CN104364655A

CN104364655A - 贝伐单抗组合疗法用于治疗乳腺癌的血浆生物标志物

Info

Publication number: CN104364655A
Application number: CN201380030336.6A
Authority: CN
Inventors: U·克劳泽; N·穆尔; C·帕劳德; S·谢勒; N·怀尔德
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-02-18
Also published as: WO2014001232A1; CA2871385A1; MX2014014821A; RU2015102026A; JP2015522815A; BR112014032456A2; KR20150024342A; HK1202334A1; EP2864788A1

Abstract

本发明提供通过将贝伐单抗(bevacizumab)(

Description

贝伐单抗组合疗法用于治疗乳腺癌的血浆生物标志物

发明领域

本发明针对用于鉴定哪些诊断有乳腺癌的患者会最多地受益于用包含抗VEGF抗体的抗癌疗法治疗的方法。

发明背景

血管发生有助于良性和恶性疾病诸如癌症形成，而且尤其在癌症中，是原发性肿瘤生长，侵袭和转移所必需的。为了生长，肿瘤必须进行血管发生转换。需要血管内皮生长因子(VEGF)来诱导此血管发生转换。VEGF和VEGF途径中的基因被视为癌症进展的重要介导物。VEGF基因家族包括VEGF基因(亦称为VEGFA)，VEGF的同源物，包括胎盘生长因子(PlGF)，VEGFB，VEGFC，VEGFD，VEGF受体，包括VEGFR-1和VEGFR-2(亦分别称为FLT1和FLK1/KDR)，VEGF诱导物，包括缺氧可诱导因子HIF1α，HIF2α，和氧传感器PHD1，PHD2和PHD3。

此途径在癌细胞生长和转移中的重要性导致开发出用于癌症疗法的抗血管发生剂。这些疗法包括贝伐单抗(bevacizumab)，哌加他尼(pegaptanib)，舒尼替尼(sunitinib)，索拉非尼(sorafenib)和瓦他拉尼(vatalanib)。尽管用血管发生抑制剂诸如贝伐单抗获得显著延长的存活，但患者仍然死于癌症。另外，并非所有患者都响应血管发生抑制剂疗法。不响应性的根本机制仍然是未知的。而且，血管发生抑制剂疗法与副作用诸如胃肠穿孔，血栓形成，出血，高血压和蛋白尿有关。

因此，需要确定哪些患者对血管发生抑制剂疗法响应得特别好的方法。

发明概述

一项关于涉及血管发生和肿瘤发生的生物标志物的状态的调查揭示了在乳腺癌患者中，相对于在整个生物标志物患者群体中测定得到的参照水平，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的表达水平与改善的治疗结局有关。特别地，展现相对于在整个生物标志物患者群体中测定得到的参照水平升高的E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3表达水平的患者响应将贝伐单抗(bevacizumab)添加至曲妥单抗(trastuzumab)和多西他赛(docetaxel)的组合化疗表现出延长的无进展存活。

因此，本发明涉及确定诊断有乳腺癌的患者是否对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感的方法，其通过测定患者样品中选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平并将其与参照水平比较来进行。本发明还涉及包含抗VEGF抗体(诸如贝伐单抗)的药物组合物，其用于治疗诊断有乳腺癌且具有相对于参照水平升高的选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平的患者。本发明进一步涉及根据患者样品中选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平通过添加抗VEGF抗体(诸如贝伐单抗)改善诊断有乳腺癌的患者中包含化疗的抗癌疗法的治疗效果的方法。

本发明的一个实施方案提供确定诊断有乳腺癌的患者通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗是否更加合适或不太合适的体外方法。该方法包括：(a)在自诊断有乳腺癌的患者衍生的样品中测定选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平，并(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适或不太合适，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗更加合适，或者所述生物标志物的表达水平低于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗不太合适。在一些实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一些实施方案中，该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。在一些实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体为曲妥单抗(trastuzumab)。在一些实施方案中，所述紫杉烷为多西他赛(docetaxel)或帕利他赛(paclitaxel)。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物的表达水平为蛋白质表达水平。在一些实施方案中，所述自患者衍生的样品为血浆样品。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为ICAM-1。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。

本发明的另一个实施方案提供为诊断有乳腺癌的患者选择治疗的体外方法。所述方法包括：(a)检验来自患者的生物学样品，由此确定患者有选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平处于或高于参照水平，并(b)基于该确定，选择包括包含抗VEGF抗体的抗癌疗法的治疗。在一些实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一些实施方案中，该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。在一些实施方案中，所述患者未接受在先化疗或放射治疗。在一些实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体为贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体为曲妥单抗。在一些实施方案中，所述紫杉烷为多西他赛或帕利他赛。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物的表达水平为蛋白质表达水平。在一些实施方案中，所述自患者衍生的样品为血浆样品。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为ICAM-1。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。

本发明的又一个实施方案提供确定诊断有乳腺癌的患者是否对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感的体外方法。所述方法包括：(a)在自诊断有乳腺癌的患者衍生的样品中测定选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平，并(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。在一些实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一些实施方案中，该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。在一些实施方案中，所述患者未接受在先化疗或放射治疗。在一些实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体为贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体为曲妥单抗。在一些实施方案中，所述紫杉烷为多西他赛或帕利他赛。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物的表达水平为蛋白质表达水平。在一些实施方案中，所述自患者衍生的样品为血浆样品。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为ICAM-1。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。

本发明的甚至另一个实施方案提供为诊断有乳腺癌的患者选择抗癌疗法的体外方法。所述方法包括：(a)检验来自患者的生物学样品，由此确定患者有选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平处于或高于参照水平，并(b)基于该确定，选择包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法。在一些实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一些实施方案中，该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。在一些实施方案中，所述患者未接受在先化疗或放射治疗。在一些实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体为贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体为曲妥单抗。在一些实施方案中，所述紫杉烷为多西他赛或帕利他赛。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物的表达水平为蛋白质表达水平。在一些实施方案中，所述自患者衍生的样品为血浆样品。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为ICAM-1。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。

本发明的还有另一个实施方案提供药物组合物，其包含抗VEGF抗体，用于治疗诊断有乳腺癌的患者，其中依照任何本文所述方法已鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适。

本发明的又一个实施方案提供药物组合物，其包含抗VEGF抗体，用于治疗诊断有乳腺癌的患者，其中依照任何本文所述方法已鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。

本发明的还有另一个实施方案提供试剂盒，其用于进行任何本文所述方法。所述试剂盒包含用于检测选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平的化合物套组，该套组包含能够特异性结合所述生物标志物的抗体。

本发明的甚至另一个实施方案提供通过将抗VEGF抗体添加至化疗方案在诊断有乳腺癌的患者中改善包含化疗方案的抗癌疗法的治疗效果的方法。该方法包括：(a)在自诊断有阳性乳腺癌的患者衍生的样品中测定选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平；(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感；并(c)与有效量的化疗方案组合将有效量的抗VEGF抗体施用于依照(b)鉴定为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗的抗癌疗法敏感的患者。在一些实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一些实施方案中，该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。在一些实施方案中，所述患者未接受在先化疗或放射治疗。在一些实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体为贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体为曲妥单抗。在一些实施方案中，所述紫杉烷为多西他赛或帕利他赛。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物的表达水平为蛋白质表达水平。在一些实施方案中，所述自患者衍生的样品为血浆样品。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为ICAM-1。在一些实施方案中，所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。

发明详述

1.定义

如本文中使用的，术语“施用”或“给药”表示通过本领域已知的任何合适手段对需要此类治疗或医学干预的患者施用药物组合物，诸如血管发生抑制剂。非限制性施用路径包括口服，静脉内，腹膜内，皮下，肌肉内，表面，皮内，鼻内或支气管内施用(例如通过吸入来实现)。在本发明的语境中特别优选的是胃肠外施用，例如静脉内施用。

术语“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或是直接或是间接抑制血管发生(angiogenesis)，血管生成(vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物质，多核苷酸，多肽，分离的蛋白质，重组蛋白，抗体，或其偶联物或融合蛋白。应当理解，抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管发生剂是说明书全文定义的或本领域已知的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如但不限于VEGF-A的抗体，VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体，VEGF-陷阱，抗PDGFR抑制剂诸如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)，内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D'Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:217-39(1991)；Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara&Alitalo,Nature Medicine 5:1359-1364(1999)；Tonini et al.,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列举已知的抗血管发生因子的表2)；及Sato.Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且包括但不限于单克隆和多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，嵌合抗体，CDR嫁接抗体，人源化抗体，骆驼化(camelized)抗体，单链抗体和抗体片段和片段构建物，例如F(ab′)₂片段，Fab片段，Fv片段，单链Fv片段(scFv)，双特异性scFv，双抗体，单域抗体(dAb)和微型抗体(minibody)。

如本文中使用的，术语“VEGF”或“VEGF-A”指例如165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.(1989)Science 246:1306及Houck et al.(1991)Mol.Endocrin,5:1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式，包括纤溶酶切割VEGF₁₆₅生成的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如记载于Ferrara Mol.Biol.Cell 21:687(2010)。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

