CN104122355B - 一种通过检测斑马鱼组织肌酐含量评价化合物肾脏毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过检测斑马鱼组织肌酐含量评价化合物肾脏毒性的方法，以用于肾脏毒性研究。在利用斑马鱼胚胎模型进行化合物肾脏毒性作用的研究中，通过对胚胎组织中的肌酐成分进行提取，并利用液相色谱串联质谱方法测定其含量，作为评价胚胎肾脏功能的检测指标，从而建立一种快速、准确、特异性强的化合物肾脏毒性评价体系。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过检测斑马鱼组织肌酐含量评价化合物肾脏毒性的方法，属于毒理学检测领域。
背景技术
肾脏是机体的重要器官，能排出体内代谢产物及某些废物、毒物，调节机体水、电解质平衡，保证机体内环境的稳定。作为机体的主要排泄器官，肾脏极易受到体内各种代谢废物、毒物的影响，这些物质往往具有潜在的肾脏毒性。随着社会发展，金属、冶炼业、化工企业增多，加之医药及各种农药的滥用，环境污染日益加重，人群接触肾毒性物质的机会增加，中毒性肾病的发病率大幅增长。临床上肾毒物质导致的肾脏损伤，常表现为急性肾功能衰竭(acute renal failure,ARF)，约占急性肾衰的5～25％。急性肾衰起病凶险，死亡率高，患者多需要终身进行透析治疗甚至换肾，给患者及其家庭带来巨大的痛苦和沉重的经济负担。因此，确立快速、有效的评价体系或评价方法来检测化合物的肾脏毒性作用，对中毒性肾脏损害的早期预防具有显著意义。
目前已有的关于化合物肾脏毒性方面的研究多以大鼠、小鼠、家兔等哺乳动物为模型进行，肾脏功能的检测手段主要有血、尿生化指标测定，以及肾脏组织病理学观察，这些动物体格较大，饲养和实验成本高，所需周期长，很难实现化合物毒性的高通量检测。利用培养细胞系进行体外毒性分析是早期毒性评价的重要替代方法，可快速产生大量的初步结果，由于体外细胞脱离了肾脏所处的复杂的机体内环境，不能真实反映体内各器官相互作用下肾脏功能的变化，所获得的结果需要到活体动物模型上进一步验证，因此，评价模型的选择成为实现化合物毒性快速检测的瓶颈。
斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，属鲤科。其成鱼仅约3-4厘米长，产卵量大，胚胎透明而且体外发育，非常便于操作和观察。其胚胎发育周期短，许多研究在胚胎期即可进行。斑马鱼基因组序列与人类基因组高度相似，包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，使其作为一种理想的脊椎模式生物，在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域迅速得到广泛应用。
斑马鱼胚胎受精后14h(14hpf，14hours post-fertilization)肾脏开始发育，72hpf时肾脏发育完成。最早在48hpf可以观察到肾小球滤过现象。斑马鱼肾脏分为幼鱼期的前肾和成鱼期的中肾，前肾由一对肾单位组成，肾小球在背主动脉腹侧的胚胎正中线处融合，肾小管分居两侧。前肾的解剖结构比成鱼的中肾及哺乳动物的后肾简单，但在细胞组成及分子水平上与哺乳动物的肾脏相似，并已具备同样复杂的生物功能。斑马鱼发育第一周内，由于鳃还未发育完全，主要依赖肾脏排出体内多余的水分和代谢废物，加之此阶段仔鱼不必喂食即可存活，干扰因素少，非常有利于开展肾脏毒性相关的研究。斑马鱼胚胎作为整体动物模型，能够真实反映肾脏在心血管系统、免疫细胞等内环境作用下的病理变化，具备了活体动物实验结果可靠性高的优点。
