实施方案中，疫苗包含至少约10μg PA、25μg PA、50μg PA、75μg PA、100μg PA、125μg PA、150μg PA、200μg PA、225μg PA、250μg、275μg、300μg PA。抗原的精确量取决于待递送的抗原。

可以以单次剂量时程或任选地以多次剂量时程给予疫苗。可以例如以0.5mL剂量施用疫苗组合物。对于暴露前预防，在多次剂量时程中，初级接种过程可以有1-6个独立剂量，继之以在后续时间间隔下给予用于维持和或加强免疫反应的其它剂量，例如在1-4个月时的第二剂，以及需要时在几个月之后的后续剂量。

对于暴露后预防，疫苗也可以根据单次剂量或多次剂量方案进行施用。例如，在一个实施方案中，在暴露后0、2和4周的时间分3剂施用疫苗。给药方案还将至少部分地根据个体需要、从业者判断和/或测试结果，例如对疫苗/抗原的免疫反应的测量水平如针对抗原的抗体水平和/或T-细胞活性来确定。

另外，含有免疫原性抗原的疫苗可以结合其它免疫调节剂，例如免疫球蛋白、抗生素、介白素(例如IL-2、IL-12)和/或细胞因子(例如IFN-β、IFN-α)施用。

在一个实施方案中，向对炭疽暴露后的受试者施用疫苗。在本实施方案中，可以与抗生素结合施用疫苗。可以与疫苗一起施用的抗生素包括但不限于青霉素(penicillin)、多西环素(doxycycline)和环丙沙星(ciprofloxacin)。

本发明包括治疗(暴露后预防)或预防(暴露前预防)炭疽感染的方法，其包括向受试者施用药学上有效量的本发明的疫苗。在一个实施方案中，炭疽感染是吸入性炭疽(吸入炭疽)的后果。如本文所用，疫苗的药学上有效量是诱导免疫反应的量。在一个实施方案中，疫苗的药学上有效量是包含至少25μg PA的量。如本文所用，受试者是哺乳动物，如人。

本发明还提供通过向受试者施用足以刺激免疫反应的量的本发明疫苗而在受试者体内刺激免疫反应的方法。在一个实施方案中，通过增大对疫苗中的抗原有特异性的抗体效价来测量免疫刺激。在其它实施方案中，通过对疫苗中的抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞中增大的频率来测量免疫刺激。

还提供针对病原体对受试者接种的方法，其包括施用本发明的组合物。另外提供针对病原体对受试者接种的方法，其包括向受试者施用从本发明的冻干组合物复原的药物组合物。本发明进一步包括制造强效基于明矾的冷冻疫苗的方法，其包括悬浮包含至少约10％、至少15％、至少20％、至少21％、至少25％或至少约30％糖和吸附于铝佐剂的抗原的组合物以及以足以在发生沉降之前冷冻所述悬浮组合物的速率冷冻所述组合物，例如急骤冷冻。

本发明的一些实施方案提供制备稳定冻干组合物的方法，其包括冻干本发明的组合物，其中通过小噬细胞溶解分析(MLA)、尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)和/或阴离子交换色谱(AEX-HPLC)测量复原的冻干组合物的稳定性。

对于炭疽疫苗，可如多个实施例中所述测试制剂的免疫原性。例如，可用例如10μg、20μg或更多的悬浮于佐剂乳液中rPA使小鼠免疫。用在佐剂中乳化的盐水使对照小鼠免疫以用作阴性对照物。通常将小鼠免疫，接着以多个间隔，例如在免疫后第0天、第21天和第28天放血。接着例如通过ELISA分析血清的特异性抗体的存在，所述ELISA也可用于测定抗血清的效价。

也可使用小鼠毒素中和抗体分析以测定炭疽疫苗制剂是否引发保护性抗体。在这个分析中，接着用2个致命剂量的致死毒素(PA和致死因子(LF))腹膜内攻击用rPA免疫的小鼠。在攻击之后四天，对小鼠进行存活者评分。

rPA制剂也可用于制备包含与炭疽毒素免疫反应的中和抗体的组合物。所得的抗血清可用于制造用于治疗炭疽暴露的药物。在本发明的一个实施方案中，抗体组合物包含纯化的抗PA抗体。“纯化的”意谓抗体基本上不含与其天然缔合的其它生物材料。本发明的纯化的抗体为至少60重量％纯、至少70重量％纯、至少80重量％纯、至少90重量％纯或至少95重量％纯。抗血清或从抗血清纯化的抗体也可用作检测PA片段或者天然蛋白质的诊断剂。

通过增大冷冻速率将本发明的冷冻和冻干制剂制造成具有增大的效力。在一个实施方案中，将制剂急骤冷冻。

也可通过冷冻悬浮而非沉降的组合物来增大效力。可通过轻微震荡来悬浮组合物并且将其立即冷冻。

由以下实施例进一步阐明本发明，所述实施例旨在纯粹地例示本发明而决不限制本发明。

实施例1：有和无海藻糖的液体rPA和AVA疫苗的冷冻/解冻

如下表1中所概述制备有和无海藻糖的rPA102疫苗制剂。

表1.用于冷冻/解冻分析的海藻糖制剂

在混配之后，将每一样本在10ml玻璃管中分成两个8ml等分试样。对于每一样本，将一管在轻微混合过夜之后放在-80℃下并且将另一管在轻微混合过夜之后放在2-8℃下。

次日将在-80℃下存放过夜的样本在实验室工作台上解冻数小时(＞3-4小时)，随后观察并且与变成室温的2-8℃样本比较。对样本拍照并且测量总的液体高度和ALHYDROGEL(氢氧化铝)高度。比较冷冻/解冻前后的常规的rPA102疫苗。图1是将在2-8℃下的rPA对照1样本(标记为5℃)与-80℃样本在解冻之后相比的照片。所述照片示出了经受冷冻/解冻条件的rPA对照1样本中的明矾凝胶显著塌缩。测试保护rPA102不受冷冻/解冻应激的常规制剂中的糖水平。如图1中所示，冷冻破坏的rPA102疫苗和效力(MRPT)数据与生理化学和凝胶高度(塌缩)相关。图2是将在2-8℃下的rPA测试1样本(标记为5℃)与-80℃样本在解冻之后相比的照片。解冻的rPA测试1样本中的明矾没有明显的塌缩。表2提供相对明矾高度％的概述。

表2.相对明矾高度％

制剂	5℃	-80℃
			rPA对照1	100％	32.6％
rPA测试1	100％	101.5％

用含有15％海藻糖、0.15mg rPA/mL、2％丙氨酸、0.025％聚山梨醇酯80、25mM NaPi(pH 7.4)的测试组合物进行类似的冷冻/解冻实验，与无15％海藻糖的对照制剂相比，得到类似的结果(数据未示出)。