“VEGF生物学活性”包括对任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性，诸如调节正常的和异常的血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)(Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77:527-543)；促进胚胎脉管发生和血管发生(Carmeliet et al.(1996)Nature 380:435-439；Ferrara et al.(1996)Nature380:439-442)；及调控雌性生殖道中的和为了骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al.(1998)Nature Med.4:336-340；Gerber et al.(1999)Nature Med.5:623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生因子之外，VEGF，作为多效生长因子，在其它生理过程诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙流入中展现出多种生物学效应(Ferrara and Davis-Smyth(1997),见上文及Cebe-Suarez et al.Cell.Mol.LifeSci.63:601-615(2006))。此外，最近的研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞、和许旺(Schwann)细胞的促有丝分裂效应(Guerrin et al.(1995)J.Cell Physiol.164:385-394；Oberg-Welshet al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126:125-132；Sondell et al.(1999)J.Neurosci.19:5731-5740)。

“VEGF拮抗剂”或“VEGF特异性拮抗剂”指能够结合VEGF，降低VEGF表达水平，或者中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性(包括但不限于VEGF与一种或多种VEGF受体的结合及由VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖)的分子。在本发明的方法中有用的VEGF特异性拮抗剂包括特异性结合VEGF的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))、和VEGF121-白树毒素(Peregrine)。VEGF特异性拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗性变体、针对VEGF的反义核碱基寡聚物、针对VEGF的小RNA分子、RNA适体、肽体、和针对VEGF的核酶。VEGF特异性拮抗剂还包括结合VEGF且能够阻断、抑制、消除、降低、或干扰VEGF生物学活性的非肽小分子。如此，术语“VEGF活性”明确包括VEGF介导的VEGF生物学活性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。在某些实施方案中，所选择的抗体通常会具有对VEGF的足够结合亲和力，例如，该抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患。还有，该抗体可进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。例子包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692中所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利No.5,500,362)；及激动活性或造血测定法(参见WO95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF，PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗VEGF抗体是依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(BV；)的抗体。

抗VEGF抗体“贝伐单抗”(Bevacizumab；BV)是依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57：4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，也称作“rhuMAb VEGF”或“”。它包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879，通过述及明确将其完整公开内容收入本文。

术语“癌症”指哺乳动物中特征通常为细胞增殖不受调控的生理学疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌(包括转移性胰腺癌)，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，乳腺癌(包括局部晚期的，复发或转移性的HER-2阴性乳腺癌和局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌)，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌(liver cancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级无裂性小细胞NHL，贮积病(bulky disease)NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。

“生理学或病理学血管发生异常”的例子包括但不限于高度胶质瘤(highgrade glioma)，成胶质细胞瘤，M.Rendu-Osler，von-Hippel-Lindau病，血管瘤，银屑病，卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)，眼新血管化(ocularneovascularisation)，类风湿性关节炎，子宫内膜异位症，动脉粥样硬化，心肌缺血(myochardial ischemia)，外周缺血(peripheral ischemia)，脑缺血和伤口愈合。

术语“化疗剂”或“化疗方案”包括可以提供抗癌治疗效果，并且可以是化学药剂或生物学药剂，特别是能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物学药剂的任何活性剂。具体的活性剂是那些充当抗赘生物(化学毒性或化学抑制性)药剂的，其抑制或阻止恶性细胞的形成，成熟或增殖。化疗剂的例子包括烷化剂(alkylating agents)诸如氮芥类(nitrogen mustards)(例如，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异环磷酰胺(ifosfamide)，美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil))，亚硝脲类(nitrosoureas)(例如，卡莫司汀(carmustine)(BCNU)，洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU))，乙撑亚胺类(ethylenimines)/甲基蜜胺类(methylmelamines)(例如，三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine)(TEM)，三乙烯(triethylene)，硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(塞替派(thiotepa))，六甲蜜胺(hexamethylmelamine)(HMM，六甲蜜胺(altretamine))，磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)(例如，白消安(busulfan))，和三嗪(triazines)(例如，达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC))；抗代谢物诸如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，三甲曲沙(trimetrexate))，嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶，卡培他滨，氟脱氧尿嘧啶(fluorodeoxyuridine)，吉西他滨，阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(AraC，阿糖胞苷)，5-氮胞苷(azacytidine)，2，2’-二氟脱氧胞苷(2，2’-difluorodeoxycytidine)，和嘌呤类似物(例如，6-巯嘌呤，6-硫鸟嘌呤，硫唑嘌呤(azathioprine)，2’-脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)(喷司他丁(pentostatin))，红羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)，磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)，和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA))；自天然产物开发的抗有丝分裂药物(例如，帕利他塞，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(例如，长春碱(vinblastine，VLB)，长春新碱(vincristine)，和长春瑞滨(vinorelbine))，多西他赛(docetaxel)，雌莫司汀(estramustine)，和磷酸雌莫司汀)，表鬼臼毒素类(epipodophylotoxins)(例如，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(teniposide))，抗生素(例如，放线菌素(actimomycin)D，道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))，daunorubicon，多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，伊达比星(idarubicin)，博来霉素(bleomycin)，普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))，丝裂霉素(mitomycin)C，放线菌素(actinomycin))，酶(例如，L-门冬酰胺酶)，和生物反应修饰剂(biological response modifier)(例如，干扰素-α，IL-2，G-CSF，GM-CSF)；混杂的药剂，包括铂配位复合物(例如，顺铂，卡铂，奥沙利铂)，蒽二酮类(anthracenediones)(例如，米托蒽醌(mitoxantrone))，取代的脲(即，羟基脲(hydroxyurea))，甲基肼(methylhydrazine)衍生物(例如，N-甲基肼(MIH)，丙卡巴肼(procarbazine))，肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(mitotane)(o,p’-DDD)，氨鲁米特(aminoglutethimide))；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂(例如，泼尼松(prednisone)和等同物，地塞米松(dexamethasone)，氨鲁米特(aminoglutethimide))，黄体酮(progestin)(例如，己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)，醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))，雌激素(例如，己烯雌酚(diethylstilbestrol)，乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)及其等同物)；抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen))，雄激素(例如，丙酸睾酮(testosterone propionate)，氟甲睾酮(fluoxymesterone)及其等同物)，抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)，促性腺素释放素类似物，亮丙瑞林(leuprolide))，非类固醇抗雄激素(例如，氟他胺)，表皮生长因子抑制剂(例如厄洛替尼，拉帕替尼(lapatinib)，吉非替尼(gefitinib))，抗体(例如曲妥单抗(trastuzumab))，伊立替康(irinotecan)和其他药剂如亚叶酸。对于局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌的治疗，用于与贝伐单抗一起施用的化疗剂或化疗方案包括卡培他滨、帕利他赛、多西他赛和曲妥单抗及其组合(亦见本文中提供的例子)。

术语“多西他赛(docetaxel)”指一种抗肿瘤剂，其结合游离的微管蛋白且促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制它们的装配。这导致生成没有正常功能的微管束及稳定微管，阻断细胞于细胞周期的M期及引起细胞死亡。

术语“有效量”指药物单独或与其它药物或治疗方案组合时有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓和优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。就药物可预防现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。对于癌症疗法，可以例如通过评估存活持续时间，无进展存活(PFS)持续时间，响应率(RR)，响应持续时间，和/或生命质量来测量体内功效。

如本文中使用的，术语“表达水平”也可以指样品中本发明的标志物/指示物蛋白质的浓度或量。

术语“表位A4.6.1”指受抗VEGF抗体贝伐单抗()(参见MullerY et al.,Structure 15September 1998,6:1153-1167)识别的表位。在本发明的某些实施方案中，抗VEGF抗体包括但不限于与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。

“表位4D5”指HER2胞外域中抗体4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥单抗所结合的区域，如记载于WO2009/154651。此表位接近HER2的跨膜域，且在HER2的结构域IV之内，为来自约第489-630位残基的氨基酸残基，残基编号不含信号肽。参见Garrett et al Mol Cell.11:495-505(2003)；Cho et alNature 421:756-760(2003)；Franklin et al Cancer Cell 5:317-328(2004)；及Plowman et al.Proc.Natl.Acad.Sci 90:1746-1750(1993)。为了筛选基本上结合4D5表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述的。或者，可进行表位作图以评估抗体是否基本上结合HER2的4D5表位(例如HER2胞外域约第529位残基至约第625位残基区域内的任何一个或多个残基，含端点，残基编号包括信号肽)。

“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括EGFR，HER2，HER3和HER4受体。HER受体通常将包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和含有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。在一个实施方案中，HER受体是天然序列人HER受体。术语“ErbB1”，“HER1”，“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，指例如Carpenter et al,Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中公开的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(例如Humphrey et al.PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。erbB指编码EGFR蛋白质产物的基因。

表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Semba et al.,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)及Yamamoto et al.Nature 319:230-234(1986)中描述的人抗原HER2蛋白(Genebank编号X03363)。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因，而“neu”指编码大鼠p185的基因。

“抗Her2抗体”指结合HER2受体的抗体。任选地，HER抗体进一步干扰HER2活化或功能。在一个实施方案中，本发明的抗HER2抗体为结合HER2多肽上4D5表位的抗HER2抗体，或者在另一个实施方案中，为曲妥单抗。

人源化HER2抗体包括huMAb4D5-l，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或曲妥单抗(Trastuzumab，即)，如美国专利5，821，337的表3中所述。

