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CN104126122B - 与胰岛素受体族反应抗体结合性能调节剂之识别 - Google Patents

与胰岛素受体族反应抗体结合性能调节剂之识别 Download PDF

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CN104126122B CN201380010208.5A CN201380010208A CN104126122B CN 104126122 B CN104126122 B CN 104126122B CN 201380010208 A CN201380010208 A CN 201380010208A CN 104126122 B CN104126122 B CN 104126122B
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Abstract

本发明涉及一种方法和试剂盒，用以识别与胰岛素受体(IR)，类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)，类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)，类胰岛素‑IGF‑1混合受体(IIHR)，和胰岛素受体相关受体(IRRR)等受体族成员反应抗体的结合性能调节剂，以及抗体检测方法。

Description

与胰岛素受体族反应抗体结合性能调节剂之识别
简述：
本发明涉及一种方法和试剂盒，用以与一种或多种胰岛素族受体反应的抗体结合性能调节剂的识别，以及抗体检测方法。
发明背景：
胰岛素受体家族(IRF)主要含四种与胰岛素和/或IGF-1以不同的亲和力结合的受体：胰岛素受体(IR)，IGF1受体(IGF1R)和IGF2受体(IGF2R)，和胰岛素-IGF1混合受体(IIHR)。另一个孤立成员是胰岛素受体相关受体(IRRR)。
上述受体中，IR，IGF1R，IIHR和IRRR属于配体活化的酪氨酸激酶受体，而IGF2R是具有大的细胞外结构域的跨膜单体，没有内信源能力。
IR和IGF1R在细胞表面表达为两个相同单体组成的同源二聚体，或者为包含两个不同受体单体的异二聚体(例如，胰岛素-IGF1混合受体(IIHR))。IIHR广泛分布在各种哺乳动物组织内。他们对于配体诱导的酪氨酸磷酸化的信号的行为与IGF1R类似。
IGF1R和IR受体都含有两个α和两个β糖基化亚基，其中两个跨膜α-β链一起形成二硫键链异四聚体(β-α-α-β)。该受体有一个胞外配体结合域，一个跨膜结构域和表现出酪氨酸激酶活性的胞质结构域。胞外结构域包含整个α亚基和β亚基的N末端的一部分，而胞内部分的β亚基含有酪氨酸激酶(TK)结构域。虽然在结构上相似，IGF1R和IR服务于不同的生理功能。IR主要参与代谢功能，而IGF1R调节生长和分化。但是，与受体结合时，它们的配体胰岛素和IGF-1可诱导有丝分裂和代谢两种作用方式。
由于IRF族成员的结构特点，胰岛素配体不仅结合IR，还能结合IGF1R和IIHR；IGF-1配体不仅结合IGF1R，还能结合IR，IIHR和IGF2R；IGF-2配体不仅结合IGF2R，还能结合IR，IIHR和IGF1R。
已知自身抗体在自体免疫紊乱的产生中起重要作用，例如，受试者存在对IR的自身抗体则表明糖尿病发病(B型胰岛素抵抗)。
针对IGF1R的非内源性抗体目前正在开发中，以提供新颖的癌症治疗方法。例如，针对IGF1R的治疗性单克隆抗体，辉瑞公司的候选药物figitumumab，和默克公司的dalatozumab，目前正在研究其对不同类型癌症的治疗作用。又例如，专利申请WO2002/053596A，WO2004/083248A，WO2005/016967A，WO2005/016970A，US 2005/0249730，US2005/0084906，WO2005/052005A，WO2005/058967A，WO2005/094376A，WO2006/008639A，WO2006/013472A和WO2008/077546等---均涉及IGF1R抗体治疗癌症的手段。
与IRF族受体成员结合的自身抗体的产生机制和作用尚未完全清楚，需要进一步调查才能成功用于诊断，预防和治疗自身免疫性疾病(例如，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，弥漫性毒性甲状腺肿)，肥胖症，神经性疾病，生长障碍，癌症的生成和发展(包括乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，肺癌)，和其它细胞增殖性疾病及其他疾病或功能障碍。例如，已经报道了包括I型和II型糖尿病，老年痴呆，和癌症等疾病中的IR信源功能失调现象。
更专门的、更灵敏的检测方法可以帮助深入了解这些复杂的机理，并成为这方面诊断和研究的有价值的工具，例如，允许判别健康个体和逐渐功能障碍者不同的生理状态。特别是，对IRF族自身抗体的血清测定标记对早期诊断或鉴别，对预防和/或治疗任何上述的自身免疫性疾病大有益处。
本发明的改进是可以识别与IRF族成员，和影响或触发受体活性的抗体反应的调节剂(即激活剂，抑制剂，或称影响或触发分子)，因此适合作为药学有效化合物用于诊断、预防和/或治疗与IRF族成员有关的疾病。
W.Minich等已经演示了稳定转染HEK293细胞，重组人体IGF1R-萤光素酶融合蛋白的表达(《甲亢病人发光免疫沉淀分析检测对类胰岛素生长因子-1的自身抗体》。ITC会议墙报发表，2010年巴黎)，表明如何用免疫沉淀分析(IPA)对甲亢患者的血清样本进行IGF1R自身抗体的定量分析。
Verch等(Bioanalysis，2011年9月，3(18)：2107-211)报告了两种ELISA测定对治疗性IGF1R抗体的量化分析的进展，以研究其药物动力学特性。这两个实验基于经典的标记抗人IgG抗体ELISA法，或者将标记的抗人IgGFc抗体作为检测试剂。
人抗胰岛素受体抗体检测所用ELISA试剂盒是USCN生命科学公司(中国，武汉)提供。该试剂盒是基于夹心酶免疫测定的原则，其中，微量滴定板已经预先涂敷抗原。孵育后的样品，加入生物素结合的抗原，HRP-偶联的抗生物素蛋白被用作检测试剂。
已知使用标记的抗IgG抗体或抗IgGFc抗体作为检测试剂，可能形成非特异性地与抗原结合的抗体复合物，从而导致假阳性信号。还有，生物素-抗生物素蛋白扩增技术导致差的信噪比。因此，测定技术和性能还需要改善，在高通量筛选(HTS)测定中，样品大小往往是关键因素；由于有限的可用性和成本的要求，样品量和检测试剂消耗均需要进一步减少。此外，流行病学分析或HTS分析均需要少反应步骤，低动手时间的分析处理等技术。
本发明通过改善的检测手段，采用试剂盒分析和筛选与IRF选定的抗原分子反应的抗体，克服了上述问题。特别是通过新的免疫测定方法和试剂盒，本发明意外地提高了前述抗体测定技术的特异性和灵敏度。本发明使用的方法更接近生理条件，因此允许抗原分子显露正常的三维结构。结果，本发明方法不仅有利于科研和临床实验室实现自动检测程序，而且比现有测定技术更灵敏更特异。
令人惊讶的是，根据本发明的方法发现了自身抗体阳性样品与IRF族不同成员的交叉反应。由于灵敏度和特异性令人惊喜的改善，新的测定形式允许更差异化地调查和发展新的治疗和诊断工具，处理与IRF族成员有关的失调和疾病。此外，还可以根据本发明方法处理任何一种适当的二价抗体，无论抗体源自何处。
发明内容
因此，本发明的一实施例提供了一种方法，鉴定分析一种或多种与抗原分子反应的分析抗体结合性质的调节剂，所述方法包括：(a)提供一个或多个分析抗体与一个或多个第一抗原分子，和一个或多个第二抗原分子反应；(b)提供一个或多个第一抗原分子，所述分析抗体可与之反应；第一抗原分子从胰岛素受体家族(IRF)选择；以及(c)提供一个或多个第二抗原分子，所述分析抗体可与之反应；其中第二抗原分子从胰岛素受体家族(IRF)选择；和(d)待查样品同时或依次与步骤(a)中所述分析抗体,与步骤(b)中第一抗原分子,和与步骤(c)中第二抗原分子接触，存在于所述样品中调节剂可以与所述分析抗体相互作用，和/或与所述抗原分子干扰形成[第一抗原分子]-[分析抗体]-[第二抗原分子]的复合物；和(e1)分别在步骤(d)之前，或同时，或以后，分别对步骤(d)存在于所形成的复合物中第一抗原分子提供固化手段；由是可分别在步骤(d)之前，或同时，或以后，使步骤(d)存在于所形成的复合物中第一抗原分子固定在固态支持物上；和/或(e2)分别在步骤(d)之前，或同时，或以后，提供对所述复合物中第一抗原分子实施第二标记手段。由是分别在步骤(d)之前，或同时，或以后对所述复合物中第一抗原分子实施第二标记手段；和(f)分别在步骤(d)之前，或同时，或以后对所述复合物中第二抗原分子实施第一标记手段；和(g)在步骤(d)之前，或同时，或以后提供一个或多个能够与步骤(d)形成的复合物相互作用和/或能够干涉的调节剂，所述一个或多个调节剂可与所述样品，所述一个或多个第一抗原的分子，和/或所述一个或多个第二抗原分子同时或依次接触，或所述一个或多个调节剂可同时或依次接触在步骤(d)中或其后形成的复合物；和(h)探测在步骤(d)中或其后形成的复合物。
