CN104189954B - 一种原位固化组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种原位固化组织工程支架，由聚丙交酯‑乙交酯和生物可降解微球在极性有机溶剂的存在下原位固化形成。本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球作为致孔剂，原位固化组织工程支架中的微球逐渐降解，其孔结构逐渐形成，孔隙率逐渐增加，可以实现体内由外而内梯度致孔，使其孔隙形成与组织长入相匹配。在本发明提供的原位固化组织工程支架的原位固化初期，由于部分未降解的致孔剂的存在，使得本发明提供的原位固化组织工程支架的初始强度明显提高。另外，本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球为致孔剂，生物相容性好，避免了由盐等粒子的高渗对组织细胞的损伤。

Description

一种原位固化组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种原位固化组织工程支架及其制备方法。

背景技术

据统计，我国每年因疾病、创伤、肿瘤等造成的骨缺损病人超过100万，且呈上升趋势。自体骨移植和同种异体骨移植是目前治疗骨缺损的主要方法。然而，自体骨来源有限，且对供体部位造成新的缺损，应用受到限制。同种异体骨骨诱导能力较自体骨差，且存在排斥反应和疾病传播的危险性。近年来，越来越多的无机合成材料或有机合成高分子材料被研究和开发作为组织工程支架或骨修复材料，并且逐步应用于临床。

而可注射的组织工程生物支架可解决以上出现的问题。骨修复材料通过注射的途径到达骨缺损部位，迅速完全填充缺损部位，实现移植材料与宿主骨缺损的完全匹配，可有效刺激骨组织的应力生长。这种无创手术还避免了周围软组织的再次损伤，手术时间短，成本低，更容易为患者所接受，有利于医用新材料的推广和应用。

原位成形移植物(in situ forming implants，ISI)是一种可注射的生物医用材料，是将高分子聚合物溶于可与水互溶的有机溶剂中，将得到的混合物注射入组织内后，有机溶剂迅速被组织中的水置换，高分子聚合物原位成形固化。

2009年凯斯西储大学Krebs等将PLGA(聚丙交酯-乙交酯)溶于三缩四乙二醇中，以钠盐颗粒作为致孔剂制备出多孔的可注射的骨修复材料。2012年德国科学家Schloegl通过调整PLGA、α-TCP、有机溶剂及钠盐(致孔剂)的不同比例优化支架，经过优化的支架材料孔隙率可达到81.2％-91.5％。但是，上述技术均以钠盐作为致孔剂，钠盐随支架注射进入组织后，初始机械强度较小，仅为0.285MPa，无法满足承重部位的修复需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原位固化组织工程支架及其制备方法，本发明提供的原位固化组织工程支架具有较高的初始机械强度，且其制备方法简单。

本发明提供一种原位固化组织工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在极性有机溶剂的存在下原位固化形成。

优选的，所述生物可降解微球为明胶微球、聚丙交酯-乙交酯微球、海藻酸盐微球和壳聚糖微球中的一种或几种。

优选的，所述生物可降解微球的粒径为100～450μm。

优选的，所述聚丙交酯-乙交酯的数均分子量为50000～200000。

优选的，所述聚丙交酯-乙交酯与生物可降解微球的质量比为(1～9)：(9～1)。

优选的，所述极性有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜、四甘醇和乙酸乙酯中的一种或几种。

优选的，所述原位固化组织工程支架的孔隙率为70～95％。

优选的，所述原位固化组织工程支架还包括羟基磷灰石。

优选的，所述生物可降解微球为担载活性蛋白的生物可降解微球。

本发明提供一种原位固化组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

将聚丙交酯-乙交酯、生物可降解微球和极性有机溶剂混合，经原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明提供了一种原位固化组织工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在极性有机溶剂的存在下原位固化形成。本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球作为致孔剂，将所述原位固化成孔组织注射至体内修复部位，极性有机溶剂被体液中的水置换，于原位快速固化成型。由于所述生物可降解微球的降解速率较聚丙交酯-乙交酯快，逐渐降解成孔，引导组织长入，最后材料完全降解被修复组织替代，达到修复目的。本发明提供的原位固化组织工程支架中的微球逐渐降解，其孔结构逐渐形成，孔隙率逐渐增加，可以实现体内由外而内梯度致孔，使其孔隙形成与组织长入相匹配。在本发明提供的原位固化组织工程支架的原位固化初期，由于部分未降解的致孔剂的存在，使得本发明提供的原位固化组织工程支架的初始强度明显提高。并且，本发明所述原位固化组织工程支架的制备方法简单。

