CN104160039A

CN104160039A - 川崎病的生物标志物

Info

Publication number: CN104160039A
Application number: CN201280070975.0A
Authority: CN
Inventors: V·M·帕斯夸尔; 许兆辉; O·拉米罗; R·科玛兹
Original assignee: Baylor Research Institute
Current assignee: Baylor Research Institute
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2032-12-21
Also published as: EP2798081A1; CN104160039B; CA2862270A1; JP2015505245A; US20140348818A1; KR20140108718A; WO2013101758A1

Abstract

本发明提供了川崎病(KD)的生物标志物。在某些方面，本发明提供了用于检测KD生物标志物的方法，如用于检测升高的PDGFC表达。同样地，本发明描述了治疗具有KD的生物标志物的受试者的方法。

Description

川崎病的生物标志物

发明背景

本申请要求于2011年12月29日提交的美国临时专利申请61/581,199的优先权，将其引入本文作为参考。

1.发明领域

概括地说，本发明涉及药物和医学诊断学领域。更具体地，其涉及用于检测和治疗川崎病的方法。

2.相关领域的描述

川崎病(KD)具有年龄特异性分布，大多数病例发生在6个月至4岁的儿童中。其在日本和具有日本血统的儿童中更为流行，年度发病率为每100000个年龄低于5岁的儿童约112例。在美国，2000年川崎病的发病率的最佳地估计值为4248例与川崎病相关的住院治疗，中位年龄为2岁。KD开始时通常高烧至少5天，并且呈现其他主要特征和实验室/临床结果。虽然在尸检病例中实际上总是涉及冠状动脉，但川崎病是涉及整个身体的血管的泛发性全身性血管炎。动脉瘤可以在其他实质外肌性动脉如腹腔动脉、肠系膜动脉、股动脉、髂动脉、肾动脉、腋动脉和肱动脉中发生。

川崎病的病因学仍然是未知的，尽管临床和流行病学特征强有力地表明了感染性病因。在早期阶段(发病后7-9天)发现嗜中性粒细胞汇集，并快速过渡为与淋巴细胞(主要为CD8⁺T细胞)和IgA浆细胞相呼应的大单核细胞。内弹性膜的破坏和最终的成纤维细胞增殖在该阶段发生，并且KD患者中的IL-1和TNF-α的循环水平也升高。活性炎症由进行性纤维化在数周至数月内替代，伴随疤痕形成。然而，尽管进行了详细的研究，但是KD的诊断仍然基于临床症状，因此在施加治疗可能最有效的疾病早期阶段通常不能作出正确的诊断。

发明概述

在第一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者中的川崎病(KD)的生物标志物的方法，其包括确定来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的生物样品中的EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816,PDGFC或OLFM4的表达水平，其中相对于参考水平升高的表达鉴定受试者具有KD的生物标志物。

在另一个实施方案中，提供了用于检测受试者中的KD的生物标志物的方法，其包括确定来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的生物样品中的LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2或TMCC1的表达水平，其中相对于参考水平降低的表达鉴定受试者具有KD的生物标志物。

在又一个实施方案中，提供了用于检测受试者中的川崎病(KD)的生物标志物的方法，其包括确定来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的生物样品中的PDGFC的表达水平，其中相对于参考水平升高的PDGFC表达鉴定受试者具有KD的生物标志物。

在再一个实施方案中，提供了用于治疗患有KD的受试者的方法，其包括(a)评价受试者中的生物标志物的表达和(b)如果受试者含有KD生物标志物，则给予受试者抗KD治疗。例如，在一些方面，评价生物标志物的表达可以包括测量来自受试者的样品中的生物标志物的表达。在另外的方面，评价生物标志物的表达可以包括对提供来自受试者的样品中的生物标志物表达水平的报告进行分析。因此，在一些方面，提供了用于治疗患有KD的受试者的方法，其包括(a)评价受试者中的PDGFC的表达和(b)如果受试者相对于参考水平显示出升高的PDGFC表达，则给予受试者抗KD治疗。

在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有KD的受试者的方法，其包括(a)给予受试者抗KD治疗；(b)评价受试者中的PDGFC的表达；和(c)如果受试者相对于参考水平显示出升高的PDGFC表达，则给予受试者进一步的抗KD治疗。因此，在某些方面，实施方案的方法可以定义为用于监测或确定抗KD治疗的有效性的方法。

在又一个实施方案中，提供了治疗KD的方法，其包括给予经确定具有KD生物标志物的受试者抗KD治疗。例如，在某些方面，提供了治疗KD的方法，其包括给予经确定相对于参考水平具有升高的PDGFC表达的受试者抗KD治疗。

实施方案的某些方面涉及疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者。例如，受试者可以显示出以下症状中的一种或多种：口腔红斑；皮疹；嘴唇肿胀；嘴唇干裂；手肿胀；足肿胀；眼部发红；葡萄膜炎；无菌性脑膜炎；淋巴结炎症；血管炎症；冠状动脉瘤；发热(例如，发作至少2、3、4、5或更多天的持续性发热)；关节痛；关节肿胀；或甲床、手掌、足底和腹股沟区域皮肤剥落。在一些方面，受试者为儿童，如年龄为6个月到2、3、4或5岁的儿童。在另外的方面，受试者为人类受试者，如具有亚洲(例如，日本)血统的受试者。在某些方面，受试者可以是不包含KD生物标志物(例如，升高的PDGFC表达水平)的受试者。

实施方案的某些方面涉及来自受试者的生物样品，如血液(例如，血清)、唾液、尿液、粪便或组织样品。在某些方面，样品可以直接从受试者获得(例如，通过从受试者抽取血液)。在另外的方面，样品可以是从第三方(例如，医生)获得的样品或可以来自组织库或血库。在一些方面，样品可以被加工，如通过从样品中分离或浓缩蛋白或核酸(例如，RNA)。例如，可以处理样品以纯化或部分地纯化蛋白或核酸或去除某些蛋白或核酸(例如，去除过量的球蛋白RNA)。

实施方案的方面涉及确定样品中KD生物标志物的表达。例如，确定表达可以包括测量生物标志物的表达。生物标志物的表达可以通过例如检测RNA或蛋白表达或通过检测RNA或蛋白的活性来确定。因此，在某些方面，确定生物标志物的表达可以包括测量样品中的RNA或蛋白的表达水平。在另外的方面，实施方案的方法可以包括报告(例如，以书面或电子报告形式)样品中的生物标志物的表达。在再另外的方面，实施方案的方法可以包括报告样品(或受试者)是否具有KD生物标志物。

在一些实施方案中，方法将涉及根据关于一种或多种生物标志物的表达水平的数据来确定或计算诊断分数，这意味着一种或多种生物标志物的表达水平是分数所依据的因素中的至少一个。诊断分数将提供关于生物样品的信息，如样品来自患有KD的受试者的一般概率。在某些实施方案中，概率值表示为代表受试者患有KD的0％可能性至100％可能性的概率的整数值。在一些实施方案中，概率值表示为代表受试者患有KD的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可能性(或从其中可得出的任何范围)的概率的整数值。