“HER2阳性”的癌症或癌细胞或肿瘤是与同一组织类型的非癌细胞相比具有显著更高水平的HER受体蛋白质或基因的癌症或癌细胞或肿瘤。此类过表达可以是由基因扩增或转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的HER蛋白质水平的增加(例如经由免疫组织化学测定法，IHC)来确定HER受体的过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中编码HER的核酸的水平，例如经由荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)，Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。还可通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原(例如HER胞外域)来研究HER受体过表达或扩增(参见例如1990年6月12日公布的美国专利No.4,933,294；1991年4月18日公布的WO91/05264；1995年3月28日公告的美国专利5,401,638；及Sias et al.J.Immunol.Methods 132:73-80(1990))。除了上述测定法之外，熟练从业人员还可利用各种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自先前暴露于抗体的患者的活检。

术语“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤，渗透入淋巴和血管，经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶(转移)中生长。转移可以是局部的或远端的。转移是一个连续过程，视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落，经由血流而传播，并在远端部位停止而定。在新的部位，该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径均调节这种行为，而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。

术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交换使用，且指包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(优选超过3个)的分子。它的确切大小将取决于许多因素，其相应地取决于该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可合成或通过克隆得到。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合体也可在本发明的范围内。

术语“总体存活(OS)”指治疗期间和之后患者存活的时间的长度。如技术人员会领会的，如果患者属于具有与另一患者亚群相比统计学显著更长的均值存活时间的患者亚群的话，患者的总体存活得到改善或增强。

术语“患者”指期望治疗的任何单个动物，更具体地是哺乳动物(包括非人动物如例如犬，猫，马，家兔，动物园动物，牛，猪，绵羊和非人灵长类)。甚至更具体地，本文中所述患者是人。

术语“患有......的患者”指显示关于涉及生理性和病理性血管发生的疾病和/或肿瘤性疾病(诸如乳腺癌，特别是局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌)的临床体征的患者。

术语“药物组合物”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。

术语“无进展存活(PFS)”指治疗期间和之后依照主治医师或调查人员的评估，患者的疾病没有恶化，即没有进展的时间的长度。如技术人员会领会的，如果患者属于与类似处境的患者的对照组的平均或均值无进展存活时间相比具有更长的疾病没有进展的时间长度的患者亚群的话，患者的无进展存活得到改善或增强。

术语“多肽”涉及肽，蛋白质，寡肽或多肽，其涵盖给定长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键而连接。然而，本发明还涵盖此类蛋白质/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键以功能性类似物，例如20种由基因编码的氨基酸之一以外的氨基酸残基，例如硒代半胱氨酸替换。肽，寡肽和蛋白质可以称作多肽。术语多肽和蛋白质在本文中可互换使用。术语多肽还指且不排除多肽的修饰，例如糖基化，乙酰化，磷酸化等等。此类修饰在基础教科书中有充分描述，而且在专著中以及在多卷研究文献中有更为详细地描述。如本文中使用的，术语多肽还指且涵盖术语“抗体”。

术语“响应”在本发明的语境中指示患有，怀疑患有或倾向于患上乳腺癌，特别是局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌的受试者/患者显示对包含贝伐单抗的化疗方案的响应。技术人员会容易地能够确定依照本发明的方法用贝伐单抗治疗的人是否显示响应。例如，响应可以反映为来自乳腺癌，特别是局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌的痛苦减轻，诸如肿瘤生长降低和/或停止，肿瘤的尺寸缩小和/或癌症的一种或多种症状改善。优选地，响应可以反映为乳腺癌的转移性转化的指数降低或减少，诸如预防转移形成或降低转移数目或尺寸(参见例如Eisenhauser et al.,New response evaluationcriteria in solid tumours:Revised RECIST guideline(version 1.1)Eur.J.Cancer200945:228-247)。

如本文中使用的，术语“参照样品”指用于比较目的的任何样品、标准品或水平。在一个实施方案中，参照样品是自同一受试者或患者的身体的健康和/或非患病部分(例如组织或细胞)获得的。在另一个实施方案中，参照样品是自同一受试者或患者的身体的未处理组织和/或细胞获得的。在还有另一个实施方案中，参照样品是自不是受试者或患者的个体的身体的健康和/或非患病部分(例如组织或细胞)获得的。在甚至另一个实施方案中，参照样品是自不是受试者或患者的个体的身体的未处理组织和/或细胞部分获得的。在某些实施方案中，参照样品是在一个或多个与获得测试样品的时间不同的时间点来自相同受试者或患者的单一样品或组合多份样品。例如，参照样品是在比获得测试样品的时间更早的时间点自相同受试者或患者获得的。如果参照样品是在癌症的初始诊断期间获得的而测试样品是更晚，在癌症已经转移时获得的话，此类参照样品可以是有用的。在某些实施方案中，参照样品包括自一个或多个不是受试者或患者的个体获得的，上文术语“样品”下定义的所有类型的生物学样品。在某些实施方案中，参照样品是自一个或多个具有血管发生性病症(例如癌症)的、不是受试者或患者的个体获得的。在某些实施方案中，参照样品是来自一个或多个不是受试者或患者的健康个体的组合多份样品。在某些实施方案中，参照样品是来自一个或多个具有疾病或病症(例如血管发生性病症，诸如例如癌症)的、不是受试者或患者的个体的组合多份样品。在某些实施方案中，参照样品是来自正常组织的合并RNA样品或来自一个或多个不是受试者或患者的个体的合并血浆或血清样品。在某些实施方案中，参照样品是来自肿瘤组织的合并RNA样品或来自一个或多个具有疾病或病症(例如血管发生性病症，诸如例如癌症)的、不是受试者或患者的个体的合并血浆或血清样品。

术语“参照水平”在本文中指预定值。如技术人员会领会的，参照水平预先确定和设置为在例如特异性和/或灵敏度方面达到要求。这些要求可以变化，例如在不同管理机构之间。它可以是例如测定法灵敏度或特异性分别要设置成某些限制，例如80％，90％或95％。这些要求也可以在阳性或阴性预测值方面限定。无论如何，基于本发明中给出的教导，总是会有可能到达达到那些要求的参照水平。在一个实施方案中，参照水平是在健康个体中确定的。在一个实施方案中，参照值是在患者所属疾病实体中预先确定的。在某些实施方案中，参照水平可以例如设置为调查的疾病实体中的值的总体分布的25％和75％之间的任何百分位。在其它实施方案中，参照水平可以例如设置为自调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值，三分位或四分位。在一个实施方案中，参照水平设置为自调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值。

在某些实施方案中，术语“升高”或“高于”指高于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的，E-选择蛋白、ICAM-1或VEGFR-3水平与来自参照样品的E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平相比5％，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，100％或更大的总体升高。在某些实施方案中，术语“升高”指E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的升高，其中升高是与例如自参照样品预先测定的E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平相比高至少约1.5，1.75，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，70，75，80，90，或100倍。在一个优选的实施方案中，术语“升高的水平”指处于或高于参照水平的值。

在某些实施方案中，术语“降低”或“低于”在本文中指低于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平与来自参照样品的E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平相比5％，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更大的总体降低。在某些实施方案中，术语“降低”指E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平的降低，其中“降低的水平”是来自参照样品的E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平的至多约0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，或0.01倍或更低。

在某些实施方案中，术语“处于参照水平”指与参照样品中通过本文所述方法检测的E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3水平相同的水平。

“复发性”癌症指在对初始疗法的响应之后，在初始部位或在远端部位再次生长的癌症。

术语“对……敏感”在本发明的语境中指示患有，怀疑患有或倾向于患上乳腺癌，特别是局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌的受试者/患者以某种方式对与化疗方案组合的贝伐单抗的治疗显示阳性反应。患者的反应在与如上文描述的“对......响应”的患者相比时可以是不太明显的。例如，患者可以经历较少的与疾病有关的痛苦，尽管可能没有测量到肿瘤生长或转移性指示物的降低，和/或患者对与化疗方案组合的贝伐单抗的反应可以仅仅是瞬时性质的，即肿瘤的生长和/或转移可以仅仅是暂时降低或停止的。

术语“存活”指受试者保持活着，包括无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。存活可通过Kaplan-Meier法来评估，而且存活的任何差异可使用分层时序检验来计算。

“延长存活(extending survival)”或“提高存活可能性”意味着使接受治疗的受试者的PFS和/或OS相对于未接受治疗的受试者(即相对于未用VEGF抗体治疗的受试者)或相对于对照治疗方案(诸如只用化疗剂的治疗，诸如局部复发性或转移性乳腺癌的标准护理(standard of care)中使用的那些，例如卡培他滨，紫杉烷，蒽环类抗生素，帕利他赛，多西他赛，帕利他赛蛋白质结合颗粒(例如)，多柔比星，表柔比星，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，或曲妥单抗(例如)，或其组合)有延长。在一个实施方案中，用于治疗局部复发性或转移性乳腺癌的此类标准护理是包含曲妥单抗和多西他赛的治疗组合。存活在启动治疗之后或在初始诊断之后监测至少约1个月，约2个月，约4个月，约6个月，约9个月，或至少约1年，或至少约2年，或至少约3年，或至少约4年，或至少约5年，或至少约10年，等。

