CN104306965B - 预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，包括PspA‑mRX1、PspA‑EF5668、PspA‑EF3296和PlyL460D，其中，所述各组分的含量均为10‑100μg/ml；通过向铝佐剂中加入相应剂量的PspA‑mRX1、PspA‑EF5668、PspA‑EF3296和PlyL460D四种原液并混匀制得；所述免疫原性组合物可以预防覆盖95％以上临床上流行的肺炎链球菌的感染和侵袭，在肺炎预防方面具有广泛应用，其制备方法简单，生产成本较低，生产周期缩短，适合规模化工业生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其是预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及其制备方法。
背景技术
肺炎链球菌是世界范围内引起死亡的重要原因之一，且是肺炎、脑膜炎、中耳炎等侵袭性和非侵袭性感染的重要致病菌。肺炎链球菌常寄生在健康人的鼻咽部，约有40％－70％的人带菌，当机体免疫功能降低时，病菌就会乘虚而入侵入肺部，造成肺炎。肺炎链球菌感染，一是来自自身带菌，当抵抗力降低时，肺炎链球菌向下呼吸道侵犯引起肺炎；二是被来自带菌的别人或患者所传染，引起肺炎。
接种疫苗是有效的特异性预防措施，具有极佳的卫生经济学价值。目前普遍应用的预防肺炎链球菌疾病的疫苗主要有两类，多糖疫苗(23价多糖疫苗，适用于2岁以上适合人群)和多糖蛋白结合疫苗(7价、10价或13价，可用于2岁以下婴幼儿)。
肺炎多糖疫苗为“23价肺炎多糖疫苗”，能覆盖23种经常引起肺炎球菌感染的血清型，约90％的肺炎球菌感染疾病是由这23种血清型引起的。绝大多数健康的成年人，在接种后2-3周内，均能产生抵抗所有或大部分肺炎链球菌的保护性抗体。23价肺炎疫苗可以有效地预防肺炎，已经在美国、加拿大等30多个国家及地区应用14年以上，接种后保护率可达92％，具有良好的安全性，免疫功效可维持5年。2岁以上体弱或反复患肺炎的幼儿及高危人群(如无脾儿童)可以使用。
23价肺炎多糖疫苗所含的荚膜多糖抗原为T细胞非依赖性抗原，可以刺激成熟的B淋巴细胞，但不会刺激T淋巴细胞，此抗原介导的免疫反应持续时间较短，不能产生免疫记忆。2岁以下婴幼儿免疫功能发育尚不完善，对T细胞非依赖性抗原的反应很差，所以多糖疫苗不能诱导婴幼儿产生保护性免疫应答。23价肺炎多糖疫苗不能用于2岁以下儿童的预防。7价肺炎多糖蛋白结合疫苗可以预防疫苗所覆盖7种血清型肺炎链球菌所引起的疾病，国外研究显示，其所包含的7种血清型所导致的疾病约占所有肺炎链球菌感染疾病的80％左右。2006-2007年在我国四所有代表性的儿童医院(北京儿童医院、上海复旦大学附属儿科医院、广州儿童医院和深圳儿童医院)5岁以下住院肺炎儿童中临床分离到279株肺炎链球菌。分析发现主要的致病肺炎链球菌血清型与PCV7所覆盖血清型一致，而这7种血清型占到所有致病肺炎链球菌的81％。这说明7价肺炎结合疫苗在中国同样具有较高的血清型覆盖率。但7价肺炎结合疫苗不能预防疫苗覆盖这7种血清型之外的其他血清型肺炎链球菌的感染。研究表明，其它血清型肺炎链球菌的感染也普遍存在。
肺炎链球菌表面的多种膜蛋白是重要的毒力因子，可作为一种重要的抗原物质，由于外膜蛋白具有保守的组成结构，因此外膜蛋白可诱发交叉免疫作用。肺炎表面蛋白A(PspA)广泛存在于90种肺炎链球菌亚型中，PspA蛋白的a螺旋端是一个重要的抗原决定区域，在不同血清型中有广泛的同源性，根据该端氨基酸序列，PspA蛋白被划分为3个家族(famlily)，再细分为6个支系(clade)。
已有大量的研究报道了PspA蛋白对不同血清型SPN的保护作用，将PspA蛋白作为疫苗成分，可克服多糖蛋白结合疫苗荚膜血清型数量有限且抗蛋白载体抗体对病原菌缺乏特异性保护作用的不足之处。流行性病学调查显示，绝大多数SPN菌PspA属于一、二两家族,临床上很少分离到家族三菌株。本发明所述免疫原性组合物PspA-mRX1来自家族一、PspA-EF5668和PspA-EF3296来自于PspA家族二，以此免疫组合物作为抗原组分，将覆盖95％以上的临床分离株血清型。
溶血素的主要作用是溶血和激活补体，鼻腔和腹膜腔的肺炎链球菌攻击试验证实，重组ply可使老鼠的寿命延长89％和93％。ply氨基酸序列高度保守，抗原性强，因此，ply可以作为覆盖所有血清型抗原疫苗的备选蛋白，该蛋白的疫苗潜能已经在不同的实验室中证实。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物(PBPV制剂)，包括PspA-mRX1(去除人同源性的RX1亚型肺炎球菌表面蛋白A)、PspA-EF5668(EF5668亚型肺炎球菌表面蛋白A)、PspA-EF3296(EF3296亚型肺炎球菌表面蛋白A)和PlyL460D(改造的肺炎链球菌溶血素)，其中，所述PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D的含量均为10-100μg/ml，即该免疫原性组合物的组分剂量配制方案为：
(1)PspA-mRX1用量10-100μg/ml；
(2)PspA-EF5668用的量10-100μg/ml；
(3)PspA-EF3296用量10-100μg/ml；