实施方案的某些方面涉及确定样品中的PDGFC的表达。例如，PDGFCRNA和/或蛋白表达可以在样品中确定。在某些方面，确定表达包括确定活性PDGFC的表达(例如，编码功能性蛋白的PDGFC RNA的表达)。在一些方面，确定PDGFC的表达包括测量样品中RNA或蛋白的表达水平。

用于确定生物标志物的表达的方法在本领域中是熟知的并且针对KD生物标志物可以采用任何这样的方法。例如，在检测蛋白表达的情况下，可以采用的方法包括但不限于，质谱法、适体结合分析或采用抗生物标志物抗体的免疫检测方法(例如，蛋白质印迹(Western blot)、ELISA或IHC)。在确定生物标志物的RNA表达的情况下，可以采用的方法包括但不限于，核酸杂交(例如，RNA印迹(Northern blot)或杂交到阵列)、核酸测序或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。

实施方案的一些方面包括确定样品中的KD生物标志物的表达是否升高。例如，KD生物标志物(例如，PDGFC)的表达可以与参考表达水平进行比较，所述参考表达水平如来自健康受试者或未患有KD的受试者的样品中的表达水平。例如，在PDGFC的情况下，升高的RNA表达水平可以包括的表达为表达的参考水平的约3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-或10-至约20-、25-、30-、35-、40-、45-或50-倍的PDGFC RNA表达。在再另外的方面，确定PDGFC表达水平可以包括确定编码活性PDGFC多肽的RNA(例如，编码序列SEQ ID NO:1的RNA)的表达水平。因此，在某些方面，确定PDGFC表达可以包括确定编码活性PDGFC多肽的PDGFC RNA的表达，或确定编码活性PDGFC多肽的RNA相对于不编码活性多肽的PDGFC RNA的表达比。

再另外的实施方案涉及确定样品中KD生物标志物的表达和至少第二基因的表达。例如，第二基因可以是对照基因。在一些方面，对照基因的表达可以用于归一化KD生物标志物的表达水平，例如，以说明样品尺寸或样品质量的差异。在另外的方面，第二基因可以是另外的生物标志物。例如，在某些方面，实施方案的方法包括确定样品中的PDGFC表达和确定至少第二基因的表达，所述第二基因选自LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816和OLFM4。在又另外的方面，来自与KD相关的至少第二基因的表达在样品中确定，其中所述第二基因为TNFα、IL-1或在美国专利公开20110189698或20090304680中描述的基因之一，将所述专利公开引入本文作为参考。因此，在一些方面，方法可以包括确定来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30种生物标志物的表达。

实施方案的另外的方面涉及治疗患有KD或经诊断患有KD的受试者或经确定具有KD的生物标志物的受试者(例如，经确定具有升高的PDGFC表达的受试者)。例如，可以使用合适的抗KD治疗来治疗受试者，如通过给予IgG、阿司匹林、皮质类固醇和/或抗TNFα治疗。在再另外的方面，提供了治疗经确定不具有KD的生物标志物的受试者的方法，其包括给予不包括IgG给药的抗炎治疗。

在又一个实施方案中，提供了有形的计算机可读介质，其包括计算机可读代码，当计算机执行所述计算机可读代码时，使得计算机执行操作，所述操作包括(a)接收对应于来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中KD生物标志物的表达水平的信息；和(b)确定与参考水平相比的KD生物标志物的相对表达水平。例如，计算机可读代码可以使得计算机执行操作，所述操作包括(a)接收对应于来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中的PDGFC的表达水平的信息；和(b)确定与参考水平相比的PDGFC的相对表达水平，其中相对于参考水平升高的PDGFC表达表明存在KD的生物标志物。在某些方面，计算机可读代码进一步使得计算机接收对应于来自健康受试者的样品中的KD生物标志物(例如，PDGFC)的表达的参考水平的信息。在另外的方面，计算机可读介质包括存储在所述介质中的参考水平(例如，PDGFC参考水平)。

在再另外的方面，计算机可读介质包括用于执行包括以下的一种或多种另外的操作的代码：将对应于生物标志物(如PDGFC)表达的相对表达水平的信息发送到有形的数据存储装置和/或针对样品计算诊断分数，其中所述诊断分数表明样品来自患有KD的受试者的概率。在再另外的方面，计算机可读介质包括用于接收信息的代码，所述信息对应于来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中的LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816或OLFM4之一的表达水平。

处理器或多个处理器可以用于执行由本文公开的示例性的有形计算机可读介质驱动的操作。供选择地，处理器或多个处理器可以在硬件控制下或在硬件和软件控制的组合下执行那些操作。例如，处理器可以是具体配置以进行一种或多种那些操作的处理器，如专用集成电路(ASIC)或现场可编程门阵列(FPGA)。使用处理器或多个处理器能够进行在没有处理器或多个处理器帮助的情况下不可能的或至少不以使用处理器或多个处理器可实现的速度进行的信息(例如数据)处理。执行这些操作的一些实施方案可以在一定量的时间内实现，如比在不使用计算机系统、处理器或多个处理器的情况下执行操作将花费的时间更短的一定量的时间，包括不多于一小时、不多于30分钟、不多于15分钟、不多于10分钟、不多于一分钟、不多于一秒和不多于一秒至一小时的每个以秒计的时间间隔。

现有的有形的计算机可读介质的一些实施方案可以是，例如，CD-ROM、DVD-ROM、闪存驱动器、硬盘驱动器或任意其他物理存储装置。本方法的一些实施方案可以包括使用计算机可读代码记录有形的计算机可读介质，当计算机执行所述计算机可读代码时，使得计算机执行本文所讨论的任意操作，所述操作包括与现有的有形的计算机可读介质相关的那些。记录有形的计算机可读介质可以包括例如，将数据烧录到CD-ROM或DVD-ROM上，或除此以外，将数据填入物理存储装置。在某些方面，有形的计算机可读介质可以包括在实施方案的试剂盒中。

还提供了含有用于实施所公开的方法的公开的组合物或多种组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以用于确定一种或多种生物标志物的表达。在某些实施方案中，试剂盒含有、至少含有或至多含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60种或更多种或从其中可得到的任意范围和组合的核酸探针，所述核酸探针包括在严格条件下可以特异性地杂交到本文公开的RNA生物标志物的那些。在另外的实施方案中，试剂盒或方法可以涉及核酸探针，所述核酸探针能够特异性检测以下LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816、PDGFC和OLFM4中的一种或多种的RNA表达。

在再一个实施方案中，实施方案的试剂盒包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60种或更多种或从其中可得到的任意范围和组合的抗体，所述抗体特异性结合于本文公开的生物标志物。在另外的实施方案中，试剂盒或方法可以涉及抗体，所述抗体能够特异性检测以下LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816、PDGFC和OLFM4中的一种或多种的蛋白表达。

在再一个实施方案中，试剂盒可以包括可以特异性地杂交到编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC RNA(例如，SEQ ID NO:1)的至少第一核酸探针，和可以特异性地杂交到不编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC RNA(例如，SEQ ID NO:3)的至少第二核酸探针。例如，实施方案的试剂盒可以包括可以特异性扩增来自编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC RNA的序列(例如，SEQ ID NO:1)的片段的至少第一引物对，和可以特异性扩增来自不编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC RNA的序列(例如，SEQ ID NO:3)的片段的至少第二引物对。

