CN104271726B

CN104271726B - 洗涤剂组合物

Info

Publication number: CN104271726B
Application number: CN201380023173.9A
Authority: CN
Inventors: A.贝尼; J.W.塔姆斯; P.R.奥斯特加德; M.格杰曼森; M.S.博彻特
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2012-05-01
Filing date: 2013-05-01
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2033-05-01
Also published as: CN104271726A; MX354048B; EP2844728B1; WO2013164379A1; US10407650B2; MX2014013088A; EP2844728A1; US20150104856A1; JP2015524002A

Abstract

披露了一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括一种具有蛋白酶活性的多肽。该组合物可以用于衣物洗涤或硬表面清洁中，例如自动餐具洗涤，并且与一种商业化蛋白酶相比，它具有改进的性能。

Description

洗涤剂组合物

序列表的引用

本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

多年来，洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用了不同酶，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每种酶适于除去不同类型的污物。除这些酶之外，洗涤剂组合物典型地包括成分的复合物组合。例如，大多数清洁产品包括表面活性剂体系、漂白剂或助洗剂。不管当前洗涤剂的复杂度如何，但是对于研发包括新的酶和/或酶共混物的新的洗涤剂组合物仍存在需要。

传统地，在升高的温度和pH下进行洗涤，并且选择熟知的洗涤剂酶在较高的温度和pH下进行，典型地在40℃-60℃的范围内。

对改进洗涤过程以便使得它们更环保的增加的聚焦导致降低洗涤时间、pH、温度并且减少可以消极地影响环境的洗涤剂组分的量的全球趋势。

因此，还希望在较低的温度、较低的pH和/或较低量的洗涤剂组分下洗涤，并且因此对以下洗涤剂蛋白酶存在需要，这些蛋白酶除了在传统条件(例如，升高的温度、pH和高量的洗涤剂组分)下表现良好之外，还例如在低温和/或低pH下具有高性能。另外，对于在不同洗涤剂中起作用的酶存在需要，例如具有低量的表面活性剂和助洗剂的洗涤剂。

本发明针对这些以及其他重要目的。

发明领域

本发明涉及包括一种具有蛋白酶活性的多肽的清洁和/或洗涤剂组合物。本发明还涉及此类具有蛋白酶活性的多肽在清洁过程(例如餐具洗涤和衣物洗涤)中的用途。本发明还涉及编码该多肽的多核苷酸、包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同生产和使用这些多肽的方法。

发明概述

在一个方面中，本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽在清洁过程中的用途，其中具有蛋白酶活性的该多肽选自：

a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性，例如至少70％一致性，优选至少75％一致性，优选至少80％一致性，优选至少85％序列一致性，优选至少90％一致性，优选至少95％一致性，优选至少97％一致性，优选至少98％一致性并且最优选至少99％一致性；

(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性，例如至少70％一致性，优选至少75％一致性，优选至少80％一致性，优选至少85％序列一致性，优选至少90％一致性，优选至少95％一致性，优选至少97％一致性，优选至少98％一致性并且最优选至少99％一致性；

(c)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

在另一个方面中，本发明涉及一种包括在清洁过程中具有蛋白酶活性的多肽的洗涤剂组合物。该清洁过程可以是织物或纺织品的洗涤或它可以是餐具洗涤，例如自动化餐具洗涤。

在另外的方面中，本发明涉及编码具有蛋白酶活性的多肽的多核苷酸，包括这样一种多核苷酸的核酸构建体(例如表达构建体)，包括这样一种构建体的宿主细胞，以及通过使用这样一种多核苷酸和/或核酸构建体生产具有蛋白酶活性的多肽的方法。

另一个方面涉及一种包括一种或多种洗涤剂组分和一种具有蛋白酶活性的多肽的洗涤剂组合物，其中具有蛋白酶活性的该多肽选自：

a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或100％序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性，例如至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或100％序列一致性；

(c)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性，但是具有小于100％序列一致性；以及

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

另一个方面涉及一种用于从纺织品或硬表面降解或除去蛋白质材料的方法，该方法包括用一种根据本发明的组合物处理该纺织品或该硬表面。

本发明的又另一个方面涉及具有蛋白酶活性的多肽在洗涤剂组合物中的用途，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(b)一种多肽，该多肽由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

(c)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性，例如至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或100％序列一致性；

(d)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性，但是具有小于100％序列一致性；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明的一个第三方面涉及一种具有蛋白酶活性的分离的多肽在清洁过程(例如衣物洗涤或餐具洗涤)中的用途，该多肽选自：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

(d)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有70％序列一致性，例如至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性，但是具有小于100％序列一致性；以及

附图简要说明

图1-4示出了来源于链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的表征的结果，对于实验细节参见实例4。

图1示出了Suc-AAPF-pNA底物上的pH-活性。

图2示出了pH-稳定性(在37℃下2小时后的残余活性)。

图3示出了Protazyme AK底物上的温度-活性。

图4示出了在pH 9.0下，Suc-AAPX-pNA底物上的特异性。

序列表综述

SEQ ID NO:1是具有以迟缓芽孢杆菌赛威蛋白酶的信号肽代替天然信号肽的链霉菌属ACTE蛋白酶的编码多核苷酸的芽孢杆菌密码子使用优化的融合基因的DNA序列。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是赛威蛋白酶(Savinase)(来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶，可商购自丹麦的诺维信公司(Novozymes A/S))的氨基酸序列

定义

具有蛋白酶活性的多肽：具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，该底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5；欧洲生物化学杂志1995，232，1-6；欧洲生物化学杂志1996，237，1-5；欧洲生物化学杂志1997，250，1-6；以及欧洲生物化学杂志1999，264，610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽在洗涤剂组合物中的用途。本发明还提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S8肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶在从pH 4-11的宽范围内在Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA上有活性并且在范围pH 6-11内展现尤其高的活性。

本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：

(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或

(b)S8肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；

如在生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.&贝特曼(Bateman)，A.(2010)‘MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database)’，核酸研究(Nucleic Acids Res)38,D227-D233中。

本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。

为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S8家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行测定，而不论其是天然或野生型蛋白酶；还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。

S8家族的肽酶以Asp、His和Ser的顺序含有催化三联体Asp、His和Ser。该催化三联体的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。如从链霉菌属ACTE(SEQ ID NO:2)分离的S8蛋白酶的催化三联体的氨基酸可能是位置Asp 40、His 73和Ser 225。