术语“危害比(Hazard ratio，HR)”是事件比率的统计定义。为了本发明的目的，危害比定义为代表任何特定时间点时实验分支中的事件概率除以对照分支中的事件概率。无进展存活分析中的“危害比(hazard ratio)”是两条无进展存活曲线之间的差异的汇总，代表随访期里与对照相比治疗的死亡风险降低。

如本文中使用的，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或所处理细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。

术语“治疗效果”涵盖术语“总体存活”和“无进展存活”。

术语“E-选择蛋白”指由多种炎性刺激诱导的内皮粘附分子(Bevilacqua,P.P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,9238-9242(1987)；Luscinskas,F.W.etal.,J.Immunol.142 2257-2263(1989)；Kuijpers,T.W.et al.,J.Immunol.1471369-1376(1991))。一种编码E-选择蛋白的克隆基因(ELAM-1)披露于美国专利No.5,081,034。E-选择蛋白以UniProtKB登录号P16581和Gene ID(NCBI)：6401例示。术语“E-选择蛋白”涵盖其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“E-选择蛋白”还涵盖其变体，以及该序列的片段，前提是变体蛋白质(包括同等型)，同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种E-选择蛋白特异性抗体识别，诸如抗体克隆BBIG-E5或5D11，它们可得自R&DSystems。

术语“ICAM-1”指细胞间粘附分子1，以UniProtKB登录号P05362和GeneID(NCBI)：3383例示。术语“ICAM-1”涵盖其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“ICAM-1”还涵盖其变体，以及该序列的片段，前提是变体蛋白质(包括同等型)，同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种ICAM-1特异性抗体识别，诸如抗体克隆11C81或14C11，它们可得自R&D Systems。

术语“VEGFR-3”指血管内皮生长因子受体3，以UniProtKB登录号P35916和Gene ID(NCBI)：2324例示。术语“VEGFR-3”涵盖其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“VEGFR-3”还涵盖其变体，以及该序列的片段，前提是变体蛋白质(包括同等型)，同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGFR-3特异性抗体识别，诸如抗体克隆54716或5B6，它们可分别得自R&DSystems和Abnova。

2.详细的实施方案

在本发明中，鉴定出E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3为抗血管发生疗法的存活的标志物或预测性生物标志物。术语“标志物”、“生物标志物”和“预测性生物标志物”可互换使用，指E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的表达水平。在一个实施方案中，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3还可用作乳腺癌，更具体地，HER2阳性乳腺癌的预后性生物标志物。

因而，本发明提供一种测定诊断有乳腺癌的患者通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗是否更加合适或不太合适的体外方法，该方法包括：

(a)在自诊断有乳腺癌的患者衍生的样品中测定选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平，并

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适或不太合适，所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗更加合适，或者所述生物标志物的表达水平低于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗不太合适。在一个实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一个实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含抗VEGF抗体，用于治疗诊断有乳腺癌的患者，其中通过下述体外方法已鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适，该方法包括：

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适或不太合适，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗更加合适，或者所述生物标志物的表达水平低于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗不太合适。在一个实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一个实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为对通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适或不太合适，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者对用该抗癌疗法治疗更加合适，或所述生物标志物的表达水平低于参照水平指示患者对用该抗癌疗法治疗不太合适。在一个实施方案中，就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。在一个实施方案中，所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体、抗HER2抗体和紫杉烷。

本发明还提供一种确定诊断有乳腺癌的患者是否对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感的体外方法，所述方法包括：

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。在一个实施方案中，就无进展存活而言来确定患者是否对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。在一个实施方案中，所述化疗方案包含抗HER2抗体和紫杉烷。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含抗VEGF抗体，用于治疗诊断有乳腺癌的患者，其中通过体外方法已鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感，所述方法包括：

本发明还提供一种通过将抗VEGF抗体添加至化疗方案在诊断有乳腺癌的患者中改善包含化疗方案的抗癌疗法的治疗效果的方法，该方法包括：

(a)在自诊断有乳腺癌的患者衍生的样品中测定选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平；

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感；并

(c)与有效量的化疗方案组合将有效量的抗VEGF抗体施用于依照(b)鉴定为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗的抗癌疗法敏感的患者。在一个实施方案中，就无进展存活而言来确定患者对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法是否敏感。在一个实施方案中，所述化疗方案包含抗HER2抗体和紫杉烷。

在一个实施方案中，如下进行生物标志物的所述测定：a)使样品与特异性结合生物标志物的试剂接触，由此在试剂和生物标志物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，由此测量生物标志物的水平；或b)扩增样品中存在的生物标志物并用特异性结合所扩增的生物标志物的试剂检测所扩增的生物标志物，由此测量生物标志物的水平。

在一个实施方案中，所述患者诊断有HER2阳性乳腺癌，更具体地，局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌。在一个实施方案中，所述患者未接受在先化疗或放射治疗。

在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体结合A4.6.1表位。更具体地，所述抗VEGF抗体为贝伐单抗。

在一个实施方案中，所述紫杉烷为多西他赛(docetaxel)或帕利他赛(paclitaxel)，更具体地，为多西他赛。

在一个实施方案中，所述抗HER2抗体结合4D5表位。更具体地，所述抗HER2抗体为曲妥单抗。

在一个实施方案中，所述表达水平为蛋白质表达水平。

在一个实施方案中，所述样品为血浆样品。

在一个实施方案中，所述表达水平为E-选择蛋白的表达水平。在一个实施方案中，所述表达水平为ICAM-1的表达水平。在一个实施方案中，所述表达水平为VEGFR-3的表达水平。

在本文所述发明的语境中，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的表达水平，特别是蛋白质表达水平可作为单独的标志物分开考虑，或者作为表达概况或标志物组以两项或更多项的组考虑。在本文所述发明的语境中，表达概况或标志物组(其中两种或更多种标志物的表达概况可以一起考虑)也可以称作组合表达水平。例如，两种或更多种标志物的表达水平可以添加到一起及与相似测定的对照组合表达水平比较。因此，本发明的方法涵盖基于一种或多种标志物的表达水平测定表达概况，包括组合表达水平。

在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，对于分开考虑E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3，使用下述值作为标志物的相应高或低表达值：高E-选择蛋白(≥36.9pg/ml)，低E-选择蛋白(<36.9pg/ml)，高ICAM-1(≥210ng/ml)，低ICAM-1(<210ng/ml)，高VEGFR-3(≥10.6ng/ml)，低VEGFR-3(<10.6ng/ml)。这些水平是按照前瞻性分析计划作为样品中值确定的。另外，构成特定标志物的高和低表达之间截留值的经过优化的水平可以通过改变截留直至高于和低于截留的患者子集满足有关统计学最优性标准来确定。例如，可以选择最佳割点，使得高于和低于的子集之间的治疗危害比差异最大化，或使得一个子集中的治疗效果最大化，或任何其它有关统计学标准。然而，技术人员会理解特定标志物的表达水平和因此构成高或低表达水平的表达水平可以随患者和随患者群体而变化。因而，技术人员会理解在使用所附示例性实施例中所述以外的检测方法及研究所附示例性实施例中所述以外的患者和患者群体时，技术人员考虑的特定生物标志物的高和/或低表达水平可以不同于本文中描述的值。鉴于本文中描述的方法，技术人员能确定什么构成特定生物标志物的高和/或低表达水平。

在一个实施方案中，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的所述参照水平设为自患者组衍生的样品中浓度的中值。在一个例子中，E-选择蛋白的所述参照水平为血浆中约36.9ng/mL。在一个例子中，ICAM-1的所述参照水平为血浆中约210ng/mL。在一个例子中，VEGFR-3的所述参照水平为血浆中约10.6ng/mL。在一个实施方案中，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的所述参照水平通过自患者组衍生的样品的四分位分析来确定。在一个实施方案中，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的所述参照水平设为自患者组衍生的样品中浓度升高的第一个四分位值。在一个例子中，E-选择蛋白的所述参照水平为血浆中约26.7ng/mL。在一个例子中，ICAM-1的所述参照水平为血浆中约170.4ng/mL。在一个例子中，VEGFR-3的所述参照水平为血浆中约7.8ng/mL。在一个实施方案中，E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的所述参照水平设为自患者组衍生的样品中浓度升高的第三个四分位值。在一个例子中，E-选择蛋白的所述参照水平为血浆中约49.1ng/mL。在一个例子中，ICAM-1的所述参照水平为血浆中约272.2ng/mL。在一个例子中，VEGFR-3的所述参照水平为血浆中约13.0ng/mL。

正如技术人员会领会的，有多种方式使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。在一种相当简单但常常有效的办法中，如果样品对于至少一种调查标志物呈阳性，那么假定为阳性结果。