本发明另一实施例，提供一种方法检测样品中与一个或多个抗原分子作用的分析抗体的存在和/或其与一个或多个抗原分子作用的结合特性，所述方法包括：(a)提供一个或多个第一抗原分子，所述样品中分析抗体可与其相互作用，其中第一抗原分子从胰岛素受体家族(IRF)中选择；及(b)提供一个或多个第二抗原分子，所述样品中分析抗体可与其相互作用，其中第二抗原分子从胰岛素受体家族(IRF)中选择；和(c)待查样品可与步骤(a)中第一个抗原分子和步骤(b)中第二抗原分子同时或依次接触，由是存在于样品中的所述分析抗体可以与所述抗原分子相互作用，从而形成包括[第一抗原分子]-[分析抗体]-[第二抗原分子]的复合物；和(d1)分别对步骤(c)存在于所形成的复合物中第一抗原分子提供固化手段；由是可分别在步骤(c)之前，或同时，或以后，使步骤(c)存在于所形成的复合物中第一抗原分子固定在固态支持物上；和/或(d2)分别在步骤(c)之前，或同时，或以后对所述复合物中第一抗原分子提供第二标记手段。由是分别在步骤(c)之前，或同时，或以后对所述复合物中第一抗原分子实施第二标记手段；和(e)分别在步骤(c)之前，或同时，或以后提供对所述复合物中第二抗原分子实施第一标记手段；和(g)检测样品中在步骤(c)中或其后复合物的形成，从而确认样品中分析抗体的存在。
此外，本发明所述的方法可用于识别与一个或多个抗原分子作用的分析抗体结合特性的调节剂，具有一般知识的本行熟手，可以应用本发明筛选药物活性化合物。
本发明的方法，优选地，是体外方法。此外，它们可以包括除了上述那些明确提及以外的一些步骤，包括样品预处理和本发明方法结果的评价(例如，关于形成的复合物的存在)。本发明的方法可以手动实施，和/或自动化进行。优选地，(a)和(b)，(c)和(d)中，(d1)，(d2)，(e)，(e1)，(e2)，(f)的一个或多个步骤，和/或(g)的一个或多个步骤可全部或部分自动化，包括使用适当的机器人和传感设备检测，和/或步骤(g)的计算机处理/分析。对于本行熟手不言而喻，本发明方法需要对检测信号校准或标准化，例如将复合物信号与(一个或多个)已知复合物信号对比。
在本发明其它实施例中，所述第一抗原分子和第二个抗原分子可以是相同的，或者不相同的(即，不同)。在本发明的其它实施例中的所述第一抗原分子和所述第二抗原分子不相同，且属于IRF族中不同成员。在本发明其它实施例中，所述第一抗原的分子和/或所述第二抗原分子被包埋在膜环境。在其它实施例中，本发明的方法对IRF族抗体的检出率约3毫微克/毫升的，优选为约1毫微克/毫升，更优选的约0.3毫微克/毫升，甚至更优选的为约0.1毫微克/毫升，最优选大约0.03毫微克/毫升。
在本发明其它实施例中，一个或多个第一抗原分子分别在步骤(c)鉴定自身抗体之前和在步骤(d)鉴定调节剂之前被固化到固体支持物。
一个或多个第一抗原分子可在接触待查样品前固定到固体支持物。任选地，所述固体支持物可由液相(例如，分散液，悬浮液，和胶体)提供。如此固定的一个或多个第一抗原分子随后可同时或相继与所述样品接触，或依次与所述样品和一个或多个第二抗原分子接触。固定的一个或多个第一抗原分子与所述样品接触时，可以形成中间物包括[第一抗原分子]-[分析抗体]，其中一个或多个第一抗原分子固定于固体支持物，形成一个固定的中间体复合物；继续接触一个或多个存在于溶液中的第二抗原分子，将形成包括[第一抗原分子]-[分析抗体]-[第二抗原分子]复合物，通过第一抗原分子直接或间接地固定于固相支持物。
在本发明其它实施例中，一个或多个第一抗原分子，在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前，分别由标记手段提供。
在本发明其它实施例中，一个或多个第二抗原分子，在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前，分别由标记手段提供。
在本发明其它实施例中，固定于固体支持物的一个或多个第一抗原分子，和所述第一标记手段提供的一个或多个第二抗原分子，均在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前到位。
在本发明其它实施例中，由所述第二标记手段提供的一个或多个第一抗原分子，和所述第一标记手段提供的一个
或多个第二抗原分子，均在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前到位。
在本发明其它实施例中，固定于固体支持物的和第二标记手段提供的一个或多个第一抗原分子，和第一标记手段提供的一个或多个第二抗原分子，均在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前到位。在本发明其它实施例中，一个或多个第一抗原分子固定于固体支持物，而标记手段提供的一个或多个第二抗原分子来自溶液。
在本发明还有一些实施例中，一个或多个第一抗原分子固定于固体支持物，一个或多个第二抗原分子来自标记手段，而溶液中含有个或多个第一抗原分子和一个或多个第二抗原分子。
其它实施例包括采用本领域已知的测定技术(例如，无竞争或竞争测定法)直接检测(ⅰ)样品中存在的分析抗体和(ii)一个或多个第一抗原分子及(iii)一个或多个第二抗原分子的相互反应。例如，夹心型或RET型，后者检测类型不要求所述一个或多个第一抗原分子的固定或液相分离。
其它实施例还包括识别能与形成于步骤(c)的复合物相互作用，和/或能够干扰步骤(c)形成的复合物的调节剂。
相应地，本发明还有一关于分析抗体的实施例，包括在步骤(c)之前，或同时，或以后的步骤(f)提供一个或多个调节剂与形成于步骤(c)的复合物相互作用，和/或干扰步骤(c)形成的复合物；所述一个或多个调节剂与样品及一个或多个第一抗原分子；和/或一个或多个第二抗原分可同时或依次接触。或者，所述一个或多个调节剂同时或依次与步骤(c)或其后形成的复合物接触。
在本发明另外一些实施例中，在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前，提供一个或多个调节剂。
在本发明还有一些实施例中，在鉴别自身抗体的步骤(c)前，和鉴别调节剂的步骤(d)前，在所述固定化方法，所述第二标记手段，所述第一标记手段中选定一种或多种方法。
在另一实施方案中，本发明提供一种试剂盒，用于本发明涉及的任何方法，包括(a)从IRF选择本发明方法指定的一个或多个第一抗原分子；(b)从IRF选择本发明方法指定的一个或多个第二抗原分子；(c1)选择本发明指定的一个或多个固定手段，和/或(c2)选择本发明方法指定的一个或多个的第二标记手段；及(d)选择本发明方法指定的一个或多个的第一标记手段。还可以按照本发明指定一个或多个方法选择一个或多个第一抗原分子和第二抗原分子。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包括：(a)所述第二标记手段标记的第一抗原分子，或(a)所述固定到固体支持物上第一抗原分子；以及(b)所述第一标记手段标记的第二抗原分子。
还有一些实施例中，本发明提供的试剂盒手段，用于胰岛素受体家族相关疾病患病或发病的诊断；和/或鉴定药学有效化合物，供胰岛素受体族关联疾病的预防和治疗。
发明的详细说明
原则上，本申请中所使用的术语和短语的含义均属本领域技术人员的一般知识。但是，下述特定术语和短语的含义需要注意：
术语“多肽”和“蛋白质”在整个文本中可互换使用。