可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米尔斯基(Mirsky)，A.E.，1932，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森(Anson)，M.L.，1938，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)22:79)。

出于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定确定蛋白酶活性，如动力学Suc-AAPF-pNA测定、Protazyme AK测定以及动力学Suc-AAPX-pNA测定。对于ProtazymeAK测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶Protazyme AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。本发明的多肽具有至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的SEQ ID NO:2的成熟多肽的蛋白酶活性。

分离的多肽：术语“分离的多肽”意指一种相对于如在自然界中发现的那一多肽通过人工修饰的多肽，由此该多肽与至少一种其他与该多肽一起在自然界中发现的化合物完全或部分分离。在一个方面中，该多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指一种包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的与其天然地或重组地相关的其他多肽物质的多肽。优选地，该多肽按存在于该制剂中的总的多肽物质的重量计是至少92％纯，例如至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％、至少99.5％纯、以及100％纯。优选的是本发明的多肽以基本上纯的形式存在。例如，这可以通过采用众所周知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于使用埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的测序，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至279。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C末端和/或N末端氨基酸)。

前肽：术语“前肽”意指一种与成熟多肽一起翻译并且在成熟多肽被释放并且获得蛋白酶活性之前被剪切的多肽。在一个方面中，该前肽是SEQ ID NO:2的氨基酸-89至-1。

信号肽：术语“信号肽”意指一种与成熟多肽和前肽(如果存在的话)一起翻译的短多肽。信号肽位于翻译的多肽的N-末端并且负责该多肽的分泌。通常，信号肽在多肽移位跨过膜(例如质膜或内质网膜)的过程中被移除。

信号肽在本领域中是熟知的并且已经开发若干用于预测信号肽的方法，例如SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)]。在一个方面中，信号序列是SEQ ID NO:2的氨基酸-116至-90。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于还预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至81编码信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)预测程序，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸349至1085。在另一个方面中，基于使用该成熟多肽的埃德曼降解和整体分子量分析的测序,该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸349至1185。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的任选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

片段：术语“片段”意指使一个或多个(若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面中，一个片段包含至少200个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸50至250)、至少230个氨基酸残基(例如，SEQ IDNO:2的氨基酸20至250)、至少260个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸15至275)以及至少275个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至275)。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一个方面中，一个子序列包含至少600个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸496至1098)，例如至少690个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸406至1098)、至少780个核苷酸(例如，SEQ IDNO:1的核苷酸391至1173)、以及至少825个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸391至1173)。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指一种相对于如在自然界中发现的那一多核苷酸通过人工修饰的多核苷酸，由此该多核苷酸与至少一种与该多核苷酸一起在自然界中发现的其他化合物完全或部分分离。在一个方面中，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的、更多至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定。该多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任意组合。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内部的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸按重量计至少90％纯，例如至少92％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、以及至少99.5％纯。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一种多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意思指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸而言可以是天然的或外来的，或对于彼此而言是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括产生多肽所涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环状DNA分子，该分子包括一种编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供其表达的另外的核苷酸。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于用包括本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置处包括改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸置换；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻来添加例如1-3个氨基酸。

清洁组合物：术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌(zincs)、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与用于该组合物中的蛋白酶以及其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其意图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂)。

洗涤剂组合物：除非另外指明，否则术语“洗涤剂组合物”包括颗粒或粉末形式通用型或重垢(heavy-duty)洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式通用型清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体精细织物洗涤剂；手工餐具洗涤剂或轻垢(lightduty)餐具洗涤剂，尤其是高发泡型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、颗粒、液体及冲洗援助类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口剂、假牙清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和漂发剂(hair-rinse)；沐浴露、泡沫浴；金属清洁剂；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理类型。

就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物(detergent composition)”和“洗涤剂配制品(detergent formulation)”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂(laundry detergent)”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、炊具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂(dishwashing detergent)”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的蛋白酶以外，该术语涵盖了包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

酶洗涤益处：在此将术语“酶洗涤益处”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要的洗涤益处是在洗涤和或清洁之后没有或有非常少的可见污垢的污物去除，预防或减少在洗涤过程中释放的污垢的再沉积(一种也被称作抗再沉积的效果)，完全或部分恢复纺织品的白度(一种也被称作增白的效果)，这些纺织品初始是白色的但是在重复使用和洗涤后获得浅灰色或浅黄色的外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。

纺织品护理益处：不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一纺织品转移至另一纺织品或同一纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。

δ反射值(Delta remission value)(ΔRem)：在此将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为在460nm处的反射比或反射测量值的结果。用一种具有类似颜色的小块布样，优选一种来自重复洗涤的小块布样作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种小块布样类型的小块布样。δ反射是洗涤的小块布样的反射值减去未洗涤的小块布样的反射值。

δ酶性能值(ΔRem酶值)：在此将术语“δ酶反射值”定义为在460nm处的反射比或反射测量值的结果。用一种具有类似颜色的小块布样，优选一种来自重复洗涤的小块布样作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种小块布样类型的小块布样。δ反射是用存在一种酶的洗涤剂洗涤的小块布样的反射值减去用不存在酶的洗涤剂洗涤的类似小块布样的反射值。

洗涤剂组分：在此将术语“洗涤剂组分”定义为意指可以用于洗涤剂组合物中的化学品的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂、以及增溶剂。该洗涤剂组合物可以包括一种或多种任何类型的洗涤剂组分。

餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动化餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的刀具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。

餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。

纺织品：术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料的任何纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如玷污的家居衣物。当使用术语织物或衣服时，旨在也包括广义术语纺织品。

硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀和叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。

改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为一种蛋白酶的洗涤性能相对于参考蛋白酶的洗涤性能的变化，例如通过增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。

洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。

发明详细说明

本发明涉及一种具有蛋白酶活性的多肽，该多肽选自：

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

这样的一种多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是具有蛋白酶活性的其片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个优选的方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至279或由其组成。

本发明涉及一种包括一种或多种清洁或洗涤剂组分以及一种具有蛋白酶活性的多肽的清洁组合物(例如洗涤剂组合物)，其中具有蛋白酶活性的该多肽选自：

a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

(c)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；和/或

(d)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但是具有小于100％序列一致性；以及

本发明涉及包括一种或多种洗涤剂组分并且包括分离的多肽的洗涤剂组合物，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明进一步涉及具有蛋白酶活性的多肽在洗涤剂组合物中的用途，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