将一小瓶(炭疽吸附疫苗)、AVA和一小瓶AVA+25％海藻糖在轻微混合之后放到-80℃下。将第二小瓶BioThrax和第二小瓶AVA+25％海藻糖在轻微混合之后放在2-8℃下过夜。次日，使-80℃小瓶解冻并且检查所有小瓶。铝凝胶高度看似与存放在2-8℃下的BioThrax和两个含有25％海藻糖的AVA样本大约相同。铝凝胶高度比存放在-80℃下的BioTlirax(无海藻糖)低得多。(数据未示出)。

实施例2：有和无蔗糖的液体rPA疫苗的冷冻/解冻

如下表3中所概述制备有和无蔗糖的rPA102疫苗制剂。

表3.用于冷冻/解冻分析的蔗糖制剂

在混配之后，将每一样本在10ml玻璃管中分成两个10ml等分试样。对于每一样本，将一管在轻微混合过夜之后放在-80℃下并且将另一管在轻微混合过夜之后放在2-8℃下。

次日将在-80℃下存放过夜的样本在实验室工作台上解冻2-3小时，随后进行观察。图3含有来自2-8℃(标记为5℃)和-80℃的每一制剂在都达到室温之后的照片。如所示，与仍冷藏在2-8℃下的样本相比，在解冻之后，在两个-80℃样本(rPA对照2和rPA测试2)中都发生凝胶塌缩。然而，在不包括蔗糖的rPA对照2样本中凝胶塌缩的量明显更大。

实施例3：体内小鼠效力分析

如表4中所概述制备冻干疫苗。用注射用水将经过干燥的疫苗复原至最终rPA浓度0.15mg/ml(75μg/0.5ml剂量)，接着在生理盐水中稀释10倍以得到0.1(DL)的剂量水平。

将5-8周龄并且重20-25克的雌性CD-1小鼠各自用于本研究中。将0.1DL疫苗(0.5ml)腹膜内注入20只雌性CD-1小鼠的组中，并且在第28天收集血清以便在小鼠中在毒素中和分析(TNA)中评估其中和炭疽LT细胞毒性的能力。

表4.用于小鼠效力分析的冻干制剂

通过计算中和因子(NF50)研究rPA102制剂的免疫原性。中和因子NF50定义如下：

其中通过使用存放在-20℃或低于-20℃下的合格血清参考标准来制备有效剂量50％(ED50)参考标准。

基于来自20只小鼠的20个NF50值计算每一疫苗制剂的NF50的几何平均数(几何平均值)。将T检验或单因素ANOVA用于在95％置信水平比较每一制剂的NF50的几何平均数。如果几何平均数NF50的p值大于0.05，那么在制剂间NF50(效力)没有显著差异。如果p值小于0.05，那么制剂的几何平均数NF50相互显著不同。

对照物(2号冻干物)是无稳定剂的rPA102制剂(0.15mg/ml rPA、1.5mg/ml铝、20mM Tris-HCL，pH 7.4)。图4中示出对于常规rPA102制剂，冷冻对来自相对小鼠效力分析的NF50几何平均值的影响。对照制剂对冷冻/解冻破坏敏感，在冻结过程之后免疫原性显著下降(图4)。免疫原性的下降对应于溶液中铝凝胶高度的降低。

相对于3号和4号冻干样本(其分别含有30％和20％海藻糖)，1号和2号冻干样本示出显著更低的免疫原性效力。图7中的NF50几何平均值结果示出了制剂中糖对rPA102疫苗冻干的影响。1号冻干样本(10％糖)不能保护rPA102免受冷冻干燥应激(参见图7)。这些结果示出20％和30％糖能够保护rPA102免受冻干应激。凝胶塌缩的出现与效力损失相关。

从另外两个不同之处仅在于不存在或存在海藻糖的制剂确定NF50反应：1)号：0.15mg/mL rPA、1.5mg/mL明矾、2％精氨酸、0.025％TWEEN 80(聚山梨醇酯80)、20mM Tris-HCL(pH 7.4)以及2号和3)号：0.15mg/mL rPA、1.5mg/mL明矾、20％海藻糖、2％海藻糖、0.025％TWEEN 80(聚山梨醇酯80)、20mM Tris-HCL(pH 7.4)，并且图5中示出在冷冻之前糖对rPA102的几何平均值的影响。在图5中，2号和3号制剂组仅是相同制剂的不同小瓶。添加海藻糖对制剂的免疫原性没有影响，如由有和无糖并且不冷冻的两种制剂(3个样本)的NF50没有统计变化所证明(图5)。图6中示出在这些含有海藻糖的制剂冷冻前后几何平均值的比较。当使用这种制剂时，在冷冻前后免疫原性(NF50)没有统计上显著的变化(图6)。另外，这种制剂在冷冻之后明矾凝胶没有塌缩(凝胶高度得到维持)(图6中的照片)。这些结果显示，含20％海藻糖的测试制剂会保护这种rPA疫苗免受冷冻/解冻应激。

实施例4：兔免疫原性和稳定性研究

在新西兰白(NZW)兔中使用毒素中和抗体分析(TNA)将在5℃和50℃下存放4个月的重组型保护性抗原(rPA)冻干疫苗制剂的免疫原性与炭疽吸附疫苗(AVA)()相比。这种兔免疫原性研究利用两种免疫时程(第0天和第28天)，并且在第-1或0、14、21、28、35、42、56和70天采血。

使用表5中所示的成分来制备rPA冻干疫苗。在冻干之前且在复原之后将最终制剂的成分共混，如表5中所示。简言之，将2mL悬浮液装在10mL玻璃小瓶中。使用VirTis AdVantage冻干器进行冻干。在冻干之后，将疫苗存放在5℃和50℃下。

表5.rPA制剂

具体来说，制备储备溶液并且(除TWEEN 80和NaCl以外)使用0.1N NaOH和/或0.1N HCl将pH值调节到7.4。在制备储备溶液之后，在200mL Nalgene瓶中制备150mL以下制剂共混物：0.5mg/mLrPA、5.0mg/mL铝、30％海藻糖(w/v)、0.25％山梨醇(w/v)、1％精氨酸(w/v)、0.025％TWEEN 80、75mm NaCl、20mM Tris-HCl(pH 7.4)，将其用于与2mL制剂共混物一起装在10mL小瓶中。