术语“样品”在本申请中特指生物和/或化学来源的液体或悬浮液样品。样品可通过众所周知的方式获得，并且特别地是指分离的体液，如血液，血浆，血清，脑脊液，唾液，尿液，精液液，泪液等。样品可以进一步包括剪下的指甲，粪便，排泄物等，分离细胞，细胞匀浆，组织匀浆，或从动物或人类个体所获得的器官匀浆(如小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猪，灵长类动物)。组织样品或器官样品可从通过，例如，切片获得。分离的细胞样品可以从体液或组织或器官，通过如离心或细胞分离技术获得。最理想的细胞样品，组织样品或器官样品，从那些表达、包含、积累、富集或产生抗原分子的细胞，组织或器官得到。样品可能需要处理和/或修饰，以便允许本领域技术人员依本发明的方法进一步存储和处理。
例如，本领域技术人员熟知，可将样品稀释于适当的缓冲液，或者，如果所述样品是来自尿液，且生物素作为本发明方法指定的标记手段，样品中含有的任何生物素必得去除，以免对生物素精确测定的干扰。样品可以从怀疑发生或存在自身免疫性疾病，生长发育或能量代谢紊乱，生长激素结合蛋白症，生长激素受体紊乱和生长激素紊乱的个体取得。在本发明的一个实施例中，样品包括已知量的分析抗体和/或已知量的一个或多个调节剂；理想的是，分析抗体和一个或多个调节剂的量均为已知。此议题与前述调节剂的辨识特别相关。
术语“抗原性分子”，在本发明中一般泛指与分析抗体可以进行交互作用，能够结合(一个或多个)分析抗体，形成[分析抗体-抗原分子]特定复合结构的任何分子。抗原性分子可以是天然的或合成的及其变型，理想的是，例如，根据本发明的方法对结合性质无不利影响的分子。
本发明中，术语“分析抗体”是指能与于IRF族中任何成员分别结合的任何抗体；能够结合一个或多个IR，IGF1R，IGF2R，IIHR和IRRR中选择的受体；本文将进一步描述对其存在的定量和/或定性分析。术语“分析抗体”可包括一个单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，双特异性抗体或双抗体，二价抗体，多特异性抗体，合成抗体，适体，斯皮尔格体，人或人源化抗体和一个片段或其变体，例如，Fab、Fv或scFv片段，或下述任何一种，例如抗体-药物缀合物，结构域抗体，纳米抗体或抗体拟体(DARPins，设计的锚蛋白重复蛋白)的化学修饰衍生物。在本发明具体的实施方案中，术语“分析抗体“是指内源性抗体，治疗性抗体，和/或诊断抗体。
本发明中，术语“胰岛素受体家族成员”，“胰岛素受体族”(IRF)指选自胰岛素受体(IR)中任一多肽，包括类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)，类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)，胰岛素IGF-1杂交受体(IIHR)，胰岛素受体相关受体(IRRR)，任何亚基，变体，类似物，衍生物和片段。理想地，IRF是动物(如小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猪，灵长类动物)或人源性的，首选为人源性的受体。
在本发明的第一实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”，“胰岛素受体族”(IRF)是指胰岛素受体(IR)或任何亚基，或其任何变体。在其它实施例中，仅所述第一抗原分子由胰岛素受体(IR)或任何亚基，或其任何变体选择。
在本发明的第二实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)或任何亚基，或其任何变体。在其它实施例中，仅所述第一抗原分子由类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)或任何亚基，或其任何变体选择。
在本发明的第三实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)或任何亚基，或其任何变体。在其它实施例中，仅所述第一抗原分子由类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)或任何亚基，或其任何变体选择。
在本发明的第四实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指胰岛素IGF1混合受体(IIHR)或任何亚基，或其任何变体。在其它实施例中，仅所述第一抗原分子由胰岛素-IGF1混合受体(IIHR)或任何亚基，或其任何变体选择。
在本发明的第五实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指胰岛素相关受体(IRRR)或任何亚基，或其任何变体。在其它实施例中，仅所述第一抗原分子由胰岛素相关受体(IRRR)或任何亚基，或其任何变体选择。
在本发明的第六实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自胰岛素受体(IR)，或任何亚基，或其任何变体；和类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第七实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自胰岛素受体(IR)，或任何亚基，或其任何变体；和类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第八实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自胰岛素受体(IR)，或任何亚基，或其任何变体；和胰岛素IGF1混合受体(IIHR)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第九实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自胰岛素受体(IR)，或任何亚基，或其任何变体；和胰岛素相关受体(IRRR)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第十实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自胰岛素受体(IR)，或任何亚基，或其任何变体；和类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)，或任何亚基，或其任何变体；及类胰岛素生长因子2受体(IGF2R),或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第十一实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自胰岛素受体(IR)，或任何亚基，或其任何变体；和类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)，或任何亚基，或其任何变体；和胰岛素IGF1混合受体(IIHR),或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第十二实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自类胰岛素生长因子1受体(IGF1R)，或任何亚基，或其任何变体；和胰岛素相关受体(IRRR)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第十三实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)或其任何变体；和胰岛素IGF1混合受体(IIHR)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第十四实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自类胰岛素生长因子2受体(IGF2R)或其任何变体；和胰岛素关联受体(IRRR)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
在本发明的第十五实施例中，术语“胰岛素受体家族的成员”或“胰岛素受体族”(IRF)是指选自和胰岛素IGF1混合受体(IIHR)或其任何变体；和胰岛素关联受体(IRRR)或任何亚基，或其任何变体的任何多肽。
