CN104116712B

CN104116712B - 一种用于肺部给药的干扰素‑白蛋白中空性纳米聚集颗粒

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Publication number: CN104116712B
Application number: CN201310141203.8A
Authority: CN
Inventors: 谢英; 王艺辉; 刘畅; 涂盈锋; 丁源; 徐海峰
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: CN104116712A

Abstract

本发明提出了一种具有中空性结构的干扰素‑白蛋白纳米聚集颗粒，制剂形式为干粉吸入剂。该颗粒圆整，表面有凹陷，显示中空性球状壳结构，空气动力学半径为3.47μm，可吸入粒子比例(FPF)为83.7％。该制剂在保持干扰素药物活性、降低给药剂量、减小副作用等方面具有一定的优势，是一种具有前景的新型干扰素干粉吸入剂。该颗粒的制备工艺为：采用吸附法和包载法制备干扰素‑白蛋白纳米溶液，然后通过喷雾干燥技术制得纳米聚集颗粒，所用载体为乳糖。最优工艺参数为：入口温度：130℃，蠕动泵转速为5，压缩空气压力为0.6MPa；喷雾溶液固体含量为3％。

Description

一种用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒

技术领域该发明提出了一种干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒，其用途为肺部给药治疗病毒性肺炎，制剂形式为干粉吸入剂。该制剂由干扰素-白蛋白纳米溶液与乳糖混合后经喷雾干燥制备而得，本发明优化了干扰素-白蛋白纳米粒的制备工艺和处方，以及筛选了喷雾干燥工艺参数，得到了肺部沉积率高、稳定性好、具有肺部缓释特征的一种干扰素肺部给药制剂，属于药学中纳米给药系统和生物制药技术领域。

背景技术干扰素是一种多功能的高活性蛋白质，分子量约为20000Da^[1]。目前临床上应用最广泛的是干扰素α。作为一种广谱抗病毒剂，干扰素作用机制主要是通过与细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒复制，同时还可增强NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用^[2]。

1973年，Merigan等首先证实了干扰素能预防呼吸道病毒感染^[3]，现在国内外不少学者开始将干扰素α应用于小儿病毒性呼吸道感染，在急性上呼吸道感染，喘憋性肺炎、病毒性肺炎等方面取得了一定疗效。现已有多种干扰素产品用于呼吸道病毒感染的防治^[4]。但现行的干扰素干粉吸入剂仍存在一些问题：(1)肺部沉积率不高，仅为20％左右^[5]。经口吸入给药后，大部分滞留于口腔和咽喉部位，造成较大部分的药物浪费；(2)干扰素到达肺泡后快速释放，易被肺清除系统快速清除，与细胞作用时间短，需要频繁给药；(3)干扰素的不良反应如发热、头痛、寒战等流感样症状与剂量具有相关性^[6]。

近期研究表明，在纳米技术的基础上，通过将纳米粒溶液或纳米粒和辅料的混合液进行喷雾干燥，可制得的中空性纳米聚集颗粒，也称多孔性纳米粒聚集颗粒(porousnanoparticle-aggregate particles，PNAPs)^[7]。这种“中空颗粒”有助于提高颗粒的分散性质，提高肺部沉积率，同时，还能发挥纳米给药系统的优势，在病灶部位缓慢释放药物可以达到长效、降低药物不良反应等效果。2002年，Tsapis等人^[8]最先制备了这样的中空纳米粒聚集颗粒。在Tsapis的基础上，Hadinoto等人^[9，10]发表了多篇关于PNAPs的研究文章。他们首先使用了干粉制备中常用的乳糖作为辅料，分别以不载药的多种粒径(20-170nm)的聚丙烯酸酯和二氧化硅纳米粒为模型，通过喷雾干燥，制成大的孔性空壳颗粒。这种多孔性纳米粒聚集颗粒有利于药物的储存和吸收，将药物递送至支气管和肺泡区域，能够起到局部或全身治疗的效果。但需引起我们注意的是，该PNAPs中用到的聚丙烯酸酯和二氧化硅为降解缓慢甚至为不能够被生物降解的材料，其到达肺部后若不能及时被清除，很容易造成纳米粒在肺部的沉积，引起矽肺甚至肺组织纤维化，给用药安全带来隐患。

