CN104297480B - 一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于三维结构的GS-CNT-Pt纳米材料较大的比表面积，较高的催化效率等优点提高了对前列腺癌特异性抗原检测的灵敏度，降低了检出限，对前列腺癌特异性抗原的检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法及应用。具体是采用三维结构的GS-CNT-Pt制备一种检测前列腺癌标志物的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
目前对前列腺癌标志物的检测有多种方法，比如基因检测法，化学发光免疫分析，酶联免疫分析等；本发明是将免疫学原理与电分析化学相结合，制备了一种灵敏性高、选择性好、简便快速的用于检测前列腺特异性抗原的传感器。
石墨烯纳米层作为一种二维材料，有较大的比表面积，催化性能好，生物相容性好等特点；金纳米粒子具有催化性能高、长期分散性稳定、生物相溶性强等特点；氨基化石墨烯相比石墨烯能更大程度地增加了与金的结合，Au-NH2-GS纳米复合材料能够增加抗体在其表面的负载量和在水中的分散性，该复合材料的应用具有提高免疫传感器的灵敏度和稳定性，降低传感器的检出限，增强电化学信号等优势。本发明制备了一种具有三维结构的GS-CNT纳米材料，在其三维空间结构中插入Pt纳米粒子，促使抗体更容易、牢固的与其结合，从而显著提高了该材料的催化性能。本发明制备过程简单，检测快捷，灵敏性高，检出限低等一系列优点。
发明内容
本发明的目的之一基于具有三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合材料，制备一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器；本发明的目的之二将该传感器应用于前列腺癌特异性抗原的高灵敏、快速特异检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，用超纯水清洗干净；将4~6 μL、0.5~2 mg/mL的Au-NH2-GS溶液滴加到处理好的裸电极上，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（2）将4~6 μL、8 ~ 12 μg/mL的前列腺癌标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，放置4℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（3）将3 μL、质量分数为0.5 ~ 3.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加4~6 μL、0.5 pg/mL~ 15 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺癌标志物抗原标准溶液到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将4~6 μL、3 ~ 6 mg/mL的GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干后，超纯水冲洗，制得前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器。
2. Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备，步骤如下：
（1）金纳米粒子溶液的制备
将100 mL、质量分数为0.01~0.02％的HAuCl4溶液加热至沸，滴加2.0~3.0 mL、质量分数为0.5~1.5％的柠檬酸钠水溶液，溶液颜色变为红棕色，冷却至室温；
(2) 氨基化石墨烯NH2-GS的制备
0.05~0.2 g石墨烯分散在5~15 mL的乙醇中，超声搅拌1 h, 加入0.1~0.3 mL、质量分数为99％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70 ℃条件下加热搅拌1.0~2.0 h；加入0.1 mL、质量分数为80％的水合肼，95℃加热1 h；在9000 rpm的转速下离心20~40 min；在真空条件下干燥8~12 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS；
（3）Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
称取10~20 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小烧杯中，加入10~20 mL金纳米溶液，搅拌10~14 h，离心后在真空条件35~45 ℃下干燥12h，制得Au-NH2-GS纳米复合材料，用水配制成0.5~2 mg/mL的Au-NH2-GS纳米复合材料溶液。
3. GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）氧化石墨烯的制备
将0.3 g的石墨和1.5~2.0 g高锰酸钾混合，放入带有磁子的500 mL的三口瓶中，加入体积比为8~10 ∶1的硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴锅，加热到50 ℃，反应10 ~12 h；将样品倾倒到40 mL的冰上，磁力搅拌下，滴加0.5~1.0 mL的过氧化氢，溶液变为土黄色，在8000 rpm的转速下离心0.5 h，依次用30 mL、 0.2 mol/L的盐酸及30 mL的无水乙醇离心洗涤3次，弃去上清液，用乙醚离心洗涤1次，弃去上清液，得到的固体样品置于30~40 ℃的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黄色固体粉末；
（2）三维结构的GS-CNT纳米复合材料的制备
将20~40 mg的碳纳米管CNT加入到30 mL、1~3 mg/mL 的氧化石墨烯的均匀分散液中，超声30 min，将得到的混合物放入50 mL 的高压反应釜中，加热升温至160~190 ℃，并保持12 h，冷却至室温，将得到的混合物冷冻干燥；
（3）三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物的制备
在剧烈搅拌的条件下，将1 mL、5~15 mmol/L 的K2PtCl4溶液和5 mg 的三维结构的GS-CNT纳米复合材料加入到10 mL的超纯水中，冰浴30 min， 7000 rpm下离心分离5 min，制得三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物，用水洗涤、离心分离3次， 35~45℃下真空干燥12h；
（4）GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
将3~6 mg的三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物加入到3~6 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入150~300 μL、10 μg/mL的前列腺癌标记物二抗Ab2溶液， 4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h， 3000 rpm的转速下离心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
4. 前列腺癌标志物的检测方法，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、30~50 mmol/L的pH =5.9~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、30~50 mmol/L的pH=5.9~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5~10 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化，绘制工作曲线；
（4）用血清样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液，按照工作曲线绘制的方法进行检测。