在装在小瓶中之后，使用VirTis AdVantage冻干器，用以下程序干燥样本：

初始冷冻：

干燥：

后干燥：

如表6中所述存放小瓶。在免疫当天，将6.11mL无菌注射用水添加到每一小瓶中以使冻干样本复原。上下颠倒地混合小瓶直到所有制剂组分都完全溶解为止。在无菌生理盐水中制备每一测试和对照物品的稀释物(1∶4、1∶16和1∶64)。

将NZW兔用于本研究。NZW兔常用作炭疽杆菌疾病的动物模型以测试毒性、免疫原性和功效，并且将NZW兔视为充分表征的模型，因为其具有与人中所见类似的发病机制和临床呈现(EK Leffel等，Clin Vaccine Immunol.19(18)：1158-1164，2012；AJ Phipps等，MicrobiolMol Biol Rev.68(4)：617-29，2004)。在第0天和第28天，使每一组NZW兔(每个疫苗组10只)接受冻干rPA疫苗制剂或AVA的具有1∶4、1∶16和1∶64稀释度的0.5mL肌肉内注射。AVA()是包括83kDa保护性抗原蛋白的液体炭疽疫苗，并且用1.2mg/mL铝(以含氢氧化铝的0.85％氯化钠的形式添加)、25mg/mL苄索氯铵和100mg/mL甲醛(添加作为防腐剂)来配制。

在第-1或0、14、21、28、35、42、56天并且在第70天结束之前收集血清样本。通过使用在第-1或0、14、35和42天收集的血清来进行TNA分析。表6概括了研究设计。

表6.兔免疫原性研究设计

TNA分析是一种功能测试，其评价使LF和PA的致命性炭疽杆菌毒素复合物(致死毒素，LT)失活所需的抗体的量。通过使用细胞毒性作为分析终点来将测试血清样本体外中和致死毒素的能力与标准血清样本的所述能力相比(PR Pittman等，Vaccine 24(17)：3654-60，2006)。

简言之，在烧瓶中在含有4.5g/升d-葡萄糖并且补充有10％热灭活牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、青霉素(50U/ml)、链霉素(50μg/ml)和0.11mM碳酸氢钠的杜贝可氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle media；DMEM)中培养J774A.1细胞48至72小时。收集细胞并且将其以30,000个细胞/孔接种在96孔组织培养板中，接着培育16至24小时。在独立的96孔微量滴定板中以2倍稀释度制备血清样本，每个样本总共七个稀释度。接着将血清样本与恒定浓度的LT(100ng/ml PA和80ng/ml LF)一起培育1小时。接着将血清样本与LT一起添加到含有细胞的组织培养板的相应孔中并且培育四小时，此后添加25μl/孔的5mg/ml四唑鎓盐3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)。在培育1小时之后，通过使用100μl/孔的pH值经使用HCl调节到4.7的酸化异丙醇(50％N，N-二甲基甲酰胺(含去离子水)和20％SDS(200g在l升50％二甲基甲酰胺中))溶解细胞。将分析板再培育16-24小时，在570和690nm下测量吸光度，其中使用经校正的Molecular Devices VersaMax PlateReader从570值减去690光学密度值。使用SoffMax Pro软件(5.4.1版，Sunnyvale，CA)确定ED50，ED50为在光学密度测量中在50％群体中产生数量效应的剂量。

使用小鼠参考血清(批号MS011211)的ED50来确定测试血清样本和阳性对照物的NF50值(NF50＝ED50测试/ED50参考)。通过用含有CPG 7909佐剂的AVA疫苗使300只小鼠免疫来制备小鼠参考标准。从所述300只小鼠收集血清，汇集并冷冻存放在-80℃下作为参考标准。表7A-C示出了分别来自第14、35和42天的血清样本的存放在5℃下的冻干rPA、存放在50℃下的冻干rPA和存放在5℃下的AVA对照物的平均动力学数据(NF50)的比较。

表7A.第14天平均动力学数据(NF50)的比较

表7B.第35天平均动力学数据(NF50)的比较

表7C.第42天平均动力学数据(NF50)的比较

NRS＝无反应者

在第0天，所有动物的毒素中和活性都测试为阴性。在所有三种剂量水平的所有三种测试疫苗的<NF50>都在第35天时达到最大含量(图8A-B、9A-B和10A-B)，显示rPA在所有三种剂量下皆具有与AVA类似或更好的免疫原性动力学。如图8A-B中所示，存放在5℃和50℃下的冻干rPA(1∶4稀释度)都具有高于AVA(1∶4稀释度)的<NF50>。类似地，在1∶16和1∶64的稀释度下，冻干rPA的<NF50>高于相当的AVA稀释度(参见图9A-B和10A-B)。

对于在第35天时的1∶4稀释度，发现存放在5℃和50℃下的冻干rPA的<NF50>几何平均值(gm)分别为3.14和2.98；并且在1∶4稀释度下的AVA的<NF50>gm为1.61。在存放在5℃相对于50℃下的冻干rPA制剂(1∶4)之间，<NF50>gm没有统计差异，p＝0.82(t检验)。发现组合数据(rPA lyo 5和50℃)的<NF50>gm是3.06；并且组合<NF50>gm在统计上高于AVA参考的组合<NF50>gm(1.61)，p＝0.034(t检验)。在第42天(1∶4)，在存放在5℃相对于50℃下的rPAlyo之间，<NF50>gm没有统计差异(分别为2.07和2.13)，p＝0.92(t检验)；并且发现组合<NF50>gm是2.10。2.10的组合<NF50>gm在统计上高于AVA参考的<NF50>gm(1.01)，p＝0.028(t检验)。

对于在第35天时的1∶16稀释度，发现存放在5℃和50℃下的冻干rPA的<NF50>gm分别为1.70和0.94。在存放在5℃和50℃下的rPA lyo之间，<NF50>gm没有统计差异，p＝0.081(t检验)。发现组合<NF50>gm为1.27，并且rPA lyo(5℃和50℃)和AVA参考(0.67)的组合<NF50>gm没有统计差异，p＝0.064(t检验)。在第42天(1∶16)，在存放在5℃相对于50℃下的rPA lyo之间，<NF50>gm没有统计差异(分别为1.08和0.57)，p＝0.071(t检验)；并且发现组合<NF50>gm是0.78。0.78的组合<NF50>gm在统计上高于AVA参考的<NF50>gm(0.40)，p＝0.05(t检验)。

对于在第35天时的1∶64稀释度，发现存放在5℃和50℃下的冻干rPA的<NF50>gm在统计上不同(分别为1.06和0.10)，p＝0.386(t检验)。发现组合<NF50>gm为0.13并且AVA参考为0.06。在第42天(1∶64)，在存放在5℃和50℃下的rPAlyo之间，<NF50>gm没有统计差异(分别为0.11和0.10)，p＝0.91(t检验)；并且发现组合<NF50>gm是0.11。在0.11的组合<NF50>gm和AVA参考的组合<NF50>gm(0.04)之间没有统计差异，p＝0.35(t检验)。