白蛋白是一种不具有调理作用的蛋白，有毒性低、内源性、生理相容性好等优点，此外，白蛋白还具有在肿瘤和炎症组织中聚集的特性^[11]，这些优势使其成为抗肿瘤药物及抗炎药物传递系统的理想材料。在肺部给药干粉吸入剂中，白蛋白和二棕榈酰磷脂酰胆碱也常用作内源性物质添加到干粉吸入剂中。如Codrons^[12]在甲状旁腺激素(PTH)干粉吸入剂处方中、美国Inhale公司在制备以干扰素(IFN)为主的干粉配方中均添加了白蛋白。白蛋白纳米粒是以白蛋白为载体，包封或吸附药物，经过固化分离而形成的实心球体。20世纪70年代已有制备自蛋白纳米粒的相关报道。经过40年的发展，白蛋白纳米粒已经成为一种相对成熟的药物传递系统^[13]。目前人血清白蛋白紫杉醇纳米粒已经获得FDA批准。然而，长期以来，关于白蛋白纳米粒的载药研究多集中于化学药物，对于载蛋白多肽类药物鲜见报道，曾一度有人怀疑，白蛋白纳米粒载蛋白多肽类药物的可行性。

综上所述，白蛋白用于肺部给药的经验为本发明奠定了良好的基础，但经文献检索，尚未见白蛋白纳米粒应用于肺部给药的研究，更没有干扰素-白蛋白中空纳米聚集颗粒的研究报道。本发明从理论分子相互作用的角度，通过计算分析，找到了白蛋白分子和干扰素分子的作用区域，为白蛋白纳米粒装载干扰素提供了理论依据；继而，通过实验进一步验证了白蛋白纳米粒载干扰素的可行性，优化得到了干扰素包封率高于70％、载药率高于1.25％的干扰素-白蛋白纳米粒制备工艺和处方。在此基础上，应用喷雾干燥技术，制备了干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒作为肺部给药的干粉吸入剂，其不仅具有良好的肺部沉积率，而且具有较高的干扰素生物活性和较高的肺部药物滞留浓度，在保持药物活性、降低给药剂量、减小副作用等方面具有一定的优势，是一种具有前景的新型干扰素干粉吸入剂。

发明内容

1.该发明的创新点之一是从理论和实验两个方面证实了白蛋白装载干扰素形成纳米粒的可行性。

本发明首次系统研究了干扰素和白蛋白分子结合的可能性，在理论上使用蛋白质对接程序在线服务ZDOCK Server(http：//zdock.umassmed.edu/)将两个蛋白质分子进行刚性对接，并进行了拉伸动力学的模拟计算，结果发现氢键和盐桥是白蛋白和干扰素结合中的主要相互作用，其中白蛋白(BSA)的第503号残基GLU和干扰素(IFN)的第125号残基ARG，BSA的第537号残基LYS和IFN的第5号残基GLU，BSA的第493号残基ASP和IFN的第2号残基ASP更是起着至关重要的作用。在实验中，通过PH值、两种蛋白质量比例及固化剂戊二醛的用量筛选，得到了包封率约为70％，粒径约为250nm的干扰素-白蛋白纳米溶液。

白蛋白装载化学药物的研究已有40余年的历史，人血清白蛋白载紫杉醇药物已经FDA 批准上市，但对于白蛋白载蛋白多肽类药物，一直是这个领域的空白地带。本发明在理论上和实验上同时证实了白蛋白装载干扰素的可行性，为白蛋白作为纳米粒载体装载蛋白多肽类药物提供了依据，属于新体系创新。

2.该发明的创新点之二在于提出了具有中空结构的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒及其制备工艺。

本发明以干扰素-白蛋白纳米粒溶液为基础，与乳糖等载体混合后，制备成一定浓度的原溶液，经对喷雾干燥参数进行优化，得到了一种具有中空结构的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒及其制备工艺。

制备工艺：将适量乳糖加入至干扰素-白蛋白纳米溶液中，配制成总固体浓度为1％～5％的溶液，其中干扰素-白蛋白纳米粒与乳糖的质量比例为1∶4～1∶8；喷雾干燥仪器参数为：入口温度：90～130℃，出口温度：50～70℃，蠕动泵转速为5～10，氮气流量为20～50。

