CN104109208A - 使用抗gpr49抗体的癌症的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与GPR49蛋白结合、且对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑制活性的抗体。细胞增殖抑制活性是指抗体依赖性细胞毒和补体依赖性细胞毒等细胞毒活性。本发明还公开了含有本发明的抗体作为有效成分的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌药。癌症例如为胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤。本发明进一步公开了通过检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白的基因的表达来诊断癌症的方法、以及用于该方法的诊断药和试剂盒。

Description

使用抗GPR49抗体的癌症的诊断和治疗

本申请是原案申请日为2008年11月14日、原案申请号为200880125021.9(国际申请号为PCT/JP2008/070751)、发明名称为“使用抗GPR49抗体的癌症的诊断和治疗”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及癌症的诊断方法、治疗方法和抗癌药。

背景技术

GPR49分子是由人染色体12q12的ENSG00000139292基因编码的蛋白，该分子是G蛋白偶联7次膜结合蛋白的激素受体家族的LGR家族(富含亮氨酸GPCR家族、以下称作LGR家族)的成员，这由其氨基酸序列的特征即可明确(非专利文献1)。LGR家族成员中，包括LHR、TSHR、FSH等激素受体、以及以松弛素、胰岛素样肽3(INSL3)等作为配体的LGR7、LGR8等(非专利文献2)。已知所有配体均包含不同的肽，主要传递由cAMP介导的信号。LGR家族具有包含7次跨膜蛋白区和N末端长的胞外区的结构，胞外区中存在9-17个由约25个氨基酸构成的重复的富含亮氨酸的区(富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat)：LRR)。GPR49有17次LRR(非专利文献1)。由TSHR等的分析可知：配体以高亲和性与该细胞外的LRR结合，并且与第2细胞外环状区结合，从而进行与G蛋白偶联的信号传递(非专利文献3；Pharmacology&Therapeutics103，21(2004))。有关GPR49的配体尚未确定，但有报道称：与果蝇(Drosophila)近缘的LGR、即DLGR2的配体是包含作为BMP拮抗剂的家族分子的Burs、Pburs(Bur的配偶体)的Bursicon，所以尚未明确配体的LGR4、LGR5(GPR49)、LGR6的配体也是BMP拮抗剂(非专利文献4、非专利文献2)。关于GPR49分子的功能，根据敲除小鼠的分析，暗示其与舌粘连(ankylogenesis)有关(非专利文献5)。另外，根据毛囊干细胞的基因表达分析，还推测其参与干细胞的增殖(非专利文献6)。

有关GPR49分子与癌症的关系，山本等人报道了：GPR49在肝细胞癌患者中高度表达(非专利文献7)，特别是在具有β-连环蛋白突变的患者中，GPR49在mRNA水平的表达亢进。此外，伊藤等人根据Affymetrix公司的Genechip数据分析，列举GPR49作为在胃癌患者中高度表达的分子之一(专利文献1)。

有报道称：GPR49在大肠癌、卵巢癌中表达亢进，在大肠癌中有64％(25/39)的患者可见mRNA水平的表达亢进，而在卵巢癌中有53％(18/33)的患者可见mRNA水平的表达亢进(非专利文献8)。有报道称：在使用PoAb的免疫染色中，GPR49在正常组织中的胎盘、骨骼肌中表达(非专利文献8)。有关GPR49与癌化的关系，根据细胞灶形成试验，在只进行了基因导入的NIH3T3中4周没有细胞灶形成，而在添加有培养SW620的培养上清(条件培养基)的细胞中3周内可见细胞灶形成。由此设想发生了依赖于配体的癌化。在siRNA实验中，可见subG1细胞的蓄积，发生了凋亡。这暗示：GPR49在大肠癌细胞中具有阻碍凋亡诱导的功能。

但是，还有报道称：基于癌细胞株的表达，虽然GPR49在大肠癌、卵巢癌、神经胶质瘤、黑色素瘤中表达亢进，但在乳癌、肺癌中未见其表达亢进(非专利文献8)。

专利文献1：WO2000071710

非专利文献1：Mol.Endocrinology12，1830(1998)

非专利文献2：Journal of Endocrinology187，333(2005)

非专利文献3：Pharmacology&Therapeutics103，21(2004)

非专利文献4：PNAS102，2820(2005)

非专利文献5：Molecular and Cellular Biology，24，9736(2004)

非专利文献6：Nature Biotechnology22，411(2004)

非专利文献7：Hepatology37，528(2003)

非专利文献8：Cancer Biology&Therapy5，419(2006)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于：提供诊断癌症的新方法、治疗癌症的新方法、新的细胞增殖抑制剂和抗癌药。

解决课题的方法

本发明人等发现：在胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤等的癌细胞中，不仅GPR49的基因、就连GPR49的蛋白也高度表达。另外，本发明人等制成了抗GPR49蛋白的单克隆抗体，并首次发现：将具有100kDa的分子量的GPR49蛋白切断，分成60kDa和40kDa的片段。由于N末端侧的60kDa的片段被切断后分泌到细胞外，所以其作为癌症诊断用标志物是有用的。另外，认为C末端侧的40kDa的片段作为治疗用抗体的靶是有用的。

并且，本发明人等在测定抗GPR49抗体的补体依赖性细胞毒(complement-dependent cytotoxicity；CDC)活性以及抗体依赖性细胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC)活性时，发现抗GPR49抗体对GPR49表达细胞具有CDC活性和ADCC活性。进一步发现：利用结合有毒素的抗体，引起GPR49表达细胞的细胞毒的活性。根据上述认识，本发明人等发现：抗GPR49抗体对原发性或转移性的各种癌症的诊断、预防和治疗有效，从而完成了本发明。更具体而言，本发明人等发现：GPR49可用作用于治疗或诊断以胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤为代表的GPR49表达亢进的癌症的手段，从而完成了本发明。

即，本发明提供与GPR49蛋白结合的抗体。本发明还提供与GPR49蛋白结合、且对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞毒活性的抗体。优选该细胞毒活性为ADCC活性。还优选该细胞毒活性为CDC活性。本发明又提供结合有细胞毒性物质的抗体。

本发明还提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的药物组合物。本发明还提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂。本发明又提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的抗癌药。

或者，本发明提供含有与GPR49蛋白结合的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。更具体而言，本发明提供下述[1]～[21]。

[1]抗体，该抗体与GPR49蛋白结合、且对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑制活性。

[2][1]所述的抗体，其中细胞增殖抑制活性为细胞毒活性。

[3][2]所述的抗体，其中细胞毒活性为抗体依赖性细胞毒活性。

[4][2]所述的抗体，其中细胞毒活性为补体依赖性细胞毒活性。

[5][1]～[4]中任一项所述的抗体，该抗体结合有细胞毒性物质。

[6][5]所述的抗体，该抗体具有内化活性。

[7][1]～[6]中任一项所述的抗体，该抗体抑制癌细胞的增殖。

[8][7]所述的抗体，其中癌细胞为胃癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞和神经胶质瘤细胞中的任一种。

[9]以下(1)～(20)中任一项所述的抗体：

(1)抗体(2J18-1N)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列；

(2)抗体(2J18-1N)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：11记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：12记载的氨基酸序列；

(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(2)所述的L链；

(4)抗体(2U1E-1)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：15记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：16记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：17记载的氨基酸序列；

(5)抗体(2U1E-1)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：22记载的氨基酸序列；

(6)抗体，该抗体含有(4)所述的H链和(5)所述的L链；

(7)抗体(2U2E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：25记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：26记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：27记载的氨基酸序列；

(8)抗体(2U2E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：30记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：31记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：32记载的氨基酸序列；

(9)抗体，该抗体含有(7)所述的H链和(8)所述的L链；

(10)抗体(2L13-3)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：35记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：36记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：37记载的氨基酸序列；

(11)抗体(2L13-3)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：40记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：41记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：42记载的氨基酸序列；

(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(11)所述的L链；

(13)抗体(2L36-12)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：45记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：46记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：47记载的氨基酸序列；

(14)抗体(2L36-12)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：50记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：51记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：52记载的氨基酸序列；

(15)抗体，该抗体含有(13)所述的H链和(14)所述的L链；

(16)抗体(2T15E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：66记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：67记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：68记载的氨基酸序列；

(17)抗体(2T15E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：71记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：72记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：73记载的氨基酸序列；

(18)抗体，该抗体含有(16)所述的H链和(17)所述的L链；

(19)抗体，该抗体是在(1)～(18)中任一项所述的抗体中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(18)中任一项所述的抗体具有同等活性；

(20)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(18)中任一项所述的抗体所结合的GPR49蛋白的表位相同。

[10][1]～[9]中任一项所述的抗体，该抗体具有人恒定区。

[11][10]所述的抗体，该抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

[12]药物组合物，其中含有[1]～[11]中任一项所述的抗体作为有效成分。

[13]细胞增殖抑制剂，其中含有[1]～[11]中任一项所述的抗体作为有效成分。

[14]抗癌药，其中含有[1]～[11]中任一项所述的抗体作为有效成分。

[15][14]所述的抗癌药，其中，癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的任一种癌。

[16]癌症的诊断方法，其特征在于：检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白的基因。

[17][16]所述的诊断方法，其特征在于：检测GPR49蛋白。

[18][17]所述的诊断方法，其中GPR49蛋白的检测使用与GPR49蛋白结合的抗体来进行。

[19]癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供从受试者采集的试样的步骤；

(b)使用与GPR49蛋白结合的抗体检测(a)的试样中所含的GPR49蛋白的步骤。

[20]癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤：

(a)将与GPR49蛋白具有结合活性、且用放射性同位素标记的抗体给予受试者的步骤；

(b)检测上述放射性同位素的累积的步骤。

[21][16]～[20]中任一项所述的诊断方法，其中癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤中的任一种癌。

本发明还提供下述[22]～[24]。

[22]抑制细胞增殖的方法，该方法使用[1]～[11]中任一项所述的抗体。

[23]癌症的治疗或预防方法，该方法包括给予[1]～[11]中任一项所述的抗体的步骤。

[24][1]～[11]中任一项所述的抗体在制造细胞增殖抑制剂或抗癌药中的应用。

发明效果

本发明的抗GPR49抗体对GPR49表达细胞具有补体依赖性细胞毒活性以及抗体依赖性细胞毒活性，并且，结合有毒素的抗体还具有引起GPR49表达细胞的细胞毒的活性，所以对原发性或转移性的各种癌症的诊断、预防和治疗有效。

附图说明

图1显示人GPR49在正常组织中的表达分布图。下面的值表示通过外显子芯片(Exon Array)分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。

图2显示人GPR49在胃癌细胞株和胃癌摘出组织的肿瘤部位的表达分布图。下面的值表示通过外显子芯片分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。

图3显示人GPR49在尤文肉瘤、小细胞肺癌、肺腺癌摘出组织的肿瘤部位的表达分布图。下面的值显示通过外显子芯片分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。

图4显示人GPR49在卵巢癌细胞株和卵巢癌摘出组织的肿瘤部位的表达分布图。下面的值显示通过外显子芯片分析得到的值，值越高则mRNA的表达量越高。

图5是利用单克隆抗体2U2E-2检测被诱导表达的GPR49的照片。照片显示：抗体特异性识别通过添加1μL、10μL Dox(多西环素)而诱导的GPR49，并识别与利用抗HA标签抗体检测附加在N末端的HA标签所得的谱带相同的谱带。

图6是用单克隆抗体2U1E-1、2U2E-2检测GPR49蛋白的照片，所述GPR49蛋白存在于用GPR49siRNA转染GPR49强制表达DG44细胞以及大肠癌细胞株LoVo而得到的细胞破碎液中。在导入有siRNA507、508、509的细胞中，GPR49的表达被抑制。(-)表示未导入siRNA的细胞，“con”表示导入有对照siRNA的细胞。除100kDa的谱带以外，2U1E-1中用箭头显示的40kDa的谱带、2U2E-2中用箭头显示的60kDa的谱带也均消失，所以这些谱带均来自GPR49。

图7是将2B10(HA-GPR49表达DG44细胞)的细胞破碎液免疫沉淀后用单克隆抗体检测GPR49而得到的照片。在2U1E-1中检测到100kDa和40kDa的谱带，在2U2E-2中检测到100kDa和60kDa的GPR49的谱带。使用HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories公司制备)作为二次抗体。

图8是将2B10(HA-GPR49表达DG44细胞)的细胞破碎液免疫沉淀后用单克隆抗体检测GPR49而得到的照片。在2L系列的抗体中均检测到60kDa的GPR49的谱带。为了区别来自用于免疫沉淀的抗体的H链的谱带和60kDa的GPR49的谱带，使用HRP标记抗小鼠κ抗体(Southern Biotech公司制备)作为二次抗体。

图9是通过使用单克隆抗体的WB检测各种癌细胞株的细胞破碎液的照片。照片中的泳道表示样品名称，分别表示大肠癌细胞株LoVo、胃癌细胞株NUGC-4、肝细胞癌株Alexander、肝细胞癌株HepG2、肝细胞癌株Huh6、卵巢癌细胞株KURAMOCHI、卵巢癌细胞株OVSAHO、神经胶质瘤U251、中国仓鼠卵巢细胞DG44、HA-GPR49表达DG44细胞株2B10。

图10是显示GPR49抗体的CDC活性的图。

图11是显示GPR49抗体对HA-GPR49表达DG44细胞的ADCC活性的图。

图12是显示使用了Mab-Zap的抗体的内化所产生的细胞杀伤活性的图。3根棒图显示通过WST8分析测定活细胞的比例的结果，其中，左：在GPR49诱导表达293细胞株B4的非诱导细胞中加入有抗体和Mab-Zap的样品；中：在GPR49表达诱导细胞中加入有抗体和Mab-Zap的样品；右：在GPR49表达诱导细胞中只加入抗体的样品。