本发明的有益成果
（1）Au-NH2-GS纳米复合材料与Au-GS复合材料相比增加抗体在其表面的负载量和在水中的分散性，从而提高传感器的灵敏度和稳定性。
（2）将碳纳米管中引入还原氧化石墨烯中，形成独特的三维网状结构，增大了比表面积，负载更多的Pt纳米粒子，使抗体容易与其结合。
（3）将三维GS-CNT-Pt纳米复合物与肿瘤标志物二抗直接孵化，利用贵金属优异的生物相容性和较高的催化性能，在二抗的标记中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
（4）本发明利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。
（5）本发明制备的电化学免疫传感器用于前列腺癌特异性抗原标志物的检测，具有响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测等优点，线性范围为0.50 pg/mL~15 ng/mL，检测限为0.12 pg/mL。
具体实施方式
实施例1一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，用超纯水清洗干净；将4 μL、0.5 mg/mL的Au-NH2-GS溶液滴加到处理好的裸电极上，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（2）将4 μL、8 μg/mL的前列腺癌标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，放置4℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）将3 μL、质量分数为0.5 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加4 μL、0.5 pg/mL~ 15 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺癌标志物抗原标准溶液到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将4 μL、3 mg/mL的GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干后，超纯水冲洗，制得前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器。
实施例2一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，用超纯水清洗干净；将5μL、1.0 mg/mL的Au-NH2-GS溶液滴加到处理好的裸电极上，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（2）将5 μL、10 μg/mL的前列腺癌标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）将3 μL、质量分数为2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，放置4℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加5 μL、0.5 pg/mL~ 15 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺癌标志物抗原标准溶液到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将5 μL、5 mg/mL的GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干后，超纯水冲洗，制得前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器。
实施例3一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，用超纯水清洗干净；将6 μL、2 mg/mL的Au-NH2-GS溶液滴加到处理好的裸电极上，放置4℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（2）将6 μL、12 μg/mL的前列腺癌标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）将3 μL、质量分数为3.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6 μL、0.5 pg/mL~ 15 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺癌标志物抗原标准溶液到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将6 μL、6 mg/mL的GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干后，超纯水冲洗，制得前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器。
实施例4 Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
（1）金纳米粒子溶液的制备
将100 mL、质量分数为0.01％的HAuCl4溶液加热至沸，滴加2.0 mL、质量分数为0.5％的柠檬酸钠水溶液，溶液颜色变为红棕色，冷却至室温；
(3) 氨基化石墨烯NH2-GS的制备
0.05 g石墨烯分散在5 mL的乙醇中，超声搅拌1 h, 加入0.1 mL、质量分数为99％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70 ℃条件下加热搅拌1.0 h；加入0.1 mL、质量分数为80％的水合肼，95 ℃加热1 h；在9000 rpm的转速下离心20 min；在真空条件下干燥8 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS；
（3）Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
称取10 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小烧杯中，加入10 mL金纳米溶液，搅拌10 h，离心后在真空条件35 ℃下干燥12 h，制得Au-NH2-GS纳米复合材料，用水配制成0.5 mg/mL的Au-NH2-GS纳米复合材料溶液。
实施例5 Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
（1）金纳米粒子溶液的制备
将100mL、质量分数为0.015％的HAuCl4溶液加热至沸，滴加2.5 mL、质量分数为1.0％的柠檬酸钠水溶液，溶液颜色变为红棕色，冷却至室温；
(4) 氨基化石墨烯NH2-GS的制备
0.1 g石墨烯分散在10 mL的乙醇中，超声搅拌1 h, 加入0.2 mL、质量分数为99％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70℃条件下加热搅拌1.5 h；加入0.1 mL、质量分数为80％的水合肼，95 ℃加热1 h；在9000 rpm的转速下离心30 min；在真空条件下干燥10 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS；
（3）Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
称取15 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小烧杯中，加入15 mL金纳米溶液，搅拌12 h，离心后在真空条件40 ℃下干燥12 h，制得Au-NH2-GS纳米复合材料，用水配制成1.0 mg/mL的Au-NH2-GS纳米复合材料溶液。
实施例6 Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
（1）金纳米粒子溶液的制备
