CN104450774A - 一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建及其在大豆基因修饰中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建，主要是根据目的基因设计核心序列，将核心序列构建入带有cas9的表达载体中，该体系利用核心序列对目的基因进行识别，cas9对目的基因进行剪切，生物体对断链进行修复的过程中会产生各种突变。本发明还提供了上述大豆CRISPR/Cas9体系在大豆基因修饰中的应用。本发明所构建的大豆CRISPR/Cas9体系简单，对大豆基因修饰能够快速、高效的完成，克服了现有的ZFNs体系过于复杂，费时且效率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种定点突变的体系，特别涉及一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建及其在大豆基因修饰中的应用。
背景技术
对基因进行定点修饰，是生物研究领域重要的方法之一。随着科学的发展，越来越多的沉默技术发展迅速。从经典的MES随机诱变、T-DNA或转座子插入失活到锌指结构(ZFs)与转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)定点突变，这些技术都大大促进了研究基因功能的进程。但由于锌指核糖核酸酶(ZFN)与转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术需要针对每一个目的基因设计特定的内切酶，且构建过程繁琐，大大限制了其应用范围。与其他沉默体系相比，CRISPR定点突变技术有其无法比拟的优点，逐渐被广泛地应用与基因定点修饰研究中。
CRISPR/Cas体系最早是在大肠杆菌中发现的，是细菌针对噬菌体等外源DNA的获得性免疫系统。该系统主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM对入侵噬菌体或质粒进行特异性切割。CRISPR系统主要有三种类型，其中II型体系仅需要一个Cas9蛋白、crRNA与tracrRNA就能行使其功能。有研究表明将crRNA与tracrRNA整合成sgRNA并不影响CRISPR/Cas9体系的作用。2013年8月，自然生物技术期刊上首次同时发表了三篇有关CRISPR/Cas9体系成功应用于植物基因修饰的研究。之后，CRISPR/Cas9体系被广泛地应用于拟南芥、烟草、水稻、高粱、玉米及小麦研究上，但CRISPR/Cas9体系在大豆作物研究上仍是一片空白。
大豆[Glycine max(L.)Merr.]是重要的农作物之一，是植物蛋白与食用油的主要来源，营养价值与经济价值较高。为更好地研究基因功能，经常需要进行特定位点的基因突变，而现有的ZFNs体系过于复杂、费时且效率低，大大限制了该方法的应用。因此，发展一种针对大豆的CRISPR/Cas体系，并将其应用在大豆基因修饰领域显得尤为重要。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建，解决目前大豆尚无CRISPR/Cas体系，而ZFNs体系过于复杂，费时且效率低的问题。
本发明的第二目的是提供上述大豆CRISPR/Cas9体系在大豆基因修饰中的应用。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建，该方法包括以下步骤：
(1)将cas9构建到pCambia3301载体上；
(2)人工合成带有大豆特异U6-10启动子的sgRNAs，大豆特异U6-10启动子和sgRNAs之间带有两个BsaI酶切位点；
(3)根据大豆目的基因设计核心序列，根据核心序列合成两端带有与BsaI酶切后形成的粘性末端互补序列的引物；
(4)将步骤(2)合成的片段连接入pUC57-Kan质粒，提取质粒后，用BsaI内切酶完全酶切；
(5)将步骤(3)合成的引物退火后结合成的带有粘性末端的核心序列，与步骤(4)酶切后的片段相连接；
(6)酶切步骤(5)连接后的质粒，获得目的片段构建到带有cas9的pCambia3301载体上，获得pCas9-GmU6-sgRNA。
二、上述的大豆CRISPR/Cas9体系在大豆基因修饰中的应用。
采用上述技术方案的积极效果：本发明所构建的大豆CRISPR/Cas9体系简单，对大豆基因修饰能够快速、高效的完成，克服了现有的ZFNs体系过于复杂，费时且效率低的问题；且通过实验证明，将大豆CRISPR/Cas9体系与大豆子叶节发根法或大豆原生质体法结合，突变率更高，更加有利于对大豆基因，尤其是与大豆根或根瘤相关基因功能的研究。