目前，在利用斑马鱼胚胎进行化合物肾脏毒性研究中，对肾脏损伤的检测主要包括表型改变、肾脏病理和肾小球滤过率估测等几方面。其中，肾小球滤过率是直接反映肾脏功能状态的重要量化指标，在斑马鱼胚胎是通过计算体内菊粉等类似物质的清除速率测得，需要将显色标记的菊粉经胚胎心静脉窦注入循环血液内，由于胚胎较小，此方法对仪器和技术要求比较高，操作难度大。疾病导致机体病理生理发生变化，必然引起组织中代谢组分含量的变化，对这些组分，尤其是一些与器官功能状态密切相关的生物标志物含量的检测，是诊断疾病发生、发展的重要依据。肌酐是肌肉的代谢产物，由前体化合物磷酸肌酸转化而成，主要由肾脏排出体外。肾功能受损时，肌酐在体内蓄积成为有害毒素。在临床上，检测血、尿肌酐值是了解肾脏功能的重要指标。斑马鱼胚胎体积小，难以获取血液或尿液样本，目前，有关斑马鱼胚胎体内肌酐含量的数据资料及肾功能受损后肌酐水平变化方面的研究尚属空白。鉴于肌酐在肾功检测中的重要意义，在利用斑马鱼胚胎进行化合物肾脏毒性研究时，有必要通过一种准确、可靠的方法对此指标进行考察，以进一步补充完善肾脏功能评价体系。
本发明利用液相色谱串联质谱的方法，对斑马鱼胚胎组织中的肌酐含量进行测定，并与正常斑马鱼胚胎组织的肌酐含量值比较，用于快速、可靠的检测化合物的肾脏毒性作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种通过检测斑马鱼组织肌酐含量评价化合物肾脏毒性的方法。
本发明的目的是提供一种以组织中肌酐含量为指标的肾脏毒性评价方法，以用于肾脏毒性研究，在利用斑马鱼胚胎模型进行化合物肾毒性作用的研究中，通过对胚胎组织中的肌酐成分进行提取，并利用液相色谱串联质谱方法测定其含量，可以以胚胎组织中的肌酐含量变化作为检测肾脏功能的指标，建立一种快速、准确、特异性强的化合物肾脏毒性的评价体系。
本发明技术方案如下：
一种通过测定组织中肌酐的含量变化检测化合物肾脏毒性的方法，步骤如下：
(1)将发育3～6天的斑马鱼胚胎移入含有待测化合物的培养水中，在28℃，14h光照/10h黑暗条件下培养24～72h，作为测试组，然后去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液后，获得培育后胚胎，所述培育后胚胎距受精时间不超过7天；
发明人通过研究发现，受精时间超过7天后的胚胎，由于受到多种干扰因素影响，会导致检测准确率降低。
在相同条件下用培养水培养作为正常胚胎组；
(2)向培育后胚胎加入内标溶液，经匀浆、分层提取其中的极性组分，提取样品经氮吹干后，加入纯水溶解，然后过0.45μm聚醚砜水相滤膜，将滤液注入LC-MS/MS，进行分离分析；然后分别将肌酐标准品溶液及内标标准品溶液注入LC-MS/MS，在相同条件下进行检测；
(3)根据如下公式：
C待测样品＝C标准品×AA待测样品/AA标准品
式中：C为提取样品浓度，AA为色谱峰面积；
计算待测样品中的肌酐及内标含量，再根据内标提取率计算各组胚胎样品中的肌酐含量；
(4)胚胎组织中肌酐含量以均值±标准差表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性，当测试组胚胎组织中肌酐含量高于正常胚胎组胚胎组织中的肌酐含量(P<0.05)，并超过相应发育龄胚胎组织肌酐含量的正常界值范围，说明胚胎肾脏功能受到损害，受试化合物具有肾脏毒性；
研究中随机选取不同的健康斑马鱼雌雄亲鱼，配对产卵，收集得到不同发育阶段的斑马鱼胚胎各20组，每组50个胚胎，按上述方法中步骤(2)(3)(4)，提取检测组织中的肌酐含量，结果如下：
表1 不同发育阶段胚胎组织中的肌酐含量(ng/50个胚胎)
单样本K-S检验分析显示上述各组数据均服从正态分布，确定不同发育龄胚胎组织中肌酐含量的正常界值范围(95％)为：
