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CN104364260B - 胰岛素制剂 - Google Patents

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CN104364260B CN201380030897.6A CN201380030897A CN104364260B CN 104364260 B CN104364260 B CN 104364260B CN 201380030897 A CN201380030897 A CN 201380030897A CN 104364260 B CN104364260 B CN 104364260B
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Abstract

一种包含胰岛素衍生物的稳定的药物制剂可方便地通过向其中加入甘油、苯酚、间甲酚和锌离子来制备。

Description

胰岛素制剂
发明领域
本发明涉及药用胰岛素制剂，其可用于预防、治疗和治愈糖尿病及其自然相关的方面。
发明背景
胰岛素是一种由胰腺的β-细胞分泌的多肽激素。
胰岛素用于治疗糖尿病和与之有关的或由其引起的疾病。胰岛素在维持正常代谢调节中是必需的。自从90年前引入胰岛素疗法以来，已经拯救、延长和改善了数百万糖尿病患者的生命。在过去的几十年间，已经证明，对糖尿病患者而言，维持血糖水平的密切控制是非常重要的。
在Prog. Biophys. Mole. Biol. 91 (2006), 199 et seq.中，有不同形式的胰岛素的概述。
通常，胰岛素通过注射(皮下)给药。在Nat. Reviews Drug Disc. 1 (2002), 529et seq., 有对给予胰岛素的备选途径的概述。
在WO 2009/115469中，提及酰化的胰岛素类似物，其中一个疏水性氨基酸已被亲水性氨基酸置换。在WO 2009/115469中，没有提到具体的可注射的药用胰岛素制剂。
在WO 2008/015099中，提及聚乙二醇化的长效胰岛素。在WO 2008/015099中，没有提到具体的药用胰岛素制剂。
简言之，WO 02/067969涉及因为含有两种不同的胰岛素种类而被稳定化的胰岛素制剂，并且明显地，描述的重点是两种胰岛素种类之一的赖脯胰岛素。
几十年来，具有不同性质的胰岛素制剂已被开发并投放市场，并且使用极其广泛的各种添加剂已经制备出那些制剂。据推测，在投放市场的中性胰岛素制剂中，全部不含呈单体形式的胰岛素。
许多患者每天接受2-4次胰岛素注射，例如，供基础治疗和膳食治疗。
在2007年，全世界有2.46亿例糖尿病患者。到2025年，预计这个数目将为约3.80亿。
发明目的
本发明的目的是克服或改善至少一个现有技术的缺点，或提供一种有用的替代品。
本发明的另一方面涉及提供具有相对高含量的胰岛素，例如，高于约1.5 mM的胰岛素、优选高于约3 mM的胰岛素和更优选高于约4 mM的胰岛素浓度和低于约9 mM胰岛素浓度的胰岛素制剂。
本发明的另一方面涉及提供具有足够的化学稳定性的胰岛素制剂。
本发明的另一方面涉及提供具有足够的物理稳定性的胰岛素制剂。
本发明的另一方面涉及提供具有足够低粘度的胰岛素制剂。
本发明的另一方面涉及提供具有足够的溶解性的胰岛素制剂。
本发明的另一方面涉及提供具有足够稳定的低聚模式的胰岛素制剂。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素制剂，其中以相对高浓度存在的胰岛素在约6或高于约6的pH值、优选在约6.5或高于约6.5的pH值、更优选在约7或高于约7的pH值、甚至更优选在约7.4或高于约7.4的pH值和低于约8.2的pH值下呈现溶解的形式。
定义
术语“糖尿病(diabetes)”或“糖尿病(diabetes mellitus)”包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病(妊娠期间)和引起高糖血症的其它状况。该术语用于以下代谢病症：其中胰腺产生不足量的胰岛素，或其中身体的细胞不能对胰岛素作出适当的反应因而阻止细胞吸收葡萄糖。结果，葡萄糖积聚在血液中。
1型糖尿病，也称为胰岛素-依赖性糖尿病(IDDM)和青年发病型糖尿病，由β-细胞破坏引起，通常导致绝对胰岛素缺乏。2型糖尿病，也称为非-胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)和成人发病型糖尿病，与主要的胰岛素抵抗和因而相对胰岛素缺乏和/或伴有胰岛素抵抗的主要胰岛素分泌缺乏有关。
在此，术语“制剂”与术语“组合物”同义使用。
溶液的离子强度是在该溶液中离子浓度的量度。离子化合物，当溶于水时，离解成离子。在溶液中的总电解质浓度会影响重要的特性例如不同盐的解离或溶解度。含有溶解离子的溶液的主要特征之一是离子强度。溶液的离子强度(在此指定为“I”)是存在于该溶液中的所有离子的浓度的函数：
其中c i是离子i的摩尔浓度(mol·dm-3)，z i是该离子的电荷数，并求出溶液中的所有离子的总数。对于1:1电解液例如氯化钠，离子强度等于浓度，但对于MgSO4，离子强度是四倍高。一般来说，多价离子强烈地有助于离子强度。
在此，使用以下缩略语：“Ac”表示乙酸根，“γGlu”或“gGlu”表示具有下式的γL-谷氨酰基：-CO-CH2CH2-CH(COOH)-NH-；“HMWP”表示高分子量肽；“OEG”表示具有下式的氨基酸：NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-COOH，其对应于也称为[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]甲基羰基的基团-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-；和使用“ThT”表示硫磺素T。
发明详述
令人惊奇地发现，在本说明书例如在本文的条款和权利要求中提及的胰岛素衍生物的制剂(包含以本说明书例如在本文的条款和权利要求中提及的浓度的在本说明书例如在本文的条款和权利要求中提及的添加剂)达到许多以上目标。例如，这样的制剂是可溶解的并具有所需的药代动力学特性。
本发明的稳定的胰岛素衍生物具有通式I：Acy-X-Yn-Ins。在该式中，“Ins”表示侧链(指定为Acy-X-Yn-)连接存在于所述胰岛素类似物中B29赖氨酸氨基酸中的ε氨基的胰岛素类似物。换言之：“Ins”表示胰岛素类似物；且根据式I，侧链(指定Acy-X-Yn-)连接于所述胰岛素类似物，即连接存在于所述胰岛素类似物中B29赖氨酸氨基酸中的ε氨基。所述胰岛素类似物是人胰岛素，其包含A14位的谷氨酸、B25位的组氨酸、任选在B16位的组氨酸以及任选地，B27和/或B30氨基酸已被除去。在具有通式II的所述侧链(和指定为Acy-X-Yn-)中，Acy是具有8-24个碳原子的、从中已除去羟基的脂肪二酸，X是γGlu，其中氨基残基连接于“Acy”和如果n不是0，则γGlu中的羰基连接于Y，或如果n是0，则γGlu中的羰基连接于胰岛素类似物中B29位赖氨酸中的ε氨基，Y是-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-，其中氨基残基连接于X和羰基连接于胰岛素类似物中B29位赖氨酸中的ε氨基，和n是0、1、2或3。