与在第35和42天时在三种稀释度(1∶4、1∶16和1∶64)下的AVA相比，存放在5℃和50℃下的冻干rPA的NF50的几何平均数(<NF50>gm)示于图11A-B、12A-B和13A-B中。

在第35天，发现存放在50℃下的冻干rPA疫苗的<NF50>gm在剂量1∶4、1∶16和1∶64下分别是2.98、0.94和0.1。在第35天，存放在5℃下的冻干rPA疫苗的<NF50>gm类似(分别为3.14、1.7和0.16)，与50℃(alph＝0.05)相比没有统计上显著的差异。在第42天发现类似的结果。这些数据显示在50℃下存放4个月的冻干rPA疫苗的免疫原性并不显著不同于存放在5℃下的冻干rPA疫苗。

在第35天，发现在剂量1∶4、1∶16和1∶64下，组合<NF50>gm(5℃和50℃)分别是3.06、1.27和0.1；并且在1∶4和1∶16下，与AVA相比，组合<NF50>gm的p值分别是p＝0.034和p＝0.064。发现组合<NF50>gm不低于(统计上高于或无差异)AVA的组合<NF50>gm。在第42天显示类似的结果。在第42天，1∶4、1∶16和1∶64的组合<NF50>值分别是2.10、0.78、0.11；并且在1∶4、1∶16和1∶64下，与AVA相比，组合<NF50>gm的p值分别是p＝0.92、p＝0.071和p＝0.91。这些免疫原性数据示出，在5℃和50℃下存放4个月的rPA冻干疫苗至少与AVA疫苗具有一样的免疫原性。

总之，这些结果示出所测试的冻干制剂能够使rPA疫苗在50℃下稳定至少4个月。数据显示，rPA冻干制剂与AVA疫苗相比具有优越的热稳定性概况。因此，结果示出rPA冻干制剂对rPA炭疽疫苗存放有效，并且所测试的制剂室温稳定并且能够规避冷链配送。

实施例5：豚鼠免疫原性研究

表8中概述了豚鼠免疫原性研究。

表8.豚鼠免疫原性研究设计

实施例6：小鼠中的免疫原性和生理化学稳定性

与液体rPA疫苗相比测试三种冻干rPA疫苗制剂的免疫原性和生理化学稳定性。通过巨噬细胞溶解分析(MLA)、尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)和阴离子交换色谱(AEX-HPLC)测量rPA疫苗的含量和纯度(生理化学稳定性性质)。通过用四个剂量水平对CD-1小鼠接种并测试小鼠血清中和炭疽毒素的能力(NF50)来评价rPA疫苗的免疫原性。

液体rPA疫苗制剂

在无菌条件下在0.15mg/mL rPA、1.5mg/mL明矾、2％丙氨酸、0.01％TWEEN 80、25mM NaPi(pH 7.0)下制备液体rPA制剂(F1)。用于稳定性分析的样本含有装在10mL玻璃小瓶中的5mL液体悬浮液(每个小瓶10剂)。在肌肉内注射情况下预期的人用剂量是每0.5mL有75μg rPA/750μg明矾。

冻干rPA疫苗制剂

制备三种冻干的rPA制剂。表9中示出在冻干之前的最终制剂。用0.15mg/mL rPA、1.5mg/mL明矾、20％海藻糖、2％Ala、0.025％Tw80和5mM NaPi(pH 7.0)配制第一批次(1yoA)。第二和第三批次(分别是lyoB和lyoC)含有高3.3倍的rPA和明矾浓度(分别是0.5mg/mL和5.0mg/mL)，糖、氨基酸和缓冲剂的变化微小，如表9中所示。

表9.在冻干之前共混的最终制剂的浓度

所有三种rPA冻干制剂经设计以使大多数rPA蛋白结合于明矾，而溶液中有极少或无游离rPA蛋白。将2mL液体悬浮液装到10mL玻璃小瓶中。使用FTSII，用以下处理参数进行冻干。

初始冷冻：

干燥：

后干：

在接种和测试之前，所有三种制剂都用注射用水(WFI)复原冻干样本以产生0.15mg/mL rPA和1.5mg/mL明矾的最终浓度。通过将1.55mL、6.2mL和6.18mL WFI分别添加到第一批(LyoA)、第二批(LyoB)和第三批(LyoC)的小瓶中来实现所述最终浓度。LyoA的每个小瓶的最终悬浮液体积是2.0mL并且批次LyoB和LyoC都是6.7mL。表10中示出rPA疫苗在复原之后的浓度。

表10.冻干rPA疫苗在复原之后的浓度

在批次LyoB和LyoC中，每个小瓶的剂量总数高于批次LyoA的剂量总数(13.3相对于4.0)。较高剂量的小瓶(如每个小瓶13.3剂)的制造成本显著低于较低剂量的小瓶(例如每个小瓶4剂)。因此，开发用于制造较高剂量的小瓶的制剂和方法是一种经济的优选项。

稳定性和测试分析

将rPA液体制剂(F1)放到处于5℃、25℃和40℃的存放温度的长期稳定性程序中。将三个rPA冻干批次(LyoA、LyoB和LyoC)放到处于5℃、25℃、40℃和50℃的存放温度的长期稳定性程序中。对液体(F1)和冻干rPA疫苗制剂都进行生理化学测试。收集样本四(4)个月的稳定性数据。

通过一系列分析，即MLA、SEC-HPLC和AEX-HPLC来评价rPA测试疫苗的生理化学性质。使用从明矾提取的rPA蛋白进行所有这些分析。提取程序利用200nM磷酸钾/0.01％Tw80/0.9％NaCl。

将存放在-80℃下的rPA原料药物质(BDS)用作参考对照物。BDS对照物从炭疽杆菌的ΔSterne-1(pPA102)CR4菌株纯化得到，所述菌株是由美国陆军传染病医学研究所(U.S.Army Medical Research Instituteof Infectious Diseases；USAMRIID)开发作为用于制造rPA的不产孢子的非产毒性表达系统。纯化rPA BDS并且将其在-80℃冷冻条件下存放在20mM Tris、0.9％NaCl(pH 7)中。

I.巨噬细胞溶解分析(MLA)

使用体外巨噬细胞溶解分析(MLA)以测定rPA对鼠类巨噬细胞细胞系J7774A.1的细胞毒性。MLA测量了rPA和rLF毒素的活性。所述分析涉及将rPA蛋白添加到致死因子蛋白(rLF)中以形成致死毒素复合物，所述复合物导致巨噬细胞的细胞膜形成孔，从而引起细胞溶解。

