CN104436165A - 一种具有神经元保护作用的生物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有神经元保护作用的生物制剂。本发明将温敏性水凝胶包裹活化素B获得复合生物制剂，活化素B对神经元具有保护功能，新型温度敏感型水凝胶具有神经保护作用、抑制炎症和缓释功能，复合生物制剂中的活化素B通过在脑内缓慢释放发挥药效，协同抑制Mptp引起的小鼠纹状体区多巴胺能神经元的损伤，降低局部炎症反应，并从行为学上改善了帕金森病的症状。本发明为临床帕金森病及其他神经系统退变性疾病的治疗提供了重要的用药参考。

Description

一种具有神经元保护作用的生物制剂

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种具有神经元保护作用的生物制剂。

背景技术

帕金森病( Parkinson′s disease，PD) 是一种以中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性、神经递质多巴胺缺乏为主要病理生化基础的中老年人常见的运动障碍性疾病。其临床症状主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓等。新近的流行病学调查显示，我国65岁以上人群帕金森病发病率达1.7%，从诊断到死亡的平均生存期为15年。帕金森病的病因和发病机制十分复杂，至今仍未彻底明确，目前所有针对帕金森病的治疗都是对症治疗，尚无根治办法。开展帕金森病机制的研究，并进一步寻找有效的治疗药物，具有深远的社会意义和巨大的市场前景。

目前，临床上对帕金森病的治疗手段主要是给予多巴胺（DA）合成的前体物质左旋多巴（L-DOPA），以补充纹状体区丢失的DA。然而，越来越多的临床病例发现，经过长时间的给药，机体对L-DOPA的耐受逐渐增强，该药的作用逐渐减弱，并呈现出强烈的负面效应，甚至起到增重帕金森疾病症状的副作用。近年来，细胞因子，特别是神经营养因子对帕金森病的治疗作用研究引人注目。其中，活化素B（Activin B）作为一种新近发现的内源性神经保护因子，正日益受到关注。然而，关于中枢神经系统给药途径、给药方式、药物能否透过血脑屏障、以及神经元是否能够透过层层包裹的胶质细胞而吸收药物等问题依旧没有得到良好的解决。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有神经元保护作用的生物制剂。

本发明所采取的技术方案是：

一种具有神经元保护作用的生物制剂，包含温敏性水凝胶和活化素B。

所述温敏性水凝胶由包括硫酸胍基丁胺、N,N'-双(丙稀酰)胱胺和N-异丙基丙烯酰胺的原料合成。

优选的，所述生物制剂中活化素B的浓度为10～25ng/μl。

本发明的有益效果是：

本发明将温敏性水凝胶包裹活化素B获得复合生物制剂，活化素B对神经元具有保护功能，新型温度敏感型水凝胶具有神经保护作用、抑制炎症和缓释功能，复合生物制剂中的活化素B通过在脑内缓慢释放发挥药效，协同抑制Mptp引起的小鼠纹状体区多巴胺能神经元的损伤，降低局部炎症反应，并从行为学上改善了帕金森病的症状。本发明为临床帕金森病及其他神经系统退变性疾病的治疗提供了重要的用药参考。

附图说明

图1为anti-TH免疫组织化学染色结果图。

图2为anti-F4/80免疫荧光染色结果图。

图3为小鼠行为学检测结果。

具体实施方式

本发明所用温敏性水凝胶由加拿大曼尼托巴大学邢梦秋教授提供，该温敏性水凝胶由包括硫酸胍基丁胺、N,N'-双(丙稀酰)胱胺和N-异丙基丙烯酰胺的原料合成。

申请人将活化素与上述温敏性水凝胶的优越性结合起来，研制出一种能有效改善神经系统变性性疾病损伤的水凝胶复合药物，为神经系统退变性疾病新药物的开发奠定基础、提供新的思路。

所述的具有神经元保护作用的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：按配比量取温敏性水凝胶、活化素B，0～4℃条件下混匀，制得活化素B的浓度为10～25ng/μl的制剂。