这样的式I的胰岛素衍生物的具体实例是A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素。该化合物也可称为A14E, B16H, B25H, B29K(Ne二十烷二酰基-γGlu-OEG-OEG), desB30人胰岛素，其具有下式：
。
母体胰岛素类似物的A和B链的序列表分别在SEQ ID NO: 1和2中给出。其它具体的式I胰岛素衍生物的实例是A14E, B16H, B25H, B29K(Nε十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E,B25H, desB27, B29K(Nε-(十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。3个最后提及的化合物的结构式分别在WO 2009/115469的实施例27、60和151中描述。
令人惊讶地，在本发明的最广泛的方面，满足以上需要的药物制剂可通过将以上式I的胰岛素衍生物与苯酚、间甲酚、锌离子、任选的一种或多种给出所需的离子强度的化合物和任选的甘油(全部以本说明书中提及的量)混合来制备。
所需的离子强度可通过加入以本说明书中提及的量中的适当量的氯化钠和/或乙酸钠和/或TRIS (2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇)和/或精氨酸而获得。
令人惊讶地，在本发明的一个方面，满足以上需要的药物制剂可通过使以上式I的胰岛素衍生物与甘油、苯酚、间甲酚、锌离子和任选的氯化钠以适当的量混合而制备和这些成分可以下文权利要求1中所述的量存在，优选4.2 mM的胰岛素衍生物，约1.6% (重量/重量)的甘油，约25 mM的苯酚，约25 mM的间甲酚，约4.5 Zn/6摩尔胰岛素衍生物，约20 mM的氯化钠并具有约7.4的pH值。
通过加入氯化钠和甘油使药物制剂成为等渗的。
在胰岛素领域内，对于存在的锌离子的量，常见的是给出作为存在于制剂中的每6摩尔胰岛素或胰岛素衍生物存在的锌离子量的数字。有时，所述6摩尔胰岛素或胰岛素衍生物被错误地称为六聚体，尽管所有的胰岛素分子不参与六聚体构象的形成并且在这样的情况下，锌实际存在的量是锌离子存在的量/6摩尔胰岛素或胰岛素衍生物，不依赖是否所述胰岛素或胰岛素衍生物参与六聚体构象的形成。对于这种计算，没有必要考虑所述锌离子以哪种形式存在。
胰岛素制剂注射后，合乎需要的是胰岛素衍生物自身缔合以形成，特别是，二聚体、六聚体、双-六聚体(十二聚体)和多-六聚体。在此，术语多-六聚体涵盖包含超过12个分子的胰岛素衍生物的胰岛素集合。认为在将本发明的制剂注射给人后，多-六聚体将由于制剂中的添加剂的扩散而解离并且释出的二聚体会迅速解离成单体。
制剂的足够的低聚模式意指模式在制剂的整个保存限期基本上没有改变。而且，所述制剂可由几种成分，即，十二聚体加单体或六聚体加单体组成，但不包括十二聚体、六聚体、二聚体加单体且不包括范围从十二聚体至单体的未指定的不同低聚体。
将胰岛素制剂以本身已知的方式给予患者，例如，根据患者的常识结合临床医师的常识。本发明最好在患者方便时使用。最后的应用模式因而既取决于产品的性能，又取决于患者的性格和偏好。这是由于这样的事实，即任何胰岛素产品的效果取决于个体患者的胰岛素需要和对所述胰岛素的药效学作用的敏感性以及最后还取决于对在给定的情况下患者的偏好的敏感性。这些条件可随着时间的推移而变化，无论是在较长的时期(年)，还是一天与一天不同。对于任何患者而言，最佳剂量水平将取决于多种因素包括患者的年龄、体重、体力活动和饮食习惯，取决于与其它药物的可能的组合，以及取决于待治疗疾病状态的严重性。建议每个个体患者的剂量方案由本领域技术人员以类似于现在对已知的胰岛素制剂所进行的方式来确定。
为本发明的主要靶标的疾病和病症是糖尿病(1或2型)或特征为高糖血症的其它病况，但是通常亦为代谢型疾病和病况，其中胰岛素的代谢作用具有临床相关性或具有益处，例如前期-糖尿病、葡萄糖耐受性受损、代谢综合征、肥胖症、恶病质、体内β-细胞损失/死亡、过度的食欲和炎症。已知或认为所有这些类型的病况可从患有所述疾病或病况的受试者的稳定代谢状态获益。
为实施本发明，胰岛素制剂可经胃肠外给予需要这样的治疗的患者。胃肠外给予可通过注射器，任选地笔式注射器，经皮下、肌内或静脉内注射实行。或者，胃肠外给予可通过输注泵进行。进一步的选项是经鼻或肺给予胰岛素组合物，优选粉末或液体的组合物，特别是为所述目的设计的组合物。
本发明的优选特征
为总结和补充上述说明，本发明的特征和条款如下：
1. 一种包含通式I的胰岛素衍生物、甘油、苯酚、间甲酚和锌离子的药物制剂。
2. 一种药物制剂，其包含具有通式I的胰岛素衍生物、不超过约2% (重量/重量)的甘油、从约16至约35 mM的苯酚、从约16至约35 mM的间甲酚、从约3.5至约8摩尔的锌离子/6摩尔的所述胰岛素衍生物和具有在从约0至约150范围内的离子强度：
式I：Acy-X-Yn-Ins，其中“Ins”表示胰岛素类似物和侧链(指定Acy-X-Yn-)连接存在于所述胰岛素类似物中B29赖氨酸氨基酸中的ε氨基，所述胰岛素类似物是人胰岛素，其包含A14位的谷氨酸、B25位的组氨酸、任选在B16位的组氨酸以及任选地，B27和/或B30氨基酸已被除去，Acy是具有8-24个碳原子的、从中已除去羟基的脂肪二酸，X是γGlu，其中氨基残基已连接于“Acy”和如果n不是0，则γGlu中的羰基连接于Y，或如果n是0则γGlu中的羰基连接于所述胰岛素类似物中B29位赖氨酸中的ε氨基，Y是-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-，其中氨基连接于X和羰基连接于所述胰岛素类似物中B29位赖氨酸中的ε氨基，和n是0、1、2或3。
3. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约0.3% (重量/重量)范围内的甘油量。
4. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约0.7% (重量/重量)范围内的甘油量。
5. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含每6摩尔胰岛素衍生物低于7.1的锌离子量。
6. 一种依据前述权利要求的药物制剂，其包含具有通式I的胰岛素衍生物、从约1至约2% (重量/重量)的甘油、从约16至约35 mM的苯酚、从约16至约35 mM的间甲酚、从约3.5至约5.5摩尔的锌离子/6摩尔的所述胰岛素衍生物和不超过约75 mM的氯化钠：