如在本文说明书中所使用的，“一个(a)”或“一个(an)”可以指一个或多个。如在本文权利要求(或多个权利要求)中所使用的，当与词语“包括(comprising)”联合使用时，词语“一个(a)”或“一个(an)”可以指一个或多于一个。

预期本文所讨论的任何实施方案可以以任何公开的方法或组合物实施，反之亦然。就特定胰腺障碍所讨论的任何实施方案可以针对不同的胰腺障碍应用或实施。此外，所公开的组合物和试剂盒可以用于实现所公开的方法。

除非明确表明仅指代替代物或替代物互相排斥，在权利要求中使用的术语“或”用于指“和/或”，但是本发明支持仅指代替代物和“和/或”的定义。如本文所使用，“另一个”可以指至少第二个或更多个。

在本申请中，术语“约”用于表示数值包括用于确定数值的装置、方法的误差的固有变化，或研究受试者中存在的变化。

本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应懂得详细描述和具体实例虽然表明本发明的优选实施方案，但仅以说明方式给出，因为对本领域技术人员而言，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将从该详细描述中变得显而易见。

附图简述

以下附图构成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参照一个或多个这些附图并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：在与炎症相关的信号转导中涉及的基因网络的示意图。将发现的在KD血液中差异调节的基因转录物绘制到信号转导网络上。+表示在KD中上调的转录物。(-)表示在KD中下调的转录物。

图2：在与结缔组织发育相关的信号转导中涉及的基因网络的示意图。将发现的在KD血液中差异调节的基因转录物绘制到信号转导网络上。+表示在KD中上调的转录物。(-)表示在KD中下调的转录物。

图3：PDGFC转录物在KD患者的血液中上调了5-30倍。图表显示PDGFC转录物表达相对于健康对照的平均表达的倍数变化(FC)。通过在PDGFC转录物的三个区域的定量RT-PCR获得结果。

图4：编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC转录物在KD患者中上调。图表显示编码功能性蛋白的PDGFC转录物与不包括功能PDGFC ORF的转录物的比例。KD表示来自KD患者的样品。H表示来自健康受试者的样品。

图5：使用定量RT-PCR评价来自KD和其他发热性疾病的全血中的PDGFC转录物水平。

图6：微阵列分析表明PDGFC转录在KD患者中上调。

说明性实施方案的描述

I.本发明

川崎病是儿童获得性心脏病的主要原因，超过80％的KD病例出现于6个月至4岁的年龄中。KD的原因是未知的，并且虽然怀疑是传染原(infectiousagent)，但是遗传和环境似乎也在该疾病中起作用。目前KD诊断仅可以通过临床特征的组合来实现，因此快速诊断是不可能的。不幸的是，延迟诊断(和在应用适当治疗中所产生的延迟)使得严重并发症的概率增加。事实上，冠状动脉瘤在多达20％的未经治疗的患者中形成，而仅5％的经治疗的患者形成这样的动脉瘤。因此，非常需要用于诊断KD的快速方法。

本文详细说明的研究考察了KD患者与其他IL-1相关疾病相比的基因表达水平，所述其他IL-1相关疾病为新生儿期发病的多系统炎性疾病(NOMID)和全身型幼年特发性关节炎(sJIA)。总之，发现基因表达谱在这三种疾病中非常类似。然而，鉴定了许多基因仅在KD的情况下特异性上调或下调。特别地，发现血小板源性生长因子C(PDGFC)在川崎病患者中特异性上调，但在NOMID和sJIA中未上调。同样地，发现血小板源性生长因子C(PDGFC)在川崎病患者中特异性上调，但在幼年型皮肌炎(JDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、鼻病毒感染、大肠杆菌(Escherichia coli)感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)感染或金黄色葡萄球菌(Staph)感染中未上调。此外，发现KD患者优先地表达升高水平的编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC转录物。

因此，本文详细说明的研究证明升高的PDGFC表达可以用作用于诊断KD的生物标志物。例如，可以分析来自疑似患有KD的患者的血清样品以确定PDGFC表达。因此，升高的PDGFC表达水平或活性PDGFC RNA同种型的升高的表达可以用于确定受试者是否患有KD。这样的快速诊断将同样地能够进行早期治疗干预，所述早期治疗干预可以显著降低疾病的严重程度并降低发生并发症如冠状动脉瘤的概率。

II.PDGFC

PDGFC在组织生长和功能中是重要的，并且在募集与耐药性肿瘤相关的成纤维细胞中发挥作用。通过基因与基因的其他成员PDGF/VEGF家族的相似性首先鉴定了基因(Reigstad等人,2005)。已鉴定了两种不同的mRNA转录物。编码RNA的两个PDGFC中较短的一个编码PDGFC蛋白的功能性可读框(ORF)(NM_016205.2,引入本文作为参考；SEQ ID NO:1)。较长的转录物包括供选择的拼接事件，其将PDGFC编码区域置于框外，因此不编码功能性PDGFC蛋白(NR_036641.1,引入本文作为参考；SEQ ID NO:3)。

实施方案的某些方面涉及确定PDGFC在样品中的表达。在一些方面，确定PDGFC的表达包括确定编码功能性PDGFC蛋白的RNA和不编码功能性蛋白的RNA的表达。然而，在某些方面，确定PDGFC的表达包括确定编码功能性PDGFC蛋白的RNA的表达，或确定编码功能性PDGFC蛋白的RNA与不编码功能性蛋白的RNA的表达比。例如，具有升高的编码功能性PDGFC蛋白的RNA的表达或具有升高的编码功能性PDGFC蛋白的RNA与不编码功能性蛋白的RNA的表达比的受试者可以被确定为具有KD的生物标志物。

技术人员将认识到多种方法可以用于确定PDGFC RNA表达，并且将能够区别编码功能性蛋白的RNA(例如，SEQ ID NO:1)和不编码功能性蛋白的RNA(例如，SEQ ID NO:3)的表达。例如，可以采用仅杂交到对一种RNA或另一种RNA唯一的序列区域的杂交探针。同样地，仅能够扩增来自一种RNA或另一种RNA的序列或在不同PDGFC RNA的情况下生成不同长度的扩增子的引物可以用于RT-PCR。本文例示了一种这样的检测方法，其可以进行功能性RNA与非功能性RNA的定量对比。

III.检测KD生物标志物

某些实施方案涉及在体内或在样品中检测KD生物标志物的表达。例如，在一些实施方案中，可以通过测量蛋白的表达或活性检测KD生物标志物如PDGFC的表达。在另外的方面，可以通过测量编码生物标志物的RNA的表达检测KD生物标志物的表达。

A.核酸检测

在一些实施方案中，评估KD生物标志物(如PDGFC)的表达可以涉及定量mRNA表达。RNA印迹技术对于本领域技术人员而言是熟知的。RNA印迹涉及RNA作为靶标的使用。简言之，探针用于靶向已固定在适合的基质上的RNA种类，所述基质通常为硝酸纤维素滤膜。不同的种类应在空间上分开以便于分析。这通常通过核酸种类的凝胶电泳接着“杂交”到滤膜上来实现。随后，在促进变性和重新杂交的条件下将经杂交的靶标与探针(如经标记的探针)一起孵育。由于探针设计成与靶标碱基配对，因此探针将在复性条件下结合靶序列的一部分。随后去除未结合的探针，完成检测。