将100 mL、质量分数为0.02％的HAuCl4溶液加热至沸，滴加3.0 mL、质量分数为1.5％的柠檬酸钠水溶液，溶液颜色变为红棕色，冷却至室温；
(5) 氨基化石墨烯NH2-GS的制备
0.2 g石墨烯分散在15 mL的乙醇中，超声搅拌1 h, 加入0.3 mL、质量分数为99％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70 ℃条件下加热搅拌2.0 h；加入0.1 mL、质量分数为80％的水合肼，95 ℃加热1 h；在9000 rpm的转速下离心40 min；在真空条件下干燥12 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS；
（3）Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
称取20 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小烧杯中，加入20 mL金纳米溶液，搅拌14 h，离心后在真空条件45 ℃下干燥12 h，制得Au-NH2-GS纳米复合材料，用水配制成2 mg/mL的Au-NH2-GS纳米复合材料溶液。
实施例7 GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
（1）氧化石墨烯的制备
将0.3 g的石墨和1.5 g高锰酸钾混合，放入带有磁子的500 mL的三口瓶中，加入体积比为8∶1的硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴锅，加热到50 ℃，反应10 h；将样品倾倒到40 mL的冰上，磁力搅拌下，滴加0.5 mL的过氧化氢，溶液变为土黄色，在8000 rpm的转速下离心0.5 h，依次用30 mL、 0.2 mol/L的盐酸及30 mL的无水乙醇离心洗涤3次，弃去上清液，用乙醚离心洗涤1次，弃去上清液，得到的固体样品置于30oC的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黄色固体粉末；
（2）三维结构的GS-CNT纳米复合材料的制备
将20 mg的碳纳米管CNT加入到30 mL、1 mg/mL 的氧化石墨烯的均匀分散液中，超声30 min，将得到的混合物放入50 mL 的高压反应釜中，加热升温至160 ℃，并保持12 h，冷却至室温，将得到的混合物冷冻干燥；
（3）三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物的制备
在剧烈搅拌的条件下，将1 mL、5 mmol/L 的K2PtCl4溶液和5 mg 的三维结构的GS-CNT纳米复合材料加入到10 mL的超纯水中，冰浴30 min，7000 rpm下离心分离5 min，制得三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物，用水洗涤、离心分离3次， 35 ℃下真空干燥12 h；
（4）GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
将3mg的三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物加入到3 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入150 μL、10 μg/mL的前列腺癌标记物二抗Ab2溶液， 4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h， 3000 rpm的转速下离心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例8 GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
（1）氧化石墨烯的制备
将0.3 g的石墨和1.8 g高锰酸钾混合，放入带有磁子的500 mL的三口瓶中，加入体积比为9 ∶1的硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴锅，加热到50 ℃，反应11 h；将样品倾倒到40 mL的冰上，磁力搅拌下，滴加0.8 mL的过氧化氢，溶液变为土黄色，在8000 rpm的转速下离心0.5 h，依次用30 mL、 0.2 mol/L的盐酸及30 mL的无水乙醇离心洗涤3次，弃去上清液，用乙醚离心洗涤1次，弃去上清液，得到的固体样品置于35oC的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黄色固体粉末；
（2）三维结构的GS-CNT纳米复合材料的制备
将30mg的碳纳米管CNT加入到30 mL、2 mg/mL 的氧化石墨烯的均匀分散液中，超声30 min，将得到的混合物放入50 mL 的高压反应釜中，加热升温至180 ℃，并保持12 h，冷却至室温，将得到的混合物冷冻干燥；
（3）三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物的制备
在剧烈搅拌的条件下，将1 mL、10 mmol/L 的K2PtCl4溶液和5 mg 的三维GS-CNT纳米复合材料加入到10 mL的超纯水中，冰浴30 min，7000 rpm下离心分离5 min，制得三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物，用水洗涤、离心分离3次， 40℃下真空干燥12h；
（4）GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
将5 mg的三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物加入到5 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入200 μL、10 μg/mL的前列腺癌标记物二抗Ab2溶液， 4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h， 3000 rpm的转速下离心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例9 GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
（1）氧化石墨烯的制备
将0.3 g的石墨和2.0 g高锰酸钾混合，放入带有磁子的500 mL的三口瓶中，加入体积比为10 ∶1的硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴锅，加热到50 ℃，反应12 h；将样品倾倒到40 mL的冰上，磁力搅拌下，滴加1.0 mL的过氧化氢，溶液变为土黄色，在8000 rpm的转速下离心0.5 h，依次用30 mL、 0.2 mol/L的盐酸及30 mL的无水乙醇离心洗涤3次，弃去上清液，用乙醚离心洗涤1次，弃去上清液，得到的固体样品置于40 ℃的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黄色固体粉末；
（2）三维结构的GS-CNT纳米复合材料的制备
将40 mg的碳纳米管CNT加入到30 mL、3 mg/mL 的氧化石墨烯的均匀分散液中，超声30 min，将得到的混合物放入50 mL 的高压反应釜中，加热升温至190 ℃，并保持12 h，冷却至室温，将得到的混合物冷冻干燥；
（3）三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物的制备
在剧烈搅拌的条件下，将1 mL、15 mmol/L 的K2PtCl4溶液和5 mg 的三维结构的GS-CNT纳米复合材料加入到10 mL的超纯水中，冰浴30 min， 7000 rpm下离心分离5 min，制得三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物，用水洗涤、离心分离3次，45 ℃下真空干燥12 h；
（4）GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