式I：Acy-X-Yn-Ins，其中“Ins”表示侧链(指定Acy-X-Yn-)连接存在于所述胰岛素类似物中B29赖氨酸氨基酸中的ε氨基的胰岛素类似物，所述胰岛素类似物是人胰岛素，其包含A14位的谷氨酸、B25位的组氨酸、任选在B16位的组氨酸以及任选地，B27和/或B30氨基酸已被除去，Acy是具有8-24个碳原子的、从中已除去羟基的脂肪二酸，X是γGlu，其中氨基残基已连接于“Acy”和如果n不是0则γGlu中的羰基连接于Y或如果n是0则γGlu中的羰基连接于所述胰岛素类似物中B29位赖氨酸中的ε氨基，Y是-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-，其中氨基连接于X和羰基连接于所述胰岛素类似物中B29位赖氨酸中的ε氨基，和n是0、1、2或3。
7. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，含有高于约1.2 mM、优选高于约2.1 mM和更优选高于3. 8 mM的量的通式I的胰岛素衍生物。
8. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，含有低于约9 mM、优选低于约7.1 mM和更优选低于约6 mM的量的通式I的胰岛素衍生物。
9. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约2.1 mM通式I的胰岛素衍生物。
10. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约4.2 mM通式I的胰岛素衍生物。
11. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含范围从约1至约2% (重量/重量)的量的甘油。
12. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约1.6% (重量/重量)的甘油。
13. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含高于约16、优选高于约20 mM的量的苯酚。
14. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含低于约35 mM、优选低于约30 mM的量的苯酚。
15. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约25 mM苯酚。
16. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含高于约16 mM、优选高于约20 mM的量的间甲酚。
17. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含低于约35 mM、优选低于约30 mM的量的间甲酚。
18. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约25 mM的间甲酚。
19. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含一定量的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物，其量为高于约3.5，优选高于约4，更优选高于约4.2。
20. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含一定量的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物，其量为低于约7.8。
21. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含一定量的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物，其量为低于约6.8。
22. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含一定量的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物，其量为低于约5.5，优选低于约5.1，更优选低于约5，且甚至更优选低于约4.8。
23. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约4.5锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物。
24. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，具有离子强度高于约1，优选高于约10。
25. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，具有离子强度低于约150 mM，优选低于约120，更优选低于约100。
26. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含高于约1 mM，优选高于约10 mM的量的氯化钠。
27. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含低于约150 mM，优选低于约120 mM，更优选低于约100 mM的量的氯化钠。
28. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含低于约75 mM，优选低于约50 mM，更优选低于约30 mM的量的氯化钠。
29. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约20 mM的氯化钠。
30. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含高于约1 mM，优选高于约10 mM的量的乙酸钠。
31. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含低于约150 mM，优选低于约120 mM，更优选低于约100 mM的量的乙酸钠。
32. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，具有高于约6.5，优选高于约6.8，更优选高于约7，且甚至更优选高于约7.2的pH值。
33. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，具有低于约8，优选低于约7.8，更优选低于约7.6的pH值。
34. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，具有约7.4的pH值。
35. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含范围从约4至约5.1的量的Zn/6摩尔胰岛素衍生物和具有范围从约7至约8.2的pH值。
36. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含范围从约4至约5.1的量的Zn/6摩尔胰岛素衍生物和具有范围从约7至约7.8的pH值。
37. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含从约2.1至约8.4mM的胰岛素衍生物，从约2至约6的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物和具有约0至约150的离子强度。
38. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含从约2.1至约6 mM的胰岛素衍生物，从约3至约5的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物和具有约10至约100的离子强度。
39. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含从约2.1至约6 mM的胰岛素衍生物，从约3至约5的锌离子/6摩尔胰岛素衍生物和具有约20至约80的离子强度。
40. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约2.1-5.2 mM的胰岛素衍生物，约0.5-1.8% (重量/重量)的甘油，约22-28 mM的苯酚，约22-28 mM的间甲酚，约3.8-5的锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物，约10-90 mM的氯化钠和具有约7.2-8.2的pH值。
41. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约4.2 mM的胰岛素衍生物，约1.6% (重量/重量)的甘油，约25 mM的苯酚，约25 mM的间甲酚，约4.5的锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物，约20 mM的氯化钠和具有约7.4的pH值。
42. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约3.8-5.2 mM的胰岛素衍生物，约1.3-1.8% (重量/重量)的甘油，约22-28 mM的苯酚，约22-28 mM的间甲酚，约3.8-5的锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物，约10-30 mM的氯化钠和具有约7.2-8.2的pH值。
43. 依据前述条款的制剂，其中胰岛素衍生物选自A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E,B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素，优选A14E, B16H,B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素。
44. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约4.2 mM的胰岛素衍生物，约0.7% (重量/重量)的甘油，约25 mM的苯酚，约25 mM的间甲酚，约4.5的锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物，约75 mM的氯化钠和具有约7.4的pH值。
45. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，包含约3.8-5.2 mM的胰岛素衍生物，约0.5-1% (重量/重量)的甘油，约22-28 mM的苯酚，约22-28 mM的间甲酚，约3.8-5的锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物，约60-90 mM的氯化钠和具有约7.2-8.2的pH值。
46. 依据前述条款的制剂，其中胰岛素衍生物选自A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E,B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素，优选A14E, B16H,B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素。
47. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，其中其主要部分，例如50% (重量/重量)的胰岛素衍生物呈现单体形式。
48. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中存在于所述通式的胰岛素衍生物中的胰岛素类似物的氨基酸序列不偏离人胰岛素超过5个位置并优选不偏离人胰岛素超过4个位置。
49. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中胰岛素衍生物选自A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E, B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu),desB30人胰岛素。
50. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中所述通式的胰岛素类似物是A14E, B16H, B25H, B29K(Nε十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
51. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中所述通式的胰岛素类似物是A14E, B16H, B25H, B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
52. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中所述通式的胰岛素类似物是A14E, B25H, desB27, B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
53. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中所述通式的胰岛素类似物是A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素。
54. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其中胰岛素衍生物，在注射后，呈现多六聚体形式或其主要部分，优选超过其50%，甚至更优选超过其75% (重量/重量)，呈现多六聚体形式。
55. 依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，该制剂含有少于5%，优选少于1%，甚至更优选少于0.1% (重量/重量)的固体物质。
56. 一种依据前述制剂条款的任一项的制剂，在可能的范围内，其如在说明书中定义，尤其是如在上述条款中定义。