最优工艺参数为：入口温度：130℃，蠕动泵转速为5，氮气流量为50；喷雾溶液固体含量为3％。

经扫描电镜观测发现制备的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒具有中空结构，几何粒径约为2.0～4.0μm，纳米粒聚集颗粒复溶效果较好，复溶系数S_f/S_i接近于1，表明该聚集颗粒复溶后粒径基本上能恢复到原纳米溶液水平。经多级撞击器测定该聚集颗粒的平均空气动力学半径为3.47μm，可吸入粒子比例FPF达到83.7％。

本发明所得到的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒未曾见报道，填补了纳米聚集颗粒的空白，为新体系创新。本发明提出的制备工艺参数也未见相关系统性筛选的报道，属于工艺方法创新。

3.该发明的创新点之三在于干扰素-白蛋白纳米粒溶液的制备工艺。

虽然曾有白蛋白装载干扰素γ的研究报道，但其没有系统地进行研究，所得到的白蛋白干扰素载药率仅为1μgIFN/mgBSA，即0.1％^[14]。而且其稳定性欠佳，易于沉积聚团。本发明在进行单因素考察的基础上，优化了pH值、两种蛋白质量比例、固化剂用量等影响因素，通过两种方法，即包载法和吸附法两种工艺制备了干扰素-白蛋白纳米粒溶液，包封率约70％，载药率约为1.25％，粒径约为250nm。制剂具有良好稳定性，4℃下放置一周，能够重新分散，分散后平均粒径约为250nm。

包载法制备工艺：用蒸馏水配制1％白蛋白溶液，加入一定量干扰素原液，调节pH值7.0，在500rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时。搅拌完成后，于40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，得到干扰素-白蛋白纳米粒混悬液。

吸附法制备工艺：用蒸馏水配制1％的白蛋白溶液，在500rpm～1000rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时，得到空白白蛋白纳米粒；40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，剩余的溶液用适量蒸馏水稀释后调节pH值为5.5，加入干扰素，持续搅拌一段时间，得到干扰素-白蛋白纳米粒溶液。

其中关键技术为pH值，包载法为7.0，而吸附法为5.5，白蛋白与干扰素质量比为80∶1～160∶1，固化剂选为戊二醛，其用量为0.032％～0.1％。

4.该发明的创新点之四在于干扰素-白蛋白纳米粒与干扰素相比较具有更高的生物活性。

干扰素为生物活性物质，常会受到溶剂、温度、搅拌等因素的影响。因此经BSA纳米粒载药后，有必要对其生物活性进行测定评价。

本发明中，根据中国药典中收载的细胞病变抑制法(CPE)来测定干扰素生物活性效价。测定结果表明，本发明干扰素经白蛋白纳米粒包载或吸附后，其抗病毒活性不但没有因此被掩盖或丧失，反而得到一定的提高，是干扰素药物生物活性的150％。分析其原因，干扰素抗病毒机制为干扰素通过与细胞表面的IFN特异性受体结合后，刺激产生NO，并诱导抗病毒蛋白生成，如蛋白激酶、磷酸二酯酶、2’-5’寡腺苷酸合成酶等，从而抑制病毒蛋白的翻译，抑制病毒繁殖。干扰素被白蛋白纳米粒包载或吸附后，有助于滞留在细胞外液中，与细胞表面受体结合，促进了抗病毒活性的提高。

终上所述，本发明所提出的干扰素-白蛋白纳米粒与干扰素相比较，具有更高的生物活性，这有助于降低给药剂量、减小毒副作用，是-种极具应用前景的干扰素纳米药物。这种提高生物活性的新制剂形式未见报道。

5.该发明的创新点之五在于干扰素-白蛋白纳米粒在小鼠肺部给药中具有较好的药物滞留浓度，具有缓释特征。

本发明的干扰素-白蛋白纳米粒经小鼠气管给药后，在肺组织的分布浓度高于干扰素组，给药9小时药物浓度为干扰素组的2.6倍，消除速率为干扰素组的41.4％，在肺部滞留时间明显提高，有利于降低给药剂量和给药频率。白蛋白具有良好的生物相容性，其代谢产物是组织的营养物质，毒性低，因此干扰素经白蛋白装载后作为肺部给药新制剂的载体具有一定优势和良好的应用前景。