(4)PlyL460D用量10-100μg/ml。
优选的，上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，所述PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D的质量比为1:1:1:1。
优选的，上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，所述PspA-mRX1是根据申请号为201110455047.3的发明专利制备得到的。
优选的，上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，可以作为预防肺炎链球菌家族一型和二型感染的疫苗。
上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)准备上述组方中各抗原原液和铝佐剂，按照PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D四种蛋白最终浓度为10-100μg/ml，铝离子最终浓度为0.48mg/ml，计算原液、佐剂以及补充的生理盐水用量；
(2)向计算所得量的生理盐水中加入对应量的铝佐剂混匀，按顺序依次加入PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四种原液，缓慢上下颠倒混匀，放入2-8℃冷库过夜，即得。
本发明的有益效果是：
上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，可以预防覆盖95％以上血清型的肺炎链球菌(家族一型和二型)的感染和侵袭，PspA-mRX1抗原组分中氨基酸肽段的加入可以增强该组分在免疫原性组合物中所发挥的免疫功效，在肺炎预防方面具有广泛应用，其制备方法简单，生产成本较低，生产周期缩短，适合规模化工业生产的需要。
附图说明
图1为PspA-EF5668抗原蛋白的分离纯化SDS-PAGE电泳图谱，其中，
1：破碎液；2：SP流穿；3：SP洗脱；4：SP洗脱拖尾；5：柱清洗；6：SP洗脱；7：Q流穿；8：杂蛋白清洗；9：目标蛋白洗脱。
图2为PlyL460D抗原蛋白的分离纯化SDS-PAGE电泳图谱，其中，
1：破碎液；2：硫酸铵沉淀；3：SP流穿；4：洗脱；M：Marker；5：柱清洗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
单个抗原组分的制备
Ⅰ、构建PspA-mRX1，按照申请号为201110455047.3进行制备，具体方法包括：
构建PspA-mRX1，利用大肠杆菌BL21(DE3)表达PspA-mRX1，具体方法包括：将mRX1的PspA的DNA序列导入PET9a质粒，再将构建好的质粒导入到大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)中，得到含有PspA-mRX1的表达载体；
取PspA-mRX1大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100μL涂布平板，37℃培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到100ml摇瓶培养基中，37℃，200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37℃，pH7.0，转速200-600rpm，补料采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为1mM的IPTG，培养结束后发酵液离心取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清；
对PspA-mRX1抗原蛋白进行分离纯化：将收获的菌体进行匀浆破碎，然后按照1L破碎液加入30-250ml柠檬酸(1M)的比例加入柠檬酸，搅拌均匀后离心收集上清。将上清经过SP FF进行纯化。首先使用pH为3-4的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到洗脱溶液。将洗脱液经过Q FF进行纯化。首先使用pH为7-8的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到纯度大于95％的样品(PspA-mRX1)。测定结果见图1。所得PspA-mRX1的序列为序列表<400>1所述序列。
Ⅱ、构建PspA-EF5668，利用大肠杆菌BL21(DE3)表达PspA-EF5668，具体方法包括：将EF5668的PspA的DNA序列导入PET9a质粒，再将构建好的质粒导入到大肠杆菌E.ColiBL21(DE3)中，得到含有PspA-EF5668的表达载体：
取PspA-EF5668大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100μL涂布平板，37℃培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到100ml摇瓶培养基中，37℃，200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37℃，pH7.0，转速200-600rpm，补料采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为1mM的IPTG，培养结束后发酵液离心取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清。
