CN104372099A

CN104372099A - 一种恶疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法

Info

Publication number: CN104372099A
Application number: CN201410699942.3A
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 吴小芹; 叶建仁
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Rui test precision medical testing (Shanghai) Co., Ltd
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN104372099B

Abstract

本发明公开了一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；BIP：5′-AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；F3：5′-TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；B3：5′-CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；LB：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为恶疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于恶疫霉菌的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对田间土壤中的恶疫霉菌进行检测。本发明对恶疫霉菌引起的疫病防治和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

Description

一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。

背景技术

恶疫霉(Phytophthora cactorum)侵染引起的植物疫病是一种世界性分布的土传毁灭性病害，危害超过200种植物，常给多种经济作物(如草莓、苹果、梨、人参等)的生产带来严重损失。恶疫霉菌属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。恶疫霉引起的植物病害分布广泛，所以建立恶疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。

传统的恶疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在恶疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测恶疫霉菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，恶疫霉菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中恶疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述恶疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供上述恶疫霉菌的LAMP检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

FIP：5′-TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；

BIP：5′-AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；

F3：5′-TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；

B3：5′-CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；

LB：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。

所述的LAMP检测引物组合物在检测恶疫霉菌中的应用。

一种检测恶疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH₄)₂SO₄、0.24mM MgSO₄、4％Triton X-100、Bst DNA polymerase 320单位，200mM羟基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：

FIP：5′-TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；

BIP：5′-AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；

F3：5′-TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；

B3：5′-CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；

LB：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。

所述的检测恶疫霉菌的LAMP试剂盒在检测恶疫霉菌中的应用。

一种检测恶疫霉菌的LAMP检测方法：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在恶疫霉菌；无特征性阶梯状条带，则所检测样品中无恶疫霉菌；或观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在恶疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在恶疫霉菌。

所述的检测恶疫霉菌的LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取1μL DNA溶液，加入23μLLAMP试剂盒中的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为：60℃～65℃，50～70min。

本发明的检测恶疫霉菌的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP；羟基萘酚蓝(hydroxylnaphthol blue，HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg²⁺的滴定剂，其颜色随溶液PH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg²⁺浓度的变化及溶液PH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg²⁺与LAMP反应的副产物P₂O₇ ^4-结合产生大量沉淀，溶液中Mg²⁺浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断恶疫霉菌的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在恶疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在恶疫霉菌。

本发明的关键性技术之一是恶疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证恶疫霉菌的特异性引物序列，本发明以15株恶疫霉菌菌株和13种其它卵菌以及19种病原真菌为供试材料(表1)，采用CTAB法提取发病组织中恶疫霉菌的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。所有的土壤样品采用SPIN试剂盒(Q-Biogene Ltd,USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。这一商用土壤微生物DNA提取试剂盒可以在0.5h内提取到土壤中的微生物。

当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升，通过HNB的显色反应结果所示，恶疫霉菌的反应管里均呈天蓝色，其为阳性结果，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性引物具有种的特异性。同时，反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，成像观察扩增的反应产物，恶疫霉菌的反应管中的反应液出现了典型阶梯形状条带，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管没有出现梯形条带。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中恶疫霉菌的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在恶疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取恶疫霉菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在。

表1 用于检测恶疫霉菌特异性的真菌和卵菌菌株

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：

1)准确性高：由于传统恶疫霉菌检测技术只是根据形态特征来确定检测对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；而本发明根据恶疫霉菌的Ypt1基因(Genebank:ID HQ850000.1)的序列，利用Bioedit软件将恶疫霉菌的Ypt1基因序列和其他疫霉种的序列进行比较，选取恶疫霉菌特有的一段序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。此外，反向环引物LB能够提高反应速率，和其他四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行恶疫霉检测。

2)操作方便：本发明提供的检测恶疫霉菌的LAMP方法克服了现有技术中恶疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测恶疫霉菌的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到恶疫霉菌，不需要复杂仪器，能较好满足对恶疫霉菌的现场检测。

3)实现了恒温扩增，不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

4)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过HNB的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。