附图说明

附图1 ZDOCK评价体系给出的5个最优的蛋白质对接模型。灰色的是BSA，彩色的是各个模型中IFN。IIIA区域BSA与IFN结合几率最大的区域。

附图2 Model1和Model2中BSA和IFN之间的静电作用能(a)和范德华作用能(b)在拉伸动力学(SMD)中随时间的变化趋势。附图2(a)表示了Model1和Model2中BSA和IFN之间的静电作用能随时间的变化趋势。可以看到Model2中的静电作用能(红)约在-550kJ/mol上下波动，Model1中的静电作用能(黑)约在-350kJ/mol上下波动。在5000ps以后，Model2中的BSA与IFN之间的静电作用能明显比Model1中更大。附图2(b)表示了Model1和Model2中BSA和IFN之间的范德华作用能随时间的变化趋势。Model2中BSA和IFN之间的范德华作用能(红)在-200kJ/mol至-400kJ/mol之间波动，最后稳定在-300kJ/mol左右。而Model1中BSA和IFN之间的范德华作用能(黑)在-50kJ/mol至-250kJ/mol之间波动。整个过程中，Model2中的BSA与IFN之间的范德华作用能始终比Model1中更大。综上，Model2中的BSA和IFN之间相互作用能量比Model1更大，这也进一步证明了Model2中BSA和IFN之间的结合方式比Model1更加合理稳定。

附图3 拉力与质心距离随时间的变化关系。从此图上还可以看出某些力的峰值与氢键断裂的对应关系。经分析，存在氢键1：BSA的GLU503OE1-IFN-a1b的ARG125HE；氢键2：BSA的GLU503OE2-IFN-a1b的ARG125HE。

附图4 附图4-a：GLU503-ARG125形成的氢键。附图4-b：LYS537-GLU5形成的氢键；附图4-c ASP493-ASP2形成的氢键白色的虚线表示氢键，形成氢键的原子由绿色的字母和数字表示。白色数字表示氢键的长短，单位是

附图5 干扰素-白蛋白纳米粒小鼠肺部给药后，在肺组织(a)和在血(b)中的药物浓度随时间的变化。从图中可见，干扰素-白蛋白纳米粒组在肺组织的药物浓度高于游离干扰素组，入血浓度低于干扰素组。显示干扰素经白蛋白纳米粒装载后在肺组织有较高的药物滞留浓度，对发挥药效具有一定积极意义。

附图6 干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒扫描电镜图谱。从图中可见，颗粒圆整，几何粒径约为2.0～4.0μm，表面凹陷，为中空性结构。

附图7 干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒的空气动力学粒径分布图。Stage：1)8.1μm，2)4.4μm，3)2.8μm，4)1.7μm，5)0.94μm，6)0.55μm，7)0.34μm.

具体实施方式

实施例1白蛋白装载干扰素可行性的理论佐证

1.模拟方法：

蛋白质的对接：为了找到两个蛋白质的潜在结合位点，使用蛋白质对接程序在线服务ZDOCK Server(http：//zdock.umassmed.edu/)将两个蛋白质进行刚性对接。将经过MD优化后的两个蛋白质三维结构提交至该在线服务，找到可能的潜在位点。

蛋白质潜在位点的筛选和比较：使用GROMACS4.5对Model1和Model2进行30ns的动力学模拟，优化结构，根据时间的变化筛选出最合理的结合方式。

拉伸动力学(SMD)对结合方式的论证：固定BSA的骨架原子，以保持BSA的位置不变，但允许BSA的侧链原子自由运动。而对于IFN则没有任何限制，骨架和侧链均可以自由运动。将拉力作用于IFN上，沿Y轴负方向，以1nm/ns的恒定速度将IFN和BSA拉开，拉动时间2.8ns，以获得这个拉动过程中拉力和两个蛋白质的质心距离随时间的变化情况，寻求拉力与相互作用位点的关系。