本发明涉及分离的多肽在洗涤剂中的用途，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有以下序列一致性，至少60％序列一致性，例如至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明还涉及以下变体，这些变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。优选地，氨基酸改变的性质小，即不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是一个至约30个氨基酸的小段删除；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；高达约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而促进纯化的小段延伸，例如多组氨酸序列段、抗原性表位或结合结构域。优选地，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性；例如与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)1979年描述于蛋白质(TheProteins)中，学术出版社(Academic Press)，纽约。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域已知的程序来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德福斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；沃勒达尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。

氨基酸Asp 40、His 73及Ser 225形成具有SEQ ID NO:2的蛋白酶的催化三联体并且因此对于分子的活性而而言是关键的并且不应被修饰。因此，对应于SEQ ID NO:2中的Asp 40、His 73及Ser 225的氨基酸残基优选不应被修饰。通过与已知的S8丝氨酸蛋白酶比对而确定催化残基，其中已经发现在所有此类蛋白酶中这些催化残基都是保守的。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈尔-奥尔森)和Sauer(萨奥尔)，1988，科学241:53-57；Bowie(鲍依)和萨奥尔，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)86:2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比希尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯等人，1999，自然生物技术17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

在一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N末端或C末端处融合。

该多肽还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由以下多核苷酸编码，这些多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

具有蛋白酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物，获得自植物、病毒，或获得自任何种类的动物。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性菌多肽，例如具有蛋白酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽，或革兰氏阴性菌多肽，例如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个方面中，该多肽是马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。

在另一个方面，该多肽是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链丝菌、或变铅青链霉菌多肽。

该多肽还可以是真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属、或耶氏酵母属多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属、伞菌属(Agaricus)、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、某真菌属(Poitrasia)、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属多肽。

在另一个方面中，该多肽是卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。

在另一个方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳霉(Thielaviaachromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳霉(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、或绿色木霉多肽。

在一个方面中,该多肽是一种链霉菌属多肽。

将理解的是，对于上述种类而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态两者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而无论已知的它们的种类名称如何。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用上述探针，从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物鉴定并获得该多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用这个或这些探针检测到编码多肽的多核苷酸，那么可以通过利用本领域普通技术人员熟知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。

用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide toMethods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由芽胞杆菌属菌株或另一种或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种的变体。

本发明还涉及包括以下多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性程度，这些分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽在一些工程化方式方面可以不同于从其天然来源分离的多肽，例如具体活性、热稳定性、pH最佳值等方面不同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如，福德(Ford)等，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链；或其等位基因变体及子序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)，如在此所定义。

还可以基于遗传码的知识设计编码本发明的多肽的多核苷酸并使用本领域已知的方法人工合成。具体而言，设计编码本发明的多肽的多核苷酸是可能的，其中该多肽的密码子使用特别适于所选宿主有机体。具有SEQ ID NO:1的多核苷酸可以提及为这样的一种多核苷酸的一个实例，该多核苷酸针对芽胞杆菌属中的表达进行了密码子优化。

在一个方面中，该多核苷酸包括SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:1的子序列或由其组成，该子序列编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2的一个片段，例如SEQ ID NO:1的核苷酸349至1185的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括与一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中该控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子序列，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的适合启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)，以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:21-25)。另外的启动子描述于“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”，吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)，242:74-94；以及萨姆布鲁克等人，1989，同上。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的一种修饰的启动子，其中未翻译的前导子已被来自编码磷酸丙糖异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中未翻译的前导子已被来自编码磷酸丙糖异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型、截短型、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。该终止子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

控制序列还可以是一个适合的前导子序列，当被转录时是对于通过宿主细胞来翻译而言重要的mRNA的一个非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何前导子序列。

丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。

可用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中有过描述。

控制序列还可以是编码连接至多肽的N-末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在多肽的N-末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。

也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包括该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中，以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

载体优选地包含允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(若干个)选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、连同其等效物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems(格姆斯)等人，1991,Gene(基因)98:61-67；Cullen(卡伦)等人，1987,Nucleic Acids Res.(核酸研究)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括与指导本发明多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。格兰氏阳性细菌包括但不局限于芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽胞杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。格兰氏阴性细菌包括但不局限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。

例如通过原生质体转化(参见例如，常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或者杜博楠(Dubnau)和大卫多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如凯勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)可以实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞中。例如通过原生质体转化(参见例如，哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。例如通过原生质体转化和电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004，微生物学报(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、通过接合(参见，例如马卓德(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)或通过转导(参见，例如伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)可以实现将DNA引入到链霉菌属细胞中。例如通过电穿孔(参见，例如崔(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或通过结合(参见，例如皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌属细胞中。例如通过天然感受态(参见，例如佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)或通过接合(参见，例如克莱怀尔(Clewell)，1981，微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)可以实现将DNA引入到链球菌属细胞中。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门、以及接合菌门(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人在Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi(真菌的Ainsworth(安斯沃斯)和Bisby(比斯比)词典，第8版，1995，CABInternational,University Press(CAB国际大学出版社)，剑桥，英国中定义)连同卵菌门(如在Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995，同上，第171页中引用)以及所有有丝分裂真菌((霍克斯沃思)等人，1995，同上)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母以及属于半知菌类(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.，帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、稻瘟菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474中描述。Malardier(马拉迪耶)等人，1989，Gene(基因)78:147-156和WO 96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及伊嫩(Hinnen)等人，1978，美国科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选的方面中，该细胞属于芽孢杆菌属。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括，但不局限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及大小排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、溶解度差(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(参见，例如Protein Purification(蛋白纯化)，J.-C.Janson(詹森)和LarsRyden(拉尔斯赖登)编辑，VCH Publisher(VCH出版社)，纽约，1989)。

在一个可替代的方面中，不回收多肽，而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。

本发明还涉及包括本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这样的一种多肽。术语“富含”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。

洗涤剂组合物

在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括与一种或多种另外的清洁和/或洗涤剂组合物组分组合的本发明的多肽。另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。