图13是显示GPR49的结构和缺失突变体、GST融合蛋白中所含的区的图。

图14是显示2U1E-1、2T15E-2与GST融合蛋白通过WB的反应性的照片。

图15是显示抗小鼠GPR49单克隆抗体2U1E-1、2U2E-2通过WB的反应性的照片。均与人(H)和小鼠(M)的GPR49反应。

图16是显示利用FACS(流式细胞术)评价结合活性的结果的图。实线显示的峰表示与癌细胞株的反应性，阴影部分表示在没有抗体的情况下反应时的峰。横轴显示利用结合有FITC的抗体的结合度测定的信号的强度，纵轴显示细胞数。

具体实施方式

GPR49

GPR49是7次跨膜型的LGR家族成员的蛋白。人GPR49的氨基酸序列和编码该序列的基因序列分别公开在NCBI检索号NP_003658.1(SEQ ID NO：1)和NM_003667.2(SEQ ID NO：2)中。在本发明中，GPR49蛋白的含义包括全长蛋白及其片段两者。片段是指含有GPR49蛋白的任意区域的多肽，可以不具有天然GPR49蛋白的功能。片段的例子有：包括GPR49蛋白的胞外区的片段。GPR49蛋白的胞外区在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中相当于第1-556位、第615-637位、第704-722位、以及第792-800位。跨膜区在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中相当于第557-579位、第592-614位、第638-660位、第681-703位、第723-745位、第769-791位、以及第801-823位。

抗GPR49抗体的制作

本发明中使用的抗GPR49抗体只要与GPR49蛋白结合即可，不限定其来源、种类、形状等。具体可以使用非人动物的抗体(例如小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体等公知的抗体。本发明中，可以使用单克隆抗体或多克隆抗体作为抗体，但优选为单克隆抗体。抗体与GPR49蛋白的结合优选为特异性结合。

本发明中使用的抗GPR49抗体，可以利用公知的方法，以多克隆或单克隆抗体的形式获得。本发明中使用的抗GPR49抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包括：由杂交瘤产生的单克隆抗体；以及利用基因工程的方法，由用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体等。

产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可以采用公知技术如下制备。首先，使用GPR49蛋白作为致敏抗原，按照常规的免疫方法对其进行免疫。按照常规的细胞融合法使由免疫动物得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，得到杂交瘤。再利用通常的筛选法，从该杂交瘤中筛选产生目标抗体的细胞，从而可以选择产生抗GPR49抗体的杂交瘤。

具体而言，单克隆抗体的制备可如下进行。首先，通过表达GPR49基因，可以获得用作取得抗体的致敏抗原的GPR49蛋白。GPR49基因的核苷酸序列公开在NCBI检索号NM_003667.2(SEQ ID NO：2)等中。即，将编码GPR49的基因序列插入公知的表达载体中，转化适当的宿主细胞，之后按照公知的方法，可以从其宿主细胞中或培养上清中纯化目标人GPR49蛋白。纯化的天然GPR49蛋白也可同样使用。另外，象本发明所使用的那样，还可以利用使GPR49蛋白的所需的部分多肽与不同的多肽融合的融合蛋白作为免疫原。为了制造作为免疫原的融合蛋白，例如可以利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：通过使所需的编码两种或两种以上多肽片段的基因进行符合读框的融合，将该融合基因插入表达载体中来制作。融合蛋白的制作方法例如记载在Molecular Cloning2nd ed.(Sambrook，J等人，Molecular Cloning2nd ed.，9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab.press，1989)中。

如此操作而纯化的GPR49蛋白可以用作用于对哺乳动物进行免疫的致敏抗原。GPR49的部分肽也可用作致敏抗原。例如，可以以下述肽作为致敏抗原。

根据人GPR49的氨基酸序列通过化学合成获得的肽；

将GPR49基因的一部分整合到表达载体中，使其表达而获得的肽；

利用蛋白分解酶分解GPR49蛋白而获得的肽。

对用作部分肽的GPR49的区域和大小没有限定。优选的区域可以从构成GPR49的胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第1-556位、第615-637位、第704-722位、以及第792-800位)中选择。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸数目优选为至少3以上、例如5以上或6以上。更具体而言，可以以8～50、优选10～30个残基的肽作为致敏抗原。

对用该致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定。为了利用细胞融合法得到单克隆抗体，优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来选择免疫动物。通常作为免疫动物，优选啮齿类动物。具体可以以小鼠、大鼠、仓鼠或兔作为免疫动物。此外，猴等也可作为免疫动物。

可以按照公知的方法，利用致敏抗原免疫上述动物。例如常规方法为：通过腹腔内或皮下注射致敏抗原，可以对哺乳动物实施免疫。具体而言，每4～21天对哺乳动物多次给予该致敏抗原。致敏抗原用PBS(磷酸缓冲盐)或生理盐水等按适当的稀释倍率稀释后用于免疫。并且，可以将致敏抗原与佐剂一同给药。例如，可以将致敏抗原与弗氏完全佐剂混合、乳化，作为致敏抗原。另外，用致敏抗原进行免疫时可使用适当的载体。特别是使用分子量小的部分肽作为致敏抗原时，优选将该致敏抗原肽与白蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)等载体蛋白结合后进行免疫。

另一方面，单克隆抗体还可以通过DNA免疫(DNA Immunization)而获得。所谓DNA免疫，是指将在免疫动物中以编码抗原蛋白的基因能够表达的方式构建的载体DNA给予该免疫动物，使免疫抗原在免疫动物体内表达，从而赋予免疫刺激的方法。与给予蛋白抗原的普通免疫方法相比，在DNA免疫中有望获得下述优势。

-可以维持GPR49这样的膜蛋白结构不变而赋予免疫刺激

-不必纯化免疫抗原

但另一方面，在DNA免疫中难以与佐剂等免疫刺激手段组合。由于GPR49具有7次跨膜型立体结构这样的结构特征，所以预料难以在体内保持天然存在的结构不变的情况下引发免疫反应。与由于这样的结构特征而难以获得抗体的、属于LGR家族的蛋白GPR49结合的单克隆抗体通过DNA免疫而实际获得，这是出乎意料的成果。

通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体时，首先，对免疫动物给予表达GPR49蛋白的DNA。编码GPR49的DNA可以通过PCR等公知方法来合成。将得到的DNA插入适当的表达载体中，之后给予免疫动物。作为表达载体，例如可以使用pcDNA3.1等市售的表达载体。对生物体给予载体的方法也可采用通常使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒通过基因枪(gene gun)打入细胞内，从而可以进行DNA免疫。

根据本发明人等的经验，由通过向腹腔内给予GPR49强制表达细胞来进行免疫的小鼠无法高效率地得到产生GPR49结合性抗体的杂交瘤，相对于此，由利用DNA免疫来进行免疫的小鼠可以高效率地获得产生GPR49结合性抗体的杂交瘤。特别是在DNA免疫后进一步给予了GPR49强制表达细胞的小鼠中，可以容易地获得目标杂交瘤。即，在DNA免疫后利用GPR49表达细胞来进行追加免疫(boost)，这是获得本发明的单克隆抗体的优选方法。

如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体量升高后，从哺乳动物采集免疫细胞用于细胞融合。特别优选使用脾细胞作为免疫细胞。

与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。优选骨髓瘤细胞具备用于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指，可以(或者不可以)在特定的培养条件下生存的特性。选择标志物中，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(以下简记为HGPRT缺陷)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(以下简记为TK缺陷)等是公知的。存在HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下简记为HAT感受性)。HAT感受性的细胞在HAT选择培养基中无法进行DNA合成而死亡，但与正常细胞融合时，利用正常细胞的补救途径可以继续进行DNA的合成，所以在HAT选择培养基中也能够增殖。

HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞，各自可以在含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简记为8AG)或5’-溴脱氧尿苷的培养基中进行选择。正常细胞由于将上述嘧啶类似物摄入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的细胞由于不摄入上述嘧啶类似物，所以可以在选择培养基中生存。此外，被称作G418耐性的选择标志物由于新霉素耐性基因，提供对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的耐性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。例如，制造本发明的单克隆抗体时可以使用下述骨髓瘤细胞。

P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)；

P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)；

NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)；

MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)；

SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)；

FO(de St.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)；

S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)；

R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等

基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中，可以实施上述细胞融合。融合促进剂例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。为了进一步提高融合效率，根据需要，还可以添加二甲基亚砜等辅助剂。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，优选相对于骨髓瘤细胞，使免疫细胞为1～10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可以使用：适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于该种细胞培养的常规培养液。并且，可以在培养液中添加胎牛血清(FCS)等血清补液。

细胞融合可如下形成：将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，再混合预先加热至37℃左右的PEG溶液，从而形成目标融合细胞(杂交瘤)。在细胞融合法中，通常可以以30～60％(w/v)的浓度添加例如平均分子量为1000～6000左右的PEG。接着，依次添加上述例举的适当培养液，离心以除去上清，通过重复该操作，可除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。

如此操作而得到的杂交瘤，可以通过使用选择培养液而进行选择，所述选择培养液对应于用于细胞融合的杂交瘤所具有的选择标志物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞，可通过在HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养来进行选择。即，将HAT感受性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，在HAT培养液中，成功地与正常细胞进行细胞融合的细胞能够选择性地增殖。为了使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，使用上述HAT培养液继续培养足够的时间。具体而言，通常通过培养数天至数周，可以选择目标杂交瘤。接着，通过实施常规的极限稀释法，可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。或者，还可以按照国际公开WO03/104453中所述的方法制备识别GPR49的抗体。

目标抗体的筛选和单克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等载体结合，再与杂交瘤的培养上清反应。然后清洗载体，之后与用酶标记的二次抗体等反应。当培养上清中含有与致敏抗原反应的目标抗体时，二次抗体经由该抗体与载体结合。最终，通过检测与载体结合的二次抗体，可以确定培养上清中是否存在目的抗体。利用极限稀释法等可以克隆能与抗原结合的产生所需抗体的杂交瘤。此时，抗原不仅可以使用用于免疫的抗原，还可以适当使用实质上为相同性质的GPR49蛋白。例如，可以使用表达GPR49的细胞株、GPR49的胞外结构域、或者包含构成该区的部分氨基酸序列的寡肽作为抗原。

除通过用抗原对人以外的动物进行免疫而获得上述杂交瘤的方法外，对人淋巴细胞进行抗原致敏，也可得到目标抗体。具体而言，首先，在体外用GPR49蛋白致敏人淋巴细胞。然后，使免疫致敏的淋巴细胞与适当的融合配偶体融合。融合配偶体可以使用例如来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞(参照日本特公平1-59878号公报)。通过该方法得到的抗GPR49抗体是与GPR49蛋白具有结合活性的人抗体。

并且，通过对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物给予作为抗原的GPR49蛋白、或者用按照在该动物中表达GPR49的方式构建的DNA进行免疫，也可得到抗GPR49抗体。免疫动物的抗体产生细胞通过与适当的融合配偶体进行细胞融合、或者通过EB病毒感染等处理，可以使之无限增殖。可以从如此操作而得到的无限增殖细胞中分离抗GPR49蛋白的人抗体(参照国际公开WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。并且，通过克隆无限增殖的细胞，也可以克隆产生具有目标反应特异性的抗体的细胞。以转基因动物作为免疫动物时，该动物的免疫系统将人GPR49识别为异物。因此，可以容易地得到抗人GPR49的人抗体。

如此操作而制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在常规培养液中继代培养。还可以在液氮中长期保存该杂交瘤。

按照常规方法培养该杂交瘤，从其培养上清中可以获得目标单克隆抗体。或者，还可以将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物以使其增殖，以其腹水的形式获得单克隆抗体。前一种方法适合获得高纯度的抗体。

本发明中，还可以利用由抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体。将克隆的抗体基因整合到适当的载体中，再导入宿主中，从而可以以抗体的形式表达。用于抗体基因的分离、载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经确立(例如参照Vandamme，A.M.等人.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767～775)。

例如，可以从产生抗GPR49抗体的杂交瘤细胞中得到编码抗GPR49抗体的可变区(V区)的cDNA。因此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，例如可以采用以下方法。

胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人.，Biochemistry(1979)18，5294～5299)；AGPC法(Chomczynski，P.等人.，Anal.Biochem.(1987)162，156～159)。

所提取的mRNA可以用mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBio-Sciences制备)等进行纯化。或者，象QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bio-Sciences制备)等那样，用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒也有市售。使用这种试剂盒，也可以从杂交瘤中得到总mRNA。可以使用逆转录酶，由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。可以使用从与小鼠的抗体基因共通的序列中选出的任意15-30个碱基的序列作为引物。具体而言，通过使用具有SEQ ID NO：61～63所示的DNA序列的引物，得到编码抗体V区的cDNA。cDNA可以通过AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(生化学工业公司制备)等来合成。为了进行cDNA的合成和扩增，可以采用5’-Ampli FINDERRACE试剂盒(Clontech制备)和使用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA(1988)85，8998～9002、Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919～2932)。并且，在上述cDNA的合成过程中，可以向cDNA的两个末端导入后述的适当的限制酶切位点。

由所得的PCR产物纯化目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如上制备重组载体，将其导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所需的重组载体。而且，cDNA的核苷酸序列可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。

此外，为了得到编码抗体可变区的基因，还可以利用cDNA引物。首先，以从抗体产生细胞中提取的mRNA为模板合成cDNA，得到cDNA文库。在cDNA文库的合成中，使用市售的试剂盒是便利的。实际上，由于仅由少数细胞得到的mRNA极其微量，所以若将其直接纯化则收率低。因此，通常是添加已明确不含抗体基因的载体RNA后再纯化。或者，在可以提取一定量的RNA时，即使仅是抗体产生细胞的RNA，也可以高效率地提取。例如从10以上、或30以上、优选50以上的抗体产生细胞中提取RNA时，有时不必添加载体RNA。