然而，也可以评估标志物组合。可以数学组合为标志物组的标志物，例如对E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3测量的值(或组合表达水平)，并将组合值与潜在的诊断问题关联起来。标志物值可以通过任何适宜现有技术数学方法来组合。用于将标志物组合与疾病或与治疗效果关联起来的公知数学方法采用像判别分析(DA)(即线性，二次，规则DA)，Kernel方法(即SVM)，非参数方法(即k-最近邻居分类器)，PLS(部分最小二乘)，基于树的方法(即逻辑回归，CART，随机森林方法，助推/装袋方法)，广义线性模型(即对数回归)，基于主分量的方法(即SIMCA)，广义叠加模型，基于模糊逻辑的方法，基于神经网络和遗传算法的方法的方法。技术人员选择适宜方法来评估本发明的标志物组合不会有问题。将依照本文中公开的本发明的标志物组合与例如改善的总体存活，无进展存活，对将贝伐单抗添加至化疗剂/化疗方案的响应性或敏感性和/或预测对(添加至一种或多种化疗剂/化疗方案的)贝伐单抗的响应或敏感性关联起来中使用的方法选自DA(即线性，二次，规则判别分析)，Kernel方法(即SVM)，非参数方法(即k-最近邻居分类器)，PLS(部分最小二乘)，基于树的方法(即逻辑回归，CART，随机森林方法，助推方法)，或广义线性模型(即对数回归)。涉及这些统计方法的详情见下述参考文献：Ruczinski,I.,et al,J.of Computational and Graphical Statistics,12(2003)475-511；Friedman,J.H.,J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175；Hastie,Trevor,Tibshirani,Robert,Friedman,Jerome,TheElements of Statistical Learning,Springer Series in Statistics,2001；Breiman,L.,Friedman,J.H.,Olshen,R.A.,Stone,C.J.(1984)Classification and regressiontrees,California:Wadsworth；Breiman,L.,Random Forests,Machine Learning,45(2001)5-32；Pepe,M.S.,The Statistical Evaluation of Medical Tests forClassification and Prediction,Oxford Statistical Science Series,28(2003)；及Duda,R.O.,Hart,P.E.,Stork,D.G.,Pattern Classification,Wiley Interscience,2nd Edition(2001)。

因而，本文中公开的本发明涉及经过优化的多变量截留用于生物学标志物的潜在组合及区分状态A与状态B，例如对包括将贝伐单抗添加至化疗方案的抗癌疗法响应或敏感的患者与作为将贝伐单抗疗法添加至化疗方案的较差响应者的患者的用途。在这类分析中，标志物不再是独立的，而是形成标志物组或组合表达水平。

3.检测E-选择蛋白、ICAM-1或VEGFR-3的表达水平

标志物E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平可通过本领域已知的适合于测定患者样品中特定蛋白质水平的任何方法来评估，而且优选通过采用对E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项特异性的抗体的免疫测定法方法，诸如ELISA来测定。此类方法是本领域公知的且常规执行的，而且相应商业性抗体和/或试剂盒易于获得。例如，用于E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的商业性抗体/测试试剂盒可分别得自R&DSystems，如克隆BBIG-E5和5D11，得自R&D systems，如克隆11C81和14C11及得自R&D Systems和Abnova，如克隆54716和5B6。优选地，本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平使用抗体或试剂盒制造商的试剂和/或方案推荐来评估。技术人员也会知道用于通过免疫测定法方法测定E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平的别的手段。因此，本发明的一种或多种标志物/指示物的表达水平可以由本领域技术人员常规且可再现地测定，没有过度负担。然而，为了确保精确且可再现的结果，本发明还涵盖在能确保确立测试规程的专业化实验室中测试患者样品。

E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3蛋白质或核酸可使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以对来自哺乳动物的组织或细胞样品方便地测定例如蛋白质(使用Western和ELISA)，来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA或DNA(使用Northern，点印迹，或聚合酶链式反应(PCR)分析，阵列杂交，RNA酶保护测定法，或使用DNA SNP芯片微阵列，它们是商品化的，包括DNA微阵列快照)。例如，实时PCR(RT-PCR)测定法诸如定量PCR测定法是本领域公知的。在本发明的一个示例性实施方案中，一种用于检测生物学样品中来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；扩增如此生成的cDNA；并检测扩增cDNA的存在。另外，此类方法可包括一个或多个容许测定生物学样品中mRNA水平的步骤(例如通过同时检查“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。任选地，可测定扩增cDNA的序列。

可得到多份参考文献来提供应用上述技术的指导(Kohler et al.,Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1980)；Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier,Amsterdam,1985)；Campbell,Monoclonal Antibody Technology(Elsevier,Amsterdam,1984)；Hurrell,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press,Boca Raton,FL,1982)；及Zola,Monoclonal Antibodies:A Manualof Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.,1987))。

可以评估作为生物学样品的患者样品中E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平。患者样品可以是血液样品，血清样品或血浆样品。获得血液样品，血清样品和血浆样品的方法是本领域公知的。患者样品可以在新辅助疗法之前或之后或在辅助疗法之前或之后得自患者。

4.治疗方法

在本发明的语境中，贝伐单抗要添加至作为本领域已知的标准化疗方案的一部分施用的一种或多种化疗剂或与作为本领域已知的标准化疗方案的一部分施用的一种或多种化疗剂一起作为共同疗法或共同治疗施用。此类标准化疗方案中包括的药剂的例子包括5-氟尿嘧啶，亚叶酸，伊利替康(irinotecan)，吉西他滨，厄洛替尼，卡培他滨(capecitabine)，紫杉烷诸如多西他赛和帕利他赛，干扰素阿尔法，长春瑞滨(vinorelbine)，和基于铂的化疗剂诸如卡铂(carboplatin)，顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。如所附示例性实施例中证明的，添加贝伐单抗实现了依照E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平定义和选择的患者和/或患者群体中无进展存活的延长。如此，贝伐单抗可以与化疗方案，诸如多西他赛疗法组合，如所附示例性实施例中证明的。

常用施用模式包括胃肠外施用如推注或如设定时间段里的输注，例如在10分钟，20分钟，30分钟，40分钟，50分钟，60分钟，75分钟，90分钟，105分钟，120分钟，3小时，4小时，5小时或6小时里施用总的日剂量。例如，可以根据所治疗的癌症的类型每周，每2周或每3周施用2.5mg/kg体重至15mg/kg体重贝伐单抗()。剂量的例子包括每周，每2周或每3周给予2.5mg/kg体重，5mg/kg体重，7.5mg/kg体重，10mg/kg体重和15mg/kg体重。剂量的其它例子是5mg/kg体重每2周，每2周10mg/kg体重，每3周7.5mg/kg体重和每3周15mg/kg体重。在本文所述发明的语境中，低剂量贝伐单抗包括例如每周2.5mg/kg体重，每2周5mg/kg体重和每3周7.5mg/kg体重的剂量。在本文所述发明的语境中，高剂量贝伐单抗包括例如每周5mg/kg体重，每2周10mg/kg体重和每3周15mg/kg体重的剂量。

技术人员会认识到，本发明涵盖由具体患者和化疗方案确定的贝伐单抗的其它施用模式，而且具体施用模式和治疗剂量是由主治医师依照本领域已知的方法最佳确定的。

依照本发明的方法选择的患者用与化疗方案组合的贝伐单抗来治疗，而且可以进一步用一种或多种别的抗癌疗法来治疗。在某些方面，该一种或多种别的抗癌疗法为放射。

5.试剂盒

本发明还涉及一种诊断组合物或试剂盒，其包含适合于测定E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平的寡核苷酸或多肽。如本文中详述的，寡核苷酸(诸如DNA，RNA或DNA和RNA的混合物)探针可用于检测标志物/指示物蛋白质的mRNA水平，而多肽可用于经特异性蛋白质-蛋白质相互作用直接检测标志物/指示物蛋白质的蛋白质水平。在本发明的优选方面，作为用于E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平的探针涵盖的且本文中描述的试剂盒或诊断组合物中包括的多肽是对这些蛋白质特异性的或对其同源物和/或截短物特异性的抗体。

因而，在本发明的又一个实施方案中，提供一种对于进行本文中描述的方法有用的试剂盒，其包含能够测定E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平的寡核苷酸或多肽。寡核苷酸可包含对编码一种或多种本文中描述的标志物/指示物的mRNA特异性的引物和/或探针，而多肽包含能够与标志物/指示物蛋白质特异性相互作用的蛋白质，例如标志物/指示物特异性抗体或抗体片段。

在上文所述方法之外，本发明还涵盖用于评估或测定E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平的别的免疫测定方法，诸如通过Western印迹和基于ELISA的检测。如本领域理解的，本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平也可以在mRNA水平评估，通过本领域已知的任何合适方法，诸如Northern印迹，实时PCR和RT-PCR。基于免疫测定法和mRNA的检测方法和系统是本领域公知的，而且可以自标准教科书，诸如Lottspeich(Bioanalytik,Spektrum Akademisher Verlag,1998)或Sambrook and Russell(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,U.S.A.,2001)推导。所述方法具体用于相对于在诊断有乳腺癌，特别是局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌的群体中建立的对照水平，测定患者或患者组中E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的表达水平。

E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平也可以利用免疫凝集，免疫沉淀(例如免疫扩散，免疫电泳，免疫固定)，Western印迹技术(例如(原位)免疫细胞化学，亲和层析，酶免疫测定法)，等等在蛋白质水平上测定。溶液中纯化的多肽的量也可以通过物理方法，例如光度法来测定。量化混合物中特定多肽的方法通常依赖于特异性结合，例如抗体的。利用抗体特异性的特异性检测和量化方法包括例如免疫测定法方法。例如，患者样品中本发明标志物/指示物蛋白质的浓度/量可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。或者，可实施Western印迹分析或免疫染色。Western印迹组合通过电泳分开蛋白质混合物和使用抗体特异性检测。电泳可以是多维的，诸如2D电泳。通常，将多肽在2D电泳中根据它们的表观分子量沿一维分开并根据它们的等电点延另一维分开。