在一些实施方案中，在凝胶分离和使用溴化乙锭染色并在UV光下可视化之后定量核酸。在一些实施方案中，如果核酸由合成得到或使用完整的放射性标记的核苷酸或荧光标记的核苷酸扩增得到，则产物在分离后可以暴露于X光片或在适合的激发光谱下可视化。

在一些实施方案中，可视化是间接实现的。在分离核酸后，使经标记的核酸与靶序列接触。将探针缀合于发色团或放射性标记。在另一个实施方案中，将探针缀合于结合伴侣，如抗体或生物素，并且结合对的另一个成员携带可检测的部分。前述的一个实例描述于第5,279,721号美国专利，将其引入本文作为参考，其公开了用于核酸的自动化电泳和转移的装置和方法。装置允许在没有外部凝胶操作的情况下进行电泳和杂交，并且理想地适用于实施根据本实施方案的方法。

在一些实施方案中，RNA到cDNA的逆转录(RT)接着是相对定量PCR^TM(RT-PCR^TM)，其可以用于确定特定mRNA(例如，编码PDGFC的RNA)或甚至从受试者分离的特定mRNA种类(例如，编码活性PDGFC的mRNA)的相对浓度。通过确定特定mRNA或mRNA种类的浓度改变，显示了编码特定mRNA种类的基因是差异表达的。在某些方面，mRNA表达可以相对于对照mRNA的表达进行定量，所述对照mRNA的表达如磷酸甘油酸激酶1(PGK1；NCBI登记号NM_000291.3，引入本文作为参考)或TATA盒结合蛋白(TBP；NCBI登记号NM_003194.4,引入本文作为参考)的表达。

在一些实施方案中，可以使用标准序列分析技术对上述扩增产物进行序列分析以鉴定特定种类的变化。在某些方法中，使用针对最佳测序设计的引物集，通过序列分析进行基因的穷尽式分析。本实施方案提供了方法，借助所述方法可以使用任意或所有这些类型的分析。使用本文公开的序列，寡核苷酸引物可以设计成允许扩增整个KD生物标志物基因的序列(或编码蛋白的序列)，随后可以通过直接测序对所述序列进行分析。同样地，DNA测序可以用于检测和/或定量KD生物标志物基因的表达。用于这样的序列的方法包括但不限于，可逆终止子法(例如，由和BioSciences使用的)、焦磷酸测序(例如，来自Roche的454测序)和通过连接测序(例如，Life Technologies^TM SOLiD^TM测序)。

在PCR^TM中，在每个反应循环中的经扩增的靶DNA的分子数量升高的倍数接近两倍，直到一些试剂变得有限。此后，扩增的速率逐渐变得降低，直到循环之间的经扩增的靶标没有升高。如果绘制了其中循环数在X轴上且经扩增的靶DNA的浓度的对数在Y轴上的图表，则通过连接所绘制的点形成特征形状的曲线。以第一循环开始，线的斜率是正的且恒定的。这被认为是曲线的线性部分。在试剂变得有限之后，线的斜率开始降低并最终成为零。在该点处，经扩增的靶DNA的浓度变得渐近至某些固定值。这被认为是曲线的平台部分(plateau portion)。

在反应开始之前，靶DNA在PCR^TM扩增的线性部分中的浓度与靶标的起始浓度成正比。通过确定已完成相同数量的循环并且在其线性范围内的PCR^TM反应中的经扩增的靶DNA产物的浓度，能够确定在原始DNA混合物中的特定靶序列的相对浓度。如果DNA混合物为由从不同组织或细胞中分离的RNA合成的cDNA，则可以确定各个组织或细胞的特定mRNA的相对丰度，其中靶序列源自所述特定mRNA。在PCR^TM产物的浓度和相对mRNA丰度之间的该正比仅在PCR^TM反应的线性范围内是可靠的。

靶DNA在曲线的平台部分中的终浓度通过试剂在反应混合物中的有效性来确定，并且不依赖于靶DNA的原始浓度。因此，在能够通过RT-PCR^TM针对一系列RNA群体来确定mRNA种类的相对丰度之前，必须满足的第一条件是当PCR^TM反应在其曲线的线性部分时，经扩增的PCR^TM产物的浓度必须进行抽样检查。

为了成功测定特定mRNA种类的相对丰度，RT-PCR^TM实验必须满足的第二条件是可扩增的cDNA的相对浓度必须归一化到一些独立的标准。RT-PCR^TM实验的目标是确定相对于样品中所有mRNA种类的平均丰度的特定mRNA种类的丰度。

竞争性PCR^TM的大多数方案利用丰度与靶标近似的PCR^TM内标。如果PCR^TM扩增的产物在其线性期过程中进行抽样检查，则这些策略是有效的。如果当反应接近平台期对产物进行抽样检查，那么较低丰度的产物变得相对过度表示。对许多不同的RNA样品进行了相对丰度的比较，如在检查RNA样品的差异表达的情况下，所述比较以这样的方式变得被曲解，即使RNA的相对丰度中的差异似乎比其实际的更小。如果内标比靶标的丰度高得多，则这不是重要的问题。如果内标比靶标的丰度高，则在RNA样品之间可以进行直接线性比较。

B.蛋白生物标志物检测

在一些方面，实施方案的方法涉及检测蛋白生物标志物(如PDGFC)的表达或活性。例如，可以采用用于结合、纯化、去除、定量和/或除此之外一般地检测蛋白组分(如PDGFC)的免疫检测方法。可以采用根据本实施方案制备的抗体以检测KD生物标志物表达和/或KD生物标志物活化。稍微提及的是，一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析、荧光免疫分析、化学发光分析、生物发光分析和蛋白质印迹等。各种有用的免疫检测方法的步骤已描述于科学文献中，例如Doolittle MH和Ben-Zeev O,1999；Gulbis B和Galand P,1993；De Jager R等人,1993；和Nakamura等人,1987，将其各自引入本文作为参考。

一般地，免疫结合方法包括获得疑似含有KD生物标志物蛋白、多肽和/或肽(例如，PDGFC)的样品，并在能够有效形成免疫复合物的条件下，将样品与根据本实施方案的第一抗生物标志物抗体接触。

这些方法包括用于纯化野生型和/或突变型生物标志物蛋白、多肽和/或肽的方法，所述方法可以用于纯化来自患者样品的野生型和/或突变型生物标志物蛋白、多肽和/或肽，和/或用于纯化重组表达的野生型或突变型蛋白、多肽和/或肽。在这些实例中，抗体从样品中去除抗原生物标志物蛋白、多肽和/或肽组分。抗体将优选地连接到固体支持物，如柱状基质(column matrix)形式的固体支持物，并且疑似含有生物标志物蛋白抗原组分的样品将被施加到固定化抗体。不需要的组分将从柱上洗去，留下免疫复合到固定化抗体的抗原，然后通过从柱上去除蛋白和/或肽来收集生物标志物蛋白抗原。

免疫结合方法还包括用于检测和定量样品中KD生物标志物或经活化的KD生物标志物的量的方法。在本文中，获得疑似含有生物标志物的样品并将该样品与抗体接触，然后检测并定量在特定条件下形成的免疫复合物的量。