57. 由本文描述的特征和/或权利要求和/或特征和/或权利要求的组合限定的任何新的产品、设备、方法或用途。
组合本文所述的一项或多项条款和实施方案，任选地还组合一项或多项下文的权利要求，产生进一步的实施方案且本发明涉及所述条款、实施方案和权利要求的所有可能的组合。
以下实施例通过举例说明，而不是限制的方式提供。
实施例1
目的
本实验的目的是测量化学和物理稳定性随制剂中锌浓度的变化，所述制剂含有A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素。
制剂
使A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素溶于milliq水至26.2mM的最终浓度(pH值约8)。根据在下表中的Zn/ 6个胰岛素(在此省略为“ins”)的浓度，按提及的次序加入苯酚、甲酚、氯化锌(Zn)和甘油，产生最终胰岛素浓度7.1 mM。
在中性pH下使用方法1测定如经SEC观察到的种类分布。
制剂的物理稳定性以硫磺素T分析法测定为滞后时间。
制剂的化学稳定性测定为于37℃储存两周后，高分子量蛋白(HMWP)和脱酰胺相对于4℃储存两周后测定的HMWP和脱酰胺的量的增加。于4℃储存两周后的HMWP含量是0.6%。于4℃储存两周后的脱酰胺含量是5.4%。
HMWP使用HMWP方法1测定。
胰岛素相关的杂质像脱酰胺的形成采用反相色谱(UPLC)测定。
脱酰氨A21和B3的量测定为以保存剂洗脱后测量的总吸光度面积的百分率测量的吸光度面积。
表1
可以得出以下结论
基于上表，可以得出结论，低聚化的增加和减少随锌浓度变化。最大量的六聚体是在包含2.3 Zn/6胰岛素的制剂中。最大量的双-六聚体是在包含3.5 Zn/6 ins和5.9 Zn/6之间的制剂中。Zn浓度从5.9 Zn/6胰岛素增加至7.1 Zn/6胰岛素降低双-六聚体的量。
物理稳定性在大于2.3 Zn/6 ins的制剂中是最佳的，因为在ThT分析中的滞后时间随锌浓度增加，和在大于2.3 Zn/6 ins是最佳的并当制剂含有2.3 Zn/6 ins或更多时，在ThT试验后回收率增加至100%。
化学稳定性随锌浓度增加；因为HMWP形成在包含从2.3 Zn/6胰岛素至5.9 Zn/ 6ins的制剂中是最佳的。脱酰胺形成在包含从2.3 Zn/6胰岛素至5.9 Zn/6 ins的制剂中同样是最佳的。
胰岛素的低聚化与样品的物理和化学稳定性有关联。主要包含胰岛素单体的制剂(0和1.2 Zn/6 ins)具有低物理和化学稳定性。包含双-六聚体种类的制剂似乎是化学上最稳定的构象。
实施例2
目的
本实验的目的是测量化学和物理稳定性随在固定的制剂中的A14E, B16H, B25H,B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素浓度的变化。已表明胰岛素的稳定性取决于低聚化程度；含有锌的六聚体胰岛素比无锌的胰岛素更稳定(Brange和Langkjær 1992)。因为低聚化亦受稀释的驱动，在样品中的胰岛素的浓度可影响稳定性。
制剂
使A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素溶于pH值约8的milliq水中。按提及的次序加入苯酚、甲酚、氯化锌(Zn)和甘油，得到最终制剂，其包含：4.7Zn/ 6胰岛素、1.6%甘油、16 mM苯酚、20 mM甲酚、20 mM NaCl (pH, 7.4)，胰岛素浓度在下表中列出。
制剂的物理稳定性以硫磺素T (ThT)分析法中的滞后时间(小时)测定并在新鲜制备的样品的ThT分析后经HPLC测定胰岛素的回收率。
制剂的化学稳定性测定为于37℃储存两周后HMWP和脱酰胺相对于4℃储存两周后测定的HMWP和脱酰胺的量的增加。HWMP使用HMWP方法1测定。脱酰胺形成采用反相色谱测定。于4℃储存两周和5周后的HMWP含量是0.4-0.5%。于4℃储存两周后的脱酰胺含量是5.4%。
表2
基于上表，可以得出结论，该制剂的物理稳定性在浓度范围0.51-7.1 mM胰岛素内是类似的。
于37℃两周后，对于A14E, B16H, B25H, B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素，HMWP形成在分析浓度范围0.51-7.1 mM胰岛素中是类似的。脱酰胺和HMWP产生在3.5 mM-7.1 mM胰岛素的浓度范围和于30℃5周和于37℃45天的时间范围也是类似的。而且，HMWP产生是低的，因为只有1%的HMWP在45天内形成和脱酰胺同样是低的，因为只有1-1.5%的HMWP形成。
实施例3
本研究的目的是研究在如下面的结果表中指定的变化pH、NaCl和Zn的制剂条件下的稳定性。具有在表3编号1-12的制剂含有4.2 mM胰岛素、7.25 mM苯酚、20 mM间甲酚以及在下表3提及的成分。NovoRapid®赋形剂对照品(在表3中的制剂号13)由600 µM门冬胰岛素、0.3 mM乙酸锌、20 mM NaCl、16 mM苯酚、16 mM甲酚、1.6%甘油和7 mM磷酸盐(pH 7.4)组成。
表3 用于这种测试的实验的不同制剂和对物理和化学稳定性的测定结果
从上表得出的结论是制剂的THT滞后时间随锌含量而增加，并且当制剂含有超过4Zn原子/每6胰岛素分子时是最佳的。进一步的结论是胰岛素7的HMWP形成是在测试的制剂中NovoRapid的范围内。
实施例4
目的
本实验的目的是在含有4.2 mM的胰岛素浓度的胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素8的制剂中测量化学和物理稳定性随锌浓度的变化。
制剂
使胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素7溶于在milliq水至最终浓度约9mM，pH值约8。根据在下表中Zn/6胰岛素(在此缩写为“ins”)浓度，按提及的次序加入苯酚、甲酚、乙酸锌(Zn)、氯化钠和甘油，产生4.2 mM胰岛素、20 mM氯化钠、25 mM苯酚、25 mM甲酚(pH 7.4)的最终胰岛素浓度。
如在“方法部分”指明的通过THT滞后时间(小时)测定的纤维化倾向
制剂的化学稳定性测定为相对于4℃储存后高分子量蛋白(HMWP)的量，于37℃储存8周(w)后HMWP的增加以及胰岛素相关杂质的增加。
使用方法1测量HMWP。在此，字母“w”用作周的缩写。
单体的量使用天然凝胶过滤(方法2)测量。
结论
当胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素8按4.2 mM胰岛素与锌在3锌/6ins-6锌/6 ins的范围内配制时，它们具有比NovoRapid更长的THT滞后时间，更低的HMWP形成和更低的杂质形成。
实施例5
目的
本实验的目的是在包含胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素8的制剂中，锌浓度固定时，化学和物理稳定性随胰岛素浓度的变化。已表明胰岛素的稳定性取决于低聚化程度；含有锌的六聚体胰岛素比无锌胰岛素更稳定(Brange和Langkjær 1992)。因为低聚化还受稀释的驱动，在样品中的胰岛素的浓度可影响稳定性。