(2)模拟结果：

ZDOCK Server根据其评价体系，一共给出了排名前5的最优的蛋白质对接模型，分别为Mode11，Model2，Model3，Model4，Model5。如附图1所示，灰色的是BSA，彩色的是各个模型中IFN。其中Model2，Model3，Model4中的IFN都集中在BSA的IIIA区域。我们选择IIIA区域中排名最靠前的Model2进一步分析。同时，由于Model1是排名第一的模型，也不能随意忽略，因此将Model1和Model2一起进行动力学模拟，作比较分析。

经过了30ns的分子动力学模拟以后，分析出Model1和Model2在整个MD过程中的能量变化。Model1和Model2的静电作用能和范德华能图谱见附图2，从图中可以看出，Model2中的BSA和IFN之间相互作用能量比Model1更大，进一步证明了Model2中BSA和IFN之间的结合方式比Model1更加合理稳定。

使用VMD可视化软件，通过拉伸动力学对BSA与IFN质点距离和拉力进行相关性分析，发现了拉力与氢键的断裂之间的对应关系(附图3)，BSA的第503号残基GLU和IFN的第125号残基形成氢键的情况如附图4所示，在这两个残基之间可以形成1至4个氢键，其中GLU503OE1-ARG125HE和GLU503OE2-ARG125HE形成的氢键强度最大(附图4-a)。同时，BSA的第537号残基LYS和IFN的第5号残基GLU也可以形成氢键(附图4-b)，BSA的第493号残基ASP和IFN的第2号残基ASP之间的氢键(附图4-c)存在时间长达1450ps，且一直保持着较强的相互作用。

BSA和IFN在形成某些氢键的过程，存在带正电的氨基和带负电的羧基，则氨基与羧基通过静电作用相互吸引形成盐桥。盐桥也被认为有增强蛋白质之间的相互作用的效果。

【结论】：IFN与BSA的IIIA区域相互作用的可能性最大，IIIA区域是两者的结合位点。氢键和盐桥是蛋白质结合中的主要相互作用。其中BSA的第503号残基GLU和IFN的第125号残基ARG，BSA的第537号残基LYS和IFN的第5号残基GLU，BSA的第493号残基ASP和IFN的第2号残基ASP更是起着至关重要的作用。

实施例2干扰素-白蛋白纳米粒的制备工艺和性质

(1)包载法：

用蒸馏水配制1％BSA溶液，加入一定量IFN原液，调节pH值，在500rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时。搅拌完成后，于40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，得到干扰素-白蛋白纳米粒混悬液。采用高速离心法测定纳米粒的包封率，激光光散射仪测定粒径。

pH值、BSA与IFN的比例、戊二醛用量三个因素对包封率有显著影响，结果如表1所示。

表1.包载法中影响因素考察

根据表中结果，确定包载法中最佳工艺参数和处方为pH7.0，BSA与IFN质量比例为80∶1，戊二醛用量为0.032％。

按最优处方制备的干扰素-白蛋白纳米粒粒径分布为235.0士5.7nm。

(2)吸附法制备工艺：

用蒸馏水配制1％的白蛋白溶液，在500rpm～1000rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入0.04％戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时，得到空白白蛋白纳米粒；40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，剩余的溶液用适量蒸馏水稀释后调节pH值，加入干扰素原溶液，持续搅拌一段时间，得到干扰素-白蛋白纳米粒溶液。

制备工艺中考察了pH值、BSA与IFN质量比例、孵育时间和孵育温度。结果见表2。

表2.吸附法影响因素考察

由表2结果可见，孵育时间和孵育温度对干扰素-白蛋白包封率影响不大，最佳pH为5.5，最佳BSA与IFN质量比例为80∶1。

按最优处方制备的干扰素-白蛋白纳米粒的平均粒径为254.3士9.8nm.