附图说明
图1是本发明的CRISPR/Cas9载体示意图；
图2是大豆原生质体法检测的CRISPR/Cas9体系对Glyma06g14180编辑情况的凝胶电泳图；
图中，M：marker；1：将CRISPR/Cas9载体转入到大豆原生质体48小时后，提取基因组DNA，Pst I完全酶切后，PCR扩增Glyma06g14180电泳；2：叶片基因组DNA，Pst I完全酶切后，PCR扩增Glyma06g14180电泳；3：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma06g14180后电泳；
图3是大豆原生质体法检测的CRISPR/Cas9体系对Glyma08g02290编辑情况的凝胶电泳图；
图中，M：marker；1：将CRISPR/Cas9载体转入到大豆原生质体48小时后，提取基因组DNA，BamH I完全酶切后，PCR扩增Glyma08g02290电泳；2：叶片基因组DNA，BamH I完全酶切后，PCR扩增Glyma08g02290电泳；3：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma08g02290后电泳；
图4是大豆原生质体法检测的CRISPR/Cas9体系对Glyma12g37050编辑情况的凝胶电泳图；
图中，M：marker；1：将CRISPR/Cas9载体转入到大豆原生质体48小时后，提取基因组DNA，EcoR I完全酶切后，PCR扩增Glyma12g37050电泳；2：叶片基因组DNA，EcoR I完全酶切后，PCR扩增Glyma12g37050电泳；3：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma12g37050后电泳；
图5是大豆子叶节诱导发根法检测的CRISPR/Cas9体系对Glyma06g14180编辑情况的凝胶电泳图；
图中，M：marker；wt1：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma06g14180后，用PstI酶切电泳；wt2：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma06g14180片段；1-21：诱导形成的发状根，提取的基因组DNA，PCR扩增Glyma06g14180后，用Pst I酶切电泳；其中4和7为阳性发状根。
图6是大豆子叶节发根法检测的CRISPR/Cas9体系对Glyma08g02290编辑情况的凝胶电泳图；
图中，M：marker；wt1：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma08g02290片段；wt2：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma08g02290后，用BamH I酶切电泳；1-21：诱导形成的发状根，提取的基因组DNA，PCR扩增Glyma08g02290后，用BamH I酶切电泳；其中11、12、13、18和19为阳性发状根。
图7是大豆子叶节发根法检测的CRISPR/Cas9体系对Glyma12g37050编辑情况的凝胶电泳图；
图中，M：marker；wt1：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma12g37050片段；wt2：叶片基因组DNA，PCR扩增Glyma12g37050后，用EcoR I酶切电泳；1-21：诱导形成的发状根，提取的基因组DNA，PCR扩增Glyma12g37050后，用EcoR I酶切电泳；其中1、5、8、14、19为阳性发状根。
图8是带有拟南芥特异U6-26启动子的CRISPR/Cas9体系构建示意图。
具体实施方式
本发明的生物材料的来源：
1、载体pH-Ubi-cas9-7：Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system，JinMiao,Dongshu Guo,Jinzhe Zhang,Qingpei Huang,Genji Qin,Xin Zhang,Jianmin Wan,Hongya Gu,Li-Jia Qu,Cell Research(2013)23:1233-1236，该载体由瞿礼嘉教授赠送给本专利的申请人；
2、载体pCambia3301：购于北京基尼亚生物技术有限公司；
3、所有引物为自行设计并委托三博远志生物技术有限公司合成。