在抗原检测方面，所分析的生物样品可以是疑似含有表达KD生物标志物的细胞的任何样品，如血清或全血样品、组织提取物或另一种生物流体。

将选择的生物样品与抗体在足以能够形成免疫复合物(初级免疫复合物)的有效条件下接触并且接触足以能够形成免疫复合物(初级免疫复合物)的时间段，通常是将抗体组合物简单地加入样品中并孵育混合物一段时间，所述时间对于抗体与存在的任何KD生物标志物蛋白抗原形成免疫复合物(即，与存在的任何KD生物标志物蛋白抗原结合)是足够长的。在该时间后，样品-抗体组合物，如组织切片、ELISA板、斑点杂交或蛋白质印迹，一般地将被洗涤以去除任何非特异性结合的抗体种类，仅允许特异性结合在初级免疫复合物内的那些抗体被检测。

一般地，免疫复合物形成的检测在本领域是熟知的，并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法一般地基于标记或标志物的检测，如那些放射性、荧光、生物和酶标记中任一的。涉及这样的标记的使用的美国专利包括3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，将其各自引入本文作为参考。当然，可以通过使用次级结合配体发现另外的优点，所述次级结合配体如次级抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列，如本领域已知的。

在一些实施方案中，在检测中采用的KD生物标志物抗体(例如，抗PDGFC抗体)自身可以连接到可检测的标记，其中随后可以简单地检测该标记，从而能够确定组合物中的初级免疫复合物的量。在一些实施方案中，可以利用对抗体具有结合亲和力的第二结合配体检测结合在初级免疫复合物内的第一抗体。在某些实施方案中，第二结合配体可以连接到可检测的标记。第二结合配体自身通常为抗体，因此其可以被称为“次级”抗体。将初级免疫复合物与经标记的次级结合配体或抗体在足以能够形成次级免疫复合物的有效条件下接触，并且接触足以能够形成次级免疫复合物的一段时间。随后一般地洗涤次级免疫复合物以去除任何非特异性结合的经标记的次级抗体或配体，并且随后检测在次级免疫复合物中的剩余标记。

另外的方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上所述，使用对抗体具有结合亲和力的第二结合配体如抗体以形成次级免疫复合物。洗涤后，将次级免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体接触，仍然在足以能够形成免疫复合物(三级免疫复合物)的有效条件下并且接触足以能够形成免疫复合物(三级免疫复合物)的一段时间。将第三配体或抗体连接到可检测的标记，能够检测由此形成的三级免疫复合物。如果需要信号放大，该系统可以提供信号放大。

免疫检测的一种方法使用两种不同的抗体。使用第一步生物素化的单克隆或多克隆抗体检测靶抗原(或多种靶抗原)，随后使用第二步抗体检测连接到复合的生物素的生物素。在该方法中，待测试的样品首先在含有第一步抗体的溶液中孵育。如果存在靶抗原，则一些抗体结合于抗原以形成生物素化的抗体/抗原复合物。然后通过依次在链霉亲和素(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA和/或互补的生物素化DNA的溶液中孵育来扩增抗体/抗原复合物，其中每一步向抗体/抗原复合物中加入另外的生物素位点。重复扩增步骤直到实现适合的扩增水平，在该节点将样品在含有抗生物素的第二步抗体的溶液中孵育。该第二步抗体是经标记的，例如使用酶进行标记，所述酶通过组织酶学，使用色原底物来检测抗体/抗原复合物的存在。通过适合的扩增，可以制备宏观可见的缀合物。

另一种已知的免疫检测方法利用免疫-PCR方法。PCR^TM法一直到使用生物素化DNA孵育都类似于Cantor法，然而，使用释放抗体的低pH或高盐缓冲液洗去DNA/生物素/链霉亲和素/抗体复合物，而不是使用多轮的链霉亲和素和生物素化DNA孵育。然后使用所得到的洗涤液和适合的引物以及适当的对照进行PCR^TM反应。至少在理论上，可以利用PCR^TM的巨大的扩增能力和特异性来检测单一的抗原分子。

本实施方案的免疫检测方法在病症的诊断和预后中具有明显实用性，所述病症如各种形式的炎性疾病，如KD。在本文中，使用疑似含有KD生物标志物蛋白、多肽、肽和/或突变体的生物和/或临床样品。然而，这些实施方案还应用于非临床样品，如在抗原或抗体样品的滴定中，例如在炎症的细胞介质的鉴定中。

在患有KD的患者的临床诊断和/或监测中，生物标志物的检测，如与来自正常受试者的相应生物样品中的水平(即，参考水平)相比升高的PDGFC表达或活化表明患者患有KD。然而，如本领域技术人员已知的，这样的临床诊断不能必然地基于该方法独立地得出。本领域技术人员非常熟悉区分代表阳性鉴定结果的生物标志物的类型和/或量中的显著差异，和/或生物标志物的低水平和/或背景变化。事实上，背景表达水平通常用于形成“界限(cut-off)”，在该界限以上的升高的检测结果将评分为显著的和/或阳性的。同样地，可以基于两种、三种或多种生物标志物的存在和/或基于生物标志物的存在连同指示KD的一种或多种临床症状而作出诊断。

1.ELISA

如以上详细说明的，免疫分析，就其最简单和/或直接的含义而言，为结合分析。某些优选的免疫分析为本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附分析(ELISA)和/或放射免疫分析(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。

在一些实施方案中，将实施方案的抗生物标志物抗体固定到显示蛋白亲和力的选择的表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，将疑似含有生物标志物蛋白抗原的测试组合物(如临床样品)加到孔中。结合和/或洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，可以检测结合的生物标志物蛋白抗原。检测通常通过加入连接到可检测的标记的另一种抗生物标志物抗体来实现。该类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测还可以通过加入第二抗生物标志物抗体，接着加入对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中所述第三抗体连接到可检测的标记。

在一些实施方案中，将疑似含有生物标志物蛋白抗原的样品固定到孔表面上和/或随后与实施方案的抗生物标志物抗体接触。在结合和/或洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的抗生物标志物抗体。当初始抗生物标志物抗体连接到可检测的标记时，可以直接检测免疫复合物。此外，可以使用对第一抗生物标志物抗体具有结合亲和力的第二抗体来检测免疫复合物，其中所述第二抗体连接到可检测的标记。

在一些实施方案中，生物标志物蛋白、多肽和/或肽是固定化的。在一些实施方案中，ELISA涉及在检测中使用抗体竞争。在该ELISA中，将经标记的抗KD生物标志物蛋白的抗体加入孔中，使之结合和/或通过其标记进行检测。然后在与经包被的孔孵育之前和/或过程中，通过将样品与经标记的抗生物标志物的抗体混合来确定在未知样品中的野生型或突变型生物标志物蛋白抗原的量。样品中生物标志物蛋白的存在起到降低可用于结合于孔的抗野生型或突变型蛋白的抗体的量的作用，从而降低最终的信号。这对于检测未知样品中的抗生物标志物蛋白的抗体也是适合的，其中未经标记的抗体结合于抗原包被的孔，并且也降低可用于结合于经标记的抗体的抗原量。