制剂
使胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素8溶于milliq水(pH值约8)。按提及的次序加入苯酚、甲酚、乙酸锌(Zn)、氯化钠和甘油，产生最终制剂，其包含：4.5 Zn/6胰岛素、1.6%甘油、25 mM苯酚、25 mM甲酚、20 mM NaCl (pH 7. 4)和在下表中规定的胰岛素浓度。
制剂的化学稳定性测定为相对于4℃储存后的HMWP的量，于37℃储存8周后高分子量蛋白(HMWP)的增加以及胰岛素相关杂质的增加。
HMWP使用方法1测定。
脱酰胺类杂质的量测定为于37℃储存8周后以反相色谱测定的杂质相对于4℃储存8周后测定的杂质量的增加。
如在“方法部分”指明的通过THT滞后时间(小时)测定的纤维化倾向
单体的量以天然凝胶过滤方法2测定，用苯酚作为洗脱液。
结论
当锌比率固定于4.5 Zn/6 ins时，胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素8在较低浓度比在较高胰岛素浓度具有更高量的单体。这符合在较高胰岛素浓度下的一般较高THT滞后时间和在较高胰岛素浓度下的较高化学稳定性。
此外，胰岛素7、胰岛素3、胰岛素6、胰岛素2和胰岛素8具有比NovoRapid更长的THT分析滞后时间、更低的HMWP形成和杂质形成，而不管单体含量在以天然凝胶过滤分析时高达80%。
实施例6
目的
本实验的目的是通过尺寸排阻色谱研究低聚作用随在包含4.2 mM胰岛素的胰岛素7和固定的锌/6胰岛素制剂中的NaCl含量的变化。此外，目的是测定物理和化学稳定性。
制剂
使胰岛素7溶于pH值约8的milliq水中。按提及的次序加入苯酚、甲酚、乙酸锌(Zn)和甘油，得到最终制剂，其包含：4.5 Zn/6胰岛素、25 mM苯酚、25 mM甲酚(pH 7.4)、4.2 mM胰岛素浓度，并且氯化钠(NaCl)、乙酸锌和甘油如在下表中所述。
物理稳定性通过以下测量评价
1. 纤维化倾向。通过硫磺素T分析法测量。纤维化倾向在硫磺素T (THT)分析法中测量为纤维化的滞后时间。THT分析法如对新鲜制备的样品所描述的进行测定。
2. 通过动态光散射的低聚物半径(nm)和低于4 µm的聚集体形成。
制剂的化学稳定性测定为相对于4℃储存后的高分子量蛋白(HMWP)的量，于37℃储存4周(4w)后HMWP的增加以及胰岛素相关杂质的增加。
HMWP使用HMWP方法2测定。
胰岛素相关的杂质像脱酰胺的形成采用反相色谱(UPLC)测定。
单体的量在天然凝胶过滤方法2中以无苯酚的洗脱液测定。
胰岛素7的HMWP形成和THT分析的纤维化滞后时间
结论
胰岛素7单体的量随氯化钠浓度而降低，在加入刚好最高50 mM NaCl时具有大的影响。
作为HMWP形成和杂质形成测定的化学降解在所有制剂中是低的，不管单体的含量如何。
THT滞后时间随着锌含量和氯化钠含量而增加。
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (4℃)。注释：样品在t=0未测量。
结论
流体动力学半径随着盐浓度的增加而增加。
Zn浓度对大小有轻微的影响，但除了7 Zn/6 Ins外。
孵育温度对低聚物的大小和物理稳定性没有显著影响。
实施例7
目的
本实验的目的是在含4.2 mM胰岛素7的制剂中测定化学和物理稳定性随氯化钠和乙酸钠浓度的变化。
制剂
使胰岛素7溶于milliq水至最终浓度约9 mM (pH值约8)。按提及的次序加入苯酚、甲酚、乙酸锌(Zn)、氯化钠、乙酸钠和甘油，得到最终制剂，其包含：4.5 Zn/6胰岛素、25 mM苯酚、25 mM甲酚、pH 7.4、4.2 mM胰岛素浓度，并且氯化钠(NaCl)、乙酸钠(NaAc)和甘油如在下表中所述。
通过以下测量评价物理稳定性
3. 纤维化倾向。经硫磺素T分析法测定。纤维化倾向在硫磺素T (THT)分析法中测量为纤维化的滞后时间。THT分析法如对新鲜制备的样品所述测量。
4. 通过动态光散射的低聚物半径(nm)和低于4 µm的聚集体形成。
制剂的化学稳定性测定为相对于4℃储存后的高分子量蛋白(HMWP)的量，于37℃储存4周(4w)后HMWP的增加、胰岛素相关杂质的增加。
HMWP使用HMWP方法2测定。
胰岛素相关的杂质像脱酰胺的形成采用反相色谱(UPLC)测定。
单体的量在天然凝胶过滤方法2中以含苯酚的洗脱液测定。
HMWP形成、杂质形成和THT分析的纤维化滞后时间
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (4℃)
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (37℃)
结论：
流体动力学半径随着离子强度的增加而增加。
尺寸和散射的强度随着时间的极小变化(类似于或者优于NovoRapid)。
孵育温度对低聚物的大小和物理稳定性没有显著影响。
结论
当用增加的氯化钠浓度或与乙酸盐组合的氯化钠配制4.2 mM胰岛素和4.5锌/6摩尔胰岛素的胰岛素7时，在用天然凝胶过滤分析时单体含量降低。
氯化钠和乙酸钠的作用是类似的，总离子强度降低单体的量。
实施例8
目的
本实验的目的是测定胰岛素7的化学和物理稳定性随氯化钠浓度的变化。
制剂
使胰岛素7溶于milliq水(pH值约8)。按提及的次序加入苯酚、甲酚、乙酸锌(Zn)和甘油，得到最终制剂，其包含：4.5 Zn/6胰岛素、25 mM苯酚、25 mM甲酚(pH 7.4)和氯化钠，并且氯化钠如在下表中所述。
制剂的物理稳定性使用3种不同的分析来测定，以解决物理稳定性的不同方面。
1. 在硫磺素T (ThT)分析法中以滞后时间(小时)测量纤维化滞后时间，并在THT分析后经HPLC测量胰岛素的回收率。
2. 尺寸范围小于4 µm的聚集体和颗粒形成经动态光散射(DLS)测定。
3. 尺寸范围超过4 µm的聚集体和颗粒形成通过制剂的微流成像(MFI)测定，即通过MFI颗粒随孵育时间和温度的变化估算蛋白颗粒的浓度。
制剂的化学稳定性测定为相对于4℃储存后的高分子量蛋白(HMWP)的量，于37℃储存4周(4w)后HMWP的增加以及胰岛素相关杂质的增加。
HMWP使用HMWP方法2测定。
胰岛素相关的杂质像脱酰胺的形成采用反相色谱(UPLC)测定。
颗粒形成的微流成像测量
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (4℃)
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (30℃)
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (37℃)
在此，字母“d”是天的缩写。
平均流体动力学半径Rh avg. (nm)和归一化强度Inorm avg. (106计数/秒) (45℃)
结论
来自低聚体的样品，其大小取决于盐浓度。
低聚体在整个实验过程保持稳定。
在指定的条件下温度不影响低聚体大小和稳定性。
方法
化学稳定性