对于纺织品保养，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据一种具体的功能性将以下提及的组分通过一般标题进行了分类，但是由于该组分可能具有熟练的业内人士将领会的一种或多种另外的功能，因此不应该将这理解为限制。洗涤剂组合物可以适于洗涤纺织品，例如像织物、衣服或亚麻布，或用于清洁硬表面，例如像地板、桌子、或餐具洗涤。

洗涤剂组合物中的酶量

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.0001-200mg的酶蛋白，例如0.0005-100mg的酶蛋白，优选0.001-30mg的酶蛋白，更优选0.005-8mg的酶蛋白，甚至更优选0.01-2mg的酶蛋白。

用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

可以使用常规稳定剂稳定本发明的清洁剂组合物的蛋白酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。

其他适合的稳定剂是肽醛蛋白酶抑制剂，例如披露于WO 2009/118375或WO 2010/055052中的肽醛。

本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。

该组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。例如可以通过属于以下属的微生物来产生另外的一种或多种酶：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉菌、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；镰刀菌属，例如杆孢状镰孢、纹镰刀菌、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾镰刀菌、异孢镰刀菌、合欢木镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰刀菌、硫色镰刀菌、囊珠镰刀菌、拟丝孢镰刀菌、或镰孢霉；腐质霉属，例如特异腐质霉或柔毛腐质霉；或者木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该多肽可以根据本领域已知的方法稳定化。

因此，本发明的一个方面涉及一种包括一种或多种洗涤剂组分和一种具有蛋白酶活性的多肽的洗涤剂组合物，其中具有蛋白酶活性的该多肽选自：

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括与一种或多种另外的清洁组合物组分(例如洗涤剂组分)组合的本发明的酶。

另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括：烷基二甲基乙醇胺季铵盐(ADMEAQ)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，二甲基二硬脂基氯化铵(DSDMAC)，和烷基苄基二甲基铵，以及它们的组合，烷基季铵化合物，烷氧基化季铵(AQA)。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、以及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极化表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、以及其组合。

助水溶剂

助水溶剂是一种化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述，胶体&界面科学新见(Current Opinion inColloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。

洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、以及其组合。

助洗剂和共-助洗剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约20％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自Hoechst(赫斯特公司)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氨基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-40％，例如约1％至约20％的洗涤剂共助洗剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合一种助洗剂，例如沸石助洗剂。共-助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或链烯基琥珀酸。另外的特定实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)，及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共-助洗剂描述于例如WO09/102854、US5977053中。

结垢抑制剂，例如磷酸酯

漂白系统

该洗涤剂可以包括按重量计0-10％，例如约0.5％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂，光漂白剂(photobleach)，漂白活化剂，过氧化氢源(例如过碳酸钠和过硼酸钠)，预成型的过酸及其混合物。合适的适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过白啶酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，它们可以包括例如一种无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐，与一种形成过酸的漂白剂活化剂组合。漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待于在此使用的适合的漂白活化剂包括属于酯酰胺类、酰亚胺类或酐类的那些，适合的例子是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸钠、二过氧十二烷酸、4-(十二烷酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)和/或WO 98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是含有从9到24个碳的支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R¹独立地是含有从9到18个碳的支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、WO2007/087242中。合适的合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共-助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motifs)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257、WO2007/087243中。

另外的酶

洗涤剂添加剂连同根据本发明的洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化合物酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的洗涤剂相容(即最佳pH，与其他酶的和非酶的成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

尤其适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。

可商购获得的纤维素酶包括CELLUZYME^TM和CAREZYME^TM(诺维信公司)、CLAZINASE^TM和PURADAX HA^TM(杰能科国际有限公司)、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物起源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen(斯艾森)等人，Protein Engng.(蛋白质工程学)4(1991)719-737和斯艾森等人，Protein Science(蛋白质科学)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶子组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面中，另外的蛋白酶可以是枯草杆菌酶，如枯草杆菌蛋白酶或其变体。

枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌的那些，如枯草杆菌蛋白酶lentus、芽孢杆菌lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO04/099401中。枯草杆菌酶变体的另外的实例可以是在以下任意位置中具有突变的那些：3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、^*36D、V68A、N76D、N87S,R、^*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。

胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO89/06270和WO94/25583中所公开的镰孢霉属的蛋白酶。有用的蛋白酶的实例为在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、以及WO 98/34946中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置中具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。

金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993(杰能科国际公司)所述的中性金属蛋白酶。

优选的可商购蛋白酶包括Duralase^TM、Durazym^TM、 Ultra(诺维信公司)，Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))，Excellase^TM、FN2^TM、FN3^TM、FN4^TM、Maxaca^TM、Maxapem^TM、Maxatase^TM、Properase^TM、Purafast^TM、Purafect^TM、PurafectOxP^TM、Purafect Prime^TM及Puramax^TM(杜邦/杰能科国际公司(DuPont/Genencor int.))。

另一种优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO95/23221中所述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，来自如描述于EP 258068和EP 305 216中的柔毛嗜热霉(以前被命名为柔毛腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如，如描述于WO 96/13580中的特异腐质霉；假单胞菌属脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218 272)、洋葱假单胞菌P(EP 331 376)、施氏假单胞菌(GB 1，372，034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(达尔托伊斯(Dartois)等人，1993，生物化学与生物物理学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131:253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。

其他实例是脂肪酶变体，例如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO97/04079、WO 97/07202、WO 00/060063、WO2007/087508以及WO 2009/109500中描述的那些。

优选的可商购脂肪酶包括Lipolase^TM、Lipolase Ultra^TM及Lipex^TM；Lecitase^TM、Lipolex^TM；Lipoclean^TM、Lipoprime^TM(诺维信公司)。其他可商购的脂肪酶包括Lumafast(杰能科国际公司)；Lipomax(Gist-Brocades公司/Genencor Int Inc(杰能科国际公司))以及来自Solvay(苏威公司)的芽胞杆菌脂肪酶。

淀粉酶：可以与本发明的蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体菌株的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有一个缺失并且在位置193中具有一个取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的其变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及一种在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345及A339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(商购自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM及Powerase(商购自杰能科国际有限公司)。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞菌，例如灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如描述于WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

这一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包括一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。

可以产生非尘颗粒，例如像在US 4,106,991和4,661,452中所披露的，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。

分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中多羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。合适的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列(Powdered Detergents,Surfactant science series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。