适用的多肽和它们相应的基因，其IRF族编码，是本领域技术人员熟知的。IRF族成员可从商业资源获得(例如，R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达55413，美国；OriGene技术公司，洛克维尔，马里兰20850，美国)，其蛋白和核酸序列数据也已众所周知，例如可向EMBL，GenBank和其他数据库查询。目前对IRF成员可用的数据库登录号给予人类物种的特异性受体蛋白质，然而，本发明不应被理解为仅限于此。
本发明中，术语“胰岛素受体”(IR)是指任何具有天然存在的氨基酸序列或任何变体的分离的多肽物。IR的氨基酸序列和IR基因序列编码对本领域技术人员是众所周知的。例如，可从数据库UniProtKB查询例如P06213条目(1382个氨基酸长度智人样本)。在一个实施例中，IR被修饰用于体外分析，以使它不包括功能完整的酪氨酸激酶结构域或完全删除细胞内酪氨酸激酶结构域。例如，通过使用本领域技术人员熟知的方法，重组蛋白质修饰技术。在又一实施例中IR是为IR变体，表达出以动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猪，灵长类动物)或人为对象的致病性或功能失调的发生率。在又一实施例中，IR嵌入膜环境中。
本发明中，术语“类胰岛素样生长因子1受体”(IGF1R)是指具有天然氨基酸序列或其任何变体的任何分离的多肽。氨基酸序列和IGF1R基因序列编码对本领域技术人员是众所周知的。例如，可从数据库UniProtKB查询例如，P08069条目(1367个氨基酸长度智人样本)；或C9J5X1(1366个氨基酸长度智人样本)。在一个实施例中，IGF1R被修饰用于体外分析，以使它不包括功能完整的酪氨酸激酶结构域或完全删除细胞内酪氨酸激酶结构域。例如，通过使用本领域技术人员熟知的方法，重组蛋白质修饰技术。在又一实施例中IGF1R是为IGF1R变体，表达出以动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，猪，狗，灵长类动物)或人为对象的致病性或功能失调的发生率。在又一实施例中，IGF1R嵌入膜环境中。
本发明中，术语“类胰岛素生长因子2受体”(IGF2R)是指具有天然氨基酸序列或其任何变体的任何分离的多肽。氨基酸序列和IGF2R基因序列编码对本领域技术人员是众所周知的。例如，可从数据库UniProtKB查询例如P11717条目(2491个氨基酸长度智人样本)。在又一实施例中IGF2R是为IGF2R变体，表达出以动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，猪，狗，灵长类动物)或人为对象的致病性或功能失调的发生率。在又一实施例中，IGF2R嵌入膜环境中。
本发明中，术语“胰岛素-IGF-1混合受体”(IIHR)是指具有天然氨基酸序列或其任何变体的任何分离的多肽。氨基酸序列和IIHR基因序列编码对本领域技术人员是众所周知的。在本发明另一实施例中，IIHR被修饰用于体外分析，以使它不包括功能完整的酪氨酸激酶结构域或完全删除细胞内酪氨酸激酶结构域。例如，通过使用本领域技术人员熟知的方法，重组蛋白质修饰技术。在又一实施例中IIHR是为IIHR变体，表达出以动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猪，灵长类动物)或人为对象的致病性或功能失调的发生率。在又一实施例中，IIHR嵌入膜环境中。
本发明中，术语“胰岛素受体相关受体”(IRRR)是指具有天然氨基酸序列或其任何变体的任何分离的多肽。氨基酸序列和IRRR基因序列编码对本领域技术人员是众所周知的。例如，可从数据库UniProtKB查询例如，P14616条目(1297个氨基酸长度智人样本)。在本发明另一实施例中，IIHR被修饰用于体外分析，以使它不包括功能完整的酪氨酸激酶结构域或完全删除细胞内酪氨酸激酶结构域。例如，通过使用本领域技术人员熟知的方法，重组蛋白质修饰技术。在又一实施例中IRRR是为IRRR变体，表达出以动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猪，灵长类动物)或人为对象的致病性或功能失调的发生率。在又一实施例中，IIHR嵌入膜环境中。
本发明中，术语“变体”是指任何片段、类似物、衍生物、融合蛋白、亚基或有关分子的亚基链。理想地，所述变体应具有与相应的多肽或蛋白质至少是基本相同的生物特性，除开酪氨酸激酶活性，固定的功能和/或标记的特性。此外，需要强调，本发明中“变体”一词包括氨基酸序列，其差异别来自序列中至少有一个氨基酸的取代，修改，删除和/或添加，但其氨基酸序列仍然，理想地，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约92％，至少约95％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％与所说的多肽或蛋白的氨基酸序列相同；理想情况是在特定多肽或蛋白质的整个长度上如此。变体可以是等位基因变体或任何其它物种特定同源物，旁系同源物，或直向同源物。此外，本文中变体所指包括上文IRF的多肽或蛋白质的片段，只要这些片段具有基本相同的生物学性质。此外，变体包括与前述IRF多肽队应的多肽或蛋白的融合蛋白，适合固定化手段，标记手段，或标签，只要这些融合蛋白基本上保持上述IRF的多肽或蛋白质的生物学性质。变体可进一步包括所述多肽或蛋白质通过糖基化或任何其他化学或酶修饰体，只要这些变体具有基本上与上述物质相同的生物学特性。
本发明中的变体可以包括所谓“静止”的、不改变或不显著改变其生物活性的取代、增添和缺失。更具体地，本发明中所指变体可能是一个或多个氨基酸残基改性，它们被一个或多个保守的或非保守的氨基酸残基取代；理想情况由保守的氨基酸残基取代；或者，其中一个氨基酸的一个或多个残基含有取代基团。此种变体属于这里的讲授范围。最典型地，变体是指那些保守的氨基酸取代物。这种取代是由那些化学性质类似的氨基酸取代另一个氨基酸。因此被理解为保守替换，常见于小脂肪族氨基酸A，V，L和I；羟基残基S和T；酸性残基中D和E酰胺残留物N和Q；碱性残基K和R；及芳香族残留物F和Y之间(根据IUPAC氨基酸的单字母代码命名法)。
在本发明一个实施例中，“变体”具有基本上相同生物学性质。在本发明另一实施例中，使用了IRF族成员的“变体”，展示了以动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猪，灵长类动物)或人为对象的与胰岛素受体族有关致病或功能失调的发生率。
本发明另一实施例中一个或多个IRF成员被修饰，以使它不包括功能完整的酪氨酸激酶结构域或完全删除细胞内酪氨酸激酶结构域。例如，通过使用重组的蛋白质修饰技术，这是本领域技术人员众所周知的方法。
按照本文的理解，术语“生物学特性”指涉及的各分子的结合性质。如果是IRF族中的特定成员，指与胰岛素、IGF-1和/或IGF-2在合适的条件下形成复合物的能力。对于本发明来说，IRF任何成员对于酪氨酸激酶活性的信号属性被明确地排除。术语“生物学特性”还可以随选地包括多肽某些特定的免疫学特性。例如，如果它们具有相同的ELISA法检测的特异性。特别是，如果两者(a)能与分析抗体相互作用，(b)可由相同的ELISA法检测，和/或(c)根据本发明的方法检测；可判定IRF族某成员表现出与变体基本上相同的“生物学特性”，
在本发明的另一个优选实施例中，一个或多个第一抗原分子和一个或多个第二抗原分子是选自一个或多个IR，IGF1R，IGF2R，IIHR和IRRR组中的多肽。
本发明中术语在“鉴别自身抗体的步骤(c)前提供”，和“鉴别调节剂的步骤(d)前提供”，分别指与所述抗原分子和分析抗体接触之前。
本发明中术语“检测存在和/或结合特性”，指确定数量或浓度，理想情况是定量。测量可以直接或间接进行。直接测量基于测量一种或多种反应析出物和/或反应产物的信号，及其与一种或多种反应析出物和/或反应产物分子数直接相关的强度，和/或反应体积中反应产物，确定其数量或浓度。这类信号可以如此获得，例如，通过测量所述一个或多个反应析出物和/或反应产物特定的强度值或特定的物理或化学性质的值。间接测量包括测量获得信号的次要成分(即不属于反应析出物或反应产物的成分)或生物读出系统，记为“标记手段”，例如可测量的细胞或跨膜响应，配体，或酶促反应产物，例如通过荧光团、生色团、离子浓度等，适于通过光、电和/或电子设备进行的方法。对于酶反应产物，理想情况是衬底的量处于饱和状态。衬底也可以任选地标记反应前的可测标记。理想情况，反应对象与衬底接触的时间要充分，直到一种或多种反应产物产生出可测量的信号。代替测量一种或多种反应产物的量或浓度，也可测量给定的一种或多种反应产物出现(即可检测的)定量或浓度的时间。