不论所采用的形式如何，ELISA具有某些共同的特征，如包被、孵育和结合、洗涤去除非特异性结合的种类和检测结合的免疫复合物。这些在下文进行描述。

在使用抗原或抗体包被板时，将一般地使用抗原或抗体的溶液孵育板的孔过夜或规定的数小时时间。然后将洗涤板的孔以去除不完全地吸附的材料。随后使用非特异性蛋白“包被”任何剩余的可用的孔表面，所述非特异性蛋白对测试抗血清是抗原中性的。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。包被能够封闭固定化表面上的非特异性吸附位点，从而降低由抗血清非特异性结合于表面上导致的背景。

在一些实施方案中，使用次级或三级检测手段而不是直接程序。在一些这样的实施方案中，在蛋白或抗体结合于孔、使用非反应性物质包被以降低背景和洗涤以去除未结合物质之后，在能够形成免疫复合物(抗原/抗体)的有效条件下将固定化表面与待测试的生物样品接触。免疫复合物的检测随后需要经标记的次级结合配体或抗体，以及次级结合配体或抗体连同经标记的三级抗体或第三结合配体。

“在能够形成免疫复合物(抗原/抗体)的有效条件下”是指条件优选地包括使用溶液稀释抗原和/或抗体，所述溶液如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/吐温。这些加入的试剂还倾向于帮助降低非特异性背景。

“适合的”条件也是指孵育是在足以能够有效结合的温度下或孵育足以能够有效结合的一段时间。孵育步骤在优选地以约25℃至27℃的顺序的温度下通常为约1至2至4小时左右，或在约4℃左右下可以过夜。

在ELISA中的孵育步骤之后，洗涤经接触的表面以去除非复合的物质。优选的洗涤程序包括使用溶液如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液洗涤。当在测试样品和原始结合物质之间形成特异性免疫复合物和随后洗涤后，可以确定即使微量的免疫复合物的出现。

为了提供检测手段，第二或第三抗体可以具有相关的标记以能够进行检测。在一些实施方案中，这将是酶，所述酶在与适当的发色基质孵育时将生成彩色显影。因此，例如，在有利于进一步的免疫复合物形成的显影的条件下，需要将第一和第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育一段时间(例如，在室温下在含有PBS的溶液如PBS-吐温中孵育2小时)。在与经标记的抗体孵育以及随后洗涤去除未结合的物质后，例如通过与发色基质一起孵育对标记的量进行定量，所述发色基质如尿素，或溴甲酚紫，或2,2'-连氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，或在过氧化物酶作为酶标记的情况下为H₂O₂。随后例如使用可见光谱分光光度计通过测量生成的色度实现定量。

2.免疫组织化学

本实施方案的抗KD生物标志物抗体也可以与通过免疫组织化学(IHC)制备的用于研究的新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的石蜡包埋的组织块两者结合使用。由这些微粒标本制备组织块的方法已成功地用于先前的各种预后因素的IHC研究中，和/或对本领域技术人员而言是熟知的(Brown等人,1990；Abbondanzo等人,1990；Allred等人,1990)。

简言之，冷冻切片(例如，血管组织切片)可以通过以下步骤制备：室温下在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水化50ng冷冻的“粉状”组织；通过离心使颗粒成团；使其重悬于粘性包埋介质(OCT)中；颠倒胶囊和/或通过离心再次成团；在70℃的异戊烷中速冻；切割塑料胶囊和/或移出冷冻的组织圆柱体；将组织圆柱体固定在冷冻切片机的卡盘上；和/或切割25-50个连续切片。

永久切片可以通过类似的方法制备，所述方法涉及在塑料微量离心管中再水化50mg样品；成团；重悬于10％福尔马林中以固定4小时；洗涤/成团；重悬于温热的2.5％琼脂中；成团；在冰水中冷却以使琼脂变硬；从管中移出组织/琼脂块；将块浸润和/或包埋在石蜡中；和/或切割成多达50个连续的永久切片。

3.免疫电子显微术

本实施方案的抗体还可以与电子显微术联合使用以鉴定细胞内组织组分。简言之，将电子高密度标记直接或间接缀合于抗生物标志物抗体。根据实施方案的电子高密度标记的实例为铁蛋白和金。电子高密度标记吸收电子并且可以通过电子显微镜可视化。

4.免疫检测试剂盒

在一些方面，本实施方案涉及用于上述免疫检测方法的免疫检测试剂盒。由于抗KD生物标志物抗体一般地用于检测这样的生物标志物蛋白、多肽和/或肽，因此抗体将优选地包括在试剂盒中。然而，可以提供包括两种这样的组分的试剂盒。因此，免疫检测试剂盒将在适合的容器装置中包括结合于生物标志物蛋白、多肽和/或肽的第一抗体(例如，抗PDGFC抗体)，和/或任选地，免疫检测试剂和/或进一步任选地，经纯化的或重组的生物标志物蛋白、多肽和/或肽。

在一些实施方案中，将使用单克隆抗体。在某些实施方案中，结合于生物标志物蛋白、多肽和/或肽的第一抗体可以预结合于固体支持物，如柱状基质和/或微量滴定板的孔。

试剂盒的免疫检测试剂可以呈现多种形式中的任意一种，包括与给定抗体相关联和/或连接于给定抗体的那些可检测的标记。也考虑与次级结合配体相关联和/或连接于次级结合配体的可检测的标记。示例性的次级配体为对第一抗体具有结合亲和力的那些次级抗体。

另外的适合的用于本试剂盒的免疫检测试剂包括双组份试剂，其包括对第一抗体具有结合亲和力的次级抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体连接于可检测的标记。如上文所述，许多示例性的标记是本领域已知的，和/或所有这样的标记可以与本实施方案结合使用。

根据本实施方案的试剂盒可以进一步包括适当地等分的生物标志物蛋白、多肽和/或多肽的组合物，不管是经标记的和/或未经标记的，如可以用于制备检测分析的标准曲线。提供的试剂盒可以含有抗体-标记缀合物，其为完全缀合形式，为中间体形式和/或作为由试剂盒的使用者缀合的单独的部分。试剂盒的组分可以以水性介质和/或以冻干形式包装。

试剂盒的容器装置一般地包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器装置，抗体和/或优选地适当等分的抗体可以置于其中。本实施方案的试剂盒通常还将包括用于密闭地容纳抗体、抗原和/或任何其他试剂容器以用于商业出售的装置。这样的容器可以包括注塑和/或吹塑塑料容器，将希望的小瓶保存在其中。

IV.实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，遵循由发明人发现的代表技术的实施例中公开的技术在本发明的实施中起到良好作用，因此可以认为构成其实施的优选方式。然而，本领域技术人员根据本发明应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变，并仍然获得相似的或类似的结果。

实施例1—KD生物标志物的鉴定

样品收集和处理

本研究是由贝勒研究院的伦理审查委员会批准的。从所有患者和健康供体获得知情同意。将来自患者和健康对照的血液收集到Tempus^TM管(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)或PaxGene管(Qiagen,Valencia,CA)中，运送到贝勒免疫学研究院并储存于-20℃下。表1提供了用于KD血液样品的患者的概况。