5)本发明为恶疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于恶疫霉菌的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，也能够对田间土壤中的病原物进行检测。本发明对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

附图说明

图1是基于琼脂糖凝胶电泳和HNB颜色变化判定LAMP检测恶疫霉菌的特异性显色图；图中1(a)LAMP检测恶疫霉的特异性的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为100bpDNA marker；图中显示第1泳道以及第9泳道具有典型的梯形状条带，呈阳性；其余泳道呈阴性；图中1(b)颜色判定LAMP检测恶疫霉的特异性显色图；图中显示第1管以及第9管显天蓝色，呈阳性；其余管显紫色，呈阴性；其中，1，9：恶疫霉菌(P.cactorum)；3：苎麻疫霉(P.boehmeriae)；4：樟疫霉(P.cinnamomi)；5：辣椒疫霉(P.capsici)；6：掘氏疫霉(P.drechsleri)；7：致病疫霉(P.infestans)；8：草莓疫霉(P.fragariae)；10：终极腐霉(Pythium ultimum)；11：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；12：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；13：稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；14：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；15：大丽轮枝菌(Verticilium dahliae)；8，16：阴性对照；

图2是基于琼脂糖凝胶电泳和HNB颜色变化检测LAMP灵敏度；图中2(a)LAMP检测恶疫霉的的特异性的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为100bp DNA marker；图中2(b)颜色判定LAMP检测恶疫霉的灵敏度显色图；图中显示第1管以及第2管显天蓝色，呈阳性；第3-9管显紫色，呈阴性；25μL的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg恶疫霉菌DNA的反应管显天蓝色，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有10pg、1pg、100fg、10fg恶疫霉菌DNA的反应管显紫色，呈阴性反应。显色结果表明LAMP反应的灵敏度达到100pg。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。

实施例1

一种用于检测恶疫霉菌的LAMP检测试剂盒，由1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.2μM反向环引物LB、1.25mM dNTPs、20mM pH 8.8的Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％Triton X-100、Bst DNA polymerase 16单位、5mM羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成25uL检测溶液。各引物序列具体如下：

FIP：5′-TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；

BIP：5′-AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；

F3：5′-TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；

B3：5′-CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；

LB：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。

其中，正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB可直接组成用于检测恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物。

实施例2恶疫霉菌LAMP反应的特异性试验

为了验证LAMP方法的特异性，以15株恶疫霉菌菌株和13种其它卵菌以及19种病原真菌为供试材料(表1)，LAMP检测结果显示15株恶疫霉菌菌株均可观察到天蓝色的阳性反应或者琼脂糖凝胶电泳出现LAMP阶梯状的条带，其余13种卵菌以及19种病原真菌显色结果为紫色的阴性反应或者琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与恶疫霉菌不同种(苎麻疫霉；樟疫霉；辣椒疫霉；掘氏疫霉；致病疫霉；草莓疫霉等)和不同属的菌(平头炭疽菌；茄镰刀菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮枝菌；终极腐霉)的DNA作为模板，取1μL DNA溶液，加入23μL实施例1制备的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃60min。基于反应体系琼脂糖凝胶电泳和颜色反应做为结果判定标准，结果用LAMP引物扩增P.tentaculata的DNA模板时，都扩增出典型的阶梯状条带；而与P.tentaculata不同种、不同属的菌和阴性对照都没有能够扩增出目的条带(图1a)。同时显示扩增恶疫霉菌的DNA模板时，呈现天蓝色；扩增与恶疫霉菌不同种、不同属的菌的DNA模板和阴性对照都呈现紫色(图1b)。

实施例3恶疫霉菌LAMP反应的灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的恶疫霉菌的DNA用分光光度计测定浓度(1μg/μL)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液1μL作为模板，加入23μL实施例1制备的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃60min。取2μL扩增产物上样，结果显示琼脂糖凝胶电泳和HNB显色反应表明LAMP反应的灵敏度达到100pg的恶疫霉菌的DNA(图2)。