【结论】包载法和吸附法可制备包封率约70％，载药率为1.25％的干扰素-白蛋白纳米粒，关键技术为pH值、BSA与IFN的质量比例和戊二醛用量。其中，包载法最优pH为7.0，吸附法最优pH为5.5；BSA与IFN最优质量比为80∶1；戊二醛用量最优为0.032％。

实施例3干扰素-白蛋白纳米粒的生物活性

(1)实验方法：

干扰素的抗病毒作用是通过诱导宿主细胞产生多种酶来干扰病毒复制过程的各个环节，抑制病毒的增殖，从而保护细胞免受病毒侵害。利用这个原理，可测定干扰素生物活性。细胞病变抑制法就是依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。该方法是通过病毒入侵细胞来测定干扰素的效价的，最直观地反映了干扰素的生理活性。

(2)实验结果和结论：

BSA-IFN活性测定结果如表3所示，结果表明，BSA-IFN中，干扰素抗病毒活性相对于原液提高了50％左右。

表3BSA-IFN纳米粒的相对生物活性

【结论】干扰素经BSA纳米粒包载或吸附后，有助于滞留在细胞外液中，与细胞表面受体结合，使抗病毒活性提高了50％。

实施例4干扰素-白蛋白纳米粒的肺部药动学

(1)实验方法：

氯胺T法¹²⁵I标记干扰素：用生理盐水配制干扰素溶液4mg/mL，氯胺-T溶液3mg/mL。在EP管中，依次加入20μL干扰素、1mCi¹²⁵I-Na、60μL氯胺-T，室温反应60s后，加入200μL1mg/mL的偏焦亚硫酸钠终止反应。PD-10柱分离纯化。标记率为80％，放射纯度为95％，比活为9μCi/ug.

受试药液：

a.游离[125I]IFN溶液：取100uci的[¹²⁵I]IFNα-1b溶液于1.5mlEP管中，加入一定量干扰素原液，使干扰素总量为80ug，用蒸馏水定容至1ml。最后溶液中IFN质量浓度为80ug/ml，放射浓度为100uci/ml。

b.[125I]IFN-BSA纳米粒溶液：首先制备空白BSA纳米粒(10mgBSA/ml)，取640ul空白BSA纳米粒溶液，加入100uci的[¹²⁵I]IFNα-1b溶液，补充干扰素原液，使干扰素总量为80ug，用蒸馏水定容至1ml。受试药液中IFN质量浓度为80ug/ml，放射浓度为100uci/ml。

给药方法：气管穿刺法给药，ICR雄性小鼠用4％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰位固定，修剪颈部皮毛，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及胸骨舌骨肌，暴露气管。给药时先使动物倾斜45°，用微量注射器自气管中间部位的气管环间，往气管内伸入1cm左右注入药液10μL/20gbw(给药剂量为1μCi/20gbw，0.8μg/20gbw)，再打入10μl空气，使药液能被导入到肺部深处。给药后将动物直立、顺时针相同方向旋转1min，使药液尽可能分布均匀。再与水平呈45°放置，小鼠能自主呼吸。分别于给药后0.25，1，3，6，9h处死取血并分离气管及肺组织，每个时间点8只动物。

药物含量测定：小鼠摘眼球取血后，将血置于已知质量的计数管中，精密称重。气管和肺组织用滤纸去除血污后精密称重，装于计数管中。测定血、气管、肺组织的每分钟放射性计数(counts per minute，cpm)。

以1μci给药量的放射性计数扣除气管滞留药量，准确计算每只动物给药剂量；根据如下公式计算各时间点血样及组织样本药物含量，以药物含量对时间作图绘制药动学曲线，经WinNonLin和NONMEM软件处理，进行药动学模型拟合以得到药动学参数。

其中：

c为单位质量的血或肺组织中所含有的IFN的质量；

cpm(t)为血或肺组织的每分钟放射性计数；

cpm(lμci)为1μci的[¹²⁵I]IFN-BSA纳米粒混悬液或游离[¹²⁵I]IFNα-1b溶液的每分钟放射性计数；

cpm(locates)为气管的每分钟放射性计数，作为给药部位的残留量。

m_tissue为收集的血或肺组织质量。

(2)实验结果：

不同时间点的血中药物浓度(μg/g)和肺组织药物浓度(μg/g)结果如表4，附图5所示。比较各给药时间点，[¹²⁵I]IFN-BSA纳米粒制剂组在肺组织的药物滞留浓度均低于游离[¹²⁵I]IFN参比组。在体内肺组织药动学研究中，两组给药剂量相同，初始肺组织浓度基本一致。从测定结果可以看出给药9hr后，对照组已有75.6％的药物被吸收入血而分布至其他组织，而制剂组仅有34.6％的药物被吸收入血，表明制剂组药物消除速率较小，药物在肺部有明显滞留。