如上所述，依照本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平也可以反映为编码E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的相应基因的表达升高。因此，可以对翻译(例如剪接，未剪接或部分剪接的mRNA)之前的基因产物实施定量评估以评估相应基因的表达。本领域技术人员知道要在此语境中使用的标准方法，或者可以自标准教科书(例如Sambrook,2001,见上文)推导这些方法。例如，关于编码E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的mRNA的相应浓度/量的定量数据可以通过Northern印迹，实时PCR等等来获得。

在本发明的又一个方面，可以有利地使用本发明的试剂盒来进行本发明的方法，而且可以在多种应用中，例如在诊断领域或作为研究工具等采用。本发明的试剂盒的各部分可以个别地在管形瓶中或组合地在容器或多容器单元中包装。优选地，试剂盒的制造遵循本领域技术人员知道的标准规程。试剂盒或诊断组合物可用于依照本文所述本发明方法采用例如本文中描述的免疫组织化学技术检测E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3中一项或多项的表达水平。

为了在本文所述检测方法中使用，技术人员有能力标记本发明涵盖的多肽(例如抗体)或寡核苷酸。如本领域常规实践的，可以依照本领域已知的标准方法标记并显现供检测mRNA水平使用的杂交探针和/或供免疫测定法方法中使用的抗体或抗体片段，常用系统的非限制性例子包括使用放射性标记物，酶标记物，荧光标签，生物素-亲合素复合物，化学发光，诸如此类。

实施例

以下述非限制性例示性实施例进一步例示本发明。

实施例1：与单独的曲妥单抗/多西他赛相比，贝伐单抗与曲妥单抗/多西他赛组合作为一线治疗用于具有HER2阳性局部复发性或转移性乳腺癌的患者的–AVEREL研究

本文中公开的临床试验的主要目的是比较随机化分入贝伐单抗与曲妥单抗/多西他赛组合的患者与随机化分入单独的曲妥单抗/多西他赛的患者中的无进展存活(PFS)。次要目的是评估总体存活(OS)；最佳总体响应(OR)；响应持续时间(DR)；距治疗失败的时间(TTF)；组合贝伐单抗与曲妥单抗和多西他赛的安全性和耐受性；及最终生命质量。

具体而言，本文中描述的研究确定(1)与曲妥单抗(8mg/kg加载剂量，继以6mg/kg，每3周，直至疾病进展)+多西他赛(100mg/m²，每3周最少6个周期)相比，贝伐单抗(15mg/kg，每3周)+曲妥单抗(8mg/kg加载剂量，继以6mg/kg，每3周，直至疾病进展)+多西他赛(100mg/m²，每3周，最少6个周期)赋予主要变量PFS方面的正面治疗效果；和(2)贝伐单抗(15mg/kg，每3周)+曲妥单抗(8mg/kg加载剂量，继以6mg/kg，每3周，直至疾病进展)+多西他赛(100mg/m²，每3周，最少6个周期)具有可接受的安全性概况。

研究设计

该试验是一项随机化的，开放标签的，2个分支的，多中心的，III期研究。经由中心随机化过程基于1：1将患者随机指派至各治疗组。使用一种区组设计随机化规程。为了避免两个治疗分支之间患者群体中重要预后因子的不平衡，依照下述标准将患者分层：

●在先辅助/新辅助紫杉烷/自最后一剂辅助/新辅助化疗距复发的时间。首先依在先紫杉烷治疗(是对否)将患者分层。如果“无在先紫杉烷”，那么实施第二项分层，即从未接受辅助/新辅助化疗或自最后一剂化疗起≥12个月对自最后一剂化疗起<12个月复发。

●曲妥单抗作为辅助治疗的一部分对无曲妥单抗；

●激素受体(ER/PgR)状态(阳性对阴性)；和

●可测量疾病(是对否)

将患者随机化分入下述两个分支之一：

●分支A：曲妥单抗(8mg/kg加载剂量，继以6mg/kg，每3周，直至疾病进展)+多西他赛(100mg/m²，每3周，最少6个周期(或直到疾病进展或不可接受的毒性，以先发生者为准)。6个周期没有进展或毒性后，可以根据调查人员的判断继续多西他赛的额外周期。

●分支B：曲妥单抗(8mg/kg加载剂量，继以6mg/kg，每3周，直至疾病进展)+多西他赛(100mg/m²，每3周，最少6个周期(或直到疾病进展或不可接受的毒性，以先发生者为准)。6个周期没有进展或毒性后，可以根据调查人员的判断继续多西他赛的额外周期+贝伐单抗(15mg/kg，每3周，直至疾病进展)。

表1：研究概览和剂量给药方案

研究长度

在大约29个月里自60个中心募集了424名患者，并针对主要终点(PFS)跟踪约26个月。

研究结束

这是一项事件驱动的试验。当在424名随机化患者中确认310例事件时实施主要终点的分析。在最后一名患者随机化之后大约36个月进行了另一项总体存活分析，此时结束该试验。在最后一次拜访最后一名参与这项试验的患者那天发生研究结束，与在最后一名患者随机化之后大约36个月进行的最终总体存活分析一致。

在这项最终总体存活临床取舍点切割分析之后，受益于研究治疗的患者可继续接受贝伐单抗，直至疾病进展。

患者数目/治疗组指派

将424名患者1：1随机化分入试验的两个分支：

●曲妥单抗/多西他赛分支(分支A)中的205名HER2阳性患者；和

●贝伐单抗加曲妥单抗/多西他赛治疗分支(分支B)中的205名HER2阳性患者。

将患者随机指派至各治疗组。患者在随机化日接受她们的第一剂研究治疗，但是不晚于随机化后的5个工作日。在任何情况下都不允许将在这项研究中登记的患者重新随机化分入这项研究并登记第二个疗程。

合格患者登记标准

具有局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌(排除原发性肿瘤-T4d-炎性癌)的绝经前或后女性和男性患者。患者可以接受针对转移性乳腺癌(MBC)的在先放疗，前提是它在随机化之前3周完成且不超过30％的有髓骨经过照射。在先辅助放疗是允许的，前提是它在随机化之前至少6个月完成。

在辅助背景中接受曲妥单抗的患者允许登记，前提是自最后一次辅助施用曲妥单抗过去了≥6个月。患者必须在基线时具有恰当的左心室射血功能，定义为LVEF不低于50％，通过超声心动图显象或MUGA测量。如果最大累积剂量小于/等于360mg/m²多柔比星或720mg/m²表柔比星的话，针对辅助疾病用蒽环类抗生素治疗的患者可包括在研究中。

患者必须具有组织学或细胞学确认的HER2阳性，绝经前或后乳腺腺癌，具有可测量或不可测量的局部复发性或转移性疾病。患者必须具有较好的性能状态(ECOG 0-1)，正常的肝，肾和骨髓功能，且没有可能影响服从方案或解读结果的其它严重疾病。她们不可处于升高的GI穿孔，高血压，蛋白尿和伤口愈合并发症，血栓栓塞或出血风险。具有由转移引起的转移性CNS疾病或脊髓受压的患者是不合格的。患者不可在最后5年内具有另一种原发性肿瘤(恰当治疗的宫颈CIS，皮肤鳞癌或基细胞皮肤癌除外)。排除妊娠或哺乳女性。

进入研究时的完全抗凝是允许的，只要患者在随机化时至少两周处于稳定水平的抗凝。

合格标准：

1.患者年龄≥18岁；

2.能够服从方案；

3.ECOG PS≤1；

4.生命预期≥12周；

5.具有组织学或细胞学确认的乳腺癌(腺癌)，具有可测量或不可测量的，局部复发性或转移性损害(排除原发性肿瘤-T4d-炎性癌)的绝经前或后患者，她们是化疗的候选者。局部复发性疾病不可以是适合治愈意图的切除的。ER/PgR和HER2状态必须有记录；

6.对于随机化之前由中心实验室确认的原发性肿瘤或转移，患者必须具有HER2蛋白质过表达(3+)，通过免疫组织化学(IHC)确定；或HER2/c-erbB2扩增，通过荧光原位杂交(FISH)或显色原位杂交(CISH)确定。对于先前参与Roche或Genentech发起的辅助曲妥单抗试验(其中已经中心确认了HER2状态)(例如HERA，BCIRG006，NSABP B31，或组间/NCCTG/H2061s试验)的患者，在这项试验中不要求由中心实验室确认原发性肿瘤的HER2阳性；

7.在辅助设置中接受曲妥单抗的患者是合格的，只要她们没有在最后一剂曲妥单抗之后6个月内复发；

8.在辅助或新辅助设置中用蒽环类抗生素治疗的患者只有在她们在随机化之前>6个月接受她们的最后一剂的情况中才是合格的。最大累积剂量不得超出360mg/m²多柔比星和720mg/m²表柔比星；