受精后4d斑马鱼组织中的肌酐水平为30.91～49.09ng/50个胚胎；受精后5d斑马鱼组织中的肌酐水平为36.56～56.32ng/50个胚胎；受精后6d斑马鱼组织中的肌酐水平为58.38～82.06ng/50个胚胎；受精后7d斑马鱼组织中的肌酐水平为84.47～124.81ng/50个胚胎。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所用的斑马鱼胚胎为野生型或AB系斑马鱼胚胎。
根据本发明进一步优选的，上述胚胎为受精3天以上，肾脏已完成发育的野生型或AB系斑马鱼胚胎。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，含有待测化合物的培养水为在培养水中加入待测化合物或待测化合物与助溶剂的混合。
上述助溶剂的目的是促进待测化合物的溶解，助溶剂在所用的浓度范围内应不对胚胎产生肾脏毒性作用。
上述待测化合物的浓度根据不同的待测化合物产生的毒性不同而不相同，本领域技术人员可以根据实验情况自行调整选择。
根据本发明进一步优选的，上述培养水组分为：
NaCl5mmol/L，KCl0.17mmol/L，CaCl20.4mmol/L，MgSO40.16mmol/L，去离子水配制。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，培养期间每24h更换3/4体积的含有待测化合物的培养水。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，胚胎样品中加入的内标物质为西咪替丁标准品溶液。西咪替丁结构式如下：
所述胚胎组织中的肌酐含量为每一定数目的胚胎组织中所含的肌酐的质量。肌酐结构式如下：
有益效果
1、本发明对斑马鱼胚胎组织中的肌酐进行提取和测定，以肌酐含量的变化作为检测胚胎肾脏功能状态的指标，与已有的斑马鱼胚胎肾脏功能检测方相比，不仅实现了肾脏功能的量化评价，而且更具有代表性和普遍性。
2、本发明采用液相色谱串联质谱法测定样品中的肌酐，充分利用色谱柱高效分离效能，加之色谱条件的优化，避免了组织样品中的干扰成分导致的测定偏差，提高了测定结果的准确性和可靠性；同时以西咪替丁标准品为内标分析物，有效降低了实验操作引起的误差。
3、本发明中所用的模式生物斑马鱼胚胎，既具有体外细胞株可快速筛选的优点，又具有活体动物体内验证的优势，利用斑马鱼胚胎进行大规模化合物的肾脏毒性评价，有助于提高实验效率和降低实验成本。
4、本发明严格限制培育后胚胎距受精时间不超过7天，从而可以提高检测结果的准确性。
附图说明
图1是斑马鱼胚胎(5dpf)的照片；
其中：图1A是对照组斑马鱼胚胎(5dpf)照片；
图1A’是对照组斑马鱼胚胎(5dpf)组织切片(横断面，HE染色)照片；
图1B是斑马鱼胚胎(4dpf)经马兜铃酸A(4μg/mL)处理24h后的照片；
图1B’是斑马鱼胚胎(4dpf)经马兜铃酸A(4μg/mL)处理24h后的组织切片(横断面，HE染色)照片；
图中：gl、肾小球；箭头、眼周水肿；*:肾小球囊性扩张。
图2是不同浓度马兜铃酸A处理组斑马鱼胚胎组织的肌酐含量柱状图；
*:与对照组比，P<0.05，**:与对照组比，P<0.01。
图3是斑马鱼胚胎肾脏组织切片(HE染色)照片；
其中：图3A是对照组胚胎(5dpf)肾脏组织切片(HE染色)照片；
图3B是25μmol/L橘霉素作用48h后斑马鱼胚胎(6dpf)肾脏组织切片(HE染色)
照片；
图中：gl:肾小球，pt:前肾管。*:囊性扩张；
图4是25μmol/L橘霉素处理48h后斑马鱼胚胎(6dpf)组织的肌酐含量柱状图；