另外，本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球为致孔剂，生物相容性好，避免了由盐等粒子的高渗对组织细胞的损伤。

进一步的，所述生物可降解微球作为致孔剂的同时还可以担载生长因子等活性蛋白或其它药物，致孔剂微球可有效保护蛋白药物活性，避免了活性生长因子与有机溶剂的直接接触而丧失活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的原位固化组织工程支架的制备过程示意图；

图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图；

图3为本发明实施例1得到的原位固化组织工程支架的扫描电镜图。

具体实施方式

本发明提供了一种原位固化组织工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在极性有机溶剂的存在下原位固化形成。

本发明提供的原位固化组织工程支架具有较高的初始机械强度、较好的生物相容性和担载蛋白药物的能力等优点。

本发明提供的原位固化组织工程支架由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在极性有机溶剂的存在下原位固化形成。在本发明中，所述原位固化组织工程支架的孔隙率优选为70～95％，更优选为75～90％，最优选为80～85％。

在本发明中，所述聚丙交酯-乙交酯(PLGA)的数均分子量优选为50000～200000，更优选为55000～195000，最优选为60000～190000，本发明对所述聚丙交酯-乙交酯的来源没有特殊的限制，可采用所述聚丙交酯-乙交酯的市售商品，也可按照本领域技术人员熟知的制备聚丙交酯-乙交酯的技术方案自行制备。

在本发明中，所述生物可降解微球优选为明胶微球、聚丙交酯-乙交酯微球、海藻酸盐微球和壳聚糖微球中的一种或几种，更优选为明胶微球、海藻酸盐微球和壳聚糖微球中的一种或几种，最优选为明胶微球；所述生物可降解微球的粒径优选为100～450μm，更优选为150～400μm，最优选为200～350μm；所述聚丙交酯-乙交酯与生物可降解微球的质量比优选为(1～9)：(9～1)，更优选为(1.5～8.5)：(8.5～1.5)，最优选为(2～8)：(8～2)。为了使所述的原位固化组织工程支架具有一定的功能性，在本发明中，所述生物可降解微球优选为担载有活性蛋白的生物可降解微球，本发明对所述活性蛋白种类和用量没有特殊的限制，根据实际的需求采用适当的活性蛋白即可。如，可采用骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子和类胰岛素生长因子中的一种或几种。

本发明对所述生物可降解微球的来源没有特殊的限制，在本发明中，所述生物可降解微球优选按照以下步骤进行制备：

A)将生物可降解材料与水混合，得到生物可降解材料溶液；

B)将液体石蜡、山梨糖醇酐油酸酯和所述步骤A)得到的生物可降解微球溶液混合，得到混合物；

C)将所述步骤B)得到的混合物进行过滤，得到生物可降解微球。

本发明将生物可降解材料与水混合，得到生物可降解材料溶液，本发明优选将所述生物可降解材料与去离子水混合，得到生物可降解材料溶液。在本发明中，所述生物可降解材料优选为明胶、聚丙交酯-乙交酯、海藻酸盐和壳聚糖中的一种或几种，更优选为明胶、海藻酸盐和壳聚糖中的一种或几种，最优选为明胶；所述混合的温度优选为30～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃；所述生物可降解材料溶液的质量浓度优选为15～25％，更优选为18～22％，最优选为19～20％。

得到生物可降解材料溶液后，本发明优选将所述生物可降解材料溶液进行高压灭菌，所述高压灭菌的压强优选为100～150kPa，更优选为120 kPa；所述高压灭菌的时间优选为20～30分钟，更优选为25分钟。

为了使所述生物可降解微球具有一定的功能性，本发明优选将得到的生物可降解材料溶液与活性蛋白混合，得到担载有活性蛋白的生物可降解材料溶液。在本发明中，所述活性蛋白的种类和用量与上述技术方案中活性蛋白的种类和用量一致，在此不再赘述。本发明对所述生物可降解材料溶液与活性蛋白的混合方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的混合方法即可。

得到生物可降解材料溶液后，本发明将液体石蜡、山梨糖醇酐油酸酯(Span-80)和所述生物可降解材料溶液混合，得到混合物。本发明优选将所述液体石蜡和Span-80混合，然后再与所述生物可降解材料溶液混合，得到混合物。本发明对所述液体石蜡和Span-80的来源没有特殊的限制，采用所述液体石蜡和Span-80的市售商品即可。在本发明中，所述液体石蜡和Span-80的体积比优选为(350～500)：1，更优选为(400～450)：1，本发明优选在水浴条件下，进行所述液体石蜡和Span-80的混合，所述水浴的温度优选为30～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃，本发明对所述水浴的时间没有特殊的限制，能够使所述液体石蜡和Span-80混合均匀即可。