已所得cDNA文库为模板，利用PCR法扩增抗体基因。用于通过PCR法扩增抗体基因的引物是公知的。例如，可以根据论文(J.Mol.Biol.(1991)222，581-597)等公开的内容，设计人抗体基因扩增用的引物。这些引物在每一免疫球蛋白的亚类都形成不同的核苷酸序列。因此，以亚类不明确的cDNA文库为模板时，考虑所有可能性后再进行PCR法。

具体而言，例如为了取得编码人IgG的基因时，可以使用可扩增编码作为重链的γ1～γ5、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’侧的引物中使用在相当于铰链区的部分退火的引物。而5’侧的引物中可以使用对应于各亚类的引物。

将由重链和轻链的各亚类的基因扩增用引物得到的PCR产物制成各自独立的文库。利用如此合成的文库，可以重构包含重链与轻链的组合的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白与GPR49的结合活性为指标，可以筛选目标抗体。

例如，为了获取抗GPR49抗体时，进一步优选抗体与GPR49的结合为特异性的。与GPR49结合的抗体例如可以如下筛选。

(1)使抗体与GPR49接触的步骤，所述抗体含有由所得的cDNA编码的V区；

(2)检测GPR49与抗体的结合的步骤；以及

(3)选择与GPR49结合的抗体的步骤。

检测抗体与GPR49的结合的方法是公知的。具体而言，使被检抗体与固定在载体上的GPR49反应，接下来使之与识别抗体的标记抗体反应。清洗后检测出载体上的标记抗体时，可以证明该被检抗体与GPR49结合。标记中可以使用过氧化物酶或β-半乳糖苷酶等酶活性蛋白、或FITC等荧光物质。为了评价抗体的结合活性，还可以使用表达GPR49的细胞的固定标本。

作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可采用利用了噬菌体载体的淘选法。按上述方式获取抗体基因作为重链和轻链的亚类的文库时，利用噬菌体载体的筛选法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因通过以适当的接头序列连接，可以形成单链Fv(scFv)。将编码scFv的基因插入噬菌体载体中时，可以得到在表面表达scFv的噬菌体。使该噬菌体与目标抗原接触，回收与抗原结合的噬菌体时，可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，可以浓缩具有目标结合活性的scFv。

本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长、或者可以编码抗体的一部分。抗体的一部分是指抗体分子的任意部分。以下，作为表示抗体的一部分的用语，有时使用抗体片段。本发明中优选的抗体片段包括抗体的互补链决定区(complementarity determinationregion；CDR)。进一步优选本发明的抗体片段包括构成可变区的全部的3个CDR。

获得编码目标抗GPR49抗体V区的cDNA后，通过识别插入到该cDNA的两个末端的限制酶切位点的限制酶消化该cDNA。优选的限制酶识别、消化在构成抗体基因的核苷酸序列中出现的可能性低的核苷酸序列。为了进一步将单拷贝的消化片段按正确方向插入载体中，优选提供粘性末端的限制酶。通过将上述被消化的编码抗GPR49抗体V区的cDNA插入适当的表达载体中，可以得到抗体表达载体。此时，通过使编码抗体恒定区(C区)的基因与编码上述V区的基因进行符合读框的融合，可以得到嵌合抗体。此处的嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除小鼠-人等的异种嵌合抗体外，人-人同种嵌合抗体也包括在本发明的嵌合抗体中。预先将上述V区基因插入整合有编码恒定区的DNA的表达载体中，也可构建嵌合抗体表达载体。

具体而言，例如在保持有编码所需抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧，可以预先配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。用相同组合的限制酶消化两者，使之进行符合读框的融合，从而构建嵌合抗体表达载体。

为了制备本发明中使用的抗GPR49抗体，可以将抗体基因整合到表达载体中，使在表达控制区的控制下表达。用于表达抗体的表达控制区例如包括增强子和启动子。接着，使用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗GPR49抗体的DNA的重组细胞。

表达抗体基因时，可以将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别整合到另一表达载体中。将整合有H链和L链的载体同时转化(共转染，co-transfect)到相同的宿主细胞中，从而可以使具备H链和L链的抗体分子表达。或者，可以将编码H链和L链的DNA整合到单一的表达载体中，来转化宿主细胞(参照国际公开WO94/11523)。

用于将分离的抗体基因导入适当的宿主中以制备抗体的宿主与表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可应用于本发明。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，可用于本发明的动物细胞可以例示下述细胞：

(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1等；

(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵细胞等；以及

(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。

或者，作为植物细胞，来自烟草(Nicotiana tabacum)等烟草属(Nicotiana)的细胞产生的抗体基因的表达系统是公知的。在植物细胞的转化中，可以使用进行了愈伤组织培养的细胞。

并且，作为真菌细胞，可以使用下述细胞。

酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、甲醇营养型酵母(Pichia pastoris，巴斯德毕赤酵母)等毕赤酵母(Pichia)属；

丝状菌：黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillue)属。

或者，使用原核细胞的抗体基因的表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可以将大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞用于本发明。

使用哺乳类细胞时，可以使polyA信号与常用的有效启动子、要表达的抗体基因、其3’侧下游进行功能性结合来表达。例如，启动子/增强子可以是人巨细胞病毒早期启动子/增强子。

此外，可以将病毒启动子/增强子、或人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子等用于抗体表达。作为可以利用启动子/增强子的病毒，具体可以例示：逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。

使用SV40启动子/增强子时，可以采用Mulligan等人的方法(Nature(1979)277，108)。另外，利用Mizushima等人的方法(NucleicAcids Res.(1990)18，5322)，可以容易地将HEF1α启动子/增强子用于目标基因的表达。

当为大肠杆菌时，使常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列和要表达的抗体基因功能性连接，可以表达该基因。启动子例如有lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以采用Ward等人的方法(Nature(1989)341，544～546；FASEBJ.(1992)6，2422～2427)。或者，利用Better等人的方法(Science(1988)240，1041～1043)，可以将araB启动子用于目标基因的表达。

用于抗体分泌的信号序列在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pel B信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。接着，分离在周质中产生的抗体，之后通过使用尿素的胍盐酸盐这样的蛋白改性剂，可重折叠抗体的结构，使其具有所需的结合活性。

使用动物细胞来产生抗体时，作为用于向细胞外分泌所必需的信号序列，优选使用抗体的重链基因或轻链基因的信号序列。此外，还可以使用IL-3或IL-6等的分泌蛋白所具有的信号序列。

插入到表达载体中的复制起点可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，可以向表达载体中插入选择标志物。具体可以使用下述选择标志物：

氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因；

胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因；

大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因；

二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。

将这些表达载体导入宿主细胞中，接下来，将转化的宿主细胞在体外或体内进行培养，产生目标抗体。宿主细胞的培养可以按照公知的方法进行。例如，培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。

如上表达并产生的抗体，可以通过将常规蛋白质纯化中使用的公知方法单独使用或适当组合来进行纯化。例如，可以通过适当选择并组合蛋白A柱等亲和柱、色谱柱、滤器、超滤、盐析、透析等，来分离、纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。

另外，在重组型抗体的产生中，除了使用上述宿主细胞外，还可以使用转基因动物。即，将编码目标抗体的基因导入动物体内，可以由该动物得到该抗体。例如，通过将抗体基因符合读框地插入到编码乳汁中特性产生的蛋白的基因内部，可以构建融合基因。作为乳汁中所分泌的蛋白，例如可以使用山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎中，再将该注入胚胎导入雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，可以以与乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式获得所需抗体。另外，为了增加由转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量，可以将激素适当用于转基因山羊(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699～702)。

本发明的重组抗体的C区可以使用来自人以外的动物的抗体的C区。例如，小鼠抗体的H链C区可以使用Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L链C区可以使用Cκ、Cλ。另外，除小鼠以外的动物的抗体可以使用大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴等的抗体。它们的序列是公知的。为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对C区进行修饰。

本发明中，将抗体给予人时，为了降低对人的异种抗原性等，可以制成人工修饰的基因重组型抗体。基因重组型抗体例如包括：嵌合抗体、人源化抗体等。这些修饰抗体可以采用公知的方法进行制备。

嵌合抗体是指将来源互不相同的可变区和恒定区连接而成的抗体。例如，包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体是小鼠-人-异种嵌合抗体。将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其整合到表达载体中，从而可以制备表达嵌合抗体的重组载体。培养通过该载体转化的重组细胞，使整合的DNA表达，从而可以获得培养中所产生的该嵌合抗体。在嵌合抗体和人源化抗体的C区使用人抗体的C区。

例如，在H链中，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε作为C区。在L链中，可以使用Cκ和Cλ作为C区。上述C区的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的核苷酸序列是公知的。为了改善抗体本身或抗体产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。

通常，嵌合抗体由来自人以外的动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。相对于此，人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补性决定区(CDR)和来自人抗体的构架区(FR)、以及来自人抗体的C区构成。由于人源化抗体在人体内的抗原性降低，因此可用作本发明的治疗药的有效成分。

抗体可变区通常由夹在4个构架区(FR)中的3个互补性决定区(CDR)构成。CDR实质上是决定抗体的结合特异性的区。CDR的氨基酸序列富有多样性。一方面，构成FR的氨基酸序列即使在具有不同结合特异性的抗体间往往也显示出高度同源性。因此，通常通过移植CDR，可以将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。

人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于得到人源化抗体的常规基因重组方法也是已知的。

具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠序列延伸PCR(Overlap Extension PCR)是公知的。在重叠序列延伸PCR中，将该移植的编码小鼠抗体CDR的核苷酸序列附加在用于合成人抗体FR的引物上。分别准备4个FR的引物。通常，向人FR中移植小鼠CDR时，选择与小鼠的FR同源性高的人FR，这对维持CDR的功能有利。即，通常优选利用包含与该移植的小鼠CDR相邻的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列的人FR。

另外，被连接的核苷酸序列设计成彼此符合读框地进行连接。利用各自的引物分别合成人FR。其结果，得到在各FR中附加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的核苷酸序列设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR序列进行连接。

最终，连接有3个CDR和4个FR的全长V区基因使用下述引物进行扩增，所述引物为对其5’末端和3’末端退火且附加有适当的限制酶识别序列。将如上得到的DNA与编码人抗体C区的DNA插入表达载体中，使符合读框地融合，从而可以制备人型抗体表达用载体。将该载体导入宿主中，建立重组细胞，之后培养该重组细胞，使编码人源化抗体的DNA表达，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧洲专利公开EP239400、国际公开WO96/02576)。

通过定性或定量测定并评价如上制备的人源化抗体与抗原的结合活性，可以适当选择经由CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。根据需要，还可以置换FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用用于向人FR中移植小鼠CDR的PCR法，可以向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向对FR退火的引物中导入一部分核苷酸序列的突变。利用这样的引物合成的FR中，导入了核苷酸序列的突变。通过用上述方法测定并评价取代了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，可以选择具有所需性质的突变FR序列(Sato，K.等人，Cancer Res，1993，53，851～856)。

另外，人抗体的获得方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞。接着，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合，从而可以获得与抗原具有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。在作为融合配偶体的人骨髓瘤细胞中，例如可以使用U266等。

通过用所需抗原对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物进行免疫，可以获得所需的人抗体(参照国际公开WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。并且，还已知使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，利用噬菌体展示法，使人抗体的V区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达，可以选择与抗原结合的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需人抗体C区序列进行符合读框的融合，之后插入适当的表达载体中，从而可以制备表达载体。将该表达载体导入上述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，从而可以获得该人抗体。这些方法已经公知(国际公开WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388)。

因此，作为本发明中使用的抗体的优选方式之一，可以列举具有人恒定区的抗体。

本发明的抗体，只要与GPR49蛋白结合即可，不仅包括IgG所代表的二价抗体，还包括一价抗体或IgM所代表的多价抗体。本发明的多价抗体包括：具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或具有一部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。本发明的抗体并不限于抗体的全长分子，只要与GPR49蛋白结合即可，可以是小分子抗体或其修饰物。

小分子抗体包括全长抗体(whole antibody，例如全长IgG等)的一部分缺失的抗体片段。只要与GPR49抗原具有结合能力即可，允许抗体分子的部分缺失。本发明中的抗体片段优选含有重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。此外，本发明中的抗体片段优选含有CDR。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加和/或插入。并且，只要与GPR49抗原具有结合能力即可，可以缺失VH和/或VL的一部分。另外，可变区可以进行嵌合化或人源化。抗体片段的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。小分子抗体的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的小分子抗体中。

抗体片段可以通过用酶处理抗体生成抗体片段而得到。作为生成抗体片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等是公知的。或者，构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后可以在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.和Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods inEnzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。

消化酶切断抗体片段的特定位置，给予下述特定结构的抗体片段。对上述酶解得到的抗体片段应用基因工程方法时，可以使抗体的任意部分缺失。

木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab

胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’

纤溶酶消化：Facb

因此，本发明中的小分子抗体只要与GPR49具有结合亲和性即可，可以是缺失了任意区的抗体片段。并且，特别是在本发明的癌症等细胞增殖性疾病的治疗中，优选抗体维持其效应子活性。即，本发明中优选的小分子抗体具有与GPR49的结合亲和性和效应子功能两者。抗体的效应子功能包括ADCC活性和CDC活性。本发明中的治疗用抗体，特别优选具有ADCC活性和/或CDC活性作为效应子功能。

双抗体(Diabody)是指通过基因融合构建的二价抗体片段(HolligerP等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444～6448(1993)；EP404，097号；WO93/11161号等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体。通常，构成二聚物的多肽链，各自在同一条链中VL和VH通过接头进行结合。双抗体中的接头通常短至VL和VH无法相互结合。具体而言，构成接头的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，编码在同一条多肽链上的VL和VH无法形成单链可变区片段，而是与另一单链可变区片段形成二聚体。其结果，双抗体具有两个抗原结合部位。

scFv可通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.1988，85，5879～5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以是来自本说明书中记载的任何抗体。对连接V区的肽接头没有特别限定。例如可以使用包含3～25个残基左右的任意单链肽作为接头。具体而言，例如可以使用后述的肽接头等。