相对于BDS参考标准测量rPA冻干疫苗(使用从明矾解吸附的rPA)的活性，并且报告为参考标准的百分比。测定细胞存活毒素攻击的百分比。例如，rPA疫苗的100％MLA活性表示吸附于明矾并且在冻干之后的rPA没有损失细胞毒性活性。简言之，将小噬细胞以5×10⁴个细胞/孔接种在96孔板中并且将板放到CO₂培育箱中过夜。次日，将100ul连续稀释的rPA测试样本或rPA参考标准(起始rPA浓度为800ng/ml，接着经1∶2稀释降至0.8ng/mL)与rLF(rLF浓度恒定在100ng/ml)混合并且添加到孔中。四小时之后，将25ul 5mg/mL MTT(3-(4，5-二甲基噻唑2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)添加到每一孔中并且将板培育1.5小时。在培育1.5小时之后，将100ul可溶性溶液(含20％SDS的50％二甲基甲酰胺溶液)添加到孔中并且在37℃下培育所述板过夜。次日，通过读板仪在570nm下读取所述板并且使用软件(SoftMax)用4参数模型将OD读数作图。接着将测试样本rPA的ED50值与rPA参考标准的ED50值相比，并且使用其比率来报告rPA测试样本的相对活性。分析精度确定为+/-30％。

II.尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)

SEC-HPLC是一种用于基于蛋白质分子量和尺寸来分离蛋白质的色谱技术并且其常用于评估制剂中蛋白质的稳定性。较大的蛋白质典型地比较小的蛋白质在SEC柱中具有更短的停留时间(更快地洗脱出)。降解(或破碎)的蛋白质的尺寸将变得较小并较迟些从色谱洗脱出。反过来也如此，聚集的蛋白质将更快地洗脱。例如，尺寸增大的聚集的rPA蛋白的停留时间短于天然rPA蛋白，并且降解(在尺寸上分解)的rPA蛋白将具有更长的停留时间。

SEC-HPLC是一种常用于评估制剂中蛋白质的生理化学稳定性的分析。与MLA相比，SEC-HPLC一般来说相对更敏感并且更定量，在同一运行中，其在峰面积％方面的精度小于5％并且在停留时间方面的精度小于0.1％。

使用流动相为50mM磷酸钠/250mM氯化钾(pH 7.4)的TSKG3000SWXL柱(Tosoh BioScience P/N M1182-05M)进行SEC-HPLC。将在215nm下的紫外线(UV)检测器或在280nm(激发)和335nm(发射)下的荧光检测器用于检测。

III.阴离子交换色谱(AEX-HPLC)

AEX-HPLC基于蛋白质的净静电电荷来分离蛋白质。一般来说，所述分析涉及将rPA蛋白溶液注入配备有阴离子交换柱的HPLC。由于静电相互作用，因此阴离子交换(AEX)柱(固定相)会截留rPA蛋白。接着通过使用离子强度(NaCl浓度)逐渐增大的流动相洗脱出rPA蛋白。rPA分子洗脱所在的离子强度(或洗脱时间)与净电荷有关。

已知rPA分子对借助于脱酰胺机制的降解敏感(D′Souza，Journalof Pharmaceutical Sciences，102(2)：454-461，2013)，从而引起净电荷变化。由于天门酰胺残基转化成天门冬氨酸(更负)，因此脱酰胺会增加rPA蛋白的负电荷。与天然rPA蛋白相比，脱酰胺的rPA(典型地称为酸性物质)会在更高离子强度的溶液中洗脱并且洗脱时间更长。通过主峰％表征rPA的纯度。

使用Hamilton PRP-X500阴离子交换柱(P/N 79641)，使用25mMTris(pH 8.0)流动相A和25mM Tris、0.5M NaCl(pH 8.0)的流动相B进行AEX-HPLC。类似于SEC-HPLC，使用UV或荧光检测器。

IV.免疫原性测试

使用毒素中和分析(TNA)(Hering等，Biologicals 32(2004)17-27；Omland等，Clinical and Vaccine Immunology(2008)946-953；和Li等，Journal of Immunological Methods(2008)333：89-106)来评价免疫原性。将小鼠参考血清(如上所述制备)的ED50值用于测定测试血清样本和阳性对照物的NF50值。本文报告了第一个月的稳定性数据。

对于体内免疫原性测试，使每组20只雌性CD-1小鼠接受LyoA、LyoB、LyoC或液体rPA(F1)的单次0.5mL腹膜内(i.p.)注射。评价四个稀释度剂量水平(1∶4、1∶8、1∶16和1∶32)。在用盐溶液接种当天制备稀释物。在接种后第28天通过心脏放血来获得血清样本。

生理化学稳定性结果

表11概括了三个在5℃、25℃、40℃和50℃下存放4个月的冻干制剂和BDS参考对照物的MLA、SEC-HPLC和AEX-HPLC结果。

表11.4个月时生理化学稳定性数据的概括

巨噬细胞溶解分析结果

这些MLA结果示出，当与BDS参考对照物相比时，三个在高达40℃和50℃的温度下存放4个月的冻干制剂没有显著的rPA细胞毒性下降(在+/-30％的误差可变度内)。

比较来说，在5℃、25℃和40℃下存放一个月的液体rPA疫苗(F1)有显著的MLA值下降。发现MLA值在5℃、25℃和40℃下分别是98％、65％和0％。图14示出存放4个月的三个冻干批次相对于存放1个月的rPA液体批次(F1)随存放温度变化的MLA％的比较。这些结果示出三个冻干制剂将rPA疫苗的MLA活性在40℃和50℃下维持至少多达4个月，而液体rPA疫苗在40℃下存放1个月之后损失所有其MLA活性。

尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)结果

图15B中示出rPA参考对照物(BDS)的典型SEC层析。计算每一样本峰的峰面积百分比。天然rPA蛋白(单体)在17.1分钟洗脱，主峰面积％为85％。第二峰在18.2分钟洗脱并且对应于约15％的聚集的rPA分子主峰面积。通过17.1分钟洗脱峰的面积％确定rPA蛋白的纯度％，即rPA蛋白的纯度(rPA纯度％)＝rPA峰(对应于停留时间为17.1分钟的单体rPA)的峰面积/总峰面积百分比。

LyoA、LyoB和LyoC的纯度结果与存放在-80℃下的rPA参考BDS的纯度结果84.0％相当，参见表11。SEC-HPLC数据示出与参考对照物相比，所有三个在所有存放温度下存放4个月的冻干制剂的纯度都没有显著下降。