完成所述液体石蜡和Span-80的混合后，本发明优选将所述生物可降解材料溶液加入得到的液体石蜡和Span-80的混合物中，进行搅拌，得到混合物。本发明更优选将所述生物可降解材料溶液加入得到的液体石蜡和Span-80的混合物中，进行第一搅拌，完成所述第一搅拌后，将第一搅拌的产物在冰浴的条件下进行第二搅拌，得到混合物。在本发明中，所述生物可降解材料溶液与液体石蜡的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:(1.5～2.5)，最优选为1：2；所述第一搅拌的时间优选为3～10min，更优选为4～9min；所述第一搅拌的速度优选为100～300rpm，更优选为200rpm；所述第一搅拌的温度优选为30～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃；所述第二搅拌的温度优选为0～4℃，更优选为2℃；所述第二搅拌的时间优选为50～80min，更优选为60～70min；所述第二搅拌的速度优选为100～300rpm，更优选为200rpm。

得到混合物后，本发明将所述混合物进行过滤，得到生物可降解微球。本发明优选采用滤网进行过滤，所述滤网的孔径优选为100～450μm，更优选为200～400μm，最优选为300μm。本发明对所述过滤的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的过滤的技术方案即可。

完成所述过滤后，本发明优选将过滤得到的生物可降解微球进行干燥，得到干燥的生物可降解微球。本发明优选将过滤得到的生物可降解微球进行冷冻干燥，得到干燥的生物可降解微球。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-80～-20℃，更优选为-50～-30℃，最优选为-45～-35℃；所述冷冻干燥的时间优选为18～30小时，更优选为20～26小时。

完成所述干燥后，本发明优选将干燥的生物可降解微球进行清洗，得到清洗后的生物可降解微球。本发明优选采用无水酒精对所述干燥的生物可降解微球进行清洗，得到清洗后的生物可降解微球。本发明对所述无水酒精的来源和用量没有特殊的限制，能够将所述干燥的生物可降解微球清洗干净即可。本发明对所述清洗的次数没有特殊的限制，能够将所述干燥的生物可降解微球清洗干净即可。

在本发明中，所述极性有机溶剂优选为1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、四甘醇和乙酸乙酯中的一种或几种，更优选为1-甲基-2-吡咯烷酮和/或二甲基亚砜、最优选为1-甲基-2-吡咯烷酮，所述聚丙交酯-乙交酯与极性有机溶剂的质量比优选为1：(2.5～5)，更优选为1：(2.8～4.5)，最优选为1：(3～4)。

在本发明中，为了使本发明提供的原位固化组织工程支架在骨组织修复中有更好的应用，所述原位固化组织工程支架优选还包括羟基磷灰石(HA)，羟基磷灰石是人体骨骼的主要成分，将羟基磷灰石植入体内可诱导骨组织的生长。在本发明中，所述HA与PLGA的质量比优选为1：(10～1.5)，更优选为1：(9～2)，最优选为1：(8～3)。本发明对所述HA的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员常用的HA即可。

本发明还提供了一种原位固化组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

将聚丙交酯-乙交酯、生物可降解微球和极性有机溶剂混合，经原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明优选将聚丙交酯-乙交酯(PLGA)与极性有机溶剂混合，得到PLGA溶液，将生物可降解微球与所述的PLGA溶液混合，经原位固化，得到原位固化组织工程支架。为了使得到的原位固化组织工程支架能够应用于骨组织修复，本发明优选将PLGA、极性有机溶剂和羟基磷灰石(HA)混合，得到PLGA溶液，将生物可降解微球与所述的PLGA溶液混合，经原位固化，得到原位固化组织工程支架。在本发明中，所述PLGA、极性有机溶剂和HA的来源和用量与上述技术方案中PLGA、极性有机溶剂和HA的来源和用量一致，在此不再赘述。在本发明中，所述PLGA、极性有机溶剂和HA的混合的温度优选为60～80℃，更优选为65～75℃。本发明对所述PLGA、极性有机溶剂和HA的混合没有特殊的限制，本发明优选对其进行第三搅拌，完成所述PLGA、极性有机溶剂和HA的混合，本发明对所述第三搅拌的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的搅拌的技术方案即可。