两链的V区例如可以按照上述PCR法进行连接。为了利用PCR法连接V区，首先，在下述DNA中，以编码全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作为模板：

编码抗体H链或H链V区的DNA序列；以及

编码抗体L链或L链V区的DNA序列。

编码H链和L链的V区的DNA分别利用PCR法进行扩增，所述PCR法使用具有与应扩增的DNA两端的序列对应的序列的一对引物。接着，准备编码肽接头部分的DNA。编码肽接头的DNA也可利用PCR来合成。在此时使用的引物的5’侧附加可与另外合成的各V区的扩增产物连接的核苷酸序列。接着，利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和装配PCR用的引物进行PCR反应。

装配PCR用的引物包含在[H链V区DNA]的5’侧退火的引物和在[L链V区DNA]的3’侧退火的引物的组合。即，装配PCR用引物是指可以扩增编码应合成的scFv的全长序列的DNA的引物组。另一方面，[肽接头DNA]中附加有可与各V区DNA连接的核苷酸序列。其结果，连接上述DNA，再利用装配PCR用引物，最终以扩增产物的形式生成scFv的全长。暂且制作编码scFv的DNA，按照常规方法可以获取含有上述DNA的表达载体和通过该表达载体转化的重组细胞。其结果，培养所得的重组细胞，使编码该scFv的DNA表达，从而可获得该scFv。

scFv-Fc是使Fc区与包含抗体的H链V区和L链V区的scFv融合得到的小分子抗体(Cellular&Molecular Immunology2006；3：439-443)。对scFv-Fc中使用的scFv的来源没有特别限定，例如可以使用来自IgM的scFv。此外，对Fc的来源也没有特别限定，例如可以使用小鼠IgG2(小鼠IgG2a等)、人IgG(人IgG1等)。因此，作为scFv-Fc的优选方式的例子，可以列举：IgM抗体的scFv片段和小鼠IgG2a的CH2(例如Cγ2)和CH3(例如Cγ3)通过小鼠IgG2a的铰链区(Hγ)连接而成的scFv-Fc、或IgM抗体的scFv片段和人IgG1的CH2和CH3通过人IgG1的铰链区连接而成的scFv-Fc。

sc(Fv)2是两个VH和两个VL通过接头等连接形成单链的小分子抗体(Hudson等人，J Immunol.Methods1999；231：177～189)。sc(Fv)2例如可以通过用接头连接scFv来制备。

优选具有以下特征的抗体，所述特征为：2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为基点，按照VH、VL、VH、VL([VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])的顺序排列。

2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述排列，可以按照任何顺序进行排列。例如包括以下排列：

[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]

[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]

[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]

[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]

[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]

连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接头、或化学合成接头(例如参照Protein Engineering，9(3)，299～305，1996)中公开的接头等。本发明中优选肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择。通常，构成肽接头的氨基酸残基为1～100个氨基酸，优选3～50个氨基酸，进一步优选5～30个氨基酸，特别优选为12～18个氨基酸(例如15个氨基酸)。

构成肽接头的氨基酸序列，只要不阻碍scFv的结合作用即可，可以形成任意序列。例如，当为肽接头时，可以使用下述氨基酸序列。Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：53)

Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：54)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：55)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：56)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：57)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：58)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：59)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：60)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：53))_n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：54))_n

[n为1以上的整数]

关于肽接头的氨基酸序列，本领域技术人员可以根据目的适当选择。例如，决定上述肽接头长度的n通常为1～5，优选1～3，更优选为1或2。

因此，本发明中特别优选的sc(Fv)2的方式例如有以下sc(Fv)2。

[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]-肽接头(15个氨基酸)-[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]

或者，还可以利用化学合成接头(化学交联剂)来连接V区。本发明中可以使用通常用于交联肽化合物等的交联剂。例如下述化学交联剂是公知的。这些交联剂均有销售。

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；

二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)；

双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)；

二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)；

二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)；

双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)；

双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)；

二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)；

二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)；

双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)；以及

双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等。

连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。本发明中，优选的小分子抗体为双抗体或sc(Fv)2。为了获得这样的小分子抗体，可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等处理抗体，生成抗体片段；或者构建编码这些抗体片段的DNA，将其导入表达载体中，之后在适当的宿主细胞中表达即可(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.和Skerra，A.，Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.和Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。

本发明的抗体不仅包括一价抗体，还包括多价抗体。本发明的多价抗体包括具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或者具有一部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。

作为抗体修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。而且，抗体上还可以结合化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质。上述抗体修饰物(以下称为抗体缀合物)可以通过对所得抗体施行化学修饰而获得。尚需说明的是，抗体的修饰方法在该领域中已经确立。如后所述，还可以以双特异性抗体(bispecificantibody)等分子型的形式获取，所述双特异性抗体通过基因重组技术设计成不仅识别GPR49蛋白、还识别化疗药物、毒性肽、放射性化学物质等细胞毒性物质的形式。本发明中的“抗体”也包括这些抗体。

与抗GPR49抗体结合、发挥细胞毒活性作用的化疗药物可以例示如下述化疗药物：阿扎立平、阿那曲唑、5-氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑素-1、白消安、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、道诺霉素葡萄糖醛酸苷、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基尿、伊达比星、异环磷酰胺、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春碱、长春瑞滨、长春新碱。

本发明中，优选的化疗药物为小分子化疗药物。小分子化疗药物与抗体结合后，其干涉抗体功能的可能性也小。本发明中，小分子化疗药物通常具有100～2000、优选200～1000的分子量。此处例示的化疗药物均为小分子化疗药物。本发明中的这些化疗药物包括在机体内转化成活性化疗药物的前体药物。前体药物的活化可以是酶转化，也可以是非酶转化。

另外，还可以用毒性肽修饰抗体。毒性肽的例子有下述物质：白喉毒素A链(Langone J.J.，等人，Methods in Enzymology，93，307-308，1983)、绿脓杆菌外毒素(Nature Medicine，2，350-353，1996)、蓖麻毒蛋白A链(Fulton R.J.，等人，J.Biol.Chem.，261，5314-5319，1986；SivamG.，等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.等人，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，等人，CancerRes.，50，7519-7562，1990；Gheeite V.，等人，J.Immunol.Methods，142，223-230，1991)、无糖链蓖麻毒蛋白A链(Thorpe P.E.，等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、相思子毒素A链(Wawrzynczak E.J.，等人，Br.J.Cancer，66，361-366，1992；Wawrzynczak E.J.，等人，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Sivam G.，等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Thorpe P.E.，等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、多花白树毒蛋白(Sivam G.，等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.等人，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，等人，CancerRes.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPs)(Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、Briodin(Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、皂草毒蛋白(Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、地肤子皂苷(Cumber A.J.，等人，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，等人，CancerRes.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、木鳖根蛋白(Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、石竹素32(Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、石竹素30(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白II(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、槲寄生凝集素(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白I(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、商陆毒蛋白(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、小麦毒蛋白(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、软瓜蛋白(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、栝楼素(Casellas P.，等人，Eur.J.Biochem.176，581-588，1988；Bolognesi A.，等人，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)。

在本发明中，放射性化学物质是指含有放射性同位素的化学物质。对放射性同位素没有特别限定，可以使用任何放射性同位素，例如可以使用³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re等。在另一方式中，将一种或两种以上的小分子化疗药物与毒性肽分别组合，可以用于修饰抗体。抗GPR49抗体与上述小分子化疗药物的结合可以使用共价键或非共价键。结合有这些化疗药物的抗体的制作方法是公知的。

并且，蛋白性药物或毒素可以通过基因工程方法与抗体结合。具体而言，例如使编码上述毒性肽的DNA与编码抗GPR49抗体的DNA进行符合读框的融合并整合到表达载体中，可以构建重组载体。将该载体导入适当的宿主细胞中，之后培养所得的转化细胞，使重组的DNA表达，可以以融合蛋白的形式得到结合有毒性肽的抗GPR49抗体。得到与抗体的融合蛋白时，通常将蛋白性药物或毒素配置在抗体的C末端侧。还可以使肽接头介于抗体与蛋白性药物或毒素之间。

并且，本发明的抗体可以是双特异性抗体(bispecific antibody)。双特异性抗体是指，在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。本发明中，双特异性抗体可以具有识别GPR49分子上的不同表位的抗原结合部位。这样的双特异性抗体相对于1分子的GPR49可以结合2分子的抗体分子。其结果，有望获得更强效的细胞毒作用。

或者，还可以形成其中一个抗原结合部位识别GPR49、另一个抗原结合部位识别细胞毒性物质的双特异性抗体。细胞毒性物质具体包括化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等。这样的双特异性抗体与表达GPR49的细胞结合，同时捕获细胞毒性物质。其结果，可以使细胞毒性物质直接作用于表达GPR49的细胞。即，利用识别细胞毒性物质的双特异性抗体，可以特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。

在本发明中，还可以组合识别GPR49以外的抗原的双特异性抗体。例如，可以组合识别非GPR49抗原的双特异性抗体，所述非GPR49抗原与GPR49一样在作为靶的癌细胞的细胞表面特异性表达。

用于制备双特异性抗体的方法是公知的。例如，使识别不同抗原的两种抗体结合，可以制作双特异性抗体。进行结合的抗体可以是各自具有H链和L链的1/2分子，也可以是仅包含H链的1/4分子。或者，使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合，也可以制备产生双特异性抗体的融合细胞。并且，利用基因工程方法可以制备双特异性抗体。

测定抗体的抗原结合活性(Antibodies A Laboratory Manual.EdHarlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)时，可以采用公知的方法。例如可以使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等。

本发明的抗体可以是糖链被修饰的抗体。已知通过修饰抗体的糖链，可以增强抗体的细胞毒活性。作为糖链被修饰的抗体，例如以下抗体是公知的。

进行糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)；

附加在糖链上的岩藻糖缺失的抗体(WO00/61739、WO02/31140等)；

具有具等分GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等)等。

抗体是否对表达GPR49蛋白的细胞具有细胞增殖抑制活性，这可以利用本领域技术人员所公知的方法来测定。例如，在对象抗体的存在下和不存在下(或阴性对照抗体存在下)培养表达GRP49蛋白的细胞，并测定其活细胞数，从而可以进行测定。只要抑制细胞的增殖即可，对抑制的比例没有特别限定，优选的例子有：与对象抗体不存在下的活细胞数相比，对象抗体存在下的活细胞数为90％以下、70％以下、50％以下等。对表达GPR49蛋白的细胞没有特别限定，可以列举：用编码GPR49蛋白的基因转化的细胞、胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌和神经胶质瘤等。

为了治疗目的而使用本发明的抗体时，抗体优选为具有细胞毒活性的抗体。

本发明中的细胞毒活性例如有：抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指由补体系统产生的细胞毒活性。而ADCC活性是指，特异性抗体附着于靶细胞的细胞表面抗原上时，保有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)经由Fcγ受体与其Fc部位结合，给靶细胞带来伤害的活性。

抗GPR49抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可以利用公知的方法进行测定(例如Current protocols in Immunology，Chapter7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等人，John Wiley&Sons，Inc.，(1993)等)。

具体而言，首先，制备效应细胞、补体溶液、靶细胞。

(1)效应细胞的制备

从CBA/N小鼠等中摘出脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen公司制备)中分离脾细胞。用含有10％胎牛血清(FBS、HyClone公司制备)的相同培养基清洗，之后将细胞浓度调整至5×10⁶个细胞/mL，即可制备效应细胞。

(2)补体溶液的制备

将幼兔补体(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE公司制备)用含有10％FBS的培养基(Invitrogen公司制备)稀释10倍，可以制备补体溶液。

(3)靶细胞的制备

将表达GPR49蛋白的细胞与0.2mCi的⁵¹Cr-铬酸钠(GEHealthcare Bio-Sciences公司制备)一起在含有10％FBS的DMEM培养基中、在37℃下培养1小时，从而可以放射性标记该靶细胞。表达GPR49蛋白的细胞可以使用以编码GPR49蛋白的基因转化的细胞、胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌和神经胶质瘤等。放射性标记后，将细胞用含有10％FBS的RPMI1640培养基清洗3次，将细胞浓度调整至2×10⁵个细胞/mL，从而可以制备该靶细胞。

ADCC活性或CDC活性可以利用下述方法测定。测定ADCC活性时，在96孔U底板(Becton Dickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗GPR49抗体，在冰上反应15分钟。之后，加入100μL效应细胞，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或10μg/mL。培养后，回收100μL上清，用γ射线计数仪(COBRAIIAUTO-GAMMA，型号D5005，Packard Instrument Company公司制造)测定放射活性。细胞毒活性(％)可以使用所得值、根据算式(A-C)/(B-C)×100来计算。A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入了1％NP-40(nacalai tesque公司制备)的试样的放射活性(cpm)，C表示只含靶细胞的试样的放射活性(cpm)。

另一方面，测定CDC活性时，向96孔平底板(Becton Dickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗GPR49抗体，在冰上反应15分钟。之后，加入100μL补体溶液，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或3μg/mL。培养后，回收100μL上清，用γ射线计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以和ADCC活性的测定同样计算。

而当测定抗体缀合物的细胞毒活性时，向96孔平底板(BectonDickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗GPR49抗体缀合物，在冰上反应15分钟。在二氧化碳培养箱内培养1～4小时。使抗体的终浓度达到0或3μg/mL。培养后，回收100μL上清，用γ射线计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以和ADCC活性的测定同样计算。作为本发明中使用的抗体的另一方式，可以列举具有内化活性的抗体。在本发明中，“具有内化活性的抗体”是指，与细胞表面上的GPR49结合时被输送到细胞内(细胞质内、小泡内、其他小器官内等)的抗体。