本发明中“检测存在和/或结合特性”，指本领域技术人员可以通过各种已知手段，用于确定反应析出物和/或反应产物的数量。所述装置包括免疫测定装置和可利用的各种标记分子的方法，如夹心式、竞争式或其它测定形式。所述实验检测一个信号，其为反应析出物和/或反应产物存在或不存在的标志。进一步，理想地情况，信号强度直接或间接地(例如，反比例)，与反应体积中反应析出物和/或反应产物数量相关。所述的检测方法包括，优选地，生物传感器、免疫学光学设备、生物芯片、光谱仪或色谱法的分析装置。此外，还包括使用任选的预处理或预涂覆、微板、微阵列或管阵列、全自动或机器人免疫学分析(例如，Roche-ElecsysTM，Abbott-AXSYMTM,或Brahms KryptorTM分析仪)等ELISA方法。理想地，“检测存在和/或结合特性”的步骤应保证反应对象有充分时间进行反应。
本发明中术语“结合”一词包括共价和非共价键键合。术语“特异性结合”是指比其它分子成键亲和力至少高3倍以上，优选为至少约10倍以上，更优选至少约50倍。在本发明另一实施例中术语“结合”是指合适条件下在体外结合测定中配偶体的缔合；优选条件应根据分析仪器制造商的说明或本发明中实施例部分定义的方法。一般而言，“结合”指成键亲和力(K D-表示解离常数与结合常数之比)约10-14M至10-7M，最好10-13M至10-9M。
本发明所说“调节剂”包括任何生物或化学化合物，大分子(如大于约5kDa)，小分子(例如，小于5kDa或小于800Da甚至更小)，分离的化合物或混合的化合物，组织或器官的提取物或组织匀浆或，或合成化合物，例如，单个或多个肽、多肽(例如多克隆或单克隆抗体，包括单链抗体、双抗体、多特异性抗体、人源化抗体、杂抗体、或其片段，例如Fv、Fab、和F(ab)2片段)、适体、镜像异构体、核酸、和/或小分子。
本发明中术语“抗原性分子包埋在膜环境”是指所述抗原性分子–IRF例中跨膜蛋白–处于膜或其它类似模式，包括任何合成的，天然的或人工的环境，如细胞、膜、囊泡、胶束或脂质体的结构，所述抗原分子能够与前述分析抗体相互作用，从而形成复合物。测定嵌入膜环境中蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的，例如，采用人工或仿生膜或脂质双层(简称“人造膜”)的技术和测定方法。人造生物膜被广泛地用于膜蛋白的研究，并且许多都适用于本发明，特别是所述抗原性分子的变性可以避免时。
本发明中术语“人造膜”包括，例如，任何脂质体或囊泡，比如人工制备的含有一个，两个或更多脂质层的囊泡。这样的脂质体和囊泡被用作脂质、蛋白质和小分子的传输工具；因此它们可用于药物服用技术。囊泡或脂质体可以很容易地制备，首先，例如通过超声处理和/或挤压生物膜破坏细胞培养物、组织、器官、或亚细胞结构(如细胞核、高基氏体、内质网和线粒体)，随后所述脂质结构完成自组装。对此进行染料标记或用于RET多肽的标记是容易实现的。此外“人造膜”可以包括已在体外被合成组装的脂质双层。它们可以从一个或多个合成和/或天然的脂质制成。
本发明中术语“人造膜”可以进一步包括，例如，黑脂膜(BLM)、囊泡、脂质双层膜、脂质体、胶束、脂碟、混合双层膜(例如包含疏水性单分子层和脂质单层)和纳米圆盘，可以用来固定、支承或连接固相或固相衬底，且可任选地作为间隔物或垫料(例如，聚乙二醇、低核苷酸、肽、多肽(例如链霉抗生物素蛋白)、水凝胶等)，以使膜和/或前述的抗原性分子与固体衬底保持距离。理想的间隔物或垫料是亲水性分子。与囊泡或细胞膜不同，上述支承双层具有固相支撑上的平面结构。因此，该双层的仅有上表面暴露于溶液中。例如，蛋白脂质体的制备由欧洲专利申请EP1992688 A1而众所周知，其中公开的脂质体制备实施例1～20中任何实施例，引为本专利参考。
本发明中术语“胶束”指另一类无脂质双层构造的人造生物膜。在水溶液中，胶束组装双亲分子(如清洁剂)亲水性的头朝向溶剂，而疏水性端收于中心。胶束通过部分封装和屏蔽膜蛋白的疏水面，可使其溶解。术语“脂碟”是指另一种类型的人造生物膜，典型的由两种脂质构成，其中之一构成双分子脂膜，是为另一种双亲性的，类胶束的组构，对周围溶剂分子屏蔽脂质双层膜中心。术语“纳米圆盘”是指由双亲性蛋白质外壳，脂质或清洗剂层封装的双层膜的片段。膜蛋白可以通过纳米圆盘加入和溶化。
本发明中术语“与胰岛素受体族相关的疾病”，是指任何IR，IGF1R，IGF2R，IIHR和IRRR中一种或多种多肽，更优选地表达是所述IRF族中一个，两个或三个选定的多肽引起的功能障碍。本发明中术语“与胰岛素受体族相关的疾病”包括自身免疫性疾病(例如，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，弥漫性毒性甲状腺肿)，肥胖症，神经性疾病，生长障碍，癌症的生成和发展(包括乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，肺癌)，和其它细胞增殖性疾病及其他疾病或功能障碍，无论是否自身免疫性起因，优选自身免疫性起源。
本发明中术语“固定化手段”是指本领域技术人员熟悉的，适于将所述第一抗原分子固定到固体支持物上的任何试剂和/或过程。本发明方法对所述固体支持物条件要求，与现有常规免疫测定技术中使用的固体载体的条件要求没有什么不同。本发明中的固相支持可以是目前ELISA技术中公知ELISA板，或任何其他适用的载体，如微滴定板(96，384，1536，或3456孔或更多)或诸如，玻管、颗粒、磁性珠子、硝基赛璐珞等。适合作为本发明固体支持物的材料，是行业内众所周知的，包括，例如，市售的柱材料、聚苯乙烯珠等载体、乳胶珠、磁珠、金属胶体、和蛋白质芯片技术使用的玻璃表面和芯片、蛋白质芯片技术的使用甲烷硅基化的表面和芯片、蛋白质芯片技术的使用硅表面和芯片、硝化纤维素载体、膜、人造膜、稳定脂质体或细胞(例如duracytes)、反应盘或滴定板、塑料管等的凹孔和壁面。
前文所定义的抗原分子可固定于本领域技术人员熟知的任何载体。这类载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁、和黄金。载体可以是可溶或不溶的，在不溶性载体情况，载体是固体或胶体，并且可以任选地以悬浮液形式提供。
用于所述抗原分子固化的适用方法是众所周知的，包括但不限于离子的，疏水的，共价相互作用等。在本发明中可以使用悬浮液完成固化，其中所述载体存在悬浮液中，例如微珠或微球体组成的微珠或微球；选项，不同载体不同标记。基于固相化学和光活性基团保护原理的悬浮液制作方法，可参考美国专利US 5,744,305。
本发明中术语“标记”指直接或间接的标记方法。直接标记包括将标签直接耦合(共价或非共价)到被标记分子。间接标记包括键合(共价或非共价)第二配体到被标记分子。这样第二配体对被标记分子的特异结合，在测定条件下其亲和力至少3倍高，优选至少10倍，更优选至少50倍高。所述第二配体与合适的标记手段联动，和/或可键合第三配体至所述第二配体。使用第二、第三或甚至更高级别配体通常用于增加测试信号。适用的第二和更高阶配体可包括抗体，第二抗体和众所周知的链霉亲和素-生物素系统(VectorLaboratories公司制)。此外，被标记分子或衬底也可以被用一个或多个本领域已知的标签方法“标记”。此类标签可能用以高阶配体。合适的标签包括生物素、地高辛、His-Tag、谷胱甘肽-转移酶、FLAG-Tag(N-DYKDDDDK-C)、绿色荧光蛋白(GFP)、myc-Tag、A型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等等。在肽或多肽的情况下，标记通常位于或靠近N-端和/或C-端。
此外，该被标记分子或衬底也可以利用本领域中已知适用的“间隔”手段,以避免大分子的键合属性受到任何空间限制。