得到PLGA溶液后，本发明将所述生物可降解微球与所述PLGA溶液混合，得到可注射的原位固化组织工程支架，所述可注射的原位固化组织工程支架经原位固化，得到原位固化组织工程支架。在本发明中，所述生物可降解微球的来源和用量与上述技术方案中生物可降解微球的来源和用量一致，在此不再赘述。本发明对所述生物可降解微球与所述PLGA溶液的混合方法没有特殊的限制，本发明优选对其进行第四搅拌，完成所述生物可降解微球与所述PLGA溶液的混合。本发明对所述第四搅拌的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员常用的搅拌技术方案将所述生物可降解微球与所述PLGA溶液搅拌均匀即可。

得到可注射的原位固化组织工程支架后，本发明优选将所述可注射原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。本发明对所述注射的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员常用的注射的技术方案即可。本发明对所述可注射的原位固化组织工程支架的用量没有特殊的限制，根据实际需求采用适当的用量即可。

参见图1，图1为本发明提供的原位固化组织工程支架的制备过程示意图。1为将生物可降解微球加入PLGA溶液中，2为得到的可注射的原位固化组织工程支架，3为将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中进行原位固化。由图1可以看出，本发明提供的原位固化组织工程支架制备方法简单，易于操作。

本发明按照GT/T 1041-92标准，采用直接加压的方法测定了得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度。结果表明，本发明提供的原位固化组织工程支架的初始机械强度能够达到2.8MPa，较现有的原位固化组织工程支架的初始机械强度0.285MPa提高了10倍。

本发明按照液体置换法(liquid displacement)测定了得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本发明提供的原位固化组织工程支架的孔隙率可达92％，得到的支架孔隙率较高，有利于骨组织的原位生长。

本发明提供了一种原位固化组织工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在极性有机溶剂的存在下原位固化形成。本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球作为致孔剂，将所述原位固化成孔组织注射至体内修复部位，极性有机溶剂被体液中的水置换，于原位快速固化成型。由于所述生物可降解微球的降解速率较聚丙交酯-乙交酯快，逐渐降解成孔，引导组织长入，最后材料完全降解被修复组织替代，达到修复目的。本发明提供的原位固化组织工程支架中的微球逐渐降解，其孔结构逐渐形成，孔隙率逐渐增加，可以实现体内由外而内梯度致孔，使其孔隙形成与组织长入相匹配。在本发明提供的原位固化组织工程支架的原位固化初期，由于部分未降解的致孔剂的存在，使得本发明提供的原位固化组织工程支架的初始强度明显提高。另外，本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球为致孔剂，生物相容性好，避免了由盐等粒子的高渗对组织细胞的损伤。

进一步的，所述生物可降解微球作为致孔剂的同时还可以担载生长因子等活性蛋白或其它药物，致孔剂微球可有效保护蛋白药物活性，避免了活性生长因子与有机溶剂的直接接触而丧失活性。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种原位固化组织工程支架及其制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在120kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入1gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将5gPLGA溶液与5g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含10.3％的PLGA，3.7％的HA、50％的明胶微球和36％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为92％。

本发明对本实施例得到的原位固化组织工程支架进行了扫描电镜测试，结果如图3所示，图3为本发明实施例1得到的原位固化组织工程支架的扫描电镜图。在图3中，1和2为本实施例得到的原位固化组织工程支架断面的扫描电镜图；3为本实施例得到的原位固化组织工程支架表面的扫描电镜图。由图3可以看出，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率较高，且孔隙分布均匀。

实施例2

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-40℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入1gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将6gPLGA溶液与4g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含13％的PLGA，4％的HA、40％的明胶微球和43％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为86％。

实施例3

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入1gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将7gPLGA溶液与3g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含15％的PLGA，5％的HA、30％的明胶微球和50％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为83％。

实施例4

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入2gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将5gPLGA溶液与5g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含10％的PLGA，7％的HA、50％的明胶微球和33％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为87％。

实施例5

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入2gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将6gPLGA溶液与4g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含12％的PLGA，8％的HA、40％的明胶微球和40％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为81％。

实施例6

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入2gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将7gPLGA溶液与3g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含14％的PLGA，9％的HA、30％的明胶微球和47％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为77％。

实施例7

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入3gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将5gPLGA溶液与5g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含9.5％的PLGA，9.5％的HA、50％的明胶微球和31％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为85％。

实施例8

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入3gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将6gPLGA溶液与4g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含11％的PLGA，11％的HA、40％的明胶微球和38％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为79％。

实施例9

将明胶溶解于37℃的去离子水中配制得到质量浓度为25％的明胶溶液，然后在123kPa下高压灭菌后，将骨形态发生蛋白(BMP-2)加入到明胶溶液中，得到BMP-2的浓度为500ng/mL的明胶溶液。