作为比较，当在加速温度(25℃、40℃或50℃)下存放1个月时，液体rPA疫苗的纯度有显著下降。液体制剂的rPA的相对纯度％在5℃、25℃和40℃下分别下降-3.3％、-7.2％和-98.6％。

发现对于冻干和液体分析，BDS参考对照物的纯度％分别是84.0％和98.6％。在不同时间进行两个测试。参考对照物的纯度％有差异并非不常见。所述差异可归因于变化的SEC柱条件和样本制备程序。典型地将相对纯度％(相对于参考对照物)用于比较在不同时间和不同实验室的稳定性样本。

图15A示出与液体制剂相比，三个冻干制剂的rPA SEC纯度％(相对于BDS参考对照物)随存放温度变化的相对降低。数据显示，在40℃或50℃下存放至少4个月的冻干rPA疫苗的SEC纯度没有变化，而液体rPA疫苗在40℃下存放1个月之后完全降解。

阴离子交换色谱(AEX-HPLC)结果

图16B中示出rPA参考对照物(BDS)的典型AEX层析。通过主峰面积％表征rPA的纯度。天然rPA蛋白在21.0分钟洗脱，主峰为约81.4％。脱酰胺rPA(典型地称为酸性物质)在21.7分钟和22.4分钟洗脱，面积为16.6％。通过首先将所有峰(除缓冲液峰以外)的曲线下面积积分来计算主峰面积％，然后主峰面积％对应于停留时间为21.0分钟的rPA峰(即，主峰面积％＝峰面积(RT＝21.0分钟)/所有峰面积的总和)。类似于SEC-HPLC，rPA纯度与主峰面积％相同。AEX分析的精度为约10-15％。

发现存放4个月的第一批冻干物(lyoA)的AEX纯度％在5℃、25℃和40℃下分别为87.1、86.6、84.7。第二批冻干物(lyoB)的AEX纯度在5℃、25℃和50℃下分别为87.8％、86.2％和85.3％。第三批冻干物(lyoC)的AEX纯度％在5℃、25℃和50℃下分别为87.5％、84.5％和70.5％。LyoA、LyoB和LyoC的这些纯度结果与rPA参考对照物(BDS)的纯度80.8％相当。所有三个在所有存放温度下存放4个月后的冻干制剂的纯度相对于参考对照物都没有显著下降。

发现存放1个月的液体rPA疫苗的AEX纯度在5℃、25℃和40℃下分别为65.5％、25.6％和0％；并且当用于分析测试液体rPA时，rPA参考对照物(BDS)的AEX纯度为78.2％。将AEX纯度结果概述于表11中。

如图16A中所示，与冻干制剂相比，在5℃、25℃和40℃下的rPA液体制剂(F1)中的AEX纯度有显著下降。AEX数据显示，在40℃或50℃下存放至少4个月的冻干rPA疫苗的纯度没有损失；而液体rPA疫苗在40℃下存放1个月之后完全降解。

体内免疫原性结果

测定三个存放1个月的冻干制剂各自在小鼠中在剂量水平0.25、0.125、0.0625和0.03125下的NF50结果。图17A-D、18A-D和19A-D比较了在多个温度(5℃、25℃和40℃)下在其相应制剂和剂量水平下的NF50数据(n＝20)。

表12A-C中概括了三个冻干制剂的四个剂量水平在5℃、25℃和40℃下的NF50的几何平均数(<NF50>gm)。

表12A-C.三个冻干制剂在5℃、25℃和40℃下在四个剂量水平(0.25、0.125、0.0625和0.03125)下的NF50的几何平均值(n＝20)

对于存放1个月之后的批次LyoA，发现在剂量水平0.25下在5℃、25℃和40℃下的<NF50>gm分别是1.12、1.20和1.13。在三个存放温度(5℃、25℃和40℃)下，<NF50>gm没有统计上显著的差异，p＝0.97。类似地，还示出在多个存放温度下在其它测试剂量水平(0.125、0.0625和0.01315)下，所有三个冻干制剂(LyoA、LyoB和LyoC)没有统计差异。NF50数据显示在高达40℃下1个月的三个冻干制剂的免疫原性没有显著下降。

相反地，在25℃和40℃存放温度下1个月，液体rPA制剂(F1)示出显著的免疫原性下降。表13示出在5℃、25℃和40℃下存放1个月的rPA液体制剂的<NF50>gm结果。

表13.在四个剂量水平(0.3、0.2、0.1和0.05)下在5℃、25℃和40℃下存放1个月的液体rPA制剂的NF50的几何平均值

在0.3剂量水平下，发现在5℃、25℃和40℃下的<NF50>gm分别是1.26、0.69和0.30，并且所有<NF50>gm都有统计上显著的差异，p＝0.0023。类似地，在较低的剂量水平0.2、0.1和0.05下，<NF50>gm随着存放温度提高而显著下降(参见图20A-D)。发现当将液体疫苗存放在25℃下，如相比于5℃下时，在所有四个剂量水平下，NF50都显著减小，并且在40℃下会逐渐增大。

总之，免疫原性数据显示冻干的rPA制剂优越于液体rPA制剂。冻干制剂在25℃和40℃下维持其免疫原性至少1个月，而液体制剂的免疫原性在类似的存放条件下会显著降低。

像大多数液体疫苗那样，发现液体rPA疫苗在加速存放温度(例如25℃和40℃)下不稳定。液体rPA疫苗当在40℃下存放1个月时会损失其免疫原性和关键生理化学性质。类似地，疫苗的关键生理化学性质还会显著降级。发现如通过巨噬细胞溶解分析(MLA)、尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)和阴离子交换色谱(AEX-HPLC)测量的疫苗含量和纯度在25℃下会显著降低并且在40℃下1个月会不可检测。已知液体rPA疫苗对脱酰胺反应敏感，尤其是当其吸附于铝上并且存放在加速温度下时。

制造以下批号的三个冻干制剂：lyoA、lyoB和lyoC。这三个新的rPA冻干制剂比rPA液体疫苗具有优越的稳定性概况。对于所有三批冻干制剂，当在高达50℃的温度下存放4个月时，所有关键生理化学分析(MLA、SEC-HPLC和AEX-HPLC)中的纯度都没有统计上显著的变化。另外，当在四个剂量水平下在高达40℃下存放冻干疫苗1个月时，免疫原性(NF50)没有显著的下降。

本文的结果示出冻干的rPA制剂比液体rPA制剂具有优越的生理化学和免疫学稳定性概况。在高达50℃的存放温度下并且历经4个月的存储时间，冻干制剂维持所有通过MLA、SEC和AEX测试的关键生理化学性质。在高达40℃的存放温度下至少1个月，冻干制剂还维持免疫原性。相反地，在40℃下存放1个月之后，液体rPA制剂示出完全失去生理化学性质(MLA、SEC和AEX)并且免疫原性显著下降。