染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(ParamountMinerals and Chemicals)，孟买(Mumbai)，印度(India)供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物有助于从织物、例如棉或聚酯基织物上除去污物，特别是从聚酯基织物上除去疏水污物。污物释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个芯结构和连接至该芯结构的多个烷基化基团的两亲性烷基化油污清洁聚合物。芯结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用结合在此)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素、以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、以及其混合物。

抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物、以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他合适的辅料包括但不局限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、和用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制品

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩的或浓缩的液体。

洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器剂量单位的形式。

袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及,羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包括按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包括从0％-30％的有机溶剂。

液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

洗衣皂条

本发明的蛋白酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将一固体物体(例如洗衣皂条)放置于一个容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。

洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH4⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO09/021813、WO 09/030632以及WO09/015951。

WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO2010014395、WO 2010044905、

WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO2010018043、WO 2010003783、WO2010003792、

WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO 2010000636。

用途

本发明还针对根据本发明的蛋白酶或其组合物在清洁过程中的使用方法，例如在纺织品和织物的洗涤中，例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤。

本发明还涉及用于在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方法。因此，在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的蛋白酶或包括根据本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物在清洁(例如衣物洗涤或餐具洗涤)中的用途，该蛋白酶与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少60％序列一致性。因此，在一个实施例中，本发明涉及以下多肽在洗涤剂、清洁过程和/或衣物洗涤过程中的用途，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性，或与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有100％序列一致性并且该多肽具有蛋白酶活性。

本发明的多肽可以被添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。

本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。

在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括在此所述的本发明的多肽。

对于洗涤剂配制者而言重要的污垢和污物由许多不同物质构成，已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用至其中的清洁过程中特异性地改善污物去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，例如碳水化合物酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。

在一个方面中，本发明涉及以下多肽在洗涤剂组合物和清洁过程(例如衣物和硬表面清洁)中的用途，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性，或与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有100％序列一致性。因此，在一个方面中，本发明展示了根据本发明的蛋白酶对各种污物以及在各种条件下的洗涤效果。在本发明的一个特定的方面中，该洗涤剂组合物及在清洁过程中的用途涉及本发明的蛋白酶与以上提及的去污酶中的至少一种一起使用。

在本发明的一个优选方面中，本发明的蛋白酶可以与至少两种酶组合。这些另外的酶详细地描述于“另外的酶”部分中；更优选的是至少三种、四种或五种酶。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性(carbolytic activity)、蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。酶组合可以例如是本发明的一种蛋白酶与另一种去污酶，例如本发明的一种蛋白酶与一种淀粉酶、本发明的一种蛋白酶与一种纤维素酶、本发明的一种蛋白酶与一种半纤维素酶、本发明的一种蛋白酶与一种脂肪酶、本发明的一种蛋白酶与一种角质酶、本发明的一种蛋白酶与一种果胶酶或本发明的一种蛋白酶与一种抗再沉积酶。更优选地，本发明的蛋白酶可以与至少两种其他去污酶组合，例如本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种淀粉酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种半纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种半纤维素酶。甚至更优选地，本发明的一种蛋白酶可以与至少三种其他去污酶组合，例如本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一张半纤维素酶。本发明的蛋白酶可以与任何选自非穷尽性列表的酶组合，该列表包括：碳水化合物酶(例如淀粉酶)、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、黄原胶酶或支链淀粉酶，肽酶，其他蛋白酶或脂肪酶。

在本发明的另一个实施例中，本发明的蛋白酶可以与一种或多种金属蛋白酶组合，例如M4金属蛋白酶，包括Neutrase^TM或嗜热菌蛋白酶。此类组合可以进一步包括如上概述的其他洗涤剂酶的组合。

清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是它也可以是工业洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水洗溶液。

经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻、亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。

最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤剂性能。

本发明进一步涉及本发明的蛋白酶在除去蛋白质污物过程中的用途。蛋白质类污物可能是如食品污物等污物，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、奶、墨水、草、或其组合。

典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。

在一个具体实施例中，本发明涉及包括本发明的蛋白酶的一种组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包括以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分。

在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减小。优选地，作为一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分按以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个方面中，将本发明的蛋白酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。

因此，本发明的一个方面涉及一种洗涤剂组合物的用途，该洗涤剂组合物包括一种或多种洗涤剂组分和一种具有蛋白酶活性的多肽，其中具有蛋白酶活性的该多肽选自：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

该用途是在清洁过程(例如衣物洗涤)和硬表面清洁(例如餐具洗涤)中。

洗涤方法

本发明的洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约11的pH。可以在溶液中按以下浓度使用这些组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。

在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。

在具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。

本发明涉及一种用包括本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。

一个优选实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个衣物洗涤或餐具洗涤过程。

另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污物的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。

在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包括至少一种如以上“另外的酶”部分列出的另外的酶，如选自下组的酶，该组由以下各项组成：碳水化合物酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，木聚糖酶或角质酶或其组合。在又另一个优选实施例中，这些组合物包括减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分或聚合物。

还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以任何织物处理方法使用蛋白酶，这些方法在本领域是已熟知的(参见，例如，美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，通过一种方法改善织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一个方面中，在压力下用该溶液处理该织物。

在一个实施例中，在纺织品编织过程中或之后或者在脱浆阶段或一个或多个另外的织物加工步骤过程中应用该蛋白酶。在纺织品编织过程中，螺纹暴露于大量的机械应变中。在机械织布机上进行编织之前，为了提高拉伸强度并防止破裂，经常在经纱上涂上淀粉浆或淀粉衍生物。可以应用该蛋白酶来除去这些蛋白质浆或蛋白质衍生物。在编织完纺织品之后，织物可以进行到脱浆阶段。这之后可以是一个或多个另外的织物加工步骤。脱浆是从纺织品上除去浆料的作用。编织后，为了确保均匀和耐洗效果，应在对织物进行进一步加工之前除去所涂的浆料。还提供了一种脱浆方法，该方法包括通过酶的作用酶促水解浆料。

因此，在一个方面中，本发明涉及一种具有蛋白酶活性的多肽在清洁过程(如衣物或餐具洗涤，例如手动或自动化)的用途，该多肽选自：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

(c)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(d)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但是具有小于100％序列一致性；和/或