将6 mg的三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物加入到6 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入300 μL、10 μg/mL的前列腺癌标记物二抗Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h， 3000 rpm的转速下离心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例10 前列腺癌标志物的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、30 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、30 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化，绘制工作曲线；
（4）用血清样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液，按照工作曲线绘制的方法进行检测。
实施例11 前列腺癌标志物的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、10 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化，绘制工作曲线；
（4）用血清样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液，按照工作曲线绘制的方法进行检测，线性范围为0.50 pg/mL~15 ng/mL，检测限为0.12 pg/mL。
Claims (3)
1.一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）金纳米粒子溶液的制备
将100 mL、质量分数为0.01~0.02％的HAuCl4溶液加热至沸，滴加2.0~3.0 mL、质量分数为0.5~1.5％的柠檬酸钠水溶液，溶液颜色变为红棕色，冷却至室温；
氨基化石墨烯NH2-GS的制备
0.05~0.2 g石墨烯分散在5~15 mL的乙醇中，超声搅拌1 h, 加入0.1~0.3 mL、质量分数为99％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70℃条件下加热搅拌1.0~2.0 h；加入0.1mL、质量分数为80％的水合肼，95 ℃加热1 h；在9000 rpm的转速下离心20~40 min；在真空条件下干燥8~12 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS；
（3）Au-NH2-GS纳米复合材料溶液的制备
称取10~20 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小烧杯中，加入10~20 mL金纳米溶液，搅拌10~14 h，离心后在真空条件35 ~45 ℃下干燥12 h，制得Au-NH2-GS纳米复合材料，用水配制成0.5~2 mg/mL的Au-NH2-GS纳米复合材料溶液；
（4）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，用超纯水清洗干净；将4~6 μL、0.5~2 mg/mL的Au-NH2-GS纳米复合材料溶液滴加到处理好的裸电极上，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将4~6 μL、8 ~ 12 μg/mL的前列腺癌标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，放置4 ℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将3 μL、质量分数为0.5 ~ 3.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，放置4℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（7）滴加4~6 μL、0.5 pg/mL~ 15 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺癌标志物抗原标准溶液到电极表面，放置4℃冰箱中干燥后再用超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（8）将4~6 μL、3 ~ 6 mg/mL的GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干后，超纯水冲洗，制得前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器制备方法，所述GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液，其特征在于，制备步骤如下：
（1）氧化石墨烯的制备
将0.3 g的石墨和1.5~2.0 g高锰酸钾混合，放入带有磁子的500 mL的三口瓶中，加入体积比为8~10∶1的硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴锅，加热到50 ℃，反应10 ~12 h；将样品倾倒到40 mL的冰上，磁力搅拌下，滴加0.5~1.0 mL的过氧化氢，溶液变为土黄色，在8000 rpm的转速下离心0.5 h，依次用30 mL、 0.2 mol/L的盐酸及30 mL的无水乙醇离心洗涤3次，弃去上清液，用乙醚离心洗涤1次，弃去上清液，得到的固体样品置于30~40 ℃的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黄色固体粉末；
（2）三维结构的GS-CNT纳米复合材料的制备
将20~40 mg的碳纳米管CNT加入到30 mL、1~3 mg/mL 的氧化石墨烯的均匀分散液中，超声30 min，将得到的混合物放入50 mL 的高压反应釜中，加热升温至160~190 ℃，并保持12 h，冷却至室温，将得到的混合物冷冻干燥；
（3）三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物的制备
在剧烈搅拌的条件下，将1 mL、5~15 mmol/L 的K2PtCl4溶液和5 mg 的三维结构的GS-CNT纳米复合材料加入到10 mL的超纯水中，冰浴30 min，7000 rpm下离心分离5 min，制得三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物，用水洗涤、离心分离3次， 35~45 ℃下真空干燥12 h；
（4）GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液的制备
将3~6 mg的三维结构的GS-CNT-Pt纳米复合物加入到3~6 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入150~300 μL、10 μg/mL的前列腺癌标记物二抗Ab2溶液， 4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h， 3000 rpm的转速下离心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器，用于前列腺癌标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、30~50 mmol/L的pH 5.9~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、30~50 mmol/L的pH=5.9~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5~10 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化，绘制工作曲线；
（4）用血清样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液，按照工作曲线绘制的方法进行检测。
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