本发明中术语“第一标记手段”优选地是指任何从酶标签组，同位素或放射性标签，化学发光标签，生物发光标签，荧光标签，磁性标签(例如“磁珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记物)，染料标签(生色团)，以及其他在本领域中已知标签中，采用的直接或间接可测标记方法。合适的标记物是本领域中已知检测方法可检测的。合适的标记物可以进一步包括金颗粒、胶乳珠、二氢化吖啶酯、鲁米诺、和钌。优选的非放射性标记物,酶促活性标签,包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、以及它们的衍生物。适用检测的衬底材料包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3'-5，5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、CDP-StarTM(Amersham Biosciences公司制)、ECLTM(Amersham Biosciences公司)和其他本领域中已知的材料。
适当的酶–衬底物结合可导致有色反应产物(发色团)，荧光，或化疗或生物发光的增加或减少,这个变化可以使用本领域已知的方法来测定(例如，光度计，光电倍增器，以及感光胶片或相机系统)。同样的原理适用于测量酶促反应终点或反应效率及进展。
合适的荧光标记物包括荧光染料和蛋白质(例如GFP和它的衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素、和Alexa染料(例如Alexa 568)。合适的荧光标记物是可商购的，例如从Molecular Probes分子探针公司(俄勒冈州，美国)购买。还包括使用量子点作为荧光标记物的例子。荧光蛋白的实例包括但不限于，绿色、黄色、青色、蓝色和红色荧光蛋白。
合适的化学发光或生物发光标记物包括，但不局限于原核生物(如勒克斯编码细菌)或真核的(如吕克编码萤火虫)荧光素酶，以及其具有不同的或改变的光学特性变体，比如产生不同颜色的光的出自北美萤火虫，Suberities domuncula海绵和小菇属真菌的荧光素酶。此外，光蛋白，如钙激活光蛋白及其专门设计的变体可用，它们通常的发光范围在200nm到1100nm之间，或处于可见光谱段(即介于350nm到800nm之间)；例如，从海洋息肉枝螅，或螅蛋白水母，或发光水母，或从其他合适生物提取的发光蛋白；可供膜应用任选。
合适的放射性标记包括35S，125I，32P，33P等。放射性标记可以通过任何已知的适当方法探测，例如，可以使用光敏底版或荧光成像仪。
本发明涉及的检测方法，还包括沉降法(特别是免疫沉淀法)，电化学发光(电致化学发光)，生物发光，RIA(放射免疫测定)，ELISA(酶联免疫吸附测定)，夹心酶免疫试验，三明治免疫测定(ECLIA)，解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIATM，珀金埃尔默公司，美国)，闪烁迫近测定法(SPA)，比浊法，散射比浊法，乳胶增强比浊法或散射比浊法，乳胶凝集法，或固相免疫检测。
本领域中已知的其它方法(例如凝胶电泳，2D凝胶电泳，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，Western Blotting,和质谱仪)，可任选地与上述标记手段和其它检测方法结合使用。
本发明涉及的一种或多种抗原分子，如上所述，可直接或间接地由标记手段提供。
本发明中术语“第二标记手段”优选地是指任何从化学发光标签，生物发光标签，荧光标签，染料标签(生色团)，以及其他在本领域中已知标签中，采用的直接或间接可测标记方法。使用术语“第二标记手段”意味着其不等同于“第一标记手段”。适用的第二标记手段，可用本技术领域中已知的方法，基于共振能量转移(RET)原则检测。“第二标记手段”优选地指本领域技术人员熟知的荧光共振能量转移(FRET)，生物发光共振能量转移(BRET)，或化学发光共振能量转移(CRET)等标记手段。本领域技术人员熟知，选择合适的第二标记手段须考虑第一标记手段的种类，以确保RET信号可检测。此外，RET信号的产生和选择合适的第二标记手段将为本领域熟手提供与有关复合物的形成的种类和动力学信息及结构特征。
序列：
序列号1 引子P1(33聚体)
序列号2 引子P2(34聚体)
序列号3 引子P3(35聚体)
序列号4 引子P4(33聚体)
序列号5 萤火虫荧光素酶DNA编码氨基酸2-551
序列号6 萤火虫荧光素酶的氨基酸序列2-551
序列号7 人类IGF1R DNA编码氨基酸1-1367
序列号8 人类IGF1R的氨基酸序列1-1367
序列号9 人类IGF1R-LUC融合DNA编码氨基酸1-1919
序列号10 人类IGF1R-LUC融合氨基酸序列1-1919
序列号11 人胰岛素受体的DNA编码的氨基酸1-1370
序列号12 人胰岛素受体(IR)氨基酸序列1-1370
序列号13 人类IR-LUC融合DNA编码氨基酸1-1922
序列号14 人胰岛素受体-LUC融合氨基酸序列1-1922
序列号15 人类IGF1R(ECDhIGF1R)胞外域DNA编码氨基酸1-927
序列号16 人类IGF1R(ECDhIGF1R)胞外域DNA编码氨基酸序列1-927
序列号17 引子P5(33聚体)
序列号18 引子P6(33聚体)
序列号19 引子P7(36聚体)
序列号20 引子P8(83聚体)
本发明将通过下面的实施例说明其应用，但不可以任何方式理解这些实施例为本发明的局限范围。
实验步骤
材料
DNA引物(P1～P8)，购自BioTeZ柏林布赫有限公司(德国柏林)；pSP-LUC+NF载体购自Promega公司(德国曼海姆)；载体pIRESneo购自Clontech公司(美国加利福尼亚州帕洛阿图)；载体pCR-XL-TOPO-IR购自ImaGenes公司(德国柏林)；载体pFastBac1购自Invitrogen公司；山羊抗人IgG(SIGMA公司)标为吖啶NHS酯(开曼化学公司，美国密歇根州安阿伯市)；IGF-1是从ACRIS抗体公司(德国Herford)获得；胰岛素是从Sigma-Aldrich公司获得；抗IGF1R(Tyr1165/Tyr1166)抗体从诺伟司生物制品公司(英国爱丁堡)获得；CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒购自Promega有限公司；High Five昆虫细胞购自Invitroge公司；涂PGA14抗体聚苯乙烯管(Selenotest LIA)购自ICI免疫智能有限公司(德国柏林)。如果没有特别声明，所有其他试药和试剂均购自Sigma-Aldrich化学有限公司(德国慕尼黑)或默克公司(德国达姆施塔特)；酶购自Promega公司或新英格兰Biolabs公司(美国缅因，伊普斯维奇)。
实施例1：构建融合蛋白
例1A：构建IGF1R-荧光素酶融合蛋白
DNA(序列编号5)萤火虫萤光素酶编码氨基酸2-551(在PSP-LUC+NF序列ID第6号)用引物P1(序列编号1)和P2(序列编号2)通过PCR扩增，分别含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性位点。pIRESneo被EcoRI和BamHI限制性内切酶消解；所得到片段由上述PCR处理的DNA编码萤火虫荧光素酶转换，生成pIRESneo–Luc质粒。
DNA(序列编号7)人类IGF1R编码氨基酸1-1367(序列ID编号8)用引物P3(序列编号1)和P4(序列编号4)通过PCR扩增，分别含有NotI和EcoRI限制性位点。pIRESneo–Luc被NotI和EcoRI限制性内切酶消解；所得到片段由上述PCR处理的DNA编码人类IGF1R转换，生成含序列编号9和序列编号10的pIRESneo-IGF1R-Luc载体。
例1B：构建IR-萤光素酶融合蛋白
DNA(pCR-XL-TOPO-IR序列ID号11)编码人类IR(序列编号12)氨基酸1-1370，用引物P5(序列编号17)和P6(序列编号18)通过PCR扩增，分别含有Hpal和Mfel限制性位点。pIRESneo-Luc被Hpal和Mfel限制性内切酶消解；所得到片段由上述PCR处理的DNA编码人类IR转换，生成含序列编号13和序列编号14的pIRESneo-IR-Luc载体。
例1C：构建IGF1R胞外域的融合蛋白(ECDhIGF1R)和PGA14抗体所识别的16个氨基酸表位
DNA(序列编号15)编码人IGF-1受体胞外域1-927氨基酸(序列编号16，ECDhIGF1R)，用引物P7(序列编号19)和P8(序列编号20)通过PCR扩增，分别含有BamHI和Hindlll限制性位点。pFastBac1载体被BamHI和Hindlll限制性内切酶消解；所得到片段由上述PCR处理的hIGF1R的ECD DNA编码转换，生成pFastBac1-IGF1RPGA14tag载体。