9.用紫杉烷治疗的患者只有在她们在随机化之前>12个月接受她们的最后一次辅助或新辅助化疗的情况中才是合格的；

10.基线左心室射血分数(LVEF)不低于50％，通过超声心动图显象或MUGA测量；

11.使用全剂量口服或胃肠外抗凝剂是允许的，只要患者在随机化时至少两周处于稳定水平的抗凝：

●正在接受肝素治疗的患者具有介于ULN或患者在开始肝素治疗之前的值的1.5-2.5倍之间的基线aPTT

●正在接受低分子量肝素(LMWH)的患者接受1.5的日剂量

●2mg/kg(依诺肝素)或适宜剂量的相应抗凝剂，根据包装插页

●正在接受香豆素衍生物的患者具有介于2.0和3.0之间的INR，在基线时在相隔1-4天的两次连续测量中评估

●没有正在接受抗凝剂药疗的患者必须在随机化之前7天内具有≤1.5的INR和≤1.5倍ULN的aPTT。

排除标准：

1.针对转移性或局部复发性乳腺癌的在先化疗。在先激素疗法是允许的，但是必须在随机化之前停止至少2周。

2.用于治疗转移性乳腺癌的在先放疗在下述情况中是不允许的：

●超过30％的有髓骨经过照射

●在随机化之前3周内施用放疗的最后部分

针对乳腺癌的在先辅助放疗是允许的，前提是它在随机化之前停止至少6个月。

3.随机化之前的最后5年内有其它原发性肿瘤(包括原发性脑瘤)，恰当治疗的原位宫颈癌，皮肤鳞癌，或恰当控制的受限的基细胞皮肤癌除外。

4.脊髓受压的迹象或CNS转移的当前迹象。在临床怀疑脑转移的情况中脑部CT或MRI扫描是强制性的(随机化之前4周内)。

5.CNS疾病(与癌症无关)的历史或体格/神经学检查迹象(除非用标准医学疗法恰当治疗)，例如不受控制的发作(seizure)。

6.研究治疗开始之前28天内有重大手术规程，开放式活检或重大外伤性损伤，或预期研究治疗过程期间需要重大手术。

7.随机化时现有周围神经病>2级CTC。

8.不当骨髓功能：ANC<1.5x109/L，血小板计数<100x109/L和Hb<9g/dL。

9.不当肝功能：

●血清(总)胆红素>ULN

●AST和ALT>2.5x ULN

●AST或ALT>1.5x ULN，伴随血清碱性磷酸酶水平>2.5x ULN(基线时)

10.不当肾功能：

i.血清肌酸酐>2.0mg/dL或177μmol/L

ii.针对蛋白尿的尿试纸≥2+。基线时试纸尿分析≥2+蛋白尿的患者应当经历24小时尿收集且必须展现≤1g蛋白质/24hr。

11.长期日常皮质类固醇治疗(剂量>10mg/天甲泼尼龙当量)(排除吸入式类固醇)。

12.长期日常阿司匹林(>325mg/天)或氯吡格雷(>75mg/天)治疗。

13.不受控制的高血压(收缩>150mm Hg和/或舒张>100mm Hg)或临床重大(即活动性)心血管疾病：CVA/中风(随机化之前≤6个月)，心肌梗死(随机化之前≤6个月)，不稳定心绞痛，纽约心脏联合会(NYHA，附录6)2类或更高的充血性心力衰竭，或需要药疗的严重心率失常

14.遗传性出血素质或有出血风险凝血病的历史或迹象。

15.随机化之前6个月内腹瘘，胃肠穿孔，或腹腔脓肿的历史。

16.随机化时有需要i.v.抗生素的活性感染。

17.严重的不愈合伤口，消化性溃疡，或骨折。

18.任何其它疾病的迹象，代谢或心理功能障碍，体格检查发现，或临床实验室发现，它们给出禁止使用调查性药物的疾病或状况的合理怀疑，或可能影响患者服从研究日常事务，或使患者处于治疗并发症的高风险。

19.妊娠或哺乳女性。研究治疗开始之前7天内，或14天内(及研究治疗开始之前7天内确认性尿妊娠测试)评估血清妊娠测试。

20.有怀孕潜力的患者(最后一次月经后<2年的女性)未使用有效的非激素的避孕手段(子宫内避孕装置，障碍式避孕方法连同杀精子胶冻剂或不育手术)。

21.当前或最近(开始研究治疗之前30天内)用另一种调查性药物治疗或参与另一项调查性研究。

22.已知的针对任何研究药物或赋形剂的超敏感性。

23.针对中国仓鼠卵巢细胞产品或其它重组人或人源化抗体的超敏感性。

结果：

调查人员评估的PFS(未分层且未审查非方案疗法(NPT))的改善计算为比研究的对照分支要长2.8个月，如上文描述的。具体而言，如表2中汇总的，对照组(分支A)的中值PFS为13.7个月，而“贝伐单抗”组(分支B)为16.5个月，其中风险比为0.82，95％CI为(0.65，1.02)，p值＝0.0775。

表2：调查人员评估的PFS

而且，独立审查委员会(IRC)评估的PFS结果(分层且审查NPT)是统计学显著的。具体而言，如表3中汇总的，对照组(分支A)的中值PFS为13.9个月，而“贝伐单抗”组(分支B)为16.8个月，其中风险比为0.72，95％CI为(0.54，0.94)，p值＝0.0162。总之，中值“分支B”或“贝伐单抗”组的PFS比研究的对照分支要长2.9个月。

表3：独立审查委员会(IRC)PFS

表4中显示了研究的客观响应率(ORR)结果，包括调查人员评估的结果(INV)和独立审查委员会(IRC)评估的结果二者。具体而言，对于INV评估的ORR，研究显示对照分支中的69.9％ORR和“贝伐单抗”或分支B中的74.3％。二者之间的差异为4.43％，95％CI为(-5.2％，14.0％)，p值＝0.3492。对于IRC评估的ORR，研究显示对照分支中的65.9％ORR和“贝伐单抗”或分支B中的76.5％。二者之间的差异为10.59％，95％CI为(1.0％，20.2％)，p值＝0.0265。

表4：客观响应率(ORR)

表5中汇总了研究的中间总体存活(OS)结果，其显示对照分支的中值存活率为38.3个月，而“贝伐单抗”分支B为38.5个月，风险比(HR)为1.01，95％CI为(0.74，1.38)，p值＝0.9543。

表5：中间总体存活(OS)

而且，一项安全性初步评估证明这项研究中的患者没有显示新的安全性信号。

实施例2：AVEREL研究中的探索性生物标志物分析

患者和免疫化学方法

来自这项试验中的162名患者的血浆基线样品可用于进行分析。

血浆分析

在研究BO20231中自同意的患者收集用于发现和验证生物标志物的血液样品。在基线时(在随机化之后但在第一次施用研究药疗之前)及在疾病进展时收集血液样品(总共大约20mL)。

将总共4.9mL血液吸入一个S-(EDTA)管中。其后立即通过将管温和颠倒将它们混合，并在30分钟内在离心机中以大约1500g离心(室温10分钟)。此后立即将血浆上清液在一个透明聚丙烯5mL转移管中等分。其后，将血浆等分入2个塑料保存管中(每个大约1.25ml)。将样品以竖直位置保存于-70℃。在有些情况中，将样品于-20℃保存长达1个月，然后转移至-70℃。

使用来自Roche Diagnostics GmbH的免疫学多参数芯片技术(IMPACT)，将样品用于测量白介素-8(Il-8)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)，VEGFA，VEGF-C，VEGF受体-1(VEGFR1)，VEGF受体2(VEGFR2)，VEGF受体-3(VEGFR-3)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板衍生生长因子-C(PDGF-C)，和E-选择蛋白的水平。

IMPACT多重测定法技术

Roche Professional Diagnostics(Roche Diagnostics GmbH)开发了一种多标志物平台，工作名称为IMPACT(Immunological MultiParameter ChipTechnique)。该技术用于上文“血浆分析”部分中提及的蛋白质标志物的测量。该技术基于通过EP 0939319和EP 1610129中公开的规程制造的一种聚苯乙烯小芯片。芯片表面包被有链霉亲合素层，然后上面点生物素化抗体进行每一种测定法。对于每一种标志物，以垂直线将抗体的点加载到芯片上。在测定期间，用含有特定分析物的标本样品探查阵列。

用于在一块芯片上测量所有标志物的标本每份需要的血浆体积为20μL(用于芯片1)和8μL(用于芯片2和3)(见下文)。将样品体积与温育缓冲液(50mM HEPES pH 7.2，150mM NaCl，0.1％Thesit，0.5％牛血清清蛋白和0.1％作为防腐剂的Oxypyrion)一起应用以给出每张芯片40μL的总反应体积。在温育12分钟并使用清洗缓冲液(5mM Tris pH 7.9，0.01％Thesit和0.001％Oxypyrion)清洗芯片之后，添加地高辛配基化检测抗体混合物(包括用地高辛配基标记的分析物特异性抗体混合物的40μL温育缓冲液)并再温育6分钟以结合到被捕获的分析物上。清洗之后最终用包括与荧光胶乳偶联的抗地高辛配基抗体偶联物的40μL试剂缓冲液(62.5mM TAPS pH 8.7，1.25M NaCl，0.5％牛血清清蛋白，0.063％Tween 20和0.1％Oxypyrion)检测二抗。使用这种标志物，在单个点中能检测到10例个别结合事件，产生下至fmol/L浓度的很高的灵敏度。将芯片传送入检测单元中，并且电荷耦合器件(CCD)相机产生图像，使用专用软件转换成信号强度。个别点自动定位于预先限定的位置并通过图像分析来量化。对每一种标志物，在芯片上加载多行，每行10-12个点，并且作为来自芯片上相应行的至少5个点的均值计算标志物的浓度。该技术的优点是以夹心式或竞争性形式多路复用上至10个参数的能力。一式两份测量校准物和患者样品。一次运行设计成含有总共100项测定，包括校准物和2份多重对照作为运行对照。由于一些选定分析物彼此反应(即VEGFA与VEGFR1或VEGRF2)，因此如下将分析物分到三块不同芯片上：