图中：**:与对照组比，P<0.01。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实验动物：所用野生型或AB系健康斑马鱼，为本领域普通市售产品，在28℃，14h光照/10h黑暗条件下养殖，每日于9：30(am)和4:30(pm)喂食两次丰年虫。排卵前日将成鱼按雌雄比2:1放于产卵缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，用新培养水冲洗3遍后，置于28℃培养箱内，保持14h光照/10h黑暗周期培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。
试剂配制：肌酐标准品和西咪替丁标准品均购自中国药品生物制品检定所，肌酐用纯水溶解配制成10μg/mL标准品溶液，西咪替丁用纯水溶解配制成4μg/mL标准品溶液。
培养水组分如下：
NaCl5mmol/L，KCl0.17mmol/L，CaCl20.4mmol/L，MgSO40.16mmol/L，去离子水配制。
实施例1：不同浓度马兜铃酸A对斑马鱼胚胎(4dpf)的肾脏毒性作用
试剂：马兜铃酸A标准品购自中国食品药品检定研究院，用二甲基亚砜溶解配制5mg/mL储存液，4℃保存，最长保存时间为1个月，实验时用培养水稀释至所需浓度。
选用标准规格24孔细胞培养板，每孔内加入适量马兜铃酸A储存液，用培养水稀释至2mL，得到0.5μg/mL，2μg/mL，4μg/mL三个浓度组。对照组为含0.5‰DMSO的培养水溶液，体积为2mL。用吸管将所有样孔内溶液小心吹打混匀，随机吸取发育4天大小的斑马鱼胚胎，移入上述样孔内，每孔15个胚胎，每组4个孔，所有组均设三个平行重复。加盖封闭后，放入28℃培养箱内，14h光照/10h黑暗下孵育24h。
收集处理后各组胚胎，去掉死亡胚胎，并使各组间胚胎数相同。将胚胎用纯水冲洗3遍后，移入1.5mL Eppendorf管内，尽量吸净水分，加入400μL预冷甲醇、124μL预冷纯水、1μL西咪替丁内标溶液，匀浆2min，然后向每管内加入400μL氯仿，涡旋振荡60S，静置分层，然后4℃，10000×g条件下离心5min，小心吸取上层液体移至新1.5mL Eppendorf管，氮吹干，吹干样品放于-70℃保存。
采用SHIMADZU VP-ODS柱(250mm×4.6mm，3μm)，分析时间12min，进样量5μL。洗脱条件：流动相A(甲醇)和流动相B(纯水)依不同比例进行梯度洗脱(见表2)，流动相流速：1.0mL/min。
质谱条件：电喷雾离子源极性:喷雾电压：3000V；气化温度：350℃；鞘气压：60arb；辅助气压：30arb；离子传输管温度：300℃；碰撞气体(Ar)1.5mTorr；扫描模式SRM。
表2 利用LC-MS/MS检测斑马鱼胚胎组织内肌酐所用流动相体系
取氮吹干样品加入1mL纯水充分溶解，过0.45μm聚醚砜水相滤膜，取5μL滤液注入LC-MS/MS按上述条件进行分离分析。
分别将肌酐标准品溶液及内标标准品溶液进行稀释(肌酐标准品稀释至浓度100ng/mL，内标标准品稀释至浓度15ng/mL)，各取5μL注入LC-MS/MS，在相同的色谱条件下进行测定，利用外标法计算待测样品中的肌酐及内标含量，并根据内标提取率计算样品中的肌酐含量；计算公式：
C待测样品＝C标准品×AA待测样品/AA标准品
C:提取样品浓度，AA：色谱峰面积。
结果显示，4dpf斑马鱼胚胎经马兜铃酸染毒处理24h后，肌酐含量显著升高，0.5μg/mL，2μg/mL，4μg/mL马兜铃酸A处理后胚胎肌酐含量值分别为55.79±5.4，72.91±8.1，71.60±8.3ng/50个胚胎，高于对照组(44.7±7.6ng/50个胚胎)(表3)，并有显著性差异(P<0.05)(如图2所示)。