下面结合实施例，进一步阐述本发明内容。

实施例

1、按配比量取温敏性水凝胶、活化素B，于冰上操作，轻轻吹打搅拌混匀，制得不同浓度的制剂，制剂1～4中活化素B的浓度依次为10 ng/μl、15ng/μl、20ng/μl、25ng/μl。

2、动物试验

实验动物：C57BL/6J小鼠，雄性，8-10周龄。 

1)        动物模型的建立：用无菌生理盐水配置Mptp（购自Sigma公司），现用现配，腹腔注射小鼠，注射浓度为40mg/kg，一天内连续注射四次，构建帕金森疾病模型小鼠。

2)        试验分组和给药方法：按体重将小鼠随机分为5组：空白对照组（健康小鼠，腹腔注射生理盐水，不做其他处理），Mptp组（帕金森疾病模型小鼠，不做其他处理），Mptp+Activin B组（帕金森疾病模型小鼠，在小鼠脑双侧Cpu区注射Activin B，每侧2μl，各50ng），Mptp+水凝胶组（帕金森疾病模型小鼠，在小鼠脑双侧Cpu区注射水凝胶，每侧2μl），Mptp+Activin B+水凝胶组（帕金森疾病模型小鼠，在小鼠脑双侧Cpu区注射步骤1制备的制剂4，每侧2μl）；每组18只小鼠。采用立体定位注射技术，直接将药物注入小鼠纹状体区。

3)        术后取材：分别在术后的第7、21、35天，麻醉每组小鼠各5只，用4m/v%多聚甲醛灌注固定，取脑，用多聚甲醛后固定过夜，30%蔗糖脱水，冰冻切片，切片25μm，进行后续的免疫组化检测。

4)        anti-TH免疫组织化学染色：取25μm冰冻切片，5% BSA封闭1h，anti-TH（Millipore，兔抗小鼠）一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，SABC反应20min，DAB显色试剂盒（中杉金桥）显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。

5)        anti-F4/80免疫荧光染色：25μm冰冻切片，5%BSA封闭1h，anti-F4/80（eBioscience，兔抗小鼠）一抗4℃孵育过夜，羊抗兔红色免疫荧光二抗室温孵育2h，Leica正置荧光显微镜观察拍照。

6)        小鼠行为学检测：分别在术后的第7、21、35天，进行旷场实验和转棒实验。①旷场实验：步骤2）中每组小鼠各10只，将小鼠从笼中取出，放置在旷场中心区域，旷场实验视频分析记录系统记录5分钟，将小鼠取出。②转棒实验：小鼠分组同上，转棒测试仪调适转速为40rpm/min，加速时间为30s，总运行3min，记录小鼠从转棒上跌落的时间（s）。

图1显示术后第7、21、35天切片的anti-TH免疫组化结果，说明温敏性水凝胶联合活化素B(水凝胶+Activin B)可以有效保护Mptp诱导的帕金森疾病模型小鼠纹状体区多巴胺能神经元的损伤，通过立体定位方式直接打入帕金森小鼠模型的病灶部位，活化素B缓控释放，可达到长期有效的治疗目的，和单纯给予活化素B组对比显示出作用时间长的优势。

图2显示术后第7、21、35天切片的anti-F4/80免疫荧光染色结果，说明活化素 B可有效抑制局部的炎症细胞增生，水凝胶联合活化素B可以抑制炎症细胞增加。

图3显示在术后7、21、35天对小鼠进行行为学测定，发现水凝胶联合活化素B可以有效改善小鼠行为学变化，和Mptp模型单纯给予活化素B或水凝胶的组别相比，都有统计学差异。

Claims (3)

1.一种具有神经元保护作用的生物制剂，包含温敏性水凝胶和活化素B。

2.根据权利要求1所述的生物制剂，其特征在于：所述温敏性水凝胶由包括硫酸胍基丁胺、N,N'-双(丙稀酰)胱胺和N-异丙基丙烯酰胺的原料合成。

3.根据权利要求1所述的生物制剂，其特征在于：所述生物制剂中活化素B的浓度为10～25ng/μl。