下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例用于说明大豆CRISPR/Cas9体系的构建过程。
(1)挑取含有pCambia3301质粒的单菌落，接种于50ml LB液体培养基中，培养基中加入卡那青霉素至终浓度为100ng/ml，37℃、200转速摇床中过夜培养。
(2)收集菌落，通过碱裂解法提取pCambia3301质粒，通过分光光度计测定质粒浓度，并将浓度调节至200ng/ul。
(3)取步骤(2)中5ug pCambia3301质粒，用NcoI和PmlI酶(Fermentas)双酶切过夜。
(4)将酶切产物在0.8％琼脂糖胶上电泳，用胶纯化回收试剂盒(Tiangen)回收pCambia3301质粒双酶切后的大片段DNA。分光光度计测定回收的pCambia3301大片段DNA浓度，将浓度调节为50ng/ul。
(5)以瞿礼嘉教授提供的pH-Ubi-Cas9-7质粒为模板，用高保真DNA phusion酶(NEB)和Cas9特异引物(Cas9-F：CATGccatggCCCCAAAGAAGAAGCGC和Cas9-RTCAATCGCCGCCGAGTTGTGA)扩增Cas9基因。
(6)将扩增的Cas9DNA用PCR产物纯化试剂盒(Tiagen)进行纯化，通过分光光度计将其浓度调节至100ng/ul。
(7)用NcoI酶(Fermenata)对Cas9DNA进行酶切过夜，酶切产物用PCR产物纯化试剂盒(Tiagen)进行纯化，通过分光光度计将其浓度调节至100ng/ul。
(8)取来源于(7)的100ng Cas9DNA与来源于步骤(4)的100ng pCambia3301大片段DNA混合后，加入1个单位的T4DNA连接酶进行16℃连接过夜形成pCambia3301-Cas9质粒。
(9)取2ul步骤(8)的连接产物，与50ul的DH10β感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃90秒，加入800ul LB液体培养基，37℃、200转培养50分钟，3000转离心、去上清，将沉淀的DH10β细胞重悬后均匀涂布于含有100ng/ml卡那青霉素的培养基中，37℃培养过夜。
(10)挑取单菌落，用pCambia3301引物(GATCCCTAAGCTTGGCAAGTTCC)和Cas9基因引物(AGTTGGGCGATCAGATTCTC)进行菌落PCR验证Cas9是否与pCambia3301连接，挑取阳性克隆于50ml，卡那青霉素至终浓度为100ng/ml的LB液体培养基中，37℃、200转速摇床中过夜培养。
(11)收集菌落，通过碱裂解法提取pCambia3301-Cas9质粒，通过分光光度计测定质粒浓度，并将浓度调节至200ng/ul备用。
(12)在Genscript公司进行人工合成带有大豆特异U6-10启动子的sgRNAs，该片段位于pUC57-Kan质粒的EcoRI和HindIII酶切位点之间，形成pUC57-GmU6-sgRNA质粒。在大豆特异U6-10启动子和sgRNAs之间带有两个BsaI酶切位点；两个BsaI酶切位点联合作用，使得酶切后将酶切位点序列全部切除；
(13)碱裂解法提取pUC57-GmU6-sgRNA质粒，用分光光度计调节质粒浓度至100ng/ul备用。
(14)取1ug步骤(13)中制备的质粒，用BsaI酶37℃酶切过夜，用PCR产物纯化试剂盒(Tiagen)进行纯化，用分光光度计调节质粒浓度至100ng/ul备用。
(15)根据大豆目的基因设计核心序列互补引物，核心序列合成两端带有与BsaI酶切后形成的粘性末端互补的序列。分别取1ug互补引物于10ul TE中，90℃5分钟、然后缓慢的降温使互补引物配对形成带有BsaI酶粘性末端的双链DNA。
(16)取1ug步骤(15)复性的双链DNA与100ng步骤(14)的pUC57-GmU6-sgRNA质粒，在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜。
(17)取2ul步骤(16)的连接产物，与50ul的DH10β感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃90秒，加入800ul LB液体培养基，37℃、200转培养50分钟，3000转离心、去上清，将沉淀的DH10β细胞重悬后均匀涂布于含有100ng/ml卡那青霉素的培养基中，37℃培养过夜。
(18)挑取单菌落，用M13F(cgccagggttttcccagtcacgac)和M13R(agcggataacaatttcacacagga)引物进行菌落PCR扩增验证插入片段。挑取阳性克隆进行测序(三博远志生物技术有限公司)验证序列的完整性。