胚胎肌酐值的升高说明马兜铃酸A处理后引起斑马鱼胚胎肾脏功能的损伤，肾小球滤过功能下降，导致肌酐在体内累积。镜下观察，马兜铃酸A处理组胚胎出现典型眼水肿表现(如图1所示)，说明肾脏功能受到损害引起组织水肿。将胚胎经固定、石蜡包埋，做病理切片观察，发现马兜铃酸A处理组胚胎肾脏肾小球出现结构疏松、细胞排列紊乱及囊性改变(如图1所示)，表明肾脏组织结构受到损害。
表3 LC-MS/MS检测不同浓度马兜铃酸A处理组斑马鱼胚胎中的肌酐含量
N:每组平行样数；AA:色谱峰面积；*：与对照组比，P<0.05，**：与对照组比，P<0.01。
在临床上，服用含马兜铃酸A成分的中药材会严重损害人体肾脏功能，研究中也发现马兜铃酸A对斑马鱼肾脏具有发育毒性(Yu-Ju Ding,Yau-Hung Chen.Toxicology andApplied Pharmacology261(2012)：59–65.)，在本方法中，经马兜铃酸A处理后胚胎组织中的肌酐含量值升高，并超过相应正常界值范围，结合肾脏组织切片表现，表明马兜铃酸A具有肾脏毒性作用，同时也证明本方法的检测结果是准确的。
实施例2：橘霉素对斑马鱼胚胎(4dpf)肾脏的毒性作用
试剂：橘霉素标准品购自中国药品生物制品检定所，用含25％(V/V)乙醇的培养水溶液解配制10mM储液，4℃保存，实验时用培养水稀释至所需浓度。
选用标准规格6孔细胞培养板，每孔内加入适量橘霉素储液，用培养水稀释至25μmol/L浓度水平，每孔终体积为6mL。对照组为含等浓度乙醇的培养水溶液，体积为6mL。用吸管将所有样孔内溶液小心吹打混匀，随机吸取发育4天大小的斑马鱼胚胎，移入上述样孔内，每孔60个胚胎，每组设三个平行复孔。加盖封闭后，放入28℃培养箱内，14h光照/10h黑暗下继续孵育48h，中间更换一次溶液。
收集处理后各组胚胎，去掉死亡胚胎，并使各组间胚胎数相同。将胚胎用纯水冲洗5遍后，移入1.5mL Eppendorf管内，尽量吸净水分，加入400μL预冷甲醇、124μL预冷纯水、1μL西咪替丁内标溶液，匀浆2min，然后向每管内加入400μL氯仿，涡旋振荡60S，静置分层，然后4℃，10000×g条件下离心5min，小心吸取上层液体移至新1.5mL Eppendorf管，氮吹干，吹干样品放于-70℃保存。
采用SHIMADZU VP-ODS柱(250mm×4.6mm，3μm)，分析时间12min，进样量5μL。洗脱条件：流动相A(甲醇)和流动相B(纯水)依不同比例进行梯度洗脱，条件如表2所示，流动相流速：1.0mL/min。质谱条件：电喷雾离子源极性:喷雾电压：3000V；气化温度：350℃；鞘气压：60arb；辅助气压：30arb；离子传输管温度：300℃；碰撞气体(Ar)1.5mTorr；扫描模式SRM。
取氮吹干样品加入1mL纯水充分溶解，过0.45μm聚醚砜水相滤膜，取5μL滤液注入LC-MS/MS按上述条件进行分离分析。
分别将肌酐标准品溶液及内标标准品溶液进行稀释(肌酐标准品稀释至浓度：100ng/mL，内标标准品稀释至浓度：15ng/mL)，各取5μL注入LC-MS/MS，在相同的色谱条件下进行测定，利用外标法计算待测样品中的肌酐及内标含量，并根据内标提取率计算样品中的肌酐含量；计算公式：
C待测样品＝C标准品×AA待测样品/AA标准品
C:提取样品浓度，AA：色谱峰面积
结果显示，4dpf斑马鱼胚胎经各浓度组橘霉素处理48h后，镜下观察胚胎未出现明显形态异常。收集正常组及处理组胚胎，匀浆提取，将提取样品引入LC-MS/MS，测得25μmol/L橘霉素处理组胚胎的肌酐含量为88.0±4.6ng/50个胚胎，高于正常对照组69.2±6.5ng/50个胚胎(P<0.01)(表4)(如图4所示)，并超过6d斑马鱼胚胎组织的肌酐正常界值范围。