抗体是否具有内化活性，这可以利用本领域技术人员所公知的方法来确认，例如可以采用下述方法进行确认：使结合有标记物质的抗GPR49抗体与表达GPR49的细胞接触，之后确认该标记物质是否被摄入细胞内的方法；使结合有细胞毒性物质的抗GPR49抗体与表达GPR49的细胞接触，之后确认是否诱导了该GPR49表达细胞的细胞死亡的方法等。更具体而言，利用下述实施例中记载的方法等，可以确认抗体是否具有内化活性。

具有内化活性的抗体，例如可以通过结合上述细胞毒性物质，以抗癌药等药物组合物的形式使用。

本发明的抗体可以使用识别GPR49的任意抗体。例如，优选的抗体可以例示以下(1)～(20)所述的抗体。这些抗体例如可以是全长抗体、小分子抗体、动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

(1)抗体(2J18-1N)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列。

(2)抗体(2J18-1N)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：11记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：12记载的氨基酸序列。

(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(2)所述的L链。

(4)抗体(2U1E-1)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：15记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：16记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：17记载的氨基酸序列。

(5)抗体(2U1E-1)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：22记载的氨基酸序列。

(6)抗体，该抗体含有(4)所述的H链和(5)所述的L链。

(7)抗体(2U2E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：25记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：26记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：27记载的氨基酸序列。

(8)抗体(2U2E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：30记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：31记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：32记载的氨基酸序列。

(9)抗体，该抗体含有(7)所述的H链和(8)所述的L链。

(10)抗体(2L13-3)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：35记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：36记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：37记载的氨基酸序列。

(11)抗体(2L13-3)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：40记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：41记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：42记载的氨基酸序列。

(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(11)所述的L链。

(13)抗体(2L36-12)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：45记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：46记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：47记载的氨基酸序列。

(14)抗体(2L36-12)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：50记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：51记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：52记载的氨基酸序列。

(15)抗体，该抗体含有(13)所述的H链和(14)所述的L链。

(16)抗体(2T15E-2)，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO：66记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：67记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：68记载的氨基酸序列。

(17)抗体(2T15E-2)，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO：71记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：72记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：73记载的氨基酸序列。

(18)抗体，该抗体含有(16)所述的H链和(17)所述的L链。

(19)抗体，该抗体是在(1)～(18)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(18)中任一项所述的抗体具有同等活性。

(20)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(18)中任一项所述的抗体所结合的GPR49蛋白的表位相同。

本发明中，与本发明的抗体具有同等活性是指，与GPR49的结合活性和/或对表达GPR49的细胞的细胞毒活性同等。

向多肽中导入突变的方法，是用于制备与某种多肽功能相同的多肽的、本领域技术人员所熟知的方法之一。例如，本领域技术人员可采用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.等人.(1995)Gene152，271-275、Zoller，MJ，和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.等人.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer W，和Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，向本发明的抗体中导入适当的突变，从而可以制备与该抗体功能相同的抗体。另外，氨基酸的突变在自然界中也可发生。如上所述，在本发明抗体的氨基酸序列中，具有1个或多个氨基酸发生突变的氨基酸序列、且与该抗体功能相同的抗体也包含在本发明的抗体中。

上述突变体中，突变的氨基酸数目通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以内，进一步优选为10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。

在突变的氨基酸残基中，优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。例如，根据氨基酸侧链的性质，确立以下分类：

疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；

亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；

具有脂族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；

具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)；

具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)；

具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)；

具有含碱性侧链的氨基酸(R、K、H)；

具有含芳族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)

(括号内均表示氨基酸的单字母符号)。

已知具有对某一氨基酸序列通过1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或用其它氨基酸的取代进行修饰的氨基酸序列的多肽维持其生物学活性(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666、Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500、Wang，A.等人，Science224，1431-1433、Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。即，通常构成某多肽的氨基酸序列中，被分成各组的氨基酸在相互取代时，该多肽的活性得以保持的可能性高。本发明中，将上述氨基酸组的组内氨基酸间的取代称作保守取代。

本发明还提供与表位结合的抗体，所述表位与本发明所公开的抗GPR49抗体所结合的表位相同。即，本发明涉及识别与2J18、2L13、2L36、2U1E、2U2E所识别的表位相同的表位的抗体及其用途。上述抗体例如可以通过以下方法获得。

被检抗体与某抗体共有表位，这可通过两者对同一表位的竞争来确认。抗体间的竞争通过交叉阻断测定等进行检测。例如，竞争ELISA测定为优选的交叉阻断测定。

具体而言，在交叉阻断测定中，在候选的竞争抗体的存在或非存在下，预温育包被在微量板的孔上的GPR49蛋白，之后添加本发明的抗GPR49抗体。与孔中的GPR49蛋白结合的本发明的抗GPR49抗体的量与对相同表位竞争性结合的候选竞争抗体(被检抗体)的结合能力间接相关。即，被检抗体与相同表位的亲和性越大，则本发明的抗GPR49抗体与包被GPR49蛋白的孔的结合量越降低，而被检抗体与包被GPR49蛋白的孔的结合量越增加。

关于与孔结合的抗体量，通过预先标记抗体，可以容易地测定。例如，生物素标记的抗体可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物来测定。将利用了过氧化物酶等酶标记的交叉阻断测定特别地称作竞争ELISA测定。抗体可以用可检测或可测定的其它标记物标记。具体而言，放射标记或荧光标记等是公知的。

并且，当被检抗体具有来自与本发明的抗GPR49抗体不同种的恒定区时，还可以通过识别任一恒定区的标记抗体来测定与孔结合的任一种抗体。或者，即使是来自同种的抗体，当类别(class)不同时，可以利用识别各类别的抗体测定与孔结合的抗体。

与在候选竞争抗体非存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体可以阻断至少20％、优选至少30％、进一步优选至少50％的抗GPR49抗体的结合时，该候选竞争抗体是与本发明的抗GPR49抗体实质上结合在同一表位上、或者是竞争结合在同一表位上的抗体。

上述(4)～(6)中的任一种抗体所识别的表位的例子有：人GPR49蛋白(SEQ ID NO：1)的第517位氨基酸～第537位氨基酸的区。另外，上述(16)～(18)中的任一种抗体所识别的表位的例子有：人GPR49蛋白(SEQ ID NO：1)的第510位氨基酸～第529位氨基酸的区。

药物组合物

从另一角度来看，本发明提供含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的药物组合物。此外，本发明涉及含有与GPR49蛋白结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂、特别是抗癌药。优选将本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌药给予罹患癌症的对象或有可能罹患癌症的对象。由于GPR49的表达水平在脑以外的正常细胞中非常低，而在癌细胞中亢进，由此认为：通过给予抗GPR49抗体，可以得到癌细胞特异性的细胞毒作用。

对本发明的药物组合物(例如抗癌药)中使用的抗GPR49抗体没有特别限定，可以是任何抗GPR49抗体，例如可以使用上述抗GPR49抗体。

本发明人等发现：将GPR49蛋白切断，分成60kDa和40kDa的片段，N末端侧的60kDa的片段被切断后分泌到细胞外。因此，对本发明的药物组合物中使用的抗GPR49抗体没有特别限定，但优选其识别C末端侧的40kDa的片段。C末端侧的40kDa的片段的例子有：包含SEQ ID NO：1的第510位氨基酸～第907位氨基酸序列的片段等。

SEQ ID NO：1的第510位氨基酸～第907位氨基酸序列中，胞外区形成第510位氨基酸～第556位氨基酸的区、第615位氨基酸～第637位氨基酸的区、第704位氨基酸～第722位氨基酸的区、第792位氨基酸～第800位氨基酸的区。因此，虽然没有特别限定，但识别这些区的抗体作为药物组合物特别有用。

本发明中，“含有与GPR49结合的抗体作为有效成分”是指，含有抗GPR49抗体作为主要活性成分，并不限定抗GPR49抗体的含有率。

当本发明的药物组合物的治疗对象疾病为癌症时，对作为对象的癌症没有特别限定，但优选为胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤或神经胶质瘤(例如成胶质细胞瘤)，特别优选胃癌。癌症可以是原发病灶，也可以是转移病灶。

本发明的药物组合物可以通过口服、胃肠外给药中的任一种途径给予患者。优选为胃肠外给药。所述给药方法具体有：注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射给药的例子有：例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予本发明的药物组合物。还可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。给药量例如可以在每次、每kg体重0.0001mg～1000mg的范围内选择。或者，例如可以在每位患者0.001mg～100000mg/个体的范围内选择给药量。但本发明的药物组合物并不限于上述给药量。

本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington′s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark PublishingCompany，Easton，U.S.A)，可以同时含有药学上可接受的载体或添加剂。例如有表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。并不限于这些，可以进一步适当使用其它常用的载体。载体具体有：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

本发明还提供：通过使GPR49表达细胞和与GPR49蛋白结合的抗体接触，而在GPR49表达细胞中引发毒性的方法或抑制细胞增殖的方法。

对本发明的方法中使用的抗体没有特别限定，例如可以使用上述抗体。抗GPR49抗体所结合的细胞只要是表达GPR49的细胞即可，没有特别限定。本发明中优选的GPR49表达细胞为癌细胞。更优选为胃癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、尤文肉瘤或神经胶质瘤细胞(例如成胶质细胞瘤细胞)。本发明的方法对上述癌症的原发病灶和转移病灶均适用。进一步优选的癌细胞为原发性胃癌和转移性胃癌的细胞。

本发明中，“接触”例如可以通过向在试管内培养的GPR49表达细胞的培养液中添加抗体来进行。在本发明中，“接触”还可以通过对将GPR49表达细胞移植到体内的非人动物、或具有内源性表达GPR49的癌细胞的动物进行给药来进行。

作为评价或测定通过抗GPR49抗体的接触在GPR49表达细胞中引发的细胞毒的方法，优选采用以下方法。在试管内评价或测定该细胞毒活性的方法有：上述抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等的测定方法。抗GPR49抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可以利用公知方法来测定(例如Current protocols in Immunology，Chapter 7.Immunologic studies inhumans，Editor，John E，Coligan等人，John Wiley&Sons，Inc.，(1993)等)。测定活性时，以具有与抗GPR49抗体相同的同种型、但不具有该细胞毒活性的结合抗体作为对照抗体，与抗GPR49抗体同样地加以使用，根据抗GPR49抗体显示出较对照抗体强的细胞毒活性，可以判定活性。

抗体的同种型由该抗体的氨基酸序列的H链恒定区的序列来规定。在机体内，根据产生抗体的B细胞成熟时发生的染色体上的基因重组所产生的类别转换，最终决定抗体的同种型。同种型的不同反映在抗体的生理、病理性功能的不同。具体而言，例如已知细胞毒活性的强度和抗原的表达量同时受抗体的同种型影响。因此，测定上述细胞毒活性时，用作对照的抗体优选使用与被检抗体相同的同种型。

此外，为了在机体内评价或测定细胞毒活性，例如将表达GPR49的癌细胞移植到非人被检动物的皮内或皮下，之后从当天或第二天起每天或间隔数天静脉或腹腔内给予被检抗体。通过每天测定肿瘤的大小，可以判定细胞毒活性。与试管内的评价同样，给予具有相同同种型的对照抗体，根据抗GPR49抗体给药组的肿瘤大小明显小于对照抗体给药组的肿瘤大小，可以判定具有细胞毒活性。使用小鼠作为非人被检动物时，可适当使用遗传性缺失胸腺从而缺失其T淋巴细胞的功能的裸小鼠(nu/nu)。通过使用该小鼠，在评价、测定给予的抗体所产生的细胞毒活性时，可以排除被检动物中T淋巴细胞的干预。

本发明还提供癌症的诊断方法，其特征在于：检测GPR49蛋白或编码GPR49蛋白的基因。确认GPR49在各种癌组织或癌细胞株中明显表达亢进，相对于此，在正常细胞中GPR49的表达在除脑以外的脏器中非常低。因此，GPR49作为用于特异性检测癌症的标志物是有用的。

在本发明方法的一个方式中，通过检测试样中的GPR49蛋白来进行癌症的诊断。优选检测GPR49蛋白的胞外区。GPR49蛋白的检测优选使用识别GPR49蛋白的抗体来进行。

作为本发明的诊断方法的具体例之一，可以列举包括以下步骤的癌症的诊断方法。

(a)提供从受试者采集的试样的步骤；

(b)使用与GPR49蛋白结合的抗体检测采集的试样中所含的GPR49蛋白的步骤。

本发明中，检测包括定量或定性的检测。例如，定性检测可以是下述测定：

仅测定是否存在GPR49蛋白；

测定是否存在一定量以上的GPR49蛋白；

将GPR49蛋白的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。

而定量检测可以是：GPR49蛋白浓度的测定、GPR49蛋白量的测定等。

本发明中的被检试样只要是可能含有GPR49蛋白的试样即可，没有特别限定。具体优选从哺乳类等生物的体内采集的试样。进一步优选的试样为从人体内采集的试样。被检试样的具体例子可以例示如：血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿、组织、腹水、腹腔内清洗液等。优选的试样为由下述被检试样得到的试样，所述被检试样为：将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液等。

将GPR49蛋白切断，分成约60kDa的N末端肽和约40kDa的C末端肽，N末端肽分泌到血液中。因此，在本发明的诊断方法中，可以检测切断后的N末端肽或C末端肽。例如，可以检测血液或血清等试样中所含的分泌的N末端肽。

对根据本发明诊断的癌症没有特别限定，可以是任何癌症。具体有肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤或神经胶质瘤(例如成胶质细胞瘤)等。本发明中，对上述癌症的原发病灶和转移病灶均可诊断。本发明中，特别优选的癌症为原发性胃癌和转移性胃癌。

本发明中，当在被检试样中检测出蛋白时，以其水平为指标来诊断癌症。具体而言，与阴性对照或正常者相比，被检试样中检测出的GPR49蛋白的量多时，显示受试者患有癌症、或者将来罹患癌症的可能性高。即，本发明涉及癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤：