表4游离干扰素和干扰素-白蛋白纳米粒气管给药在血和肺组织的药物浓度(n＝6～8)

分别将每只小鼠的给药剂量(μg)，处死时间(min)和处死时肺组织药物含量(μg/g) 输入WinNonlin，采用一级动力学消除方程进行拟合(C＝c₀×e^-kt)。分别得到两组的消除速率常数k(h^-1)和初始药物含量(μg/g)，如表5所示。两组的消除速率常数k分别为0.036h^-1和0.087h^-1，游离[¹²⁵I]IFN组的清除速率常数k为[¹²⁵I]IFN-BSA制剂组的2.42倍，两者的初始药物含量分别为4.46μg/g和5.23μg/g。

表5游离干扰素和干扰素-白蛋白纳米粒气管给药在肺组织的药动学参数

【结论】干扰素经白蛋白纳米粒装载后，经气管给药，肺部药物浓度得到了提高，有利于降低给药剂量和给药频率。白蛋白具有良好的生物相容性，其代谢产物是组织的营养物质，毒性低，因此干扰素经白蛋白装载后作为肺部给药新制剂的载体具有一定优势和良好的应用前景。

实施例5干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒的制备工艺和性质

(1)实验方法：

a.制备工艺：将适量乳糖加入至干扰素-白蛋白纳米溶液中，配制成总固体浓度为1％～5％的溶液，其中干扰素-白蛋白纳米粒与乳糖的质量比例为1∶2～1∶8；喷雾干燥仪器参数为：入口温度：90～130℃，出口温度：50～70℃，蠕动泵转速为5～10，氮气流量为20～50。

b.形态学鉴定：得到的白色、疏松、干燥的固体粉末，表面喷一层金颗粒后，放入扫描电子显微镜中，场加速电压为1.0kV。观察粒子的形态、完整度、是否粘连，数目等。

c.空气动力学半径的测定：制备FITC标记的白蛋白纳米聚集颗粒，将制得的干粉装入3号胶囊中，40mg/胶囊，并顺序装入胶囊型DPI给药装置。预先通过气流计调节NGI的气流速度为60L/min。在将胶囊型DPI给药装置与新一代冲击器(NGI)连通的情况下，用手指掀压装置两侧按钮，将胶囊两端刺破，再打开真空泵15s，使得粉末被吸入NGI中，依照不同的空气动力学粒径而沉降于不同的样品盘中。后取下吸入器，重复上述步骤，共测定10粒胶囊。最后打开NGI装置，用5ml蒸馏水分别清洗每个样品盘，收集清洗液，采用荧光检测方法测定各盘中沉积粒子中BSA含量。

8个样品盘中，前7个样品盘的截留粒径依次为8.1μm，4.4μm，2.8μm，1.7μm，0.94μm，0.55μm，0.34μm，可吸入粒子的空气动力学粒径范围大约在2～5μm，因此用第2、3、4盘中BSA含量除以各样品盘中总的BSA含量计算可吸入粒子比例(FPF)，计算公式为：

将所得空气动力学粒径分布结果输入http：//www.mmadcalculator.com/的在线MMAD计算程序，得到平均空气动力学粒径。

a.其他性质的测定：采用BET比表面积检测法测定干粉的比表面积；固定圆锥法测定干粉的休止角；量筒法测定干粉的堆密度及振实密度，并计算压缩度，压缩度＝(振实密度-堆密度)/振实密度。

(1)实验结果：

a.扫描电镜结果：经扫描电镜观测发现制备的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒表面凹陷，具有中空结构，如附图6所示，几何粒径为2.0～4.0μm。纳米粒聚集颗粒复溶效果较好，复溶系数之比S_f/S_i接近于1，表明该聚集颗粒复溶后粒径基本上能恢复到原纳米溶液水平。

b.经新一代冲击器(NGI)测定该聚集颗粒的平均空气动力学粒径为3.47±0.11μm，粉末的空气动力学粒径分布如附图7所示，Stage1至Stage 7截留直径依次为8.1μm，4.4μm，2.8μm，1.7μm，0.94μm，0.55μm，0.34μm。以Stage2至Stage 4中截留比例作为可吸入粒子比例(FPF)，计算得到FPF为83.7％，表明该产品有较高的肺部沉积率。

c.其它粉体学相关性质：比表面积为2.38±0.23m²/g，休止角为42.3±3.5°，堆密度为0.193±0.022g/cm³，振实密度为0.234±0.036g/cm³，压缩度为17.2±3.4％。