本发明进一步涉及一种用于从纺织品或硬表面上降解或除去朊材料的方法，该方法包括用一种洗涤剂组合物处理该纺织品或该硬表面，该洗涤剂组合物包括一种或多种洗涤剂组分以及一种具有蛋白酶活性的多肽，该多肽选自：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)(i)的全长互补链；

低温用途

本发明的一个实施例涉及一种进行衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁的方法，该方法包括使有待清洁的表面与本发明的一种蛋白酶接触，并且其中所述衣物洗涤、餐具洗涤、工业或机构清洁在约40℃或以下的温度下进行。本发明的一个实施例涉及本发明的蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中的用途，其中衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或以下。

在另一个实施例中，本发明涉及本发明的蛋白酶在除蛋白过程中的用途，其中除蛋白过程中的温度是约40℃或以下。

本发明还涉及本发明的蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的用途，该蛋白酶与参考蛋白酶相比具有至少一种改进的特性，并且其中衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的温度在约40℃或以下的温度下进行。

在每种以上确定的方法和用途中，洗涤温度是约40℃或以下，例如约39℃或以下、例如约38℃或以下、例如约37℃或以下、例如约36℃或以下、例如约35℃或以下、例如约34℃或以下、例如约33℃或以下、例如约32℃或以下、例如约31℃或以下、例如约30℃或以下、例如约29℃或以下、例如约28℃或以下、例如约27℃或以下、例如约26℃或以下、例如约25℃或以下、例如约24℃或以下、例如约23℃或以下、例如约22℃或以下、例如约21℃或以下、例如约20℃或以下、例如约19℃或以下、例如约18℃或以下、例如约17℃或以下、例如约16℃或以下、例如约15℃或以下、例如约14℃或以下、例如约13℃或以下、例如约12℃或以下、例如约11℃或以下、例如约10℃或以下、例如约9℃或以下、例如约8℃或以下、例如约7℃或以下、例如约6℃或以下、例如约5℃或以下、例如约4℃或以下、例如约3℃或以下、例如约2℃或以下、例如约1℃或以下。

在另一个优选实施例中，洗涤温度在约5-40℃的范围内，例如约5℃-30℃、约5℃-20℃、约5℃-10℃、约10℃-40℃、约10℃-30℃、约10℃-20℃、约15℃-40℃、约15℃-30℃、约15℃-20℃、约20℃-40℃、约20℃-30℃、约25℃-40℃、约25℃-30℃或约30℃-40℃。在一个特别优选的实施例中，洗涤温度是约30℃。

在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该低温洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约9。

在具体实施例中，在以下硬度下执行该低温洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。

实例

材料与方法

LB脱脂乳琼脂

LB脱脂乳琼脂通过以下制备：将37g脱水LB琼脂培养基(西格玛(Sigma)L3027)与20ml脱脂乳(阿拉公司(Arla)，丹麦))混合并且将终体积调节至1000ml。随后通过121C高压灭菌16min而将混合物灭菌。

洗涤测定

用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)

为了评定洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行衣物洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械压力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。

将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager 29，DK-2605(丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

表1：标准洗涤剂和测试材料的组成

测试材料获得自测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰和EMPA测试材料AG(EMPA Testmaterials AG)，圣加伦(Gallen)CH-9015大街，瑞士。

蛋白酶测定法

1)Suc-AAPF-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。

20μl蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)与100μl测定缓冲液混合。通过加入100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD₄₀₅的升高，作为蛋白酶活性的量度。

2)Protazyme AK测定：

底物：Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))

温度：受控的(分析温度)。

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH 6.5或pH 7.0。

通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德(Eppendorf)离心管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德离心管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400转/分钟)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

3)Suc-AAPX-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPA-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1775)

Suc-AAPR-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1720)

Suc-AAPD-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1835)

Suc-AAPI-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1790)

Suc-AAPM-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1395)

Suc-AAPV-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1770)

Suc-AAPL-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1390)

Suc-AAPE-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1710)

Suc-AAPK-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1725)

Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。

实例1.优化的DNA序列的设计

在公共数据库中鉴定来源于属于链霉菌属菌株的S8蛋白酶家族的序列具有登录号SWISSPROT:D1XSD4。为了表达该蛋白酶，设计具有针对在芽胞杆菌属菌株中的表达优化的密码子使用的编码该蛋白酶的基因，该基因具有示于SEQ ID NO:1中的序列。密码子优化方法在本领域是已知的并且还描述于WO 2012025577中。

实例2.蛋白酶的表达

合成具有SEQ ID NO:1的序列的DNA片段(生命技术公司(LifeTechnologies)，Naerum，丹麦)并且根据描述于WO 2012025577中的程序将其克隆进枯草芽孢杆菌表达载体中。在三联启动子系统的控制下表达合成的蛋白酶基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyQ)和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。表达盒还已经描述于WO 99/43835中。将指定为的C362T的所得质粒转化进蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株中并且铺板在LB+6mg/l CAM上。

将转化体在LB+CAM+脱脂乳板上划线，在37℃下孵育过夜。表达具有蛋白酶活性的多肽的转化体在菌落周围显示出透明圈，表明存在蛋白水解活性。

使如脱脂乳板上的透明圈所表明的表达该蛋白质的转化体在富液体培养基中在37℃下生长并且在225rpm下振荡5天。通过在10000rpm下离心30分钟，随后通过0.45μm过滤器过滤而将上清液与细胞分离。将上清液储存在-20℃下直到使用。

向40μl解冻的样品中添加10μl 50％三氯乙酸(TCA)，并且在40000rpm下离心5分钟之前，在冰上孵育5分钟。除去上清液并且向沉淀中添加20μlSDS-PAGE样品缓冲液(Nupage，英杰公司(Invitrogen))，随后上下吸移直到沉淀完全溶解。

将样品在99℃下加热3分钟并装载在8％-16％标准无污染SDS-PAGE凝胶(伯乐公司(Biorad))上，并且根据制造商的说明，在三-甘氨酸缓冲液中跑胶。根据制造商的说明，使凝胶在标准无污染成像仪(Criterion Stain Free Imager)(伯乐公司)中显影。