(1)检测从受试者采集的生物样品中GPR49的表达水平的步骤；知

(2)当(1)中检测的GPR49的表达水平与对照相比高时，显示受试者患有癌症的步骤。

本发明中，对照是指作为比较基准的试样，包括阴性对照和正常者的生物样品。阴性对照可以通过采集正常者的生物样品，并根据需要进行混合而得到。对照的GPR49表达水平可以和受试者的生物样品中的GPR49表达水平同时检测。或者，可以预先检测多名正常者的生物样品中的GPR49表达水平，再对正常者中的标准表达水平进行统计学判定。具体而言，例如还可以使用平均值±2×标准偏差(S.D.)、或平均值±3×标准偏差(S.D.)作为标准值。在统计学上，平均值±2×标准偏差(S.D.)包括80％的正常者的值，而平均值±3×标准偏差(S.D.)包括90％的正常者的值。

或者，可以利用ROC曲线设定对照中的GPR49的表达水平。ROC曲线(receiver operating characteristic curve；接收者操作特性曲线)是纵轴表示检测灵敏度、横轴表示假阳性率(即“1-特异度”)的曲线图。本发明中，当连续改变用于判定生物样品中的GPR49表达水平的基准值时，通过将灵敏度和假阳性率的变化作图，可以得到ROC曲线。

需要说明的是，用于得到ROC曲线的“基准值”，是为了进行统计学分析而暂时使用的数值。用于得到ROC曲线的“基准值”通常在可以覆盖可选择的所有基准值的范围内连续变化。例如可以使基准值在所分析的集团的GPR49测定值的最小值与最大值之间变化。

基于所得的ROC曲线，可以选择可以期待所需的检测灵敏度以及精度的标准值。根据ROC曲线等在统计学上设定的标准值也称为截断值(cut-off值)。基于截断值的癌症的检测方法为：在上述步骤(2)中，将(1)中检测的GPR49的表达水平与截断值比较。而且，当(1)中检测的GPR49的表达水平比截断值高时，表示受试者被检测出癌症。

本发明中，GPR49的表达水平可以通过任意方法来确定。具体而言，通过评价GPR49的mRNA的量、GPR49蛋白的量、以及GPR49蛋白的生物学活性，可以知道GPR49的表达水平。GPR49的mRNA和蛋白的量可以通过本说明书中所述的方法来确定。

本发明中，可以以表达GPR49蛋白的任意动物种作为受试者。例如已知黑猩猩(Pan troglodytes)(ENSPTRG00000005223(XR_021586.1))、恒河猴(Macaca mulatta)(ENSMMUG00000020942)、小鼠(Mus musculus)(ENSMUSG00000020140)、大鼠(Rattus norvegicus)(ENSRNOG00000004221(LOC687868))、豚鼠(Cavia porcellus)(ENSCPOG00000009492)、狗(Canis familiaris)(ENSCAFG00000000451)、猫(Felis caius)(ENSFCAG00000008064)、鸡(Gallus gallus)(ENSGALG00000010163)等人以外的多种哺乳类表达GPR49蛋白。因此，本发明中的受试者包括这些动物。特别适合的受试者是人。需要说明的是，以人以外的动物作为受试者时，当然可以检测该动物种的GPR49蛋白。

对被检试样中所含的GPR49蛋白的检测方法没有特别限定，优选通过使用抗GPR49抗体的、以下例示的免疫学方法进行检测：

放射免疫测定(RIA)；

酶联免疫测定(EIA)；

荧光免疫测定(FIA)；

发光免疫测定(LIA)；

免疫沉淀法(IP)；

免疫比浊法(TIA)；

蛋白质印迹法(WB)；

免疫组织化学法(IHC)；以及

免疫扩散法(SRID)。

上述方法中，作为癌症的诊断方法，免疫组织化学(IHC)法是优选的免疫学测定方法之一，该方法包括以下步骤：将从罹患癌症的患者取得的组织或细胞固定在切片上，之后检测切片上的GPR49蛋白。免疫组织化学(IHC)法等上述免疫学方法为本领域技术人员所公知。

即，GPR49是癌细胞中特异性表达增强的膜蛋白，因此利用抗GPR49抗体可以检测癌细胞或癌组织。通过上述免疫组织学分析，检测从机体内采集的细胞或组织中所含的癌细胞。

在另一优选方式中，还可以利用抗GPR49抗体来检测机体内的癌组织。即，本发明涉及癌症的检测方法，该方法包括：(1)给予受试者用放射性同位素等标记物标记的与GPR49蛋白结合的抗体的步骤；以及(2)检测上述标记物的累积的步骤。为了追踪给予到机体内的抗体，可以标记抗体以能够进行检测。例如，可以追踪用荧光物质、发光物质或放射性同位素标记的抗体在机体内的行为。用荧光物质或发光物质标记的抗体，可以使用内视镜或腹腔镜来观察。至于放射性同位素，通过追踪其放射活性，可以将抗体的定位图像化。本发明中，机体内的抗GPR49抗体的定位表示癌细胞的存在。

为了检测机体内的癌症，标记抗体的放射性同位素可以使用正电子发射核素。例如可以用¹⁸F、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁶Ga、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸⁹Zr和¹²⁴I这样的正电子发射核素标记抗体。利用这些正电子发射核素标记抗GPR49抗体时，可采用公知的方法(Acta Oncol.32，825～830，1993)。

将用正电子发射核素标记的抗GPR49抗体给予人或动物后，使用PET(正电子断层摄影装置)从体外计测该放射性核素放射的放射线，通过计算机层析成像的方法转换为图像。PET是用于非侵袭性地获得有关药物的体内行为等的数据的装置。利用PET可以将放射强度以信号强度的形式定量图像化。通过按上述方式使用PET，无需从患者体内采集试样，即可检测在特定癌症中高度表达的抗原分子。抗GPR49抗体除了用上述核素标记外，还可以利用使用¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁴⁵Ti等正电子发射核素的短寿命核素进行放射标记。

使用由医疗用回旋加速器得到的上述核素的短寿命核素的生产、短寿命放射标记化合物的制备技术等相关研究开发得到推进。利用这些技术，可以用各种放射性同位素标记抗GPR49抗体。给予患者的抗GPR49抗体，根据抗GPR49抗体对各部位的病理组织的特异性而累积在原发灶和转移灶中。抗GPR49抗体用正电子发射核素标记时，检测其放射活性，从而根据放射活性的定位，检测该原发灶和转移灶的存在。用于该诊断用途时，可适当使用25～4000keV的γ粒子或正电子放射量的活性值。另外，选择适当的核素、再大量给予时，也有望获得治疗效果。为了得到放射线产生的抗癌作用，可以使用给予70～700keV的γ粒子或正电子放射量值的核素。

在本发明方法的另一方式中，检测GPR49的基因的表达。本发明中，对所检测的基因没有特别限定，但优选mRNA。本发明中，检测包含定量或定性检测。例如，定性检测的例子有：下述测定操作。

仅测定是否存在GPR49mRNA；

测定是否存在一定量以上的GPR49mRNA；

将GPR49mRNA的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。

而定量检测可以是：GPR49mRNA浓度的测定、GPR49mRNA量的测定等。

作为本发明中的被检试样，可以使用可能含有GPR49mRNA的任意试样。优选从哺乳类等生物的体内采集的试样，进一步优选为从人体内采集的试样。被检试样的具体例子可以例示如：血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿、组织、腹水、腹腔内清洗液等。本发明的被检试样还包括优选的试样、即由下述被检试样得到的试样，所述被检试样为将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液等。

使用由将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液等的、从被检试样得到的试样时，优选采用原位杂交法。原位杂交法是作为确认细胞或组织内是否存在特定的DNA或RNA、或分布及其表达的强弱的方法而发展起来的。其原理是利用了下述性质：具有与细胞内的特定核酸序列互补的核苷酸序列的探针核酸特异性地形成复合体。通过预先将放射性同位素(RI)或抗原物质(半抗原)等标记在该探针上，通过检测该标记，即可识别杂交的部位，因此原位杂交法被用于细胞内DNA或RNA等的检测等。作为探针的标记，优选使用利用RI进行的标记。作为进一步优选的例子，可以使用利用了非放射性物质的生物素或洋地黄毒苷等的半抗原等的荧光标记。作为特别优选的例子，采用利用被称作FISH的荧光原位杂交(fluorescence in situ hibridization)进行的检测法。

对所要诊断的癌症没有特别限定。具体有胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和神经胶质瘤(例如成胶质细胞瘤)等。本发明中，对上述癌症的原发病灶和转移病灶均可诊断。

本发明中，可以以表达GPR49蛋白的任意动物种作为受试者。例如已知小鼠、大鼠、恒河猴、黑猩猩等人以外的多种哺乳类表达GPR49。特别适合的受试者是人。需要说明的是，当以人以外的动物种作为受试者时，检测该动物种的GPR49mRNA。

以下给出检测方法的具体方式。首先，由受试者制备试样。然后，检测该试样中所含的GPR49mRNA。本发明中，还可检测由mRNA合成的cDNA。本发明中，在被检试样中检测出GPR49mRNA或编码GPR49的cDNA时，判定可能患有癌症。例如，与阴性对照或正常者相比，在被检试样中检测出的GPR49mRNA或编码GPR49的cDNA的量多时，显示受试者患有癌症、或者将来罹患癌症的可能性大。

检测mRNA的方法是公知的。在本发明中，具体可以利用例如RNA印迹法、RT-PCR法、DNA芯片法等。

上述本发明的检测方法，还可以使用各种自动检查装置自动进行。通过自动化，可以在短时间内检查多个试样。

本发明还提供用于诊断癌症的诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒含有用于检测被检试样中的GPR49蛋白的试剂。本发明的诊断试剂至少含有抗GPR49抗体。

通过将本发明的癌症诊断用试剂与用于检测GPR49的其它要素组合，可以制成用于诊断癌症的试剂盒。即，本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒含有：与GPR49结合的抗体、和检测该抗体与GPR49结合的试剂，还可以进一步含有对照试样，所述对照试样包含含GPR49的生物样品。本发明的试剂盒，还可以在试剂盒中附带用于说明测定操作的说明书。

需要说明的是，本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书中。

实施例

以下，利用实施例来进一步具体说明本发明，但本发明的技术范围并不受这些实施例的限定。

[实施例1]利用人外显子1.0ST芯片进行的GPR49mRNA表达分析

为了明确人GPR49mRNA在临床癌症、癌细胞株、各种正常脏器中的表达分布，使用原本为了进行剪接变体分析而开发的人外显子1.0ST芯片(Affymetrix公司)进行表达分析。利用人外显子1.0ST芯片进行表达分析的优点在于：与基本上每个基因在3’侧只有1个探针组的、Affymetrix公司的现有表达芯片相比，在人外显子1.0ST芯片中基因的每个外显子可设定至少1个探针组，所以使用本芯片对每个基因进行表达分析时，每个基因可以得到多个探针组的表达数据，每个基因的表达数据的可靠性均有所提高。

此次表达分析中，使用来自22例肺腺癌摘出组织的肿瘤部分、13例胃癌摘出组织的肿瘤部分、5例尤文肉瘤组织的肿瘤部分、20例卵巢癌摘出组织的肿瘤部分、19种肺腺癌细胞株、4种小细胞肺癌细胞株、16种胃癌细胞株、20种卵巢癌细胞株和71种正常组织(从Clontech公司、Ambion公司、STRATAGENE公司、CellAPPLICATIONS公司、Panomics公司、CHEMICON公司、BioChainInstitute公司购入)的总RNA。

对于所有临床癌摘出组织(已取得知情同意)的肿瘤部分、正常部分和癌细胞株(从ATCC、JCRB、理研BIOSOURCE CENTER CELLBANK购入)，使用Trizol(Invitrogen)，按照产品附录的方法提取总RNA。

使用1μg上述总RNA，根据GeneChip全转录物(WT)有义靶标记测定指南(Affymetrix)进行基因表达分析实验，人外显子1.0ST芯片数据的数值化使用Affymetrix公司提供的ExACT(外显子芯片计算工具)软件来进行。

存在21个相对于人外显子1.0ST芯片的人GPR49的核心探针组，其探针组ID为3422146、3422162、3422166、3422167、3422175、3422177、3422179、3422180、3422181、3422182、3422189、3422191、3422194、3422195、3422197、3422198、3422199、3422200、3422201。

探针组ID3422201在正常组织中的表达数据见图1，在胃癌细胞株、胃癌摘出组织的肿瘤部分的表达数据见图2，在尤文肉瘤、小细胞肺癌、肺腺癌摘出组织肿瘤部分的表达数据见图3，在卵巢癌细胞株、卵巢癌摘出组织的肿瘤部分的表达数据见图4。

由图1～4可知：人GPR49转录物在正常组织中的表达仅限于间脑、延髓、末梢神经、骨骼肌、子宫、胎盘、胎儿大肠等中。而其在担心药物毒性的脏器、即肺、肾脏、肝脏、骨髓、末梢血中的表达低，有望将副作用抑制在低水平。在癌组织中，观察到其在胃癌、尤文肉瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、卵巢癌中高度表达，期待以人GPR49为靶的抗肿瘤药对这些癌症有效。