表1：KD患者样品

川崎病	数量
		总的患者	98
IVIG之前和IVIG 24h后的患者	47
		IVIG之前和2周或4周后的患者	13
IVIG之前和1年后的患者	1
		仅IVIG之前的患者	15
IVIG 24h后的患者(无之前)	13
		IVIG 5周后的患者(无之前)	2
患有未知病症的患者	7

使用MagMax^TM总RNA提取试剂盒(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)从全血裂解物分离总RNA，并使用GLOBINclear^TM全血球蛋白减少试剂盒(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)去除球蛋白mRNA。Agilent 2100生物分析仪(Agilent,Palo Alto,CA)用于测量RNA完整性系数(RIN)。另外，使用TotalPrep^TM RNA扩增试剂盒(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)扩增并标记RIN>6的球蛋白减少的RNA。将cRNA杂交到人HT12微珠芯片阵列(San Diego,CA)并在BeadStation 500上扫描。使用软件(San Diego,CA)评估荧光杂交信号。

微阵列分析

在背景扣除和平均归一化后，使用11.5软件(Agilent,Santa Clara,CA)分析微阵列数据。在分析前，将未在任何一种样品中表达的探针滤出。在疾病组及其相应的健康对照组之间进行统计分析(Mann–Whitney U检验与Benjamini-Hochberg多重检验校正)和倍数变化分析。通过获得与每个数据集自身的健康对照相比在川崎病中具有显著性(P<0.05,Mann–Whitney U检验与Benjamini-Hochberg多重检验校正，倍数变化>1.5)，但在NOMID和SOJIA组中无显著性(P>0.5)的探针来进行显著性分析。使用IPA软件(Ingenuity System Redwood City,CA)来进行路径分析。对于模块分析，一组260个转录模块用作用于分析的预存在的框架。用于构建这样的框架的方法之前有报道(Chaussabel等人,2008)。简言之，通过T检验评估了在九个全血疾病数据集内或跨越九个全血疾病数据集具有协同表达的基因，其中在多轮clique和paraclique聚类分析中选择所述数据集以形成260个转录模块框架，并且在每个模块内通过T检验评估了显著性探针的百分比。在KD中具有差异调节的基因的信号通路的实例显示在图1-2中。

RT-PCR

使用高容量逆转录试剂盒(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)由总mRNA生成cDNA。使用基因表达分析在480(RocheApplied Science,Indianapolis,IN)上以10μl反应体积进行定量实时PCR。人PDGFC基因的分析ID为Hs00211916_m1、Hs01053574_m1和Hs01044216_m1(参见下表2)。将PDGFC基因的阈值循环(CT)值归一化到内源性控制基因磷酸甘油酸激酶1(PGK1；NCBI登记号NM_000291.3)和TATA盒结合蛋白(TBP；NCBI登记号NM_003194.4)的平均值。

表2：分析的PDGFC区域

结果

与健康的匹配对照相比，发现多于1700个转录物在来自KD患者的离体血液样品中差异表达。KD患者还显示相对于系统性红斑狼疮(SLE)与适应性免疫相关的转录物的下调和与炎症相关的转录物的充分上调。当使用显著性策略分析与患有类似于KD的其他病症的患者中的转录物表达比较时，KD特异性转录谱尤其明显。因此新生儿期发病的多系统炎性疾病(NOMID)和全身型幼年特发性关节炎(SoJIA)两者可以使用该分析方法通过差异转录物表达与KD区分，所述新生儿期发病的多系统炎性疾病(NOMID)和全身型幼年特发性关节炎(SoJIA)为IL-1介导的伴有炎症和全身组织损伤的疾病(描述于Allantaz等人,2007，引入本文作为参考)。

来自KD患者的血液样品显示来自以下基因的转录物的表达降低：LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2和TMCC1基因。另一方面，发现KD血液样品中来自EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816、OLFM4和PDGFC基因的转录物表达升高。特别地，微阵列和RT-PCR两者证明与健康儿童和患有其他炎性疾病的儿童相比，PDGFC mRNA水平在KD患者中显著升高。随后分析KD特异性转录物在涉及炎症(图1)和结缔组织形成(图2)的信号通路中的作用，以确定何种标志物在该疾病中具有主要作用。

这些分析还表明PDGFC为KD中的主要参与者，因此进行进一步研究。定量RT-PCR证明PDGFC转录物在KD患者中上调5至30倍(图3)。使用扩增PDGFC转录物的三个不同区域的引物对时，该升高的表达明显。重要地，升高的表达在扩增编码功能性PDGFC蛋白的转录物的引物对中是最明显的。编码功能性PDGFC蛋白的PDGFC转录物的表达与编码非功能性PDGFC蛋白的PDGFC转录物的表达的进一步比较表明KD患者优先地表达功能性PDGFC转录物(图4)。

使用定量RT-PCR评价在来自KD和其他发热性疾病的全血中的PDGFC转录物水平(Taqman分析Hs00211916_ml)(图5)。PDGFC的表达值在患有幼年型皮肌炎(JDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、鼻病毒、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌(Staph)和新生儿期发作的多系统炎性疾病(NOMID)的患者中未显著改变(图5)。发现在KD患者中的PDGFC的表达升高5至30倍(图5)。

微阵列分析表明在KD样品的两个独立的群组(n＝66和n＝19)中，PDGFC转录在KD患者中上调(图6)。

根据本发明，可以在不进行过度实验的情况下得出并实施本文公开和要求保护的所有方法。虽然就优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法或方法的步骤或方法的步骤的顺序作出变化。更具体地，明显的是，在化学上和生理上都相关的某些试剂可以被替代为本文描述的试剂，但将实现相同或相似的结果。认为对本领域技术人员而言明显的是所有这些相似的替代和修改在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。

参考文献

以下参考文献，在其提供补充本文所阐述的内容的示例性程序或其他细节的情况下，特意地引入本文作为参考。

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Claims

1.一种用于检测受试者中的川崎病(KD)的生物标志物的方法，其包括确定来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的生物样品中的血小板源性生长因子C(PDGFC)的表达水平，其中相对于参考水平，升高的PDGFC表达鉴定受试者具有KD的生物标志物。

2.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为血清样品。

3.权利要求1所述的方法，其中所述疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者显示以下症状中的一种或多种：口腔红斑；皮疹；嘴唇肿胀；嘴唇干裂；手肿胀；足肿胀；眼部发红；葡萄膜炎；无菌性脑膜炎；淋巴结炎症；血管炎症；冠状动脉瘤；发热；关节痛；关节肿胀；或甲床、手掌、足底和腹股沟区域皮肤剥落。

4.权利要求1所述的方法，其中所述疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者具有亚洲血统。

5.权利要求1所述的方法，其进一步包括获得来自受试者的生物样品。

6.权利要求1所述的方法，其中通过确定样品中的PDGFC RNA的表达来确定所述PDGFC的表达水平。

7.权利要求6所述的方法，其中确定PDGFC RNA的表达包括确定编码活性多肽的PDGFC RNA的表达。

8.权利要求6所述的方法，其中确定PDGFC RNA的表达包括核酸杂交或核酸测序。

9.权利要求6所述的方法，其中确定PDGFC RNA的表达包括RT-PCR。

10.权利要求6所述的方法，其中所述升高的PDGFC表达为参考水平的约3倍至约50倍的PDGFC RNA表达。

11.权利要求1所述的方法，其中所述参考水平代表来自未患有KD的受试者的PDGFC表达水平。

12.权利要求1所述的方法，其进一步包括确定样品中的至少第二基因的表达水平。

13.权利要求12所述的方法，其中所述第二基因为对照基因。

14.权利要求12所述的方法，其中所述第二基因选自LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816和OLFM4。