在转化体样品中看到一个大约40kDa的清晰条带，表示表达的蛋白酶。

实例3.S8蛋白酶从链霉菌属ACTE的纯化

将来自实例2的培养上清液解冻，离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将固体硫酸铵添加至0.2μm滤液中，至终浓度为1.6M(NH₄)₂SO₄并且将溶液在室温下搅拌20分钟，以确保平衡。将蛋白酶溶液施加至在20mM HEPES/NaOH，2mM CaCl₂，1.6M(NH₄)₂SO₄，pH 8.0中平衡的苯基-琼脂糖FF(高取代，来自GE医疗集团(GEHealthcare))柱上。在用平衡缓冲液充分地洗涤柱之后，将蛋白酶用线性梯度在平衡缓冲液与具有25％(v/v)异丙醇的20mM HEPES/NaOH，2mMCaCl₂，pH 8.0之间进行洗脱超过三个柱体积。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行测试(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定)，并且将蛋白酶峰池化。将池转移至G25交联葡聚糖柱上的20mM CH₃COOH/NaOH，2mM CaCl₂，pH 5.0并且将G25交联葡聚糖转移的酶用去离子水稀释，以给出1.2mS/cm的电导率。将调节的蛋白酶溶液施加至在20mM CH₃COOH/NaOH，2mMCaCl₂，pH 5.0中平衡的SOURCE 30S柱(来自GE医疗集团)上。在用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，在相同的缓冲剂中用线性NaCl梯度(0->0.5M)将蛋白酶洗脱超过八个柱体积。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定)，并且通过SDS-PAGE来对峰级分进行进一步分析。将各级分(在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的大约31kDa的主要带)池化并且用于进一步表征。

实例4.S8蛋白酶从链霉菌属ACTE的表征

将Suc-AAPF-pNA测定法用于获得pH-活性谱和pH-稳定性谱(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。用于pH-稳定性谱，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 9.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。Protazyme AK测定法用于获得在pH 7.0下的温度-活性谱(Protazyme AK测定法用于获得在pH 9.0下的赛威蛋白酶(Savinase)(SEQ ID NO 3)的温度-活性谱)。使用Suc-AAPX-pNA测定和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得这些酶在pH 9.0下的P1-特异性。

结果显示在下表2-5中。对于表2，活性是相对于酶的最佳pH而言。对于表3，活性是相对于样品的残余活性，将该样品在稳定条件(5℃，pH 9.0)下保持。对于表4，活性是相对于酶在pH 7.0下的最佳温度而言。对于表5，活性是相对于酶的最佳底物(Suc-AAPF-pNA)而言。

表2：pH-活性谱

表3：pH-稳定性谱(在37℃下2小时之后的残余活性)

表4：在pH 7.0或pH 9.0处的温度活性谱

表5：在pH 9.0处对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性

与赛威蛋白酶(来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶，可获得自诺维信公司，丹麦)(SEQ IDNO 3)的数据比较的来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性、pH-稳定性谱(在37℃下2小时之后的残余活性)、在pH 7.0下对Protazyme AK的温度活性谱以及在pH 9.0下对10种Suc-AAPF-pNA底物的P1-特异性也示于图1-4中。

来自链霉菌属ACTE的纯化的S8蛋白酶的其他特征

该蛋白酶被以下已知的蛋白酶抑制剂所抑制：PMSF(苯甲基磺酰氟)、CI-2A(来自大麦的糜蛋白酶抑制剂2A)及SSI(来自白浅灰链霉菌的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂)。

通过埃德曼降解确定纯化的蛋白的N末端序列：ATQTNAP。

如通过SDS-PAGE所确定的分子量大约是M_r＝31kDa。

通过质谱分析所确定的分子量是27702.4Da。

对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至279的成熟蛋白的计算的重量是27702.1Da，与用实验方法确定的质量具有理想的一致性。

实例5.用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)

为了评定洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行衣物洗涤实验。在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：

洗涤剂	洗衣液标准洗涤剂B
		洗涤剂剂量	2g/l
测试溶液体积	140μL洗涤剂/槽；20μL酶/槽
		pH	按原来的情况
洗涤时间	20分钟
		温度	40℃和20℃
水硬度	16°dH Ca²⁺/Mg²⁺5:1

测试材料如下：

如在AMSA洗涤中所描述，测试在实例3中制备的蛋白酶。在20℃和40℃两者下进行测试并且与熟知的洗涤剂蛋白酶赛威蛋白酶(SEQ ID NO 3)进行比较，赛威蛋白酶是一种来源于迟缓芽孢杆菌的蛋白酶。结果示于表6至7中。

表6

表7

结果显示链霉菌属ACTE S8蛋白酶在20℃和40℃两者下，在所有四种污物上都展示出良好性能。

实例6用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)

使用自动机械应力测定，使用2种不同的液体洗涤剂和一种粉末洗涤剂，在2种不同的洗涤温度下，在4种不同的技术污物上，测试来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤性能。

如在AMSA中针对衣物洗涤方法所描述的，使用单循环洗涤程序执行执行实验，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样并且实验条件如下表8中所指定。并且结果示于表9和10中。

表8：用于衣物洗涤实验的实验条件

通过将CaCl₂、MgCl₂、以及NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-＝4:1:7.5)添加到测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表9：在20℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂的δ强度值。

结果显示与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去污上更有效。来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶在20℃下在去除所有四种污物方面是有效的，并且在去除血液、牛奶和油墨污物方面是尤其有效的。

表10：在40℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂的δ强度值。

结果显示与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去污方面更有效。来自链霉菌属ACTE的S8蛋白酶在40℃下在去除所有四种污物方面是有效的，并且在去除血液、牛奶和油墨污物方面是尤其有效的

实例7.液体洗涤剂中的迷你洗涤

实验条件

表11

在20℃和15°dH下，在迷你洗涤机器人装置中在PC-05小块布样上双确定地运行该实验。

测试材料获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰

随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。还可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料发射或发出的光的量度。使用Zeiss MCS 521VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进行测量。

通过计算相对性能，在10nM、30nM及60nM蛋白酶浓度处比较链霉菌属ACTE的性能与赛威蛋白酶(参考)(SEQ ID NO 3)的性能：

RP＝(R_变体-R_空白)/(R_参考-R_空白)

如果酶表现优于参考，则认为其展示出改进的洗涤性能，其具有RP＝1。因此，RP>1展示改进的洗涤性能。

结果与讨论：

下表12示出了以赛威蛋白酶(SEQ ID NO 3)(来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶，可商购自诺维信公司，丹麦)作为参考，实例13的酶的的“改进因素/相对性能”。