芯片1：VEGFA，VEGF-C，PDGF-C

芯片2：VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，Il-8，bFGF

芯片3：E-选择蛋白，ICAM-1

表6：用于本测定法的抗体

统计分析

使用样品中值将生物标志物值二分为低(低于中值)或高(处于或高于中值)。

用比例危害cox回归分析评估了具有高或低生物标志物水平的患者亚组中治疗效果的危害比。

另外，使用比例危害cox回归评估了生物标志物水平和治疗效果之间的关联。该模型包括下述共变量：试验治疗，生物标志物水平，二元分层因子(在基线时，在辅助/新辅助紫杉烷之前的可测量疾病，ER/PgR状态/在曲妥单抗新辅助疗法之前，自最后一剂辅助/新辅助化疗起的复发前时间)，治疗对生物标志物水平的交互项。使用用于交互项的Wald检验确定了生物标志物水平和治疗效果之间的关联。低于0.05的P值认为是显著的。

统计方法

分析群体

在这项研究中定义了一个生物标志物可评估群体，其由接受研究药疗的任何成分且具有基线时的标志物水平的所有患者组成，该标志物为如上所述评估且具有商品化抗体的任何下述生物标志物：VEGF-A，VEGF-C，VEGF-R1，VEGF-R2，E-选择蛋白，VEGFR-3，IL-8，bFGF，PDGF-C，ICAM-1。

多重性调整

为了避免I型错误的膨胀，如下文所示对生物标志物应用层次(hierarchy)。以双侧5％α水平测试每种生物标志物，而且只有在达到统计学显著性时，才测试该层次中的下一种生物标志物。

1.VEGF-A

2.VEGF-R2

3.ICAM-1

4.bFGF

5.IL-8

6.VEGF-R1

7.PDGF-C

8.VEGF-C

9.VEGFR-3

10.E-选择蛋白

功效分析

如研究BO20231的数据报告分析手册(DRAM)中规定的那样定义PFS和OS。对生物标志物数据的分析基于最后一次PFS分析时的PFS(调查人员评估的)数据。使用样品中值生物标志物浓度作为割点来进行患者分组(高对低水平的浓度)。

无进展分析

对生物标志物可评估群体关于PFS实施下述分析：

●自Kaplan-Meier曲线为具有低生物标志物水平的患者和具有高生物标志物水平的患者估算的中值PFS(95％CI)

●对于具有低生物标志物水平的患者和具有高生物标志物水平的患者，来自Cox模型的未分层(和分层，针对PFS)HR(95％CI)

●来自Cox模型的未分层HR(95％CI)，通过生物标志物水平的四分位

●使用包括基线生物标志物水平(作为在样品中值处二分为高和低的二元变量)，治疗，基线预后因子和交互项(基线生物标志物水平对治疗)的Cox模型，对生物标志物可评估患者实施了交互检验以评估生物标志物是否预示贝伐单抗对具有HER2阳性局部复发性或转移性乳腺癌的患者在PFS方面的治疗好处。

结果

血浆标志物

表7中呈现生物标志物的基线描述统计。

表7：生物标志物值的描述统计(基线)

表8呈现E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3与调查人员评估的无进展存活方面治疗效果的关联分析的结果。

表8

^a模型包括预后因子

T：多西他赛；H：曲妥单抗；BV：贝伐单抗；L：低；H：高

在此分析中，对E-选择蛋白使用高E-选择蛋白(≥36.9ng/mL)，低E-选择蛋白(<36.9ng/mL)，对ICAM-1使用高ICAM-1(≥210ng/mL)，低ICAM-1(<210ng/mL)，对VEGFR-3使用高VEGFR-3(≥10.6ng/mL)，低VEGFR-3(<10.6ng/mL)。

高基线ICAM-1与PFS更多受益于贝伐单抗统计学显著相关，α＝0.05。VEGFR-3和E-选择蛋白显示潜在预测价值。因此，ICAM-1、E-选择蛋白和VEGFR-3可以是贝伐单抗治疗效果在无进展存活方面的独立预测性生物标志物。

ICAM-1对PFS的影响在ICAM-1的探索性四分位分析中也是明显的(表9)。

Claims

1.一种确定诊断有乳腺癌的患者通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗是否更加合适或不太合适的体外方法，该方法包括：

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适或不太合适，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗更加合适，或者所述生物标志物的表达水平低于参照水平指示患者用抗癌疗法来治疗不太合适。

2.权利要求1的方法，其中就无进展存活而言来确定患者通过抗癌疗法来治疗是否合适。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。

5.一种为诊断有乳腺癌的患者选择治疗的体外方法，所述方法包括：

(a)检验来自患者的生物学样品，由此确定患者有选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平处于或高于参照水平，并

(b)基于该确定，选择包括包含抗VEGF抗体的抗癌疗法的治疗。

6.权利要求5的方法，其中该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。

7.权利要求5-6任一项的方法，其中所述抗癌疗法包含抗VEGF抗体，抗HER2抗体和紫杉烷。

8.一种确定诊断有乳腺癌的患者是否对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感的体外方法，所述方法包括：

(b)基于依照(a)的表达水平鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感，其中所述生物标志物的表达水平处于或高于参照水平指示患者对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。

9.权利要求8的方法，其中该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。

10.权利要求8-9任一项的方法，其中就无进展存活而言来确定患者是否对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。

11.权利要求8-10任一项的方法，其中所述化疗方案包含抗HER2抗体和紫杉烷。

12.一种为诊断有乳腺癌的患者选择抗癌疗法的体外方法，所述方法包括：

(b)基于该确定，选择包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法。

13.权利要求12的方法，其中该方法进一步包括用抗癌疗法治疗患者。

14.权利要求12-13任一项的方法，其中所述化疗方案包含抗HER2抗体和紫杉烷。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述患者诊断有局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌。

16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述患者未接受在先化疗或放射治疗。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。

18.权利要求4，7，11和14-17任一项的方法，其中所述紫杉烷为多西他赛(docetaxel)或帕利他赛(paclitaxel)。

19.权利要求18的方法，其中所述紫杉烷为多西他赛。

20.权利要求4，7，11和14-19任一项的方法，其中所述抗HER2抗体为曲妥单抗(trastuzumab)。

21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述表达水平为蛋白质表达水平。

22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述样品为血浆样品。

23.权利要求22的方法，其中所述E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3表达水平分别为约36.9ng/mL，约210ng/mL和约10.6ng/mL。

24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。

25.权利要求1-23任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物为ICAM-1。

26.权利要求1-23任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。

27.一种药物组合物，其包含抗VEGF抗体，用于治疗诊断有乳腺癌的患者，其中依照权利要求1-4，15-26任一项的方法鉴定患者为通过包含抗VEGF抗体的抗癌疗法来治疗更加合适。

28.一种药物组合物，其包含抗VEGF抗体，用于治疗诊断有乳腺癌的患者，其中依照权利要求8-26任一项的方法鉴定患者为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗方案的抗癌疗法敏感。

29.一种试剂盒，其用于进行权利要求1-26任一项的方法，包含用于检测选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平的化合物套组，该套组包含能够特异性结合所述生物标志物的抗体。

30.一种通过将抗VEGF抗体添加至化疗方案在诊断有乳腺癌的患者中改善包含化疗方案的抗癌疗法的治疗效果的方法，该方法包括：

(a)在自诊断有阳性乳腺癌的患者衍生的样品中测定选自E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3的至少一种生物标志物的表达水平；

(c)与有效量的化疗方案组合将有效量的抗VEGF抗体施用于依照(b)鉴定为对包括将抗VEGF抗体添加至化疗的抗癌疗法敏感的患者。

31.权利要求30的方法，其中所述化疗方案包含抗HER2抗体和紫杉烷。

32.权利要求30-31任一项的方法，其中所述患者诊断有局部复发性或转移性HER2阳性乳腺癌。

33.权利要求30-32任一项的方法，其中所述患者未接受在先化疗或放射治疗。

34.权利要求30-33任一项的方法，其中所述抗VEGF抗体为贝伐单抗。

35.权利要求31的方法，其中所述紫杉烷为多西他赛或帕利他赛。

36.权利要求35的方法，其中所述紫杉烷为多西他赛。

37.权利要求31的方法，其中所述抗HER2抗体为曲妥单抗。

38.权利要求30-37任一项的方法，其中所述表达水平为蛋白质表达水平。

39.权利要求30-38任一项的方法，其中所述样品为血浆样品。

40.权利要求39的方法，其中所述E-选择蛋白、ICAM-1和VEGFR-3表达水平分别为约36.9ng/mL，约210ng/mL和约10.6ng/mL。

41.权利要求30-40任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物为E-选择蛋白。

42.权利要求30-40任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物为ICAM-1。

43.权利要求30-40任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物为VEGFR-3。