对正常组和处理组胚胎做病理切片及HE染色，显示25μmol/L橘霉素处理组胚胎肾脏出现肾小球囊性变、前肾管上皮细胞结构松散、排列紊乱等表现(如图3所示)，说明胚胎肾脏的结构与功能受到破坏，橘霉素对斑马鱼胚胎具有明显的肾毒性作用。
表4 LC-MS/MS检测橘霉素处理后斑马鱼胚胎中的肌酐含量
N:每组平行样数；AA:色谱峰面积；**：与对照组比，P<0.01。
在Wu等人(Ting-Shuan Wu,Jiann-Jou Yang,Feng-Yih Yu et al.Food andChemical Toxicology50(2012)4398–4404。)的研究中，24hpf斑马鱼胚胎经橘霉素处理后，肾脏功能受到严重损害，并出现前肾及前肾管组织结构的改变，这与本方法的检测结果一致，也证明通过本方法能准确检测化合物的肾脏毒性。
Claims (4)
1.一种通过测定斑马鱼胚胎组织中肌酐的含量变化检测化合物肾脏毒性的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将发育3～6天的斑马鱼胚胎移入含有待测化合物的培养水中，在28℃，14 h光照/10 h黑暗条件下培养24～72h，作为测试组，去除死亡胚胎，经纯水洗净胚胎表面残留液后，获得培育后胚胎，所述培育后胚胎距受精时间不超过7天；
在相同条件下用培养水培养作为正常胚胎组；
所述含有待测化合物的培养水为在培养水中加入待测化合物或待测化合物与助溶剂的混合；
上述培养水组分为：
NaCl 5mmol/L，KCl 0.17mmol/L，CaCl2 0.4mmol/L，MgSO4 0.16mmol/L，去离子水配制；
（2）向培育后胚胎加入内标溶液，经匀浆、分层提取其中的极性组分，提取样品经氮吹干后，加入纯水溶解，然后过0.45 μm聚醚砜水相滤膜，将滤液注入LC-MS/MS，进行分离分析；然后分别将肌酐标准品溶液及内标标准品溶液注入LC-MS/MS，在相同条件下进行检测；
胚胎样品中加入的内标物质为西咪替丁标准品溶液；
（3）根据如下公式：
C待测样品= C标准品×AA待测样品/AA标准品
式中：C为提取样品浓度，AA为色谱峰面积；
计算待测样品中的肌酐及内标含量，再根据内标提取率计算各组胚胎样品中的肌酐含量；
（4）胚胎组织中肌酐含量以均值±标准差表示，采用独立样本t 检验法分析比较组间差异的显著性，在P<0.05显著性的水平下，当测试组胚胎组织中肌酐含量高于正常胚胎组胚胎组织中的肌酐含量，并超过相应发育龄胚胎组织肌酐含量的正常界值范围，说明胚胎肾脏功能受到损害，受试化合物具有肾脏毒性；
上述各发育龄胚胎组织中肌酐含量的正常界值范围为：
受精后4d斑马鱼组织中的肌酐水平为30.91～49.09 ng /50个胚胎；受精后5d斑马鱼组织中的肌酐水平为36.56～56.32 ng/50个胚胎；受精后6 d斑马鱼组织中的肌酐水平为58.38～82.06 ng/50个胚胎；受精后7d斑马鱼组织中的肌酐水平为84.47～124.81ng/50个胚胎。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所用的斑马鱼胚胎为野生型或AB系斑马鱼胚胎。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，上述斑马鱼胚胎为受精3天以上，肾脏已完成发育的野生型或AB系斑马鱼胚胎。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，培养期间每24h更换3/4体积的含有待测化合物的培养水。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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