15.权利要求1所述的方法，其进一步包括报告样品中的PDGFC的表达。

16.权利要求15所述的方法，其中所述PDGFC的表达以书面报告形式报告。

17.权利要求1所述的方法，其进一步包括通过将样品中的PDGFC的表达水平与参考水平进行比较来确定受试者是否具有KD的生物标志物。

18.权利要求17所述的方法，其进一步包括报告受试者是否具有KD的生物标志物。

19.权利要求1所述的方法，其中所述受试者不具有升高水平的PDGFC表达。

20.一种用于治疗患有川崎病(KD)的受试者的方法，其包括：

(a)评价受试者中的血小板源性生长因子C(PDGFC)的表达；和

(b)如果受试者相对于参考水平显示升高的PDGFC表达，则给予受试者抗KD治疗。

21.权利要求20所述的方法，其中所述抗KD治疗包括给予IgG。

22.权利要求20所述的方法，其中所述抗KD治疗包括给予阿司匹林、皮质类固醇或抗TNFα治疗。

23.权利要求20所述的方法，其中在进行所述评价之前将抗KD治疗给予受试者。

24.权利要求20所述的方法，其中所述受试者显示以下症状中的一种或多种：口腔红斑；皮疹；嘴唇肿胀；嘴唇干裂；手肿胀；足肿胀；眼部发红；葡萄膜炎；无菌性脑膜炎；淋巴结炎症；血管炎症；冠状动脉瘤；发热；关节痛；关节肿胀；或甲床、手掌、足底和腹股沟区域皮肤剥落。

25.权利要求20所述的方法，其中所述PDGFC的表达为PDGFC RNA表达。

26.权利要求25所述的方法，其中所述PDGFC RNA表达为编码活性多肽的PDGFC RNA的表达。

27.权利要求20所述的方法，其中评价PDGFC的表达包括测量PDGFC的表达。

28.权利要求25所述的方法，其中所述升高的PDGFC表达为参考水平的约3倍至约50倍的PDGFC RNA表达。

29.权利要求20所述的方法，其中所述参考水平代表来自未患有KD的受试者的PDGFC的表达水平。

30.权利要求20所述的方法，其进一步包括评价受试者中的至少第二基因的表达水平。

31.权利要求30所述的方法，其中评价至少第二基因的表达包括测量至少第二基因的表达。

32.权利要求30所述的方法，其中所述第二基因为对照基因。

33.权利要求30所述的方法，其中所述第二基因选自LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816和OLFM4。

34.一种用于治疗患有川崎病(KD)的受试者的方法，其包括：

(a)给予受试者抗KD治疗；

(b)评价受试者中的血小板源性生长因子C(PDGFC)的表达；和

(c)如果受试者相对于参考水平显示升高的PDGFC表达，则给予受试者进一步的抗KD治疗。

35.一种用于治疗患有川崎病(KD)的受试者的方法，其包括给予经确定相对于参考水平具有升高的血小板源性生长因子C(PDGFC)表达的受试者抗KD治疗。

36.权利要求35所述的方法，其中所述抗KD治疗包括给予IgG。

37.权利要求35所述的方法，其中所述抗KD治疗包括给予阿司匹林、皮质类固醇或抗TNFα治疗。

38.权利要求35所述的方法，其中所述受试者显示以下症状中的一种或多种：口腔红斑；皮疹；嘴唇肿胀；嘴唇干裂；手肿胀；足肿胀；眼部发红；葡萄膜炎；无菌性脑膜炎；淋巴结炎症；血管炎症；冠状动脉瘤；发热；关节痛；关节肿胀；或甲床、手掌、足底和腹股沟区域皮肤剥落。

39.权利要求35所述的方法，其中所述升高的PDGFC表达水平为升高的PDGFC RNA的表达水平。

40.权利要求39所述的方法，其中所述升高的PDGFC RNA表达为编码活性多肽的PDGFC RNA的升高的表达。

41.权利要求39所述的方法，其中所述升高的PDGFC表达为参考水平的约3倍至约50倍的PDGFC RNA表达。

42.权利要求35所述的方法，其中所述参考水平代表来自未患有KD的受试者的PDGFC表达水平。

43.权利要求35所述的方法，其中所述受试者被确定为相对于参考水平具有升高的EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816或OLFM4表达。

44.权利要求35所述的方法，其中所述受试者被确定为相对于参考水平具有降低的LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2或TMCC1表达。

45.一种有形的计算机可读介质，其包括计算机可读代码，当计算机执行所述计算机可读代码时，使得计算机执行操作，所述操作包括：

a)接收对应于来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中的血小板源性生长因子C(PDGFC)的表达水平的信息；和

b)确定与参考水平相比的PDGFC的相对表达水平，其中相对于参考水平，升高的PDGFC表达表明存在KD的生物标志物。

46.权利要求45所述的方法，其进一步包括接受对应于来自健康受试者的样品中的PDGFC表达的参考水平的信息。

47.权利要求45所述的方法，其中将所述参考水平存储在所述有形的计算机可读介质中。

48.权利要求45所述的有形的计算机可读介质，其中接收信息包括从有形的数据存储装置接收对应于来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中的PDGFC表达水平的信息。

49.权利要求45所述的有形的计算机可读介质，其进一步包括计算机可读代码，当计算机执行所述计算机可读代码时，使得计算机执行一种或多种另外的操作，所述另外的操作包括：将对应于PDGFC的相对表达水平的信息发送到有形的数据存储装置。

50.权利要求45所述的有形的计算机可读介质，其中所述接收信息进一步包括接收对应于来自疑似患有KD或具有患上KD风险的受试者的样品中的LOC641518、C21orf57、UBB、FBXO7、LOC731777、BTF3、C13orf15、SFRS2B、HEMGN、HPS1、IFT52、FAM10A7、IFT52、LOC441714、IMMP2L、TMEM57、IFRD2、LOC646784、PYROXD1、MIR155HG、ZNF138、TCC39B、OR7E156P、FANCD2、XPOT、AZIN1、BLOC152、CDK2、MYL5、HRASLS2、TMCC1、EPSTI1、OASL、CEBPA、C9orf167、FHOD1、ALDH3B1、LRSAM1、SIGLEC7、SLC24A4、GAA、RRBP1、DAB2、HIST2H3C、LGALS9、GPR177、CMTM4、FBXO30、WSB2、PAPSS1、SERPINB2、ACTA2、LOC729417、ABCD1、GNB4、MITF、C1QC、CCDC24、PGM5、LOC729816或OLFM4之一的表达水平的信息。

51.权利要求45所述的有形的计算机可读介质，其中当所述计算机可读代码被计算机执行时，使得计算机进一步执行的操作包括：c)计算样品的诊断分数，其中所述诊断分数表明样品来自患有KD的受试者的概率。