实施例7：用其它佐剂的制剂和冻干

将CPG 7909原料药物质(BDS)以冻干粉形式包装于高密度聚乙烯(HDPE)瓶中，热密封于多层(聚酯薄膜，箔)囊中，并且存放在-20℃±5℃下。

从Avanti Polar Lipids，Inc获得葡萄哌喃糖基脂质佐剂(GLA)。将其包装于含有25mg冻干GLA粉末的2mL琥珀色玻璃小瓶中并且存放在-20℃±5℃下。Arias等.(2012)PLoS ONE 7(7)：e41144中描述了GLA。

使用含原料药物质(BDS)：2.81mg/mL rPA、0.9％NaCl且缓冲于20mM Tris-HCl中(pH 7.4)。使用前将其存放在-80℃下并且在5℃下解冻过夜。

从InviviGen，在20mL玻璃小瓶中以含有50mg PIPC的冻干饼形式获得PolyI PolyC(PIPC)。将其存放在5℃下。

表14.化学品和来源

化学名称	来源
		超纯Tris盐酸盐	Amresco
2％ALHYDROGEL(10mg/mL铝)	Brenntag
		二水合α，α-海藻糖	Hayashibara Biochemicals
无水磷酸二氢钠	Sigma Aldrich
		七水合磷酸氢二钠	BDH
聚山梨酯80，N.F.	J.T.Baker
		L-丙氨酸	EMD

表15.设备/材料

名称	来源
		VirTis Advantage Plus冻干器	SP Scientific
Wheaton血清小瓶，硼硅酸盐玻璃	VWR
		Lyo小瓶用开槽橡皮塞	VWR
翻盖型压接封盖	VWR

储备溶液制备物

分别在20mM Tris和5mM NaPi缓冲液中制备两种60％(w/v)海藻糖溶液，并且将其无菌过滤。在DI水中制备10％(v/v)聚山梨醇酯80溶液，接着无菌过滤。分别在20mM Tris和5mM NaPi缓冲液中制备两种12％(w/v)丙氨酸溶液，并且将其无菌过滤。

通过将7mL 1M Tris缓冲液(pH 7.4)添加到343mL 2％AlOH(或10mg/mL铝)中来缓冲一个氢氧化铝储备溶液并且滴定至pH 7.4。通过将1.75mL 1M NaPi缓冲液(pH 7.0)添加到348.25mL 2％AlOH中来缓冲第二个氢氧化铝储备溶液并且滴定至pH 7.0。在任一制备物中都不考虑添加缓冲液和后续滴定所产生的稀释效应。

佐剂制备物

通过将31.2mg粉末添加到50mL锥形管中并添加15.6mL缓冲液而在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中制备GLA佐剂。在10秒的间隔内(其间其余部分为10秒，至最大功率15W)将混合物超声处理总共60秒。获得2mg/mL GLA的混浊混合物。

在20mM Tris(pH 7.4)或5mM NaPi(pH 7.0)缓冲液中制备CPG7909备料。在每一制备物中，将约200mg CPG 7909粉末完全溶解于10mL的最终体积中。两种制备物都获得透明溶液。

通过将50mg PIPC冻干饼溶解在25mL 5mM NaPi缓冲液(pH7.0)中来制备2mg/mL PIPC储备溶液。在10秒的间隔内(其间其余部分为10秒，至最大功率15W)将混合物超声处理总共60秒。没有获得具有可见粒子的透明溶液。

共混用配制程序

表16示出所制备的制剂的化学组成：

表16：液体和冻干的制剂共混物

使用如表17中所示的缓冲储备溶液制备表16中的制剂共混物。

表17：用于制剂共混物制备物的备料/赋形剂体积

用于共混所有赋形剂的添加顺序如下：氢氧化铝→海藻糖→TWEEN 80→丙氨酸→缓冲液→rPA→CPG或GLA佐剂

为样本14-20、40-45和76-81制备20mL的最终体积以便冻干。将共混物以2mL等分试样分到10mL玻璃小瓶中并且放在一旁以便冻干。

冻干程序

使用VirTis Plus冷冻干燥器冻干样本。如表18中所述采用和输入73小时循环。

表18：冻干循环

数据概括

在使用腹膜内途径免疫一次的小鼠(n＝10)中测试六个疫苗制剂的免疫学反应。在免疫之后第28天收集血清。如实施例3中所述测定在剂量水平＝0.4下的TNA数据并且结果概括于表19中。

发现CPG-液体、CPG-lyo、GLA-液体、GLA-lyo、PIPC/CPG-液体和PIPC/CPG-lyo样本的平均NF50分别是53.6、48.9、69.9、64.7、89.4和77.3。CPG、GLA和PIPC/CPG的液体相对于冻干制剂的平均NF50没有统计差异。数据显示冻干制剂和方法甚至在其它佐剂存在下也能维持免疫原性。

表19：含有CPG、GLA和PIPC/CPG佐剂的疫苗的液体相对于冻干制剂的NF50

实施例8：冻干rPA疫苗的免疫原性

本实施例比较了新鲜制备的液体疫苗相对于在5℃和50℃下存放1个月的冻干疫苗，并且比较了在NaPi(pH 7.0)相对于柠檬酸(pH5.5)缓冲液中制备的CPG制剂。

在本研究下评价四个制剂：

含rPA明矾的NaPi(pH 7.0)

含rPA明矾+CPG的NaPi(pH 7.0)

含rPA明矾+CPG的柠檬酸(pH 5.5)

含rPA明矾+GLA的Tris(pH 7.4)

储备溶液制备物

制备三个60％(w/v)海藻糖溶液，一个在20mM Tris(pH 7.4)中，第二个在5mM NaPi缓冲液(pH 7.0)中，并且第三个在20mM中柠檬酸钠(pH 5.5)中。通过在90mL DI水中混合10mL浓缩Tween 80来制备10％(v/v)聚山梨醇酯80溶液。制备三个12％(w/v)丙氨酸溶液，一个在20mM Tris(pH 7.4)中，第二个在5mM NaPi缓冲液(pH 7.0)中，并且第三个在20mM中柠檬酸钠(pH 5.5)中，并且所有都被无菌过滤。

通过将1M缓冲液添加到2％AlOH中来缓冲三个氢氧化铝储备溶液。将所得备料滴定至所需pH值以在使用时匹配缓冲液。在任何制备物中都不考虑添加缓冲液和后续滴定所产生的稀释效应。