(19)挑取步骤(18)序列正确的克隆，接种于50ml、卡那青霉素终浓度为100ng/ml的LB液体培养基中，37℃、200转速摇床中过夜培养。碱裂解法提取质粒后，用分光光度计调节质粒浓度至100ng/ul。
(20)取100ng步骤(11)的pCambia3301-Cas9质粒DNA和100ng步骤(18)的pUC57-GmU6-sgRNA质粒DNA，用EcoRI和HindIII酶(Fermentas)37℃双酶切过夜。酶切产物用PCR产物纯化试剂盒(Tiagen)进行纯化。
(21)取等体积步骤(20)的酶切纯化产物pCambia3301-Cas9和pUC57-GmU6-sgRNA，加入T4DNA连接酶、16℃连接过夜。
(22)取2ul步骤(21)的连接产物，与50ul的DH10β感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃90秒，加入800ul LB液体培养基，37℃、200转培养50分钟，3000转离心、去上清，将沉淀的DH10β细胞重悬后均匀涂布于含有100ng/ml卡那青霉素的培养基中，37℃培养过夜。
(23)挑取单菌落，用pCambia3301多克隆位点特异引物Pdmsf:(GGCTCGTATGTTGTGTGGAA)和pDMSR:(GCCTCTTCGCTATTACGCC)进行菌落PCR扩增验证插入片段。获得的阳性克隆即为pCas9-GmU6-sgRNA质粒，该质粒即为大豆CRISPR/Cas9体系。该体系中，根据目的基因设计的核心序列用于识别目的基因，cas9用于识别序列中的NGG序列，在NGG上游3-5bp处进行切割，造成DNA链的断裂，而生物体在修复DNA的过程中，会产生多种突变，从而对基因进行编辑修饰。
(24)挑取步骤(23)中的阳性克隆pCas9-GmU6-sgRNA，接种于50ml、卡那青霉素终浓度为100ng/ml的LB液体培养基中，37℃、200转速摇床中过夜培养。碱裂解法提取质粒后，用分光光度计调节质粒浓度至1ug/ul备用。
实施例2
本实施例用于说明大豆CRISPR/Cas9体系对大豆基因修饰的功能验证。
选取大豆三个基因Glyma06g14180，Glyma08g02290与Glyma12g37050为研究对象，引物合成序列如表1：
表1：大豆目的基因引物设计
由于是根据大豆目的基因设计的核心序列，从而构建的CRISPR/Cas9体系，因此CRISPR/Cas9体系中的核心序列可以对大豆目的基因进行识别，从而为cas9的修饰编辑功能提供定位。表1中，斜体为酶切位点，粗体为PAM序列，即NGG，cas9从NGG上游3-5bp处进行切割，因此切割正好发生在酶切位点处，为后期的验证试验提供了便利条件，即利用酶切试验，就可以看出是否发生了突变。
根据这三个基因构建的适用于这三个基因的CRISPR/Cas9体系，分别用大豆原生质体与子叶节发根法检测CRISPR/Cas9体系的活性。
一、大豆原生质体检测CRISPR/Cas9体系的活性
(1)取新鲜大豆叶片，剪碎后放入裂解液中(0.5％cellulose R10,0.5％macerozymeR10,0.1％pectolase Y23,0.6M mannitol,10mM MES pH5.7,20mM KCl,10mM CaCl2and 0.1％BSA)。
(2)混匀后，真空抽滤30分钟。
(3)在30rpm条件下裂解约6小时。
(4)用100μm尼龙膜过滤，100g离心3分钟，收集上清液。
(5)加入等体积的W5溶液(2mM MES pH5.7，154mM NaCI，125mM CaCl2，5mM KCl)，缓慢混匀，冰浴30分钟。
(6)100g离心3分钟，MMG溶液(4mM MES pH5.7，0.4mM mannitol，100mMCaCl2)重悬，待转化。
(7)100μl MMG重悬的原生质体溶液中加入10μl案例1步骤(24)的pCas9-GmU6-sgRNA质粒DNA，混匀后再加入110μl 40％PEG，缓慢混匀。室温下静置30分钟。
(8)吸取800μl W5溶液漂洗后，加入1ml WI溶液(4mM MES pH5.7，0.5mMmannitol，20mM CaCl2)，室温条件下，黑暗培养48小时。
(9)收集原生质体细胞，CTAB法提取原生质体基因组DNA。
(10)将提取的基因组DNA用不同的内切酶(Glyma06g14180，Glyma08g02290和Glyma12g37050对应的内切酶分别为Pst I，BamHI和EcoRI)进行完全酶切，用基因特异引物对基因进行扩增、电泳检测(图2-4)。结果显示，当基因的酶切位点发生突变后，酶切位点消失，用相应的内切酶进行酶切时，突变的DNA为完整DNA，可以用基因特异性引物进行扩增出基因特异带；而对照DNA酶切后，由于存在酶切位点，基因DNA发生断裂，用基因特异引物无法扩增出基因特异带。