【结论】本发明制备的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒具有中空性结构，加水能够极易复溶，复溶后粒径无明显变化，复溶系数接近于1。其肺部沉积率较高，FPF达到83.7％，具有一定的流动性，是一种良好的肺部干粉吸入剂。

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Claims

1.一种用于肺部给药的干扰素(IFN)-白蛋白(BSA)中空性纳米聚集颗粒，其特征在于，所述干扰素(IFN)-白蛋白(BSA)中空性纳米聚集颗粒是由干扰素-白蛋白纳米粒溶液与载体混合后经喷雾干燥制成的，其具有中空的球状壳结构，干扰素-白蛋白分散在载体中，构成所述纳米聚集颗粒的球状壳；所述载体选自乳糖；其中所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用吸附法或包载法进行制备，使用戊二醛作为固化剂，用量为0.032％～0.1％；白蛋白与干扰素的质量比为80∶1～160∶1；当所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用吸附法制备的时候，调节溶液pH值为5.5，当所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用包载法制备的时候，调节溶液pH值为7.0。

2.根据权利要求1所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒，其特征在于所述干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒的空气动力学平均粒径为3.47μm，可吸入粒子比例(FPF)高于80％，比表面积为2.38±0.23m²/g，休止角为42.3±3.5°，复溶后粒径为250nm左右，复溶系数接近为1。

3.根据权利要求1所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒，其特征在于所述干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒被配制成干粉吸入剂的形式。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒的制备方法，其特征在于：

(1)采用吸附法或包载法制备干扰素-白蛋白纳米粒溶液；其中使用戊二醛作为固化剂，用量为0.032％～0.1％；白蛋白与干扰素的质量比为80∶1～160∶1；当所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用吸附法制备的时候，调节溶液pH值为5.5，当所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用包载法制备的时候，调节溶液pH值为7.0；

(2)然后将适量乳糖加入至干扰素-白蛋白纳米溶液中，配制成1％～5％的溶液，然后喷雾干燥得到所述的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒；其中干扰素-白蛋白纳米粒与乳糖的质量比例为1∶2～1∶8；喷雾干燥仪器参数为：入口温度：90～130℃，蠕动泵转速为5～10，氮气流量为20～50。

5.根据权利要求4所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用吸附法制备，具体步骤如下：

用蒸馏水配制1％的白蛋白溶液，在500rpm～1000rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入0.4％的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时，得到空白白蛋白纳米粒；40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，剩余的溶液用适量蒸馏水稀释后调节pH值为5.5，加入干扰素原液，4℃下持续搅拌一段时间，得到所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液。

6.根据权利要求4所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液采用包载法制备，具体步骤如下：

用蒸馏水配制1％BSA溶液，加入一定量IFN原液，调节pH值为7.0，在500rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时；搅拌完成后，于40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，得到所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液。

7.一种用于肺部给药的干扰素-白蛋白纳米粒溶液，其特征在于其由下列方法制备得到：

用蒸馏水配制1％的白蛋白溶液，在500rpm～1000rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入0.4％的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时，得到空白白蛋白纳米粒；40℃水浴中减压蒸馏，除去乙醇，剩余的溶液用适量蒸馏水稀释后调节pH值为5.5，加入干扰素原液，4℃下持续搅拌一段时间，得到所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液；或者

8.根据权利要求7所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白纳米粒溶液，其特征在于所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液中干扰素-白蛋白纳米粒的包封率为70％以上，载药率高于1.25％，粒径为250nm左右，贮存稳定性好，4℃贮存1周后粒径无明显变化，生物学活性为游离干扰素的150％。

9.根据权利要求8所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白纳米粒溶液，其特征在于所述干扰素-白蛋白纳米粒溶液经气管穿刺给药后，在小鼠肺部的药物滞留浓度明显高于游离干扰素，并具有缓释特征。

10.根据权利要求1-3任一项所述的用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒在制备用于治疗呼吸道病毒感染的药物中的用途。