[实施例2]全长人GPR49表达细胞的建立

分别以NCBI检索号NP_003658.1(SEQ ID NO：1(氨基酸序列))和NM_003667.2(SEQ ID NO：2(核苷酸序列))为基础，通过PCR法分离全长人GPR49cDNA，并将其克隆到哺乳细胞表达用载体(pcDNA5/FRT/TO)(Invitrogen公司)中。pcDNA5/FRT/TO是一种在杂交人CMV/TetO₂启动子下插入基因能够诱导表达、且整合有新霉素耐性基因作为耐药性标志物的载体。再使用仅在四环素或多西环素存在下能够进行表达诱导的表达系统FlpIn系统(Invitrogen公司)，向293FlpIn T-Rex细胞中进行全长人GPR49cDNA的基因导入。向在DMEM(高糖)/10％FBS/100μg/mL Zeocin^TM(Invitrogen公司)/15μg/ml杀稻瘟素(Invitrogen公司)中培养的293FlpIn T-Rex细胞中导入表达载体时，使用Fugene6(Roche公司)。按照操作指南，同时进行表达Flp重组酶的pOG44载体和pcDNA5/FRT/GPR49载体的基因导入，用50μg/mL潮霉素B(Invitrogen公司)进行选择，建立导入了全长人GPR49基因的人GPR49诱导表达细胞株、B2、B4。在插入到表达载体中的GPR49基因的N末端导入有HA标签，所以利用抗HA抗体(Sigma公司)来检测选择细胞。

使用BioRad GenePulser，向来自中国仓鼠卵巢的细胞、即DG44细胞株中导入基因，得到HA-GPR49表达细胞株2B10。

再构建导入有GPR49基因的载体，将其用于DNA免疫。表达载体pMCN是一种在小鼠CMV启动子(ACCESSION No.U68299)下插入基因能够诱导表达、且整合有新霉素耐性基因作为耐药性标志物的载体。按照常规方法将GPR49基因克隆到pMCN中，由此制作作为GPR49表达载体的pMCN-GPR49。

[实施例3]通过DNA免疫进行的抗GPR49单克隆抗体的制作

利用基因枪粒子(GeneGun Particle)法向小鼠中导入基因，进行DNA免疫。该方法按照BioRad公司的操作指南来进行。将1mm的金颗粒(BioRad公司)与pMCN-GPR49DNA混合，包被在管内部，由此制作DNA免疫用弹丸。对于6周龄雌性MRL/lpr小鼠，以200-300psi的压力，使用Helios基因枪(BioRad公司)，将包被有pMCN-GPR49DNA的弹丸打入腹部皮肤中，由此进行基因导入。认为通过被导入到存在于皮肤中的角化细胞、郎格汉斯细胞、真皮树突细胞(dermal dendritic cell)中的基因表达GPR49蛋白，使这些细胞成为抗原提示细胞(APC)，引起了免疫(Methods31，232-242(2003)；Immunization with DNA through the skin)。以1周的间隔进行6次DNA免疫。最终免疫是指将表达GPR49的DG44细胞株2B10的100万个细胞用PBS稀释后进行尾静脉内给药。抗体效价的测定通过使用2B10细胞的FACS分析来进行。比较已免疫的小鼠的血清与在2B10细胞的细胞膜表面上表达的GPR49蛋白的反应。对反应性最高的小鼠进行最终免疫，将其用于细胞融合。最终免疫的3天后，摘出该脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞P3-X63Ag8U1(P3U1、从ATCC购入)混合，达到2∶1的比例。细胞融合通过缓慢加入PEG1500(ロシユ·ダイアグノステイツク公司)来进行，制作杂交瘤细胞。通过小心加入RPMI1640培养基(GIBCO BRL公司)来稀释PEG1500的浓度，之后通过离心操作除去PEG1500。接下来，将杂交瘤细胞悬浮于含有10％FBS、1×HAT培养基添加剂(SIGMA公司)、0.5×BM-Condimed H1杂交瘤克隆添加剂(ロシユ·ダイアグノステイツク公司)的RPMI1640培养基(以后记作HAT培养基)中，之后接种在96孔培养板上，使达到200μL/孔。接种时的细胞浓度根据所用的P3U1细胞数目来稀释，将杂交瘤细胞在96孔培养板中、于37℃、5％CO₂中、在HAT培养基中培养约1周。分泌抗体到培养上清中的杂交瘤的筛选通过流式细胞术来进行。

[实施例4]sGPR49Fc的制备

利用PCR扩增含有GPR49蛋白的第1-555位氨基酸的片段，之后构建载体，使扩增的片段与小鼠IgG2a的Fc蛋白以融合蛋白的形式表达。将构建的载体导入DG44细胞中，选择sGPR49Fc的融合蛋白能够表达的细胞作为新霉素耐性株。大量培养所得的细胞株2D3，之后回收培养上清，纯化sGPR49Fc蛋白。将通过蛋白A柱以Fc融合蛋白的形式被亲和纯化的sGPR49Fc蛋白供给蛋白免疫的抗原或杂交瘤的筛选抗原。

[实施例5]利用sGPR49Fc蛋白免疫来制作抗GPR49抗体

将50μg亲和纯化sGPR49Fc蛋白与弗氏完全佐剂混合，进行免疫，再将50μg二次亲和纯化sGPR49Fc蛋白与弗氏不完全佐剂混合，将所得混合物通过皮下对小鼠进行免疫以诱导抗体，对与GPR49蛋白的反应性最高的小鼠从尾静脉注射25μg sGPR49Fc蛋白，3天后供给细胞融合，如上操作来制备杂交瘤。

[实施例6]利用FACS(流式细胞术)评价结合活性

使用所得的杂交瘤，利用流式细胞术评价与人GPR49/DG44细胞(2B10)的结合。将悬浮于FACS缓冲液(2％FBS/PBS/0.05％NaN₃)中的人GPR49表达细胞株用FACS缓冲液稀释至1×10⁶个细胞/mL，之后按50μL/孔分别注入Falcon353910圆底96孔板中。向加入有细胞的孔中加入稀释至适当浓度的杂交瘤的培养上清，使之在冰上反应60分钟。接下来，用FACS缓冲液清洗细胞1次。向加入有细胞的孔中添加作为二次抗体的山羊F(ab′)₂片段抗小鼠IgG(H+L)-FITC(Beckman Coulter公司)，之后使之在冰上反应30分钟。反应后，通过离心除去上清，之后将悬浮于100μL FACS缓冲液中的细胞供给流式细胞术。在流式细胞术中使用FACS Calibur(ベクトンデイツキンソン公司)。根据前向角散射(forward scatter)和侧向角散射(side scatter)的斑点印迹在活细胞集团中设定阈值，选FL1的直方图，评价该集团中所含的细胞的结合活性。

使杂交瘤的上清与作为诱导表达GPR49的DG44细胞的2B10、作为其母株的DG44分别反应时，得到了与GPR49表达细胞发生特异性反应的杂交瘤。利用极限稀释法将这些孔的杂交瘤单克隆化。使用IsoStrip(注册商标)小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(ロシユ·ダイアグノステイクス)分析各抗体的同种型。其结果，2J18-1N、2J18-3是IgM，而2L7-8、2L9-3、2L10-19、2L13-3、2L15-12、2L16-15、2L18-15、2L33-6、2L34-5、2L36-12、2T4E-6、2T9E1#14、2T15E-2、2T42E-4、2T54-2、2T65-3、2T37-16、2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11是IgG1。扩大培养被单克隆化的杂交瘤，之后使用蛋白G柱，按照操作指南从培养上清中纯化抗体。至于IgM抗体，使用蛋白L柱按照操作指南进行纯化。已纯化的抗体通过DC蛋白测定等进行蛋白定量。

[实施例7]抗原基因的克隆

对于显示ADCC活性和CDC活性的2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2这6种杂交瘤，确定抗体可变区基因的序列。对于抗体的基因，使用从分别产生抗GPR49抗体2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2的杂交瘤中提取的总RNA，通过RT-PCR法进行扩增。以下，将各抗体2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2的基因名称简记为2J18、2U1E、2U2E、2L13、2L36、2T15E基因。使用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN公司)，从1×10⁷个细胞的杂交瘤中提取总RNA。通过使用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH公司)，利用1μg总RNA构建RACE文库。作为IgM抗体的2J18-1N使用与小鼠IgM恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgM(SEQ ID NO：61；CCACCAGATTCTTATCAGACAGG)，其他抗体基因则使用与小鼠IgG1恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgG1(SEQ ID NO：62；GGGCCAGTGGATAGACAGATG)、或与小鼠κ链恒定区核苷酸序列互补的合成寡核苷酸κ(SEQ ID NO：63；GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG)，从而扩增编码该杂交瘤所产生的抗体的基因的5’末端侧基因片段。在42℃下进行1小时30分钟的逆转录反应。50μL PCR溶液中含有5μL10×Advantage2PCR缓冲液、5μL10×通用引物A Mix、0.2mM的dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1μL Advantage2聚合酶Mix(以上由CLONTECH公司制备)、2.5μL逆转录反应产物、10pmol合成寡核苷酸MHC-IgM、MHC-IgG1或κ。PCR反应如下进行：在94℃的初温下反应30秒后，重复94℃下5秒、72℃下3分钟的反应循环5次，接下来，重复94℃下5秒、70℃下10秒、72℃下3分钟的反应循环5次，再重复94℃下5秒、68℃下10秒、72℃下3分钟的反应循环25次。最后，将反应产物在72℃下加热7分钟。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制备)，从琼脂糖凝胶中纯化各PCR产物。之后，将该PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司制备)中，确定其核苷酸序列。

2J18的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：3、氨基酸序列见SEQ ID NO：4、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：8、氨基酸序列见SEQ ID NO：9。2J18的重链CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：5、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：6、重链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：7、轻链CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：10、轻链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：11、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：12。

2U1E的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：13、氨基酸序列见SEQ ID NO：14、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：18、氨基酸序列见SEQ ID NO：19。2U1E的重链CDR1的氨基酸序列见SEQ IDNO：15、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：16、重链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：17、轻链CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：20、轻链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：21、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：22。

2U2E的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：23、氨基酸序列见SEQ ID NO：24、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：28、氨基酸序列见SEQ ID NO：29。2U2E的重链CDR1的氨基酸序列见SEQ IDNO：25、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：26、重链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：27、轻链CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：30、轻链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：31、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：32。

2L13的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：33、氨基酸序列见SEQ ID NO：34、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：38、氨基酸序列见SEQ ID NO：39。2L13的重链CDR1的氨基酸序列见SEQ IDNO：35、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：36、重链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：37、轻链CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：40、轻链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：41、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：42。

2L36的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：43、氨基酸序列见SEQ ID NO：44、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：48、氨基酸序列见SEQ ID NO：49。2L36的重链CDR1的氨基酸序列见SEQ IDNO：45、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：46、重链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：47、轻链CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：50、轻链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：51、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：52。

2T15E的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：64、氨基酸序列见SEQ ID NO：65、L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：69、氨基酸序列见SEQ ID NO：70。2T54E的重链CDR1的氨基酸序列见SEQID NO：66、重链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：67、重链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：68、轻链CDR1的氨基酸序列见SEQ IDNO：71、轻链CDR2的氨基酸序列见SEQ ID NO：72、轻链CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：73。

[实施例8]使用强制表达细胞株的细胞破碎液进行的蛋白质印迹分析

使用HA-GPR49表达DG44细胞株2B10的细胞破碎液，筛选可进行蛋白质印迹的抗体时，在2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11、2T15E-2、2T65-3等中，通过蛋白质印迹法分析可以检测出预想为GPR49蛋白的分子量为100kDa的谱带。为了确认所检测出的100kDa的谱带来自人GPR49，通过蛋白质印迹法分析与293细胞B2的非诱导时、诱导时的细胞破碎液的反应性，所述293细胞B2表达通过多西环素可以诱导表达的HA-GPR49。结果见图5。293、B2的0表示非诱导时的细胞破碎液，1和10表示表达诱导时的细胞破碎液。在利用单克隆抗体2U2E-2进行的检测中诱导表达的泳道上特异性地确认到100kDa的谱带。该谱带与利用HA标签检测的HA-GPR49的谱带、即100kDa的谱带大小相同，由此断定：单克隆抗体2U2E-2是识别GPR49的抗体。

[实施例9]利用siRNA确认识别抗体的抗原

为了进一步确认100kDa的谱带来自GPR49，通过转柒siRNA来剔除GPR49的表达，确认抗体所识别的谱带消失。按照操作指南，将从Invitrogen公司购入的抗GPR49的siRNA(Cat.No.1299003)LGR5-HSS112507、LGR5-HSS112508、LGR5-HSS112509(以下简记为siRNA507、508、509)导入2B10细胞株或GPR49高度表达大肠癌细胞株、即LoVo细胞中，利用蛋白质印迹法分析其细胞破碎液。结果如图6所示，在siRNA507、508、509这3种siRNA中，发现在508、509中GPR49的相当于予想分子量100kDa蛋白的谱带明显消失，由此认为：100kDa的谱带识别GPR49。

并且，如图6所示，2U1E-1、2U2E-2的蛋白质印迹分析的结果，发现了与由于siRNA的导入而消失的100kDa蛋白的谱带同时消失的新的谱带。在抗体2U1E-1的检测中，除100kDa蛋白的谱带外，发现约40kDa蛋白的谱带也由于siRNA而消失。还发现：在抗体2U2E-2的检测中，除100kDa蛋白的谱带外，约60kDa蛋白的谱带也由于siRNA而消失。这两个谱带的大小总计正好为全长100kDa，由此认为：GPR49蛋白在某处被切断，生成60kDa、40kDa的蛋白。另外，在作为大肠癌细胞株的LoVo细胞中也检测到60kDa、40kDa的谱带。