对PspA-EF5668抗原蛋白进行分离纯化：将收获的菌体进行匀浆破碎，然后按照1L破碎液加入30-250ml柠檬酸(1M)的比例加入柠檬酸，搅拌均匀后离心收集上清。将上清经过SP FF进行纯化。首先使用pH为3-4的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到洗脱溶液。将洗脱液经过Q FF进行纯化。首先使用pH为7-8的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到纯度大于95％的样品(PspA-EF5668)。测定结果见图1。所得PspA-EF5668的序列为序列表<400>2所述序列。
Ⅲ、构建PspA-EF3296，利用同样的方法构建含有PspA-EF3296的大肠杆菌表达载体，具体方法包括：
取PspA-EF3296大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100μL涂布平板，37℃培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到100ml摇瓶培养基中，37℃，200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37℃，pH7.0，转速200-600rpm，补料采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为1mM的IPTG，培养结束后发酵液离心取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清。
对PspA-EF3296抗原蛋白进行分离纯化：将收获的菌体进行匀浆破碎，然后按照1L破碎液加入30-250ml柠檬酸(1M)的比例加入柠檬酸，搅拌均匀后离心收集上清。将上清经过SP FF进行纯化。首先使用pH为3-4的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到洗脱溶液。将洗脱液经过Q FF进行纯化。首先使用pH为7-8的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到纯度大于95％的样品(PspA-EF3296)。所得PspA-EF3296的序列为序列表<400>3所述序列。
Ⅳ、构建PlyL460D的序列，利用大肠杆菌BL21(DE3)表达ply460D，具体方法包括：
取ply460D大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100μL涂布平板，37℃培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到100ml摇瓶培养基中，37℃，200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37℃，pH7.0，转速200-600rpm，补料采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为1mM的IPTG，培养结束后发酵液离心取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清。
对ply460D抗原蛋白进行分离纯化：将菌体进行匀浆破碎，然后通过0.2μm膜包进行超滤回收，再经过30KD膜包浓缩换液。将溶液经过Q 650M进行纯化。首先使用pH为8-9的tris进行平衡，然后使用含有50-250mM NaCl的tris(pH＝8-9)进行洗脱。将洗脱液经过phenyl进行纯化。首先使用含有0.5-3M NaCl的tris(pH＝8-9)进行平衡，然后使用pH为8-9的tris进行洗脱。将洗脱液经过CHT I进行纯化。首先使用pH为6.2的PB(4-10mM)进行平衡，然后使用含有0.5-1M NaCl的PB(4-10mM，pH＝7-8)进行洗脱，得到样品(PlyL460D)。测定结果见图2。所得PlyL460D的序列为序列表<400>4所述序列。
实施例2
免疫原性组合物的制剂配制
免疫原性组合物的配制，按下表1进行：
表1
配制方法如下：
(1)准备上述组方中各抗原原液和铝佐剂，按照PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D四种蛋白最终浓度为100μg/ml，铝离子最终浓度为0.48mg/ml，计算原液、佐剂以及补充的生理盐水用量；
(2)准备配制所需的材料，包括生理盐水、移液管、移液器、无热原吸头、蓝盖瓶、量筒等；使用紫外光照射超净台30min后开始配制；
(3)开始配制制剂：在超净台内，使用量筒向蓝盖瓶内加入计算所得量的生理盐水，再用移液管量取对应量的铝佐剂，混匀，按顺序依次加入等体积的PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四种原液，将瓶盖拧紧，缓慢上下颠倒混匀，放入2-8℃冷库过夜，即得免疫原性组合物1；