将20mL液体石蜡和50μL的Span-80加入到烧杯中，37℃水浴条件下搅拌均匀，取10mL明胶溶液加入其中，在200rpm转速下搅拌10min，然后保持转速不变，转入到4℃的冰浴条件下，持续搅拌1h，得到混合物。

使用孔径为300μm的滤网过滤，将过滤得到的微球在-50℃下冷冻干燥24h。

用无水酒精快速反复清洗干燥后的明胶微球，即得到明胶微球。

在80℃下，将3gPLGA溶于10gNMP中，加入3gHA,搅拌均匀，得到PLGA溶液。

将7gPLGA溶液与3g明胶微球混合，搅拌至均质，得到可注射的原位固化组织工程支架。所述可注射的原位固化组织工程支架中含13％的PLGA，13％的HA、30％的明胶微球和44％的NMP。

将可注射的原位固化组织工程支架注射至水溶液中，进行原位固化，得到原位固化组织工程支架。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架在固化10min的机械强度，结果如图2所示，图2为本发明实施例1～9得到的原位固化组织工程支架的机械强度图。

在图2中，1为本发明实施例1得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；2为本发明实施例2得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；3为本发明实施例3得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；4为本发明实施例4得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；5为本发明实施例5得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；6为本发明实施例6得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；7为本发明实施例7得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；8为本发明实施例8得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度；9为本发明实施例9得到的原位固化组织工程支架的初始机械强度。由图2可以看出，本发明提供的原位固化组织工程支架在固化10min内机械强度最高可达2.8MPa，大大提高了支架的初始机械强度。

本发明测试了本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率，结果表明，本实施例得到的原位固化组织工程支架的孔隙率为71％。

由以上实施例可以看出，本发明提供的原位固化组织工程支架以生物可降解微球为致孔剂，得到的原位固化组织工程支架中孔结构均匀，孔隙率大，还提高了原位固化组织工程支架的初始机械强度，并且，本发明提供的原位固化组织工程支架的制备方法简单、易操作。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种原位固化组织工程支架，由聚丙交酯-乙交酯、明胶微球和羟基磷灰石在1-甲基-2-吡咯烷酮的存在下原位固化形成；

以质量分数计，所述聚丙交酯-乙交酯、羟基磷灰石、明胶微球和1-甲基-2-吡咯烷酮形成的溶液中含有：

10％的聚丙交酯-乙交酯，7％的羟基磷灰石、50％的明胶微球和33％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

12％的聚丙交酯-乙交酯，8％的羟基磷灰石、40％的明胶微球和40％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

14％的聚丙交酯-乙交酯，9％的羟基磷灰石、30％的明胶微球和47％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

9.5％的聚丙交酯-乙交酯，9.5％的羟基磷灰石、50％的明胶微球和31％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

11％的聚丙交酯-乙交酯，11％的羟基磷灰石、40％的明胶微球和38％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

或

13％的聚丙交酯-乙交酯，13％的羟基磷灰石、30％的明胶微球和44％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

所述聚丙交酯-乙交酯的数均分子量为50000～200000。

2.根据权利要求1所述的原位固化组织工程支架，其特征在于，所述明胶微球的粒径为100～450μm。

3.根据权利要求1所述的原位固化组织工程支架，其特征在于，所述原位固化组织工程支架的孔隙率为70～95％。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的原位固化组织工程支架，其特征在于，所述明胶微球为担载活性蛋白的明胶微球。

5.一种原位固化组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

将聚丙交酯-乙交酯、明胶微球、羟基磷灰石和1-甲基-2-吡咯烷酮混合，经原位固化，得到原位固化组织工程支架；

以质量分数计，混合得到的溶液中含有10％的聚丙交酯-乙交酯，7％的羟基磷灰石、50％的明胶微球和33％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

12％的聚丙交酯-乙交酯，8％的羟基磷灰石、40％的明胶微球和40％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

14％的聚丙交酯-乙交酯，9％的羟基磷灰石、30％的明胶微球和47％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

9.5％的聚丙交酯-乙交酯，9.5％的羟基磷灰石、50％的明胶微球和31％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

11％的聚丙交酯-乙交酯，11％的羟基磷灰石、40％的明胶微球和38％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

或

13％的聚丙交酯-乙交酯，13％的羟基磷灰石、30％的明胶微球和44％的1-甲基-2-吡咯烷酮；

所述聚丙交酯-乙交酯的数均分子量为50000～200000。