[实施例10]利用免疫沉淀法检测切断片段

为了确认通过蛋白质印迹法检测的40kDa蛋白、60kDa蛋白的谱带的存在，使用GPR49单克隆抗体进行免疫沉淀实验。作为发生免疫沉淀的样品，使用用NP40裂解缓冲液(0.5％NP40，50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，蛋白酶抑制剂complete mini(Roche公司))增溶表达HA-GPR49的DG44细胞株2B10而制成的细胞破碎液。以BSA作为标准品，通过DC蛋白测定来定量细胞破碎液中所含的蛋白量。向500μL含100μg蛋白的细胞破碎液中加入2μg抗体溶液，使之在4℃下反应1小时。再加入20μL蛋白A/G Plus琼脂糖(Santa Cruz公司)，使之反应一夜。以1000×g的离心力离心1分钟，使琼脂糖珠粒沉淀，用1mL PBS清洗2次，之后加入50μL2×SDS-样品缓冲液，在60℃下保温30分钟，从而洗脱与抗体结合的抗原。以1000×g的离心力离心1分钟，将所得上清中的15μL供给SDS-PAGE。利用submarine法转录到ミリポア公司的Immobilon-P上，利用单克隆抗体2U1E-1、2U2E-2进行检测。结果见图7、图8。如在2L13-3、2L36-12中发生免疫沉淀的样品流过的泳道中之所见，除100kDa的谱带外，确实在2U1E-1中还可检测到40kDa的谱带、在2U2E-2中还检测到60kDa的谱带，由此可知：GPR49除了以具有100kDa的分子量的分子形式存在外，还以具有显示为约60kDa、约40kDa的大小的分子量的分子形式存在。图7使用作为二次抗体的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制备)，图8使用作为二次抗体的HRP标记抗小鼠κ抗体(Southern Biotech公司制备)，以区别来自用于免疫沉淀的抗体的H链的谱带和60kDa的GPR49的谱带。

[实施例11]使用各种癌细胞株的细胞破碎液进行的蛋白质印迹分析

使用单克隆抗体2U2E-2检测各种癌细胞株的细胞破碎液。如图9所示，在大肠癌细胞株LoVo、肝细胞癌株Alexander、HepG2、卵巢癌细胞株KURAMOCHI、OVSAHO、神经胶质瘤U251中，GPR49蛋白的表达特别显著地亢进。箭头显示100kDa、60kDa的GPR49蛋白的谱带。照片中的泳道显示出样品名称，分别显示大肠癌细胞株Lovo、胃癌细胞株NUGC-4、肝细胞癌株Alexander、肝细胞癌株HepG2、肝细胞癌株Huh6、卵巢癌细胞株KURAMOCHI、卵巢癌细胞株OVSAHO、神经胶质瘤U251、中国仓鼠卵巢细胞DG44、HA-GPR49表达DG44细胞株2B10。

[实施例12]抗GPR49单克隆抗体的CDC活性的测定

通过以产生细胞毒的细胞中7-AAD的摄入程度为指标，测定CDC活性。

使GPR49表达DG44细胞或DG44细胞与单克隆抗体以10μg/mL的浓度在4℃下反应30分钟。接下来，添加幼兔补体(Baby RabbitComplement)(CEDARLANE LABORATORIES公司)，使其最终浓度达到1％或5％，在37℃下继续反应90分钟。加入7-AAD(BeckmanCoulter公司)，使其最终浓度达到1μg/mL，之后在室温下静置10分钟。之后，用FACS缓冲液清洗细胞，然后用FACSCalibur分析产生细胞毒的细胞的比例。％FL3的值表示用7-AAD染色的、损伤细胞的比例，在表达HA-GPR49的DG44细胞中，利用抗GPR49抗体2J18-1N确认到特异性补体依赖性细胞毒(complement-dependent cytotoxicity(CDC))活性(图10)。

[实施例13]2J18scFv-Fc表达载体的构建

由于抗人GPR49单克隆抗体2J18是IgM，所以无法评价ADCC活性。于是，使抗体基因以scFv-Fc的形式表达。对于如实施例7那样克隆的2J18抗体基因，通过PCR扩增H链、L链的可变区，并经由作为接头的氨基酸GGGGS使之结合，之后连接小鼠的IgG2a的H链的铰链区、CH2区、CH3区，制成以scFv-Fc形式表达的抗体分子。

具体使用以下引物进行PCR。

KozakATG-2J18VH

GCGAATTCCACCATGGGATG(SEQ ID NO：74)

2J18VH-GS1

TGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAG(SEQ ID NO：75)

GS1-2J18VL

GGTGGCGGTGGCTCACAGATTGTTCTCACCCAGTC(SEQ ID NO：76)

2J18VH-GS2

ACTCCCACCACCGCCTTTTATTTCCAATTTTGTCCCCG(SEQ ID NO：77)

GS2-mIgG2a-铰链

GGCGGTGGTGGGAGTGAGCCCAGAGGGCCCAC(SEQ ID NO：78)

NX-mG2a-3

CTCTAGAGCGGCCGCTTATC(SEQ ID NO：79)

将其插入表达载体中，完成2J18scFv-Fc表达载体的构建。

[实施例14]2J18scFv-Fc蛋白的制备

使2J18scFv-Fc表达载体在293T细胞中一过性表达，使用蛋白G柱从其培养上清中亲和纯化。将18μg质粒DNA和54μL FugeneHD(Roche公司制备)一同在900μL Opti-MEM(Invitorogen公司制备)中混合，静置15分钟，之后添加到200万个在T75烧杯中培养的293T细胞(从ATCC购入)细胞上，将基因导入细胞中。在5％CO₂培养箱中、37℃下培养3天，之后回收培养上清，使用蛋白G柱，按照操作指南纯化2J18scFV-Fc。

[实施例15]人IgG1嵌合2L13抗体的制作

对于如实施例7那样克隆的抗人GPR49单克隆抗体2L13的抗体基因，通过PCR扩增H链、L链的可变区，之后将其与人IgG1的H链恒定区、L链恒定区连接，以人IgG1嵌合分子的形式插入表达载体中，使其能够表达。所得载体基因导入到大鼠骨髓瘤细胞YB2/0(从ATCC购入)中，建立新霉素耐性株。在RPMI-1640/10％FBS/500μg/mLGeneticine/青霉素·链霉素存在下培养，使用蛋白A柱，按照操作指南从培养上清中纯化人IgG1嵌合抗体。将已纯化的抗体2L13/YB供给ADCC活性的测定。

[实施例16]抗GPR49单克隆抗体的ADCC活性的测定

利用铬释放法研究对抗人GPR49单克隆抗体中的GPR49强制表达DG44细胞2B10的ADCC活性。将作为靶细胞的2B10用添加有铬-51的培养液(CHO-S SFM II(Invitrogen公司制备))培养数小时，之后除去培养液，用培养液清洗细胞，之后将悬浮于新的培养液中的细胞添加到96孔圆底板中，使达到1×10⁴个细胞/孔。接着，添加抗体，使最终浓度达到1μg/mL、0.1μg/mL，向各孔中的与靶细胞相比为约5倍量的效应细胞(NK-92(ATCC，CRL-2407)中添加强制表达含有小鼠Fc-γ受体3(NM_010188)的胞外区和人γ链(NM_004106)的跨膜区和胞内区的嵌合蛋白的重组细胞(日本特愿2007-20155))，将板在5％CO₂培养箱中、于37℃下静置4小时。静置后将板离心，从各孔中回收一定量的上清，使用γ射线计数仪Wallac1480测定放射活性，使用下式求出特异性的铬游离率(％)。

特异性的铬游离率(％)＝(A-C)×100/(B-C)

其中，A表示各孔中的放射活性，B表示以终浓度1％Nonidet P-40进行细胞溶解后释放到培养基中的放射活性平均值，C表示仅添加培养基时的放射活性平均值。

其结果如图11所示，在用于试验的抗人GPR49单克隆抗体中，特别是2T54-2、2T15E-2、2L13-3、2L36-12和2J18scFv-Fc对人GPR49表达细胞2B10诱导非常强的ADCC活性。此结果显示：抗体治疗对以人GPR49为靶的肿瘤非常有用。

测定人IgG1嵌合抗体2L13/YB的ADCC活性时，使用与上述相同的2B10细胞作为靶细胞，向与靶细胞相比为约5倍量的效应细胞(NK-92(ATCC，CRL-2407)中添加强制表达人Fc-γ受体3(NM_000569)的重组细胞(日本特愿2007-20155))，将板在5％CO₂培养箱中、于37℃下静置4小时。静置后将板离心，从各孔中回收一定量的上清，使用γ射线计数仪Wallac1480测定放射活性，使用下式算出特异性的铬游离率(％)。其结果如图11所示，确认2L13/YB对人GPR49表达细胞产生非常高的ADCC活性。

[实施例17]使用了Mab-ZaD的内化所产生的细胞杀伤效果

使用结合有名为皂草毒蛋白的毒素的二次抗体、Mab-Zap(Advanced Targeting Systems公司制备)作为具有下述作用机理的抗体药物的开发模型，评价对GPR49表达细胞的杀伤能力，所述作用机理为：使毒素等与抗体结合，在细胞内抗体与靶细胞结合后内化进入细胞内，之后利用缀合毒素的作用杀伤靶细胞。细胞使用诱导表达HA-GPR49的B4、未诱导表达HA-GPR49的B4细胞。每孔中加入100ng抗体和100ng Mab-Zap，在37℃、5％CO₂培养箱中保温3天，之后通过使用活细胞测定试剂SF(ナカライテスク公司制备)的WST8测定分析活细胞数。结果见图12。除2T42E-4、2U2E-2、2U4E-11外，在所分析的抗体中均可确认到细胞毒活性。

[实施例18]GST融合蛋白的表达和表位的分析

构建缺失突变体的GPR49表达载体，通过WB分析识别40kDa谱带的2U1E-1，结果表明：在第495-537位氨基酸中存在表位。于是，为了缩小范围，作为GST融合蛋白，使第495-537、495-516、510-529、517-537位的氨基酸与GST蛋白融合并表达。各GST融合蛋白所含有的GPR49的氨基酸序列见图13。结果如图14所示，使用表达产物的蛋白质印迹法进行分析，结果表明：2U1E-1以517-537的氨基酸区作为表位。另外，同样进行识别40kDa的2T15E-2抗体的表位分析时，在510-529的氨基酸区存在表位。该结果表明：通过切断而产生的40kDa的蛋白是含有至少直至第510位氨基酸的序列的分子。

[实施例19]抗GPR49单克隆抗体与小鼠GPR49的反应性

将小鼠GPR49整合到表达载体中，使其在293T细胞中一过性表达，通过WB分析其细胞破碎液时，如图15所示，结果表明：其与小鼠的GPR49也发生反应。

[实施例20]利用FACS(流式细胞术)评价结合活性

利用流式细胞术分析抗体2T15E-2与人癌细胞株的反应性。将悬浮于FACS缓冲液(2％FBS/PBS/0.05％NaN₃)中的人癌细胞株用FACS缓冲液稀释至1×10⁶个细胞/mL，之后以50μL/孔分别注入Falcon353910圆底96孔板中。加入浓度稀释至10μg/mL的抗体2T15E-2，使之在冰上反应60分钟。接下来，用FACS缓冲液清洗细胞1次。向加入有细胞的孔中加入作为二次抗体的山羊F(ab′)₂片段抗小鼠IgG(Fcγ)-FITC(Beckman Coulter公司)，之后使之在冰上反应30分钟。反应后，通过离心除去上清，之后将悬浮于100μL含有PI(碘化丙锭)的FACS缓冲液中的细胞供给流式细胞术。在流式细胞术中使用FACS Calibur(ベクトンデイツキンソン公司)。根据前向角散射(forward scatter)和侧向角散射(side scatter)的斑点印迹在活细胞集团中设定阈值，取FL1的直方图，评价该集团中所含的细胞的结合活性。

在使用卵巢癌细胞株OVSAHO、肝癌细胞株Alexander、胃癌细胞株NUGC-4的流式细胞术分析中，与不含一次抗体的峰相比，观察到明显的峰的移动，由此可知：在这些细胞株中GPR49分子存在于细胞膜上(图16)。以实线表示的峰显示与癌细胞株的反应性，阴影部分则表示在没有抗体的情况下进行反应时的峰。横轴显示结合有FITC的抗体的结合度所产生的信号的强度，纵轴显示细胞数。

产业实用性

本发明的GPR49蛋白特异性抗体可以用作胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤等的诊断药。本发明的诊断药对原发性或转移性癌症的诊断有用。具体而言，通过检测从患者采集的生物样品中所含的GPR49蛋白，可以判定癌症的可能性。或者，通过检测机体内的GPR49表达细胞的定位，可以检测机体内胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的存在。

另外，本发明的具有细胞毒活性的抗GPR49抗体对治疗或预防表达GPR49蛋白的癌症有用。具体而言，根据本发明，提供胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤等各种癌细胞的细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂。本发明的癌细胞的细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂还可适用于原发性和转移性的任一种癌。

并且，本发明的具有细胞毒活性的抗GPR49抗体可以用作胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤等各种癌症的治疗药。本发明中，抗GPR49抗体还可用作原发性和转移性的任一种癌症的治疗药。

此外，编码本发明的抗体的基因和通过该基因转化的重组细胞可用于制作发挥上述效果或更佳效果的重组抗体。

Claims (6)

1. 选自以下(1)~(6)中任一项所述的抗GPR49抗体：

(1) 抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 45记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 46记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 47记载的氨基酸序列，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 50记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 51记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 52记载的氨基酸序列，即抗体2L36；

(2) 抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 25记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 26记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 27记载的氨基酸序列，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 30记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 31记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 32记载的氨基酸序列，即抗体2U2E-2；

(3) 抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 35记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 36记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 37记载的氨基酸序列，所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 40记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 41记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 42记载的氨基酸序列，即抗体2L13-3；

(4) 抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)、(2)或(3)中所述的抗体所结合的GPR49蛋白表位相同；

(5) (1)～(3)中任一项所述的抗体，其中，该抗体含有人恒定区；

(6) (5)中所述的抗体，其中，该抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

2. 药物组合物，其中含有权利要求1所述的抗体作为有效成分。

3. 细胞增殖抑制剂，其中含有权利要求1所述的抗体作为有效成分。

4. 权利要求1所述的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

5. 权利要求4所述的应用，其中，癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的任一种癌。

6. 权利要求1所述的抗体在制备用于诊断癌症的试剂盒中的应用，其中，癌症为选自胃癌、大肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神经胶质瘤的任一种癌。