(4)将步骤1中蛋白浓度改为50μg/ml，重复步骤1-3可得到免疫原性组合物2；将步骤1中蛋白浓度改为10μg/ml，重复步骤1-3可得到免疫原性组合物3。
实施例3
供试品配置方法参见实施例2。
本试验的目的是研究单个抗原组分对WU2菌株、Tigr4菌株感染NIH小鼠的保护效力(通过小鼠存活率判断)。12-14g NIH小鼠每组10只，皮下注射10μg/ml的单个抗原组分0.5ml，Al(OH)3作为对照，每隔2周进行一次免疫，共3次免疫过程；每次免疫前进行眼眶取血，备用。第一次免疫记为0天，45天后进行肺炎链球菌(WU2菌株的菌浓为1.5x107/ml，每只小鼠静脉注射100μl；Tigr4菌株的菌浓为1.0x108/ml,每只小鼠静脉注射100μl)攻击实验，2周后观察动物的死亡情况。
上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的抗原组分中所述PspA-mRX1对于肺炎链球菌家族一型(WU2菌株)具有保护作用；所述PspA-EF3296和PspA-EF5668主要对于肺炎链球菌家族二型(Tigr4菌株)具有保护作用，同时对家族一型(WU2菌株)也具有一定的保护效果。所述PlyL460D单组份不足以对肺炎链球菌家族具有保护作用。如下表2。
表2攻毒后小鼠存活率(单组分抗原免疫)
实施例4
供试品配置方法参见实施例2。
本实验目的是研究多组分抗原组合物对WU2菌株、Tigr4菌株感染NIH小鼠的保护效力(通过小鼠存活率判断)。12-14g NIH小鼠每组10只，皮下注射不同抗原含量的三组分抗原组合物和四组分抗原组合物各0.5ml，AL(OH)3作为对照，每隔2周进行一次免疫，共3次免疫过程；每次免疫前进行眼眶取血，备用。第一次免疫记为0天，45天后进行肺炎链球菌(WU2菌株的菌浓为1.5x107/ml，每只小鼠静脉注射100μl；Tigr4菌株的菌浓为1.0x108/ml,每只小鼠静脉注射100μl)攻击实验，2周后观察动物的死亡情况，保护力结果见表3。
表3攻毒后小鼠存活率(多组分抗原免疫)
备注：制剂混合比PRX1:P3296:P5668:L460D＝1:1:1:1
实验结果发现，四组分组合物在抗原含量为10μg/ml和2μg/ml条件下，对于WU2菌株和Tigr4菌株都具有很高保护力功效，10μg/ml条件下对于WU2菌株和Tigr4菌株均达到100％保护效果，2μg/ml条件下对于WU2菌株具有80％的保护力效果，而对于Tigr4菌株则具有60％的保护效果；
对比表2和表3中的数据可以看到，同等抗原含量(10μg/ml)条件下，多组分抗原组合物对于肺炎链球菌家族一型(WU2菌株)和二型(Tigr4菌株)的保护能力要比每个单组分抗原的作用强；
三组分抗原组合物和四组分抗原组合物的对比实验可以看到，三组分(PspA-mRX1、PspA-EF5668和PspA-EF3296)抗原组合物虽然对于肺炎链球菌家族一型和二型都具有一定的保护作用，但明显弱于四组分(PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PLY460D)的抗原组合物。说明抗原PlyL460D能明显增强另外三种抗原组合物的免疫效果。
上述参照实施例对该预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，其特征在于：包括PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D，所述PspA-mRX1的序列为序列表中序列1所示，所述PspA-EF5668的序列为序列表中序列2所示，所述PspA-EF3296的序列为序列表中序列3所示，所述PlyL460D的序列为序列表中序列4所示，其中，所述PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、 PlyL460D的含量均为10-100μg/ml,所述PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D的质量比为1:1:1:1。
2.根据权利要求1所述的用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，其特征在于：应用于预防肺炎链球菌家族一型和二型感染的疫苗。
3.权利要求1所述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物的制备方法，其特征在于：具体制备步骤如下：
（1）按照PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296、 PlyL460D四种蛋白最终浓度为10-100μg/ml,铝离子最终浓度为0.48mg/ml，计算原液、佐剂以及补充的生理盐水用量；
（2）向计算所得量的生理盐水中加入对应量的铝佐剂混匀，按顺序依次加入PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四种原液，缓慢上下颠倒混匀，放入2-8℃冷库过夜，即得。
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