实施例4恶疫霉菌LAMP反应引物特异性验证和灵敏度验证

针对恶疫霉菌的LAMP引物组，共设计了11组符合条件的引物，最终筛选出1组最为特异并灵敏度极高的引物即实施例1中所使用的引物组合物(包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB)。采用设计的其余引物(随机从剩余10对引物中选1对)，引物序列如下：FIP1：5′-AGGAAACACGCCACGTCTGC-TCGAGCTGGACGGAAAGAC-3′；BIP1：5′-AACGGTCCACTTGTGTGTCTGT-AGTGATCGTGCGGAAACG-3′；F31：5′-TTTTTGCGGTTGTGCCCA-3′；B31：5′-CCACGATAATGCCATGGGC-3′；LB1：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′；以实施例2中所采用的菌株为供试材料(15株恶疫霉菌菌株和13种其它卵菌以及19种病原真菌)，LAMP检测结果显示所选引物的特异性不高，灵敏度也较差。说明用于本发明引物组合物具有较高的特异性和灵敏度。

实施例5从带菌土样中检测恶疫霉菌

实施例1的恶疫霉菌检测试剂盒用于检测恶疫霉菌的方法，包括：

1)土壤中卵孢子的富集：取待检土壤样品20～100克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3～10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1mL水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。

2)从微量卵孢子中提取DNA：将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min^-1转速下离心5分钟，倒出液体；加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；加入等体积氯仿抽提，在12000r.min^-1转速下离心10分钟，吸取上清；加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min^-1转速下离心10分钟，倒干液体；加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r.min^-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；加10μL无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。

3)恶疫霉菌LAMP检测，包括：恶疫霉菌的LAMP检测：取1μL DNA溶液，加入23μL的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；反应程序为：64℃60min；以HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，扩增结束后LAMP反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断从带菌土样中能够产生阳性反应含有恶疫霉菌。

实施例6活体组织中恶疫霉菌的LAMP检测

采用NaOH碱裂解法提取接种恶疫霉菌的发病草莓植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增。取1uL DNA溶液，按实施例4的方法，进行LAMP反应。结果显示接种恶疫霉菌的发病草莓植株中进行LAMP，其颜色反应也呈现阳性天蓝色；而健康草莓植株和阴性对照呈现紫色。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法

<130> 100

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FIP引物序列

<400> 1

tctgggcaca accgcaaaaa tttgcgagct ccagatttcc 40

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BIP引物序列

<400> 2

aatccgtacg atcgagctgg acacacgcca cgtctgct 38

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F3引物序列

<400> 3

ttctgcgcta ggcgacc 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> B3引物序列

<400> 4

cacacaagtg gaccgttag 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LB引物序列

<400> 5

ggaaagacca tcaagctcca gat 23

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FIP1引物序列

<400> 6

aggaaacacg ccacgtctgc tcgagctgga cggaaagac 39

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BIP1引物序列

<400> 7

aacggtccac ttgtgtgtct gtagtgatcg tgcggaaacg 40

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F31引物序列

<400> 8

tttttgcggt tgtgccca 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> B31引物序列

<400> 9

ccacgataat gccatgggc 19

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LB1引物序列

<400> 10

ggaaagacca tcaagctcca gat 23

Claims

1.一种用于检测恶疫霉菌的LAMP引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

FIP：5′- TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；

BIP：5′- AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；

F3：5′- TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；

B3：5′- CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；

LB：5′- GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。

2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测恶疫霉菌中的应用。

3.一种检测恶疫霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于：包含1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM 反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM （NH₄）₂SO₄、0.24mM MgSO₄、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320单位，200mM羟基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：

FIP：5′- TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC -3′；

BIP：5′- AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT -3′；

F3：5′- TTCTGCGCTAGGCGACC -3′；

B3：5′- CACACAAGTGGACCGTTAG -3′；

LB：5′- GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT -3′。

4.权利要求3所述的检测恶疫霉菌的LAMP试剂盒在检测恶疫霉菌中的应用。

5.一种检测恶疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP引物组合物或LAMP试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在恶疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在恶疫霉菌。

6.根据权利要求5所述的检测恶疫霉菌的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，取2 μL DNA溶液，加入23 μL LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：60℃~65℃，50-70min，扩增产物进行颜色变化的观察。