实施例2：IGF1R-Luc和IR-Luc融合蛋白细胞
例2A：生成IGF1R-Luc和IR-Luc产出HEK 293
HEK 293细胞在添加10％胎牛血清DMEM培养；5％CO2气氛，37℃。HEK293细胞转染pIRESneo-IGF1R-Luc载体，或使用根据制造商指定的pIRESneo-IR-Luc载体FUGENE6转染试剂(Roche Deutschland Holding GmbH公司，德国格伦扎克-威伦)。48小时转染后，开始用0.8mg/ml的G418(GibcoTM BRL，Invitrogen)选择。稳定克隆表达高水平的融合蛋白选定。
例2B：生成表达ECDhIGF1RPGA14tag融合蛋白的重组杆状病毒
从例1C获得的ECDhIGF1R-PGA14tag序列被转移到通过位点特异性重组的杆状病毒的DNA。杆粒病毒，然后根据制造商协议，在Sf9昆虫细胞中产生充分的重组杆状病毒，(菌-菌表达系统手册，Invitrogen)。
例2C：生成IGF1R-PGA14tag融合蛋白
High Five昆虫细胞悬浮液在Express Five无血清培养基中培养至密度2x10e6细胞/ml。然后将细胞感染重组IGF1RPGA14tag-杆状病毒，感染复数为1(MOI)，放置72小时，将感染细胞收集储存于-80℃条件。
实施例3：表达产物的控制
例3A：IGF1与IGF1R-Luc细胞的相互作用
在96孔板中生长的融合性HEK 293细胞用DMEM/F12冲洗，与DMEM/F12，0.1％BSA稀释，吖啶脂标记的100μl IGF-1(大约1.0e06RLU/孔)一起培养；5％CO2气氛，37℃下3小时。在进一步的实验中未标记的IGF-1(0.3毫克/毫升)加入用吖啶标记的IGF1，以确定非特异性结合。孵化后的细胞用DMEM冲洗，重新悬浮于含有2％Triton X-100PBS中；获得的溶解液进行光度计测量(Berthold Technologie AutoLumatPlus LB 953)，持续10秒。表中数值代表平均值(RLU)+/-重复测量的标准偏差(SD)(相对光单位(RLU)×1000)。
表1 野生型HEK293 IGF1R-Luc HEK293
1GF1标记 27+/-4 55+/-7
1GF1标记+过量IGF1 11+/-1 12+/-1
此结果表明IGF1R-luc融合蛋白处理正确，并在细胞膜得到表达。
例3B：IR-Luc细胞与胰岛素的相互作用
在96孔板中生长的融合性HEK 293细胞用DMEM/F12冲洗，与DMEM/F12，0.1％BSA稀释，吖啶脂标记的100μl胰岛素(大约1.0e06RLU/孔)一起培养；5％CO2气氛，37℃下3小时。在进一步的实验中未标记的IGF-1(0.3毫克/毫升)加入用吖啶标记的IGF1，以确定非特异性结合。孵化后的细胞用DMEM冲洗，重新悬浮于含有2％Triton X-100PBS中；获得的溶解液进行光度计测量(Berthold Technologie AutoLumatPlus LB 953)，持续10秒。表中数值代表平均值(RLU)+/-重复测量的标准偏差(SD)(相对光单位(RLU)×1000)。
表2 野生型HEK293 IR-Luc HEK293
胰岛素标记 32+/-2 78+/-6
胰岛素标记+过量胰岛素 13+/-2 17+/-3
此结果表明IR-luc融合蛋白处理正确，并在细胞膜得到表达。
实施例4：制备IGF1R-Luc和IR-Luc细胞提取物
生长在一个75平方厘米培养板上的融合性HEK 293细胞(产生或IGF1R-Luc或IR-Luc)刮入PBS中重新制成悬浮液，并以相同缓冲液洗涤并以2500转/分速度离心处理。所得到的细胞溶解于0.5ml含有20mM HEPES-氢氧化钠，pH7.5，50mM氯化钠，1％的Triton X-100，10％甘油的缓冲液内。悬浮液以5,000转/分速度离心处理15分钟，收集上层清液，保存于-80℃。
实施例5：IGF1R的自身抗体免疫沉淀法检测
IGF1R-Luc细胞提取物稀释10倍，缓冲液含20mM HEPES-氢氧化钠，pH7.5，50mM氯化钠，1％Triton X-100，10％甘油，5毫克/毫升BSA。对于免疫沉淀测试，100μl稀释提取物(大约1.0e07RLU)与10μl样品(血清探针)混合，并在4℃下孵育过夜。免疫复合物，通过加入100μl 10％的蛋白A-琼脂糖沉淀，悬浮在相同的缓冲液，室温下振摇1小时。蛋白A-琼脂糖粒化后沉淀，用1ml的洗涤缓冲液洗涤3次，缓冲液成分(10mM Tris-HCl，pH值7.5，60mM氯化钠，0.02％Tween 20)。最后，荧光素酶的活性由光度计测量(Berthold TechnologieAutoLumat Plus LB 953)，持续10秒。结果为RLU，是重复测量的平均值。对原始血清和来自同一血清抗体免疫沉淀物的分离免疫球蛋白对IGF1受体的反应进行了比较。
表3 血清(RLU) RLU-血清(最大％) IgG(RLU) RLU-IgG(最大％)
1 417 0 238 0
2 619 0 181 0
3 781 1 392 1
4 669 0 414 1
5 348 0 293 0
6 121585 83 70472 92
7 145972 100 76178 100
8 130683 90 62441 82
9 55840 38 23002 30
10 131560 90 19699 65
表4：IGF1R自身抗体的稀释，恢复和稳定性的检测。
(A)五种含不同浓度自身抗体的血清以孵育缓冲液稀释，以实施例5中所描述的测定法测量；(B)五种血清含有IGF1R,五种血清不含IGF1R,和它们(1:1)的混合物，以实施例5中所描述的测定法测量；(C)五种血清混合液置于于室温(RT)和4℃孵育定常时间，以实施例5中所描述的测定法进行IGF1R自身抗体分析。
表4A：IGF1R的自身抗体检测的稀释实验。
五种含有不同浓度自身抗体的血清以孵育缓冲液稀释，以实施例5中所描述的测定法测量对萤光素酶活性测定。数值为重复测量的平均值(RLU×1000)。
表4A血清(％) 血清1 血清2 血清3 血清4 血清5
100 76.3 93.7 71.8 41.3 86.6
50 50.2 54.6 39.6 21.5 51.8
25 27.1 30.1 24.2 13.9 27.6
10 11.6 13.9 11.4 6.6 12.2
表4B：IGF1R自身抗体检测的恢复实验。
五种无自身抗体IGF1R血清(A)，五种含有IGF1R自身抗体的血清(B)和它们的(1:1)混合物，按照实施例5中描述的测定法进行了分析，对萤光素酶活性进行测定。数值为重复测量的平均值(RLU×1000)。
表4B 1 2 3 4 5
血清A 4.9 5.6 3.3 3.2 3.4
血清B 63.3 76.1 60.3 25.4 63.2
A+B混合 35.0 42.1 33.4 15.0 37.4
表4C：IGF1R的自身抗体检测的稳定性试验。
含IGF1R自身抗体的血清在4℃和室温(RT)孵育不同时间。以实施例5中所描述的测定法对血清样品进行分析。如前述对萤光素酶活性进行测定。数值为重复测量的平均值(RLU×1000)。
表4C 0天 5天 10天
4℃ 53.0 52.5 49.4
室温 63.353. 52.2 53.8
实施例6：人体IgG分离
1ml人体血清与1ml PBS和0.2ml蛋白G-琼脂糖混合，并在4℃摇动孵育过夜。蛋白G-琼脂糖凝胶粒化，用PBS洗涤10次。结合的IgG用25mM柠檬酸洗脱，使用1M的Hepes-NaOH，将pH值由8调节至7。洗脱的IgG用SpeedVac在室温下浓缩至100μl。IgG转移到DMEM/F12培养基，使用葡聚糖凝胶G25柱速度过滤。
实施例7：自身抗体对IGF1R自磷酸化的影响