(11)将步骤(10)的PCR产物克隆到pEasy-T载体(Transgene)上，挑取阳性克隆进行测序验证突变的位点。大豆原生质体法的三个基因编辑情况见SEQ ID No.1-SEQ ID No.16。
二、大豆子叶节诱导发根法检测CRISPR/Cas9体系的活性
(1)用氯气消毒法处理Williams 82大豆种子，将消毒的种子播种于灭菌的潮湿盒中，25℃，16小时光/8小时暗培养5天。
(2)将构建好的pCas9-GmU6-sgRNA与pCas9-AtU6-sgRNA质粒，通过液氮速冻法转化到发根农杆菌K599中，在含有100ng/ml卡那青霉素、50ng/ml链霉素和50ng/ml壮观霉素抗性的固体MS培养基上28℃培养3天。
(3)用注射器的针头挑取步骤(2)的菌落，将农杆菌K599直接插入到步骤(1)健康生长的大豆苗的子叶节下胚轴处。将感染K599的大豆苗放于密封的高湿度培养盒中，25℃，16小时光/8小时暗培养2-3周。
(4)当发状根从子叶节下胚轴处长至5-10厘米时，剪取单条发状根，CTAB法提取发状根基因组DNA。
(5)将基因组DNA用基因特异引物进行基因扩增，扩增的PCR产物用相应的内切酶进行酶切(Glyma06g14180，Glyma08g02290和Glyma12g37050对应的内切酶分别为Pst I，BamHI和EcoRI)电泳检测(图5-7)。以大豆叶片基因组DNA作为对照，结果有三种情况：
显示两条带：目的基因PAM上游的3-5个碱基序列未改变或其它非预测序列发生变化；
仅显示一条带：双突变。因为大豆是双倍体植物，当基因组姐妹染色体都发生突变，由于酶切位点发生变化，导致内切酶无法发生酶切作用，因此显示一条带；
显示三条带：单突变。单突变即在一条染色体上发生突变，而配对的另一条染色体没有突变，因此，酶切时，一条染色体DNA可以酶切，显示两条带，而另一条染色体DNA无法酶切，显示一条带，共三条带。
(6)用胶回收试剂盒(Tiagen)回收突变的DNA带，克隆到pEasy-T载体(Transgene)上，挑取阳性克隆进行测序验证突变的位点。从图中可以看出，每个目的基因都显示有多个突变情况，即条带不一。统计CRISPR/Cas9体系对目的基因的编辑情况，详见序列表中的基因片段，CRISPR/Cas9体系处理后的大豆基因确实发生了例如缺失、增加、替换等多种突变。大豆子叶节发根法的三个基因编辑情况见SEQ IDNo.17-SEQ ID No.28。
可以说明，大豆原生质体法和大豆子叶节发根法，CRISPR/Cas9体系均可以对目的基因造成多种突变，突变率高。
对比例
采用实施例1的方法，同样构建带有拟南芥特异U6-26启动子的pCRISPR/Cas9体系，见图8。将构建的pCas9-AtU6-sgRNA同样对大豆原生质体法和大豆子叶节发根法这两种方法所得到的大豆基因组进行突变处理，处理方法同上。结果发现，
pCas9-GmU6-sgRNA体系的活性远高于pCas9-AtU6-sgRNA体系，目的基因突变率高达20.2％，详见表2，说明本专利申请构建的体系适用于大豆基因编辑修饰。
表2用两种体系对三个目的基因进行突变处理的结果比较
本发明所构建的大豆CRISPR/Cas9体系简单，对大豆基因修饰能够快速、高效的完成，克服了现有的ZFNs体系过于复杂，费时且效率低的问题。
Claims (2)
1.一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)将cas9构建到pCambia3301载体上；
(2)人工合成带有大豆特异U6-10启动子的sgRNAs，大豆特异U6-10启动子和sgRNAs之间带有两个BsaI酶切位点；
(3)根据大豆目的基因设计核心序列，根据核心序列合成两端带有与BsaI酶切后形成的粘性末端互补序列的引物；
(4)将步骤(2)合成的片段连接入pUC57-Kan质粒，提取质粒后，用BsaI内切酶完全酶切；
(5)将步骤(3)合成的引物退火后结合成的带有粘性末端的核心序列，与步骤(4)酶切后的片段相连接；
(6)酶切步骤(5)连接后的质粒，获得目的片段构建到带有cas9的pCambia3301载体上，获得pCas9-GmU6-sgRNA。
2.根据权利要求1所述的大豆CRISPR/Cas9体系在大豆基因修饰中的应用。
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