表12

结果显示链霉菌属ACTE S8蛋白酶优于赛威蛋白酶,特别是在低洗涤剂浓度下。

实例8.使用液体洗涤剂的链霉菌属ACTE的S8蛋白酶在不同水硬度和蛋白酶浓度中的AMSA洗涤性能

使用自动机械应力测定，使用一种液体洗涤剂，在3种不同的水硬度和2种不同的酶浓度中，在3种不同的技术污物上，测试链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤性能。

如在AMSA中针对衣物洗涤方法所描述的，使用单循环洗涤程序执行执行实验，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样并且实验条件如下表13中所指定。

表13：用于表14至19的AMSA的实验条件。

测试溶液	2g/L洗衣液标准洗涤剂B
		测试溶液体积	160μL
pH	按原来的情况
		洗涤时间	20分钟
温度	20℃或40℃
		蛋白酶浓度	0(空白)、5nM或30nM
小块布样	EMPA117EH，PC-03，C-10

通过将CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺＝5:1)添加至测试系统中将水硬度调节至6、16或24°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表14：在20℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶或赛威蛋白酶的洗涤剂在EMPA117EH小块布样上的δ强度酶值

酶浓度	5nM	5nM	5nM	30nM	30nM	30nM
							水硬度	6°dH	16°dH	24°dH	6°dH	16°dH	24°dH
赛威蛋白酶	0,91	3,00	2,24	8,72	9,89	12,28
							链霉菌属ACTE	5,01	5,42	4,45	20,51	22,81	18,84

结果显示无论是与不具有蛋白酶的洗涤剂还是与包含赛威蛋白酶的洗涤剂相比，在低至中水硬度下，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去除棉布/聚酯上的血液/牛奶/油墨污物方面是尤其有效的。

表15：在20℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含链霉菌属ACTE或赛威蛋白酶的洗涤剂在PC-03小块布样上的δ强度酶值

结果显示无论是与不具有蛋白酶的洗涤剂还是与包含赛威蛋白酶的洗涤剂相比，在低至中水硬度下，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去除棉布/聚酯上的巧克力牛奶/油墨污物方面是有效的。

表16：在20℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶或赛威蛋白酶的洗涤剂在C-10小块布样上的δ强度酶值

结果显示无论是与不具有蛋白酶的洗涤剂还是与包含赛威蛋白酶的洗涤剂相比，在低至中水硬度下，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去除油/牛奶/颜料污物方面是有效的。

表17：在40℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶或赛威蛋白酶的洗涤剂在EMPA117EH小块布样上的δ强度酶值

酶浓度	5nM	5nM	5nM	30nM	30nM	30nM
							水硬度	6°dH	16°dH	24°dH	6°dH	16°dH	24°dH
赛威蛋白酶	2,63	6,21	16,76	22,19	21,18	49,54
							链霉菌属ACTE	22,25	21,85	32,56	57,31	52,03	59,50

表18：在40℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含链霉菌属ACTE或赛威蛋白酶的洗涤剂在PC-03小块布样上的δ强度酶值

酶浓度	5nM	5nM	5nM	30nM	30nM	30nM
							水硬度	6°dH	16°dH	24°dH	6°dH	16°dH	24°dH
赛威蛋白酶	2,84	5,22	5,76	15,49	18,02	20,06
							链霉菌属ACTE	15,96	16,64	16,30	31,10	27,61	31,10

结果显示无论是与不具有蛋白酶的洗涤剂还是与包含赛威蛋白酶的洗涤剂相比，在低至中水硬度下，在40℃下，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去除棉布/聚酯上巧克力牛奶/油墨污物方面是尤其有效的。

表19：在40℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶或赛威蛋白酶的洗涤剂在C-10小块布样上的δ强度酶值

酶浓度	5nM	5nM	5nM	30nM	30nM	30nM
							水硬度	6°dH	16°dH	24°dH	6°dH	16°dH	24°dH
赛威蛋白酶	4,47	4,77	6,35	10,81	13,07	17,81
							链霉菌属ACTE	15,00	13,29	13,94	25,84	20,60	22,75

结果显示无论是与不具有蛋白酶的洗涤剂还是与包含赛威蛋白酶的洗涤剂相比，在低至中水硬度下，在40℃下，包含链霉菌属ACTE的S8蛋白酶的洗涤剂在去除油/牛奶/颜料污物方面是有效的。

Claims

1.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括一种或多种洗涤剂组分和一种具有蛋白酶活性的多肽，其中具有蛋白酶活性的该多肽选自：

a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性或100％序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少99％序列一致性或100％序列一致性；和

(c)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO： 2的成熟多肽具有至少99％序列一致性，但是具有小于100％序列一致性；

其中所述多肽源自链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)。

2.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包括一种或多种选自以下各项的另外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化物酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、和/或过氧化物酶。

3.如权利要求2所述的洗涤剂组合物，其中所述氧化酶是漆酶。

4.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包括一种蛋白酶抑制剂。

5.如权利要求2所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包括一种蛋白酶抑制剂。

6.如权利要求4所述的洗涤剂组合物，其中该蛋白酶抑制剂为4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)或一种肽醛。

7.如权利要求5所述的洗涤剂组合物，其中该蛋白酶抑制剂为4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)或一种肽醛。

8.如权利要求1-7中任一项所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物处于以下形式：棒、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩的或浓缩的液体。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物处于粉末、颗粒或液体的形式。

10.根据权利要求8所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物处于粉末、颗粒或液体的形式。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的洗涤剂组合物在衣物洗涤、硬表面清洁、餐具洗涤或自动化餐具洗涤中的用途。

12.一种用于从纺织品或硬表面降解或除去朊材料的方法，该方法包括用一种根据权利要求1-10中任一项所述的洗涤剂组合物处理该纺织品或该硬表面。

13.一种具有蛋白酶活性的多肽在洗涤剂组合物中的用途，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(c)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入，其中所述变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性，但是具有小于100％序列一致性；

其中所述多肽源自链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)。

14.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽在衣物洗涤或餐具洗涤中的用途，该多肽选自：

(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少99％序列一致性或100％序列一致性；和/或

其中所述多肽源自链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)。

15.根据权利要求14所述的用途，其中该餐具洗涤是手动的或自动的。