制剂的化学稳定性测定为相对于4℃储存后的高分子量蛋白(HMWP)的量，于37℃储存8周(w)后HMWP的增加以及胰岛素相关杂质的增加。
用于HMWP测量的方法1。
HMWP如下测定。肽(单体)以及HMWP的含量的定量测定在Waters (300 x 7. 8 mm,part nr wat 201549)上用包含以下成分的洗脱液以0.5 ml/min的流速并于50℃进行：4mM L-精氨酸HCl、496 mM NaCl、10 mM NaH2PO4、5 mM H3PO4、50% (体积/体积) 2-丙醇。检测用可调吸光检测器(Waters 486)于276 nm处进行。注射体积是2 μl并包括600 μM人胰岛素标准品。HWMP的量以相对于色谱中胰岛素的总面积的面积百分比来测定。
用于HMWP测量的方法2。
HMWP如下测定。HMWP的含量相对于肽单体含量的测定在Waters (150 x 4. 5 mm,part nr wat)上用包含以下成分的洗脱液以0.5 ml/min的流速并于50℃进行：4 mM L-精氨酸、496 mM NaCl、10 mM NaH2PO4、5 mM H3PO4、50% (体积/体积) 2-丙醇。检测用可调吸光检测器(Waters 486)于276 nm处进行。包括600 μM人胰岛素标准品。HWMP的量以相对于色谱中胰岛素的总面积的面积百分比来测定。
胰岛素相关的杂质像脱酰胺的形成如下测定。
反相色谱(UPLC)
胰岛素相关的杂质的测定在UPLC系统上进行，使用Phenomenex Kinetix RP C182.1 x 150 mm柱，颗粒大小1.7 μm，流速0.3 ml/min.，于50℃在220 nm处检测。洗脱用由以下组成的流动相进行：
A. 10 % (V/V)乙腈、0.09 M磷酸氢二铵pH 3.6 B. 80 % (体积/体积)乙腈。梯度：0-7 min的85%/15% A/B至74%/26% A/B的线性变化，7-34 min至60%/40% A/B的线性变化，34-36 min至20%/80% A/B的线性变化，36-38 min的20%/80% A/B的等度梯度，38-39min至85%/15% A/B的线性变化，39-42 min的85%/15% A/B的等度梯度。
用于评价蛋白制剂的物理稳定性的ThT纤维化分析的一般介绍
肽的低物理稳定性可导致淀粉样原纤维形成，在样品中其被观察为非常有序的、线状大分子结构，最终导致凝胶形成。这在传统上通过目测检查样品来测量。然而，这种测量是非常主观的并取决于观察者。因此，小分子指示剂探针的应用更加有利。硫磺素T(ThT)是这样一种探针，并在结合于原纤维时具有明显的荧光信号[Naiki等，于Anal.Biochem. 177 (1989), 244-249；和LeVine，于Methods. Enzymol. 309 (1999), 274-284]。
原纤维形成的时间过程可用下面的表达式通过S形曲线描述[Nielsen等，于Biochemistry40 (2001), 6036-6046]：
方程(1)
在此，F是在时间t的ThT荧光。常数t0是达到50%的最大荧光所需的时间。描述原纤维形成的两个重要的参数是经t0 – 2τ计算的滞后-时间和表观速率常数k app = 1/τ。
肽的部分折叠中间体的形成被提示为纤维化的一个通用启动机制。这些中间体中的极少数成核形成一个模板，在该模板上可以装配更多的中间体并发生纤维化。滞后时间相当于其中核的临界质量建立的时间间隔，和表观速率常数是原纤维本身形成的速率。
样品制剂
在每次分析之前制备新鲜样品。每个样品组成在实施例中描述。使用适当量的浓NaOH和HCl，将样品的pH调节至所需的值。将硫磺素T加入到来自储备液的在H2O中的样品中至最终浓度1 µM。
将200 μl的样品等分液置于96孔微量滴定板(Packard OptiPlateTM-96，白色聚苯乙烯)中。通常将每个样品4 (或8)份重复(对应于一种试验条件)置于一栏孔中。板用Scotch Pad (Qiagen)密封。
孵育和荧光测量
于给定温度下孵育，振荡并在Fluoroskan Ascent FL荧光读板仪(ThermoLabsystems)上测量ThT荧光发射。将温度调节至37℃。将板在不振荡下孵育(没有外部的物理压力)或者在调节至960 rpm和振幅1 mm的回转式振荡下孵育。荧光测量使用通过444 nm滤光器的激发进行和发射的测量通过485 nm滤光器进行。
每次运行通过在分析温度下孵育板10 min启动。每20分钟测定板一段所需的时段。每次测量之间，振荡板并如所述加热。进行分析最多可达45小时。
HPLC浓度测量：回收率
完成ThT分析后，合并每个样品的4或8个重复并于18℃以20,000 rpm离心30分钟。通过0.22 µm滤器过滤上清液并将等分试样转移至HPLC小瓶。
肽在初始样品和在过滤的上清液中的浓度通过反相HPLC，使用适当的标准品作为参照测定。相对于初始样品浓度构成的过滤样品浓度的百分比分数作为回收率报告。
数据处理
测量点以微软Excel格式(Microsoft Excel format)保存供进一步处理并使用GraphPad Prism进行绘制曲线并拟合。在原纤维的缺乏下，来自ThT的背景发射可忽略不计。数据点通常为4或8个样品的平均值并显示标准偏差棒(standard deviation errorbars)。只有在相同实验中获得的数据(即在相同板上的样品)存在于相同曲线图上，确保在实验之间纤维化的相对测量。
数据集可以拟合至方程(1)。然而，纤维化之前的滞后时间可通过目测检查曲线确定时间点评价，在所述时间点ThT荧光增加明显高于背景水平。如果在分析时间45小时内，在一份样品中的任何重复均未观察到ThT荧光增加，则滞后时间指定为45小时。
物理稳定性通过动态光散射(DLS)测定
动态光散射
在动态光散射中，检测入射在含水样品上的散射激光的微秒波动并经由所谓的自相关函数转化为各个种类的扩散系数(Df)。为方便起见，假定样本由球形种类组成，扩散系数通常以流体动力学半径(Rh)报告。而且，从所述半径，获得分子量的经验估计。动态光散射是高度灵敏的方法，其可分辨尺寸的微小变化以及药物制剂中的不需要的微量凝集物质。
由检测器记录的平均、静强度也用作样品的物理稳定性的一个总体衡量，因为较大的物质的生成急剧增加散射的强度。
方法：动态光散射
样品在20 mM磷酸盐(pH 7.5)缓冲液中制备并具有0.9 mg/mL或45.5 mg/mL的浓度(分别11.5和0.23 mM)。于25℃，在Wyatt (Santa Barbara, CA) DynaPro DLS读板仪上进行测量，在各次测量之间使样品保持于37℃。在表1中指定的时间点测定样品最多至2周。测量在用透明塑料薄片(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA)密封的Corning3540 384-孔微量滴定板(Corning, NY)上按25-uL一式三份或一式四份进行，每次测量进行二十次10-秒的采集。以Dynamics 7.1. 7.16的正则化拟合对自相关曲线进行拟合，将得到的扩散系数转化为流体动力学半径和假设为球形的分子质量以及大小和质量之间经验关系。使散射强度相对于激光强度和检测器灵敏度标准化。