HepG2细胞接种在96孔板(10000个细胞/孔)，全DMEM/F12培养基中孵育24小时，随后在含0.1％BSA的无血清DMEM/F12培养基中培养过夜。血清饥饿细胞和人IgG(10-20毫克/毫升)在DMEM/F12培养基中孵育15分钟至1小时。此后在某些情况下，加入IGF-1(1纳克/毫升)，并将细胞孵育额外的15分钟。用含有磷酸酶抑制剂的PBS洗涤细胞，溶解在缓冲液中(20mM HEPES-氢氧化钠，pH 7.5，50mM氯化钠，2％的Triton X100，10％甘油，磷酸酶抑制剂)。细胞裂解物在10％SDS-PAGE进行电泳，并转印至硝酸纤维素膜。酪氨酸磷酸化的IGF1R，用抗IGF1R的(Tyr1165/Tyr1166)抗体印迹检测。使用增强的化学发光免疫印迹检测试剂盒将条带显影(Amersham ECL Plus，GE Healthcare,General Electric DeutschlandHolding GmbH，德国法兰克福)。
实施例8：自身抗体对细胞生长的影响
MCF7细胞接种每孔2500个(96孔板)，全DMEM/F12培养基中孵育过夜。然后将细胞在含有0.1％BSA无血清DMEM/F12培养基中饥饿5小时；加入来自从5份低浓度(1-5)和5份高浓度(6-10)IGF1R抗体(从病人体内分离的)血清，1％FCS和1纳克/毫升IGF1。细胞孵育5天。使用CellTiter-Glo细胞活力发光试剂盒，根据制造商说明书，基于ATP定量，评估存活细胞数。自身抗体的抑制效果以抑制指数表达，计算式Inl％＝100x[(1—(RLU test IgG)/(RLUnegative IgG pool)].数值为重复测量的平均值。
表5 血清 抑制指数(％)
1 -7
2 1
3 -3
4 -3
5 -2
6 20
7 18
8 22
9 16
10 21
实施例9：桥接检测
例9A：自身抗体与IGF-1受体与胰岛素受体相互作用的桥接测定。
涂有PGA14抗体的聚苯乙烯试管，SF6昆虫细胞培养基中200μl IGF1R-PGA14tag，4℃孵育过夜。IGF1R-PGA14tag固定后，试管用缓1ml缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，50mM氯化钠，10％甘油)冲洗两次。然后试管与200μl IGF1R-Luc(或IR-Luc)的稀释液(相同BSA缓冲液,荧光素酶活性的约40X10E6RLU)4℃孵育过夜。孵化管用20mM Tris-HCl，pH7.5，100mM氯化钠，0.1％的Triton X100洗涤四次。最后，对荧光素酶的活性进行光度计测量(Berthold Technologie AutoLumatPlus LB 953)，持续10秒。表中数值为RLU(相对光单位)重复测量的平均值。
例9B：病人血清的检测下限
一个IGF1R-Ab阳性血清，用20mM的Tris-HCl，pH7.5，50mM NaCl，10％甘油，10毫克/毫升BSA稀释。以例9A所述方法测定。缓冲液控制信号定义为血清阴性。
表7稀释血清(v/v) IGF1R-Luc【RLU】
未稀释 64651
1/4 38829
1/16 20269
1/64 8135
1/256 5383
背景(阴性血清) 5369
例9C：市售抗IGF1R抗体的检测下限
对IGF1R胞外域单克隆抗体(抗IGF1R克隆#24-75，Millipore，美国)，用20mM的Tris-HCl，pH7.5，50mM氯化钠，10％甘油，10毫克/毫升的BSA稀释。以例9A所述方法测定
表8抗体浓度(ng/ml) IGF1R-Luc【RLU】
50000 805261
12500 767157
3125 626879
781 475770
195 234773
49 88894
12 27013
3 11831
0.8 8856
0.2 5904
0.05 5369
背景 5418
这一结果表明，本发明的抗体浓度检测下限约为0.2纳克/毫升。
实施例10：IRF族成员人体蛋白的自身抗体水平的临床相关性。
检测了1001例(健康成年人)先证血清样本中对胰岛素受体自身抗体的存在水平。发生率10％阳性(n＝103)，比较自身抗体阳性和阴性个体表明基底血糖浓度的显著差异(P＝0.03)。

Claims (15)

1.一种检测方法，用于检测样品中可与一种或多种抗原分子反应的分析物抗体的存在和/或其结合特性，所述方法包括：
(a)提供一种或多种第一抗原分子，所述样品中分析物抗体可与其相互作用，其中第一抗原分子从胰岛素受体家族(IRF)中选择；及
(b)提供一种或多种第二抗原分子，所述样品中分析物抗体可与其相互作用，其中第二抗原分子从胰岛素受体家族(IRF)中选择；和
(c)待查样品与步骤(a)中第一抗原分子和步骤(b)中第二抗原分子同时或依次接触，因此存在于样品中的所述分析物抗体可以与所述抗原分子相互作用，从而形成包括[第一抗原分子]-[分析物抗体]-[第二抗原分子]的复合物；和
(d1)任选地在步骤(c)之前，或同时，或之后，提供固定化手段，因此使在步骤(c)中形成的所述复合物中第一抗原分子，分别在步骤(c)之前，或同时，或之后，固定在固态支持物上；和
(d2)在步骤(c)之前，或同时，或之后，提供第二标记手段，因此对在步骤(c)中形成的所述复合物中第一抗原分子，分别在步骤(c)之前，或同时，或之后，可用第二标记手段进行标记；和
(e)在步骤(c)之前，或同时，或之后，提供第一标记手段，因此对在步骤(c)中形成的所述复合物中第二抗原分子，分别在步骤(c)之前，或同时，或之后，可用第一标记手段进行标记；和
(g)检测样品中在步骤(c)中或其后复合物的形成，从而提供样品中分析物抗体存在的指标；
其中所述第一和第二标记手段是不同的。
2.一种根据权利要求1所述的方法，还包括：
(f)在步骤(c)之前，或同时，或之后，提供一种或多种能够与形成于步骤(c)的复合物相互作用/或能够干扰该复合物形成的调节剂；在步骤(c)之前，或同时，或之后，使所述样品，所述一种或多种第一抗原分子，和/或所述一种或多种第二抗原分子与前述提供的一种或多种调节剂同时或依次接触；或者前述提供的一种或多种调节剂与步骤(c)中或之后形成的复合物同时或依次接触。
3.一种根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述第一抗原分子和所述第二抗原分子是相同的。
4.一种根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述第一抗原分子和/或所述第二抗原分子被包埋在膜环境。
5.一种根据权利要求1或2的方法，其中所述一种或多种第一抗原分子和/或所述一种或多种第二抗原分子缺失功能完整的酪氨酸激酶结构域。
6.一种根据权利要求1或2的方法，其中所述样品中的待检测分析物抗体是内源性自身抗体或单克隆抗体。
7.一种根据权利要求1或2的方法，其中所述第一标记手段，所述第二标记手段，所述固定化手段，所述调节剂于抗原分子与所述分析物抗体接触前提供。
8.一种试剂盒，用于实现权利要求1-7中一个或多个方法，所述试剂盒包含：
(a)如权利要求1、2和/或5中所定义的，选自胰岛素受体家族的一种或多种第一抗原分子；
(b)如权利要求1、2和/或5中所定义的，选自胰岛素受体家族的一种或多种第二抗原分子；
(c1)任选的如权利要求1中所定义的固定化手段，和
(c2)如权利要求1中所定义的第二标记手段；和
(d)如权利要求1中所定义的第一标记手段。
9.一种根据权利要求8的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)所述第一抗原分子，由第二标记手段标记；和
(b)所述第二抗原分子，由第一标记手段标记。
10.一种根据权利要求8的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)所述第一抗原分子，被固定于固体支持物；和
(b)所述第二抗原分子，由第一标记手段标记。
11.一种根据权利要求8、9或10的试剂盒，所述试剂盒用于诊断胰岛素受体家族相关疾病的存在或发病。
12.根据权利要求1-7任一项的方法中定义的包括[第一抗原分子]-[分析物抗体]-[第二抗原分子]的复合物在鉴定用于治疗和/或预防胰岛素受体家族相关疾病的药学有效化合物中的用途。
13.一种根据权利要求8-10任一项的试剂盒在鉴定用于治疗和/或预防胰岛素受体家族相关疾病的药学有效化合物中的用途。
14.根据权利要求1-7任一项的方法在鉴定胰岛素受体家族的一个或多个成员和抗体之间相互作用的调节剂中的用途。
15.根据权利要求8-10任一项的试剂盒在鉴定胰岛素受体家族的一个或多个成员和抗体之间相互作用的调节剂中的用途。
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