表19：在冻干之前的制剂

共混每一配制，接着使用如实施例7中所述的冻干方法以每小瓶2mL冻干。

表20：新鲜液体或复原浓聚物

动物模型

每一动物接收0.5mL 1/16稀释度的所列制剂。每组5只雌性/5只雄性豚鼠(n＝10)。在第0天和第14天进行IM免疫。在第14、28和35天进行采血。分析和呈现在第28天的TNA数据。

NF50数据

图21示出12种制剂的NF50和平均数标准差。

表21示出12种制剂的每一只小鼠的数值。

表21：12种制剂中每一种的每一只小鼠的NF50和LogNF50。

NF50数据示出四个冻干制剂的优越稳定性。还显示制剂的稳健性。

对于所有四个制剂，在新鲜液体、lyo(在5℃和50℃下1个月)之间，NF50平均值和几何平均值没有统计差异：(参见表21)

对于rPA明矾+CPG制剂，在NaPi相对于柠檬酸缓冲液之间，NF50的平均值和几何平均值没有统计差异。(参见表21)

实施例9：含流感抗原的制剂

使用类似于本文关于rPA制剂所公开的方法配制含有流感抗原的制剂，除了存在流感抗原和不存在rPA抗原的情况以外。

将含有流感抗原的制剂的实例列于表20中。

表22.用于冻干的含有流感抗原的制剂的实例

制备两组制剂，一组在5mM NaPi(pH 7.0)缓冲液或20mM Tris(pH 7.4)缓冲液中。流感抗原是流感血凝素。制剂也可以含有另一佐剂如0.5mg/mL CPG、0.5mg/mL PIPC、0.1mg/Ml GLA或其组合。

使用如实施例7中所述的冻干方法以每小瓶2mL冻干每一制剂。

在免疫性研究、稳定性研究和/或功效研究中测试每一制剂。

Claims (50)

1.一种用于制备冻干疫苗的组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原和至少20％(w/v)的非还原糖。

2.一种温度稳定性液体疫苗组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原和至少20％(w/v)的糖。

3.一种组合物，其在冻干之前包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原和至少20％(w/v)的非还原糖，其中在复原之后，所述非还原糖是至少6％(w/v)。

4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂。

5.一种用于制备冻干疫苗的组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂和至少15％(w/v)的糖。

6.一种温度稳定性液体疫苗组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂和至少15％(w/v)的糖。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含氨基酸。

8.一种用于制备冻干疫苗的组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂、氨基酸和至少10％(w/v)的糖。

9.一种稳定的液体疫苗组合物，其包含至少一种吸附于铝佐剂的抗原、表面活性剂、氨基酸和至少10％(w/v)的糖。

10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述铝佐剂选自磷酸铝和硫酸铝。

11.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述铝佐剂是氢氧化铝。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述组合物含有约0.5至1.5mg/ml氢氧化铝。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物含有约0.5mg/ml氢氧化铝。

14.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物含有约1.5mg/ml氢氧化铝。

15.如权利要求4至14中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。

17.如权利要求4至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物含有约0.020％或0.025％(w/v)的表面活性剂。

18.如权利要求1至17所述的组合物，其中所述糖是选自海藻糖、蔗糖和其组合的非还原糖。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述糖是海藻糖。

20.如权利要求18所述的组合物，其中所述糖是蔗糖。

21.如权利要求18所述的组合物，其中所述糖是海藻糖和蔗糖。

22.如权利要求5至21中任一项所述的组合物，其中所述组合物含有约15-40％(w/v)的糖。

23.如权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述组合物含有约20-40％(w/v)的糖。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述组合物含有约20-35％(w/v)的糖。

25.如权利要求24所述的组合物，其中所述组合物含有约25-40％(w/v)的糖。

26.如权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述组合物含有大于约20％、21％、22％、23％、24％和25％(w/v)的糖。

27.如权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述抗原是炭疽抗原。

28.如权利要求27所述的组合物，其中所述炭疽抗原是保护性抗原。

29.如权利要求28所述的组合物，其中所述保护性抗原与SEQID NO：2的多肽具有至少约80％的同一性。

30.如权利要求28至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约150-500μg/ml保护性抗原。

31.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含约150、175、200、225、250、275、300、325、400、375、400、425、450、475或500μg/ml保护性抗原

32.如权利要求31所述的组合物，其中所述炭疽抗原是来自无毒力炭疽杆菌菌株的无细胞滤液。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述无毒力炭疽杆菌菌株是V770-NP1-R。

34.如权利要求7至33中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸选自精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和其任何组合。

35.如权利要求34所述的组合物，其中所述组合物含有约0.5-4％(w/v)的丙氨酸或精氨酸。

36.如权利要求40所述的组合物，其中所述组合物含有约2％(w/v)的丙氨酸或精氨酸。

37.如权利要求34所述的组合物，其中所述组合物含有约6-12％(w/v)的甘氨酸。

38.如权利要求37所述的组合物，其中所述组合物含有约10％(w/v)的甘氨酸。

39.如权利要求1、3至5、7、8和10至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物在真空下经历升华以产生冻干组合物。

40.一种冻干组合物，其从如权利要求1、3至5、7、8和10至38中任一项所述的组合物冻干。

41.一种复原的组合物，其包含在水溶液中复原的如权利要求39或40所述的冻干组合物。

42.如权利要求41所述的复原的组合物，其中所述水溶液选自水、Tris EDTA(TE)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲液或盐水。

43.如权利要求1、3至5、7、8和10至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物在以冻干形式在50℃下存放至少4个月之后保持至少80％、至少90％或至少95％的纯度。

44.如权利要求1、3至5、7、8和10至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物在以冻干形式在40℃下存放至少1个月之后保持至少80％、至少90％或至少95％的免疫原性。

45.一种针对病原体对受试者接种的方法，其包括施用如权利要求1至44中任一项所述的组合物。

46.一种针对病原体对受试者接种的方法，其包括向受试者施用从如权利要求39或40所述的冻干组合物复原的药物组合物。

47.一种制造强效的基于明矾的冷冻疫苗的方法，其包括悬浮包含至少约10％糖和吸附于铝佐剂的抗原的组合物以及以足以在发生沉降之前冷冻所述悬浮组合物的速率冷冻所述组合物。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述组合物含有至少约15％的糖。

49.如权利要求47所述的方法，其中所述组合物含有至少约20％的糖。

50.一种制备稳定的冻干组合物的方法，其包括将如权利要求1、3至5、7、8和10至38中任一项所述的组合物冻干，其中通过小噬细胞溶解分析(MLA)、尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)和/或阴离子交换色谱(AEX-HPLC)测量所述复原的冻干组合物的稳定性。