经微流成像(MFI)测定的4 µm以上的颗粒形成
在表中所列的温度下，在Penfill®筒柱中孵育该溶液。在给定的孵育期后，将Penfill®筒柱倒空到14mL离心管(falcon tubes)中。在MFI5200+Bot1系统上分析2x1mL样品。测量蛋白样颗粒的浓度(ECD>4µm和Circularity*AspectRatio*强度STD <70)以在硅油样小滴浓度中滤去Penfill®的Penfil®可变性。
如经SEC观察到的在中性pH下种类分布
方法1
运行的缓冲液是150 mM NaCl、2 mM苯酚和10 mM Tris pH 7.6。使用包含单体胰岛素(X2) (19.0 min)、非-解离六聚体胰岛素(Co(III)HI (“HI”是人胰岛素)) (16.0min)、HSA (14.0 min)和HSA-二聚体(12.5 min)的MW标准品以分配各种类。柱排阻限制是2x106 Da。色谱包迹被积分和双六聚体被定义为AUC 12.5 min-14.3 min，六聚体被定义为14.3 min-16.0 min和小于六聚体的低聚体被定义为16.0 min-21.0 min。
方法2
柱，BEH200，1,7µm, 4,6x150mm柱，得自Waters，流速0.3 ml/min，于22℃下，在有苯酚的方法中8 mM苯酚，或在无苯酚的方法中0 mM苯酚，140 mM NaCl, 10 mM Tris/HClpH 7.4。种类分布通过UVVis检测并针对适当的MW蛋白标准品进行评价。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用以其整体予以结合，如同各个参考文献单独地和特别地指明通过引用结合到本文中的程度一样，并且在本文中以其整体阐明(至法律允许的最大程度)。
本文中专利文件的引用和结合仅为了便利而进行且不反映这样的专利文件的有效性、可专利性和/或可实施性的任何观点。本文中提及的参考文献不应认为它们构成现有技术。
本文中使用的所有标题和副标题仅仅是为了方便起见并不应视为以任何方式限制本发明。
除非另外指明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。在本公开与授权的专利、申请和本文或他处引用的参考文献之间不一致的情况下，将以本公开为准。
本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅仅意欲更好地说明本发明，并不构成对本发明范围的限制，除非另有要求。在说明书中的语言不应解释为指明任何非要求的要素为实施本发明所必要的。
在此，单词“包含”被广义地解释为意指“包括”、“含有”或“涵盖” (参见，欧洲专利局审查指南(Guidelines for Examination in the Europe Patent Office), 部分C, 第III章, 4. 21, 2007年12月)。
本发明包括适用法律允许的所附的权利要求和条款中所述的主题的所有修饰和等同物。

Claims (11)

1.一种药物制剂，其包含选自以下的胰岛素衍生物、从1至2% (重量/重量)的甘油、从16至35 mM的苯酚、从16至35 mM的间甲酚、从3.5至5.5摩尔的锌离子/6摩尔的所述胰岛素衍生物和不超过75 mM的氯化钠：
A14E, B16H, B25H, B29K((Nε-二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E, B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu),desB30人胰岛素；
其中胰岛素衍生物的量为高于1.2 mM且低于9 mM。
2.依据权利要求1的药物制剂，其中胰岛素衍生物是A14E, B16H, B25H, B29K((Nε-二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素。
3.依据权利要求1的药物制剂，其中胰岛素衍生物是A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
4.依据权利要求1的药物制剂，其中胰岛素衍生物是A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
5. 依据权利要求1的药物制剂，其中胰岛素衍生物是A14E, B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
6.依据权利要求1-5中任一项的药物制剂，其中胰岛素衍生物的量为高于2.1 mM。
7.依据权利要求1-5中任一项的药物制剂，其中胰岛素衍生物的量为低于7.1 mM。
8.依据权利要求1-5中任一项的药物制剂，其中胰岛素衍生物的量为低于6 mM。
9.药物制剂，其包含2.1-5.2 mM的胰岛素衍生物、0.5-1.8% (重量/重量)的甘油、22-28 mM的苯酚、22-28 mM的间甲酚、3.8-5摩尔锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物、10-90 mM的氯化钠和具有7.2-8.2的pH值，其中所述胰岛素衍生物选自A14E, B16H, B25H, B29K((Nε-二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E, B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
10.依据权利要求1的药物制剂，包含4.2 mM的胰岛素衍生物、1.6% (重量/重量)的甘油、25 mM的苯酚、25 mM的间甲酚、4.5 摩尔Zn离子/6摩尔的所述胰岛素衍生物、20 mM的氯化钠和具有7.4的pH值。
11.药物制剂，其包含4.2 mM的胰岛素衍生物、0.7% (重量/重量)的甘油、25 mM的苯酚、25 mM的间甲酚、4.5摩尔锌离子/6摩尔的胰岛素衍生物、75 mM的氯化钠和具有7.4的pH值，其中所述胰岛素衍生物选自A14E, B16H, B25H, B29K((Nε-二十烷二酰基-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)), desB30人胰岛素；A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-十六烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；A14E, B16H,B25H, B29K(Nε-二十烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素；和A14E, B25H, desB27, B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